НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ.О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

ЗАПОРОЖЕЦЬ Тетяна Миколаївна

УДК 612.111.11/.13

КОМПЛЕКС ПЕПТИДНИХ ФРАГМЕНТІВ ГЕМОГЛОБІНУ:

РОЛЬ В РЕГУЛЯЦІЇ СИСТЕМИ КРОВІ

14.03.03 - нормальна фізіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Київ-2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі нормальної фізіології та Центральній науково-дослідній лабораторії Української медичної стоматологічної академії Міністерства охорони здоров'я України

Науковий консультант: Заслужений діяч науки України,

доктор медичних наук, професор

Міщенко Віталій Петрович

Українська медична стоматологічна академія,

завідувач кафедри нормальної фізіології

Офіційні опоненти: член-кор.АПН України, доктор медичних наук, професор

Шевчук Віктор Григорович,

Національний медичний університет ім. О.О.Богомольця,

завідувач кафедри нормальної фізіології

доктор медичних наук, професор

Третяк Наталія Миколаївна

Інститут гематології і трансфузіології АМН України,

завідувачка відділення захворювань системи крові

доктор медичних наук, професор

Чаяло Петро Петрович

Інститут експериментальної радіології Наукового центру радіаційної медицини АМН України, завідувач лабораторії

радіаційної біохімії

Провідна установа: Інститут геронтології АМН України, лабораторія регуляції метаболізму

Захист відбудеться “14” сiчня 2003 року о 10-й годині на засіданні Спеціалізованої Вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01204, м.Київ, вул. Богомольця,4.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології ім..О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01204, м. Київ, вул. Богомольця,4.

Автореферат розісланий “28” листопада 2002 р.

Вчений секретар

cпеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Серед важливих задач сучасної біології та медицини, найважливіше місце займає вивчення механізмів регуляції фізіологічних функцій за участю пептидних біорегуляторів, дослідження їх фармакологічної дії, з'ясування ролі у підтримці клітинного гомеостазу, координації процесів біосинтезу, відновлення генетичної інформації (Кузник Б.И., 1999, 2001; Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., 1996-2001; Шатаева Л.К.,2002). З дією білків та пептидів пов'язують сприйняття клітинами еферентних сигналів і шляхи їх реалізації, а також регуляцію механізмів загибелі клітин (Владимирская Е.Б., 2000; Козинец Г.И., 2001]. У звўязку з цим, особливого значення набувають наукові дослідження, спрямовані на поглиблене вивчення молекулярних аспектів біосинтезу регуляторних пептидів, особливостей фізіологічної дії та кооперативності окремих субстанцій.

В останній час велика увага приділяється коротким (менше 30 амінокислотних залишків) біологічно активним пептидам, які утворюються внаслідок фрагментації гемоглобіну (Blishchenko E.Y., 1997; Пивнык А.В., 2000). До сьогодні з екстрактів різноманітних біологічних тканин вилучено близько 200 ендогенних фрагментів гемоглобіну (Ivanov V.T.et al.,1997). Незважаючи на те, що гемоглобін, головним чином, локалізований в еритроцитах і тому як компонент крові повинен бути присутній в усіх тканинах, його ендогенна фрагментація носить виражений тканинноспецифічний характер. В залежності від вихідної тканини фрагменти цього білка складають від 30 до 90% від загального числа пептидів, які ідентифікуються в екстракті. Вміст цих сполук у тканинах досягає десятків нмоль/г, що робить вірогідним можливість реалізації біологічних ефектів, які зареєстровані у модельних тестах. Таким чином, можливо припустити, що роль гемоглобіну як джерела ендогенних біологічно активних пептидів порівнюється по важливості з його загальновідомою функцією переносника кисню, що являє собою безперечний інтерес.

На важливість біологічних функцій фрагментів гемоглобіну вказують і результати ряда робіт, в котрих зазначається, що при деяких патологіях, наприклад, при хворобі Альцгеймера, ішемії мозку щурів, карциномі легень людини спостерігається зміна вмісту окремих фрагментів гемоглобіну в екстрактах відповідних тканин (Пивнык А.В., 2000). Причинно-наслідкові відносини, що обумовлюють цей феномен поки що не встановлені, але припускається, що вони можуть бути пов'язані або з порушенням біохімічних процесів в організмі, або з його захисною реакцією. У будь-якому випадку, вивчення цього явища потребує додаткових досліджень.

В літературі майже не висвітлені питання про утворення біологічно активних пептидів в організмі шляхом обмеженого протеолізу гемоглобіну. Не було спроби виявити біологічну активність цих пептидів в умовах цілісного організму. Залишається нез'ясованим, яку роль відіграють пептидні фрагменти гемоглобіну в перенесенні інформації, необхідної для нормального функціонування, розвитку і взаємодії клітинних популяцій. Тому дослідження впливу пептидних фрагментів гемоглобіну на процеси проліферації, диференціювання та фізіологічної загибелі клітин перспективним для розуміння морфофункціональних змін в системі крові.

Дослідження молекулярних механізмів програмованої загибелі клітин є однією з актуальних проблем сучасної біології (Лукьянова Н.Ю., 2000; Белушкина Н.Н., 2001; Рябенко В.В., 2002). Складність цієї проблеми вочевидь: не дивлячись на велику кількість експериментальних даних, до теперішнього часу залишаються до кінця не виявлені механізми регулювання апоптозу окремими клітинами у багатоклітинному організмі. Актуальність цієї проблеми визначається взаємозв'язком порушень регуляції процесу програмованої загибелі клітин з більшістю захворювань. Подальше поглиблення знань про механізми гуморальної регуляції програмованої клітинної загибелі дозволить розробити принципово нові біотехнологічні підходи при лікуванні різноманітних захворювань, пов'язаних з порушенням загибелі клітинних клонів.

На жаль, в Україні у галузі розробки методів корекції процесів апоптозу пептидними біорегуляторами широкомасштабних розробок не проводиться. Тому розуміння відмінностей в механізмах апоптозу та інших клітинних процесів (проліферації та диференціювання) дозволить створити препарати, які мають високу і універсальну ефективність для лікування захворювань системи крові.

Водночас, регуляція функцій клітин залежить від інтенсивності генерації активних форм кисню і потужності антиоксидантного захисту (Середенко М.М., 1998; Тимочко М.Ф.,1999), які чинять вплив на системи гемостазу, імунітету та неспецифічної резистентності організму (Лобань Г.А., 1992; Катрушов О.В., 1995). Вивчення ролі пептидних фрагментів, які утворюються внаслідок протеолітичного процесінгу гемоглобіну у взаємодії між зсіданням крові, перекисним окисленням ліпідів, неспецифічною резистентністю організму, може стати головною передумовою сучасної діагностики і успішного лікування гематологічних захворювань.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є фрагментом конкурсної теми МОЗ України “Роль дисбалансу пептидергічної системи регуляції в розвитку типових патологічних процесів та шляхи її відновлення інформаційними молекулами поліпептидної природи”, номер держреєстрації 4А01001570Р і планової науково-дослідної роботи Центральної науково-дослідної лабораторії (ЦНДЛ) УМСА “Пептидна регуляція процесів апоптозу за участю органних пептидних комплексів, номер держреєстрації 01980002719. Автор є безпосереднім виконавцем фрагмента зазначених досліджень.

Мета дослідження.

Довести участь комплексу пептидних фрагментів, які утворюються внаслідок протеолізу білкових структур гемоглобіну, у підтримці балансу життєвого циклу клітин системи крові (проліферації, диференціюванні та апоптозі) і регуляції процесів перекисного окислення ліпідів, гемостазу, неспецифічної резистентності організму за фізіологічних умов та дії чинників, які впливають на стан системи крові.

Задачі дослідження:

1.Розробити спосіб отримання пептидного комплексу гемоглобіну шляхом ферментативного гідролізу і дати його характеристику за фізико-хімічними властивостями.

2.Вивчити дію комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну на гематологічні показники периферичної крові і кісткового мозку, перекисне окислення ліпідів, гемостаз, процеси імунітету за фізіологічних умов.

3.Визначити дію комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну на систему крові за умов хронічної свинцевої інтоксикації, отруєнні гемолітичним токсином фенілгідразином, при дії іонізуючої радіації та депресії кровотворення, викликаній введенням цитостатика.

4.Дослідити участь комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну в процесах апоптозу клітин кісткового мозку при станах, викликаних інтоксикацією важкими металами, радіаційним ураженням, мієлодепресією після введення вінбластину.

Об'єкт дослідження - комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну.

Предмет дослідження - фізіологічна активність комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну, яка спрямована на регуляцію гематологічних показників, стану кісткового мозку, перекисного окислення ліпідів, гемостазу та імунітету при дії чинників, що впливають на систему крові.

Методи дослідження. Висунуті завдання вирішувались шляхом проведення хроматографічних методів аналізу для отримання (за власною методикою) та характеристики фізико-хімічних властивостей комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну, дослідження гематологічних, біохімічних, коагулологічних, імунологічних, імуногістохімічних методів з метою оцінки біологічної активності та впливу комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну на систему крові при відтворенні експериментальних моделей патології крові.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше розроблено спосіб отримання пептидних фрагментів гемоглобіну шляхом ферментативного гідролізу, охарактеризовано його фізико-хімічні властивості.

Вперше проведено комплексне дослідження регуляторної дії комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну на гематологічні показники крові і кісткового мозку, перекисне окислення ліпідів, гемостаз, імунітет за фізіологічних умов та під час дії чинників, що моделюють стан системи крові.

Вперше показано, що комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну стимулює процеси проліферації і диференціювання клітин-попередників мієлоїдного та еритроїдного ростків, знижує експресію манозовміщующих мембранних структур лейкоцитів, стабілізує антиоксидантний гомеостаз та процеси гемокоагуляції, модулює клітинний і гуморальний імунітет при хронічній свинцевій інтоксикації, дії гемолітичної отрути (сірчанокислий фенілгідразин), променевому ураженні та депресії кровотворення. Вперше виявлено механізм підвищення фагоцитарної активності нейтрофілів внаслідок дії комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну за фізіологічних умов та при відтворенні внутрішньосудинного гемолізу.

Вперше в Україні вивчені механізми апоптозу клітин кісткового мозку в умовах експериментальної патології системи крові. Доведено, що комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну гальмує процес апоптозу в клітинах кісткового мозку, впливаючи позитивно на експресію онкопротеїну bcl-2 та негативно на експресію ядерного білку р53.

За матеріалами роботи є деклараційний патент України: “Спосіб отримання комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну” № 48685А, від 15.08.2002 р.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані дозволяють теоретично зрозуміти складні процеси розвитку клітин, обміну, реалізації генетичної інформації, управління гомеостазом та метаболізмом, а також використовувати ці знання для розробки принципово нових підходів до профілактики і лікування захворювань системи крові.

Винайдений спосіб екстракції біологічно активних пептидів може бути використаний для створення нових лікарських препаратів. Виявлені системні ефекти комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну на організм, зокрема, імуномодулюючі, гіпокоагулюючі, антиоксидантні, дозволяють рекомендувати його для подальшого вивчення з метою створення нових лікарських засобів для лікування розладів системи кровотворення.

Отримані в роботі дані, які доводять позитивний вплив комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну на підсилення проліферації клітин кісткового мозку, гальмування апоптозу, можуть бути використані при подальшій розробці лікувальних засобів, зокрема, при апластичній анемії, яка супроводжується активацією загибелі клітин.

Впровадження результатів дослідження. Матеріали дисертації використовуються в навчальному процесі, в методичних розробках і лекційному матеріалі на кафедрах нормальної фізіології Харківського, Львівського, Дніпропетровського медичних університетів, кафедрах патологічної фізіології, біохімії, мікробіології, вірусології та імунології Української медичної стоматологічної академії.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійним дослідженням автора, яким вибрана мета наукового дослідження, обґрунтовані його завдання, проаналізована література з досліджуваної проблеми та проведений патентно-інформаційний пошук. Автор розробив план та програму досліджень, ним особисто проведені експериментальні дослідження, їх статистична обробка, інтерпретація одержаних результатів, обґрунтовані та сформульовані висновки роботи, підготовані наукові праці. Проведення лабораторних аналізів матеріалу здійснені автором на базі кафедри нормальної фізіології та ЦНДЛ Української медичної стоматологічної академії. Розробка та одержання природного поліпептидного біорегулятора здійснювалась спільно з завідуючим ЦНДЛ УМСА д.м.н. Кайдашевим І.П., що відображено в спільних публікаціях.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації представлені на Міжнародному симпозіумі “Системно-антисистемная регуляция в живой и неживой природе” (Київ, 1993); Международном симпозиуме “Физиология и патология гемостаза” (Симферополь, 1994); науково-практичній конференції “Актуальні питання теоретичної та клінічної медицини на сучасному рівні” (Полтава, 1996); Міжнародній міжвузівській конференції молодих вчених “Фізіологія і патологія перекисного окислення ліпідів, гемостазу та імуногенезу” (Полтава 1997, 1999); XV з'їзді Українського фізіологічного товариства (Донецьк,1998); IV Українській науково-практичній конференції з актуальних питань алергології та клінічної імунології (Київ, 1999); науково-практичній конференції “Вчені України - вітчизняній фармації” (Харків, 2000); Міжнародній науково-практичній конференції молодих учених “Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины”(Минск, 2000); Науково-практичній конференції “Історія та сучасні досягнення фізіології в Україні” (Київ,2001); 1-зўїзді токсикологів України (Київ, 2001), 2-й Міжнародній конференції “Мікроциркуляція та її вікові зміни” (Київ, 2002); Всеукраїнській науковій конференції, присвяченій 160-річчю кафедри фізіології людини і тварин Київського національного університету ім.Тараса Шевченка (Київ, 2002).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 31 наукова праця, а саме, 20 статей у фахових виданнях, затверджених ВАК України, деклараційний патент, 10 тез доповідей на наукових конференціях і з'їздах.

Структура та обсяг дисертаційної роботи. Дисертація викладена на 257 сторінках машинописного тексту та складається з вступу, аналітичного огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, чотирьох розділів власних досліджень, обговорення отриманих результатів, висновків, показника літератури, що включає 348 джерел (з них 186 зарубіжних) та додатку. Робота ілюстрована таблицями (48), рисунками (16) та мікрофотографіями (19).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Для вирішення поставлених задач були проведені експериментальні дослідження на 120 білих статевозрілих щурах лінії Wistar масою 180-200 г. обох статей, 140 мурчаках самцях масою 350-450 г, 30 мишах лінії С 57ВІ різної статі масою 20-25 г, крові 30 здорових донорів. Лабораторних тварин утримували в умовах віварію на стандартному раціоні харчування у відповідності з “Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)”.

Об'єктами досліджень були кров, плазма, сироватка крові, пунктат кісткового мозку, сеча експериментальних тварин, а також кров здорових донорів.

При проведенні дослідів in vitro кров здорових донорів і здорових тварин інкубували з комплексом пептидних фрагментів гемоглобіну в дозах 10; 25; 50 мкг на 1 мл крові при 37° С на протязі 60 хвилин. Для вивчення дії комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну на організм здорових тварин пептидні комплекси вводили в дозах 0,1; 1; 10 мг/кг розчиненими у 0,2 мл фізіологічного розчину, внутрішньом'язово на протязі 7 днів.

Для вирішення поставлених задач були відтворені наступні експериментальні моделі.

Гостру форму фенілгідразинової анемії (Дударев В.П.,1988) у щурів викликали трикратним, через добу, підшкірним введенням 2% водного розчину сірчанокислого фенілгідразину (0,25/100 г). Тварини контрольних груп в усіх серіях отримували ін'єкції 0,2 мл 0,9% апірогенного розчину натрію хлориду. Дослідним тваринам в цій серії вводили внутрішньом'язово комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну в дозі 1 мг/кг маси тіла на добу протягом 7 діб з протективною метою і потім ще 7 діб, паралельно з підшкірним введенням 2% водного розчину сірчаного фенілгідразину.

Хронічну інтоксикацію свинцем відтворювали у мурчаків щоденним (27 днів) введенням per os 4% розчину оцтовокислого свинцю з розрахунку 60 мг/кг маси тіла на добу (Архипова О.Г., 1961). За тиждень до останнього введення розчину оцтовокислого свинцю починали експериментальну терапію комплексом пептидних фрагментів гемоглобіну у дозі 1 мг/кг маси тіла на добу

Гостру гіпоплазію кровотворення викликали у щурів введенням вінбластину внутрішньочеревинно в дозі 0,1 мг на 100 г маси тіла одноразово (Торубарова Н.А., 1977). Експериментальну терапію комплексом пептидних фрагментів гемоглобіну проводили протягом 7 діб внутрішньом'язовим введенням в дозі 1 мг/кг маси тіла.

При відтворенні патології променевого ураження в експерименті було використане екстракорпоральне опромінення мурчаків жорсткими гама-променями. Джерелом радіоактивного опромінення був 60Со. Опромінення проводилось на устаткуванні “Агат-Р”. Тварин цієї серії піддавали одноразовому тотальному опроміненню в дозі 4,5 Гр (ЛД 50/30). Дослідження проводили на 8-у добу, в розпал променевої хвороби (Жербин Е.А.,1989). Контрольній групі тварин після одноразового тотального опромінення в дозі 4,5 Гр внутрішньом'язово вводили 0,2 мл 0,9% апірогенного розчину натрію хлориду. Дослідній групі тварин після одноразового тотального опромінення в дозі 4,5 Гр вводили пептидний комплекс, добутий з гемоглобіну, в дозі 1 мг/кг маси тіла на добу у 0,2 мл фізіологічного розчину на протязі 7 днів після опромінення.

Молекулярну масу пептидів, що входять до складу комплексу, аналізували методом колончатої гель-фільтрації (Остерман Л.А., 1985) на акрилексі П-10 (Угорщина), вища межа молекулярної маси молекул, які фільтруються, 10 кD. Вміст білку в пробах визначали за методом Лоурі (Lowry et al., 1951), або за допомогаю біуретової реакції (Меньшиков В.В.,1975). Методом іонної хроматографії було досліджено спектр природного комплексу, вилученого з гемоглобіну (Остерман Л.А.,1985).

Загальний аналіз крові проводили за стандартними методиками (Козинец Г.И.,1998). Концентрацію метгемоглобіну в крові визначали спектрофотометричним методом (по Evelyn et Malloy в модифікації М.С.Кушаковского). Гемолітичну резистентність еритроцитів вивчали за допомогою метода Гительзона И.И. і Терскова И.А. (1959). Глюкозо-6-фосфатдегідрогеназу визначали якісним методом (Меньшиков В.В., 1975).

Морфологічне дослідження клітинних елементів крові проводили після забарвлювання мазків периферійної крові за Романовським-Гімзою. Мазки з пунктату кісткового мозку забарвлювали по Папенгейму.

Враховуючи функціональну єдність основних систем резистентності крові було необхідним дослідити показники перекисного окислення ліпідів (ПОЛ), гемостазу та імунітету.

Вміст первинних продуктів ПОЛ (дієнових конўюгатів) визначали у сироватці крові тварин за методом (Воскресенский О.Н., Туманов В.А., 1982), кінцевих продуктів ПОЛ (ТБК-активних продуктів) в мембранах еритроцитів із використанням спектрофотометра СФ-46 та спонтанний гемоліз еритроцитів за методом (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972). Супероксиддисмутазну активність (СОД; супероксид: супероксидоксидоредуктаза, КФ1.15.1.1.) еритроцитів за методом (Брусов О.С. и др.1976) в модифікації (Моисеев Н.И., 1989). Каталазну активність (перекис водню: перекис водню оксиредуктаза, КФ .11.1.6.) еритроцитів за методом (Архипова О.Г., 1988). Вміст ліпопротеінів низької щильності, ліпопротеінів дуже низької щільності, загальні ліпіди та холестерин сироватки визначали методом (Климова А.Н. и Никульчевой Л.Г., 1984).

Стан системи гемостазу та фібринолізу оцінювали за часом рекальцифікації, тромбіновим, каоліновим та кефаліновим часом (Балуда В.П., 1980), протромбіновим часом за методом Quick A.J. модифікація (Баркаган Л.З., 1993), активованим частково тромбопластиновим часом за метод Biggs R.M. модифікація (Момот А.П. и др.1997). Антикоагуляційну властивість плазми оцінювали за активністю антитромбіну 111 (АТ111) за методом Hensen A. модифікація (Момот А.П., 1995). Вміст фібриногену в плазмі визначали з використанням стандартних наборів реактивів фірми “Simko” (Львів) за методом (Шелепова Т.М.,1989). Фібріноліз еуглобулінів плазми визначали методом (Андреенко В.Г. и др. 1981), етаноловий тест та продукти деградації фібриногену і фібрину оцінювали за методом Вreen F.F. в модифікації (Макарова В.А.,1990).

Імунологічні методи досліджень включали підрахунок Т- і В-лімфоцитів, Т-хелперів, Т-супресорів, О-клітин в крові людей за методикою (Лебедева К.А., Понякина И.Д.,1990), визначення імуноглобулінів А, М, G за методикою (Фримель Г.,1987), НСТ-тесту (Нагоев В.С.,1983) та фагоцитарної активності нейтрофілів за методом (Herscowitz H.B.,1981).

Поверхневі глікопротеїди лейкоцитів визничали по методиці лектин-пероксидазного забарвлення в модифікації І.П.Кайдашева і Н.О.Бобрової (1998). Кров тварин стабілізували гепарином, потім інкубували у вологій камері на протязі 2 годин. Після відмивання в забуференому ізотонічному розчині на фіксовані препарати з клітинами наносили конканавалін А (Кон-А) в дозі 30 мг/мл, який мав вуглеводну специфічність до моносахариду - манози, та продовжували інкубацію 30 хвилин. В якості маркера Кон-А використовували пероксидазу хріна (“Reanal”,Угорщина). Після інкубації активність пероксидази виявляли за допомогою реакції з 3,3-діамінобензидіна тетрагідрохлоридом (“Сhemapol”, Чехія). Ядра дофарбовували в розчині сафраніну. Ступінь експресії манозовміщующих мембранних структур (МВМС) оцінювали за допомогою середнього цитохімічного коефіцієнту для лімфоцитів та нейтрофілів окремо.

Імуногістохімічне дослідження антигенів bcl-2 та р 53 проводили з використанням моноклональних антитіл (Глузман Д.Ф., 1993). Імуногістохімічний метод дозволяє зберегти клітинну структуру і вивчити тонку локалізацію продукту в апоптозних клітинах. Дослідження проводили на парафінових зрізах авідін-біотиновим методом з попереднім видаленням парафіну. Метод заснований на спорідненості вітаміну Н (біотину) до глікопротеіну з молекулярною масою 68 кД - авідіну. В якості перших антитіл використовували моноклональні антитіла до bcl-2 та р 53(“Dako” N-Series Mouse ANTI-HUMAN bcl-2 oncoprotein,124)відповідно. В якості других антитіл використовували біотілильовані антитіла козла до імуноглобулінів миші (“Sigma” Anti-Mouse Immunoglobulins Biotin Conjugate). Для зв'язування біотину використовували треті антитіла ExtrAvidin Peroxidase Conjugate “Sigma”. Для цитохімічного визначення активності пероксидази, зрізи відмивали та інкубували в розчині хромогену діамінобензидіну, дофарбовували ядра 2% розчином метилового зеленого та заключали в бальзам. В контрольних реакціях на зрізи замість перших антитіл наносили Negative Control “Dako”. Результати реакцій оцінювали якісним методом.

Фрагментацію ДНК виявляли шляхом електрофорезу в агаровому гелі. ДНК вилучали за методом Max E.E. (1992). Відмиті клітини кісткового мозку ресуспензували в 1,58 мл ТЕ-буферу 10mM тріс-HCl (рН 8,0/10mM ЕДТА). Зразки заморожували при -20єС, потім розморожували і додавали 20 мкл протеінкінази К (10 мг/мл), інкубували 5 годин при 37°С. Для екстракції зразків додавали 2 мл забуференого фенола, потім центрифугували 5 хвилин при 4000 об/хв. при кімнатній температурі, додавали 5 мл 95% етанолу, перемішували, залишали на 10 хвилин при кімнатній температурі, знову центрифугували 10 хвилин при кімнатній температурі. Ресуспензію проводили в 70% етанолі, центрифугували 5 хвилин, осад висушували сухим повітрям. Для розчинення ДНК додавали 50 мкл ТЕ-буферу і інкубували ніч при 40°С. ДНК розділяли в 1,8% агарозі упродовж 2,5 год при U=5 В/см. Після пофарбування етідіумом бромідом гель фотографували в ультрафіолеті.

Матеріали, отримані під час дослідження, аналізувалися за допомогою персонального комп'ютера IBM Pentium з використанням системи керування базами даних і статиcтичною програмою Microsoft Excel для Windows 95. Проводили обчислення середньої арифметичної, середньоквадратичного відхилення, помилки середньої арифметичної, вірогідність отриманих результатів за коефіцієнтом Ст'юдента, коефіцієнтів кореляції. Зміни показників вважали вірогідними при р<0,05).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

У відповідності з задачами роботи нами було розроблено метод отримання біологічно-активних речовин шляхом протеолітичного гідролізу гемоглобіну. Екстракцію гідролізату проводили органічною галогенвміщуючою кислотою в присутності двовалентних катіонів з наступною преципітацією пептидних речовин та їх очищенням.

Отриманий екстракт давав позитивну біуретову реакцію, мав спектр поглинання в УФ-області з максимумом 210-220 нм, характерний для пептидного зв'язку. Під час гель-хроматографії виявлено чотири основні фракції від 4 до 10 кДа. Аналіз іонообмінної хроматограми виявив шість основних фракцій. Таким чином, розроблений нами метод дає можливість отримати природні пептидні комплекси, достатньо простий, не потребує великих фінансів.

Дослідження in vitro біологічної активності комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну виявило, що він не впливав на процеси перекисного окислення ліпідів, активність фізіологічної антиоксидантної системи, але мав здатність впливати на процеси обмеженого протеолізу в системі зсідання крові. Виявлена нами активація зовнішнього шляху зсідання крові може бути пов'язана з підсиленням дії факторів Ха, Х11а, Х1а, калікреїну, плазміну. Посилення фібринолітичних властивостей плазми після 60 хвилин інкубації крові з комплексом пептидних фрагментів гемоглобіну, можливо, пов'язано з активацією проактиваторів і активаторів плазміногену, які являють собою серинові протеази (Гарська Н.А. і співавт., 2000). Звертає на себе увагу, що пептидний комплекс гемоглобіну володів імуномодулюючими властивостями. Додавання в донорську кров комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну викликало підвищення відсотку В-лімфоцитів ( на 37,0 %, р<0,01), збільшувало кількість теофілін-резистентних клітин ( на 27,0%, р<0,05), а також знижувало ступінь експресії МВМС лімфоцитів та поліморфноядерних лейкоцитів. Відомо, що Кон-А специфічно взаємодіє з вуглеводними залишками (D-манозою) рецепторних білків клітинної поверхні (Луцик А.Д.,1989). Мабуть, пептидний комплекс гемоглобіну конкурентно взаємодіє з лектинами при зв'язуванні з мембраною лімфоцитів та нейтрофілів. Можливо, активні центри пептидного комплексу гемоглобіну блокують частину рецепторів, з якими взаємодіє конканавалін-А.

Надалі нами була досліджена біологічна активність комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну під час введення здоровим тваринам. Внутрішньомўязове введення комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну збільшувало час перебігу процесів деполяризації і реполяризації по шлуночках міокарду та швидкість проведення імпульсів зорової модальності по аферентних системах підкоркових та коркових відділів зорового аналізатора, що свідчило про активацію неспецифічних лімбікоретикулярних аферентних систем.

Введення препарату тваринам не викликало розвитку реакцій гіперчутливості негайного типу, введення разом з повним ад'ювантом Фрейда також практично не викликало сенсибілізації. Отже, пептидний комплекс гемоглобіну виявляв слабкі антигенні властивості.

В периферичній крові найбільші зміни нами відмічено у тварин, яким вводили комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну в дозі 1 мг/кг: підвищення кількості гемоглобіну на 30,0% (р<0,01), поліморфноядерних лейкоцитів на 37,0% (р<0,05), фагоцитарної активності нейтрофілів на 48,0% (р<0,01), зниження експресії манозовміщуючих мембранних структур в лімфоцитах і нейтрофілах у 2,6 рази (р<0,05) та 1,7 рази (р<0,05) відповідно. В мієлограмі відмічено посилення розвитку еритробластних елементів на стадії пронормобластів, базофільних та поліхроматофільних нормобластів, стимуляція процесів проліферації клітин гранулоцитарного ряду, переважно мієлобластів та промієлоцитів, гальмування мітозу на стадії мієлоцитів з послідуючим пригніченням процесів дозрівання паличкоядерних та сегментоядерних нейтрофілів (рис.1).

Звертає на себе увагу стан вільнорадикального окислення у тварин, яким вводили комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну. Нами відмічено зростання концентрації головного антиоксиданту плазми церулоплазміну у 1,4 рази (р<0,01). Аналіз показників коагуляційної ланки плазми крові показав розвиток гіпокоагуляції при введенні пептиду в дозі 1 мг/кг.

Наведені вище спостереження спонукали нас змоделювати процес пошкодження кісткового мозку та системи крові взагалі і дослідити вплив комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну під час патологічних станів.

Відповідно з загальнобіологічним законом регенерації тканин, який був відкритий акад.О.О.Богомольцем, стереотипною реакцією адаптації системи крові у відповідь на дію екстремальних факторів є посилення руйнування еритроцитів напередодні активації анаболічних процесів не тільки еритроїдної ланки кісткового мозку, а й інших тканин (Козинец Г.И. и соавт., 1997). Нами була відтворена гемолітична анемія внаслідок інтоксикації сірчанокислим фенілгідразином, яка супроводжувалась внутрішньосудинним гемолізом.

Дія хімічного окислювача фенілгідразину приводила до руйнування зрілих еритроцитів, анізо-пойкілоцитозу, мікроцитозу та порушення гемоглобінсинтетичних процесів в еритроні. В кровотік надходили якісно неповноцінні еритроцити, які характеризувалися зниженим енергетичним потенціалом (зменшення вмісту глюкозо-6-фосфатдегідрогенази в еритроцитах). Відомо, що дефіцит глюкозо-6-фосфатдегідрогенази приводить до недостатності утворення НАДФН2, який потрібен для відновлення глютатіону (Мещинен І.Ф. і співавт., 1994), внаслідок чого еритроцити втрачають здатність протистояти токсичній дії фенілгідразину.

Підвищення в сироватці крові контрольних тварин вмісту загального білірубіну (за рахунок концентрації непрямого білірубіну) свідчило на користь посиленного гемолізу еритроцитів (Давыдов А.А. и соавт., 1998). Спостерігався прямий кореляційний звўязок концентрації загального білірубіну та концентрації церулоплазміну (r=0,87; p<0,05), концентрації непрямого білірубіну і приросту малонового діальдегіду під час інкубації еритроцитів (r=0,89; p<0,05). Підтверженням стимулюючого впливу продуктів розпаду еритроцитів на еритропоез є посилення еритронормобластної реакції з підвищенням числа поліхроматофільних нормобластів у 2,8 рази (р<0,01) у контрольної групи тварин. В мієлоідному ростку зменшувався відсоток мієлобластів у 2,7 рази (р<0,05), паличкоядерних нейтрофілів у 1,3 рази (р<0,05), тоді як відсоток мієлоцитів вірогідно зростав у 1,2 рази (р<0,05). Тобто гальмування мітозу йшло на стадії переходу мієлоцитів у метамієлоцити, з послідуючим інгібіруванням дозрівання паличкоядерних нейтрофілів і наступним зниженням фагоцитарної активності нейтрофілів в периферичній крові у 1,2 рази (р<0,05). Встановлені кореляції між здатністю поліморфноядерних лейкоцитів відновлювати нітросиній тетразолій і початковою концентрацією продуктів, які реагують з тіобарбітуровою кислотою (r=0,95; p<0,05).

Отруєння сірчанокислим фенілгідразином приводило до активації перекисного окислення ліпідів, в тому числі і ліпідів мембран еритроцитів з накопиченням МДА та зниженням активності супероксиддисмутази у 1,5 рази (р<0,01).

Використання Кон-А, лектину, реагуючого з моносахаридним кінцевим залишком D-манози, виявило вірогідне зниження кількості місць його зв'язування у лімфоцитах та нейтрофілах контрольної групи тварин. Привертає увагу той факт, що лімфоцити і нейтрофіли відповідали на стимули ідентично. Тобто введення гемолітичного токсину приводило до зменшення кількості рецепторів до лектину на поверхні лімфоцитів та нейтрофілів.

В системі зсідання крові виявлені зміни, які вказували на наявність процесу гіперкоагуляції (скорочення часу рекальцифікації у 1,2 рази (р<0,05), тромбінового часу у 1,3 рази (р<0,05). Посилення процесів зсідання крові можливо і при активації прокоагулянтних властивостей еритроцитів (Мищенко В.П., 1998). І.Я.Ашкіназі (1977) показано залежність включення тромбопластинового фактору еритроцитів у процес гемокоагуляції від змін динамічних властивостей мембрани. Розглянуті вище дослідження показали, що зміни еритроцитів при дії сірчанокислого фенілгідразину зачіпають структурну перебудову мембрани клітин, відбуваються конформаційні зміни мембранних молекул, порушення роботи ферментних систем еритроцитів, що вказує на причетність еритроцитів до процесів зсідання крові.

Для корекції змін системи крові, викликаної отруєнням сірчанокислим фенілгідразином, дослідним тваринам вводили внутрішньом'язово комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну. Процеси синтезу гемоглобіну у дослідних тварин залишались на рівні контрольної групи тварин, але відновлення вмісту глюкозо-6-фосфатдегідрогенази вказувало на нормалізацію енергетичного потенціалу еритроцитів.

Введення комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну приводило до зменшення кількості мікросфероцитів, зростання відсотку нормохромних еритроцитів, зниження кількості ретикулоцитів у периферичній крові у 1,5 рази (р<0,05).

В мієлоідному ряді червоного кісткового мозку під впливом комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну зменшувався відсоток промієлоцитів(на 41,7% р<0,05), мієлоцитів(на 39,7% р< 0,05), тоді як відсоток метамієлоцитів зростав у 1,6 рази (р<0,05). У крові кількість паличкоядерних нейтрофілів зменшувалась на 50,0% (р<0,05), а кількість лімфоцитів зростала на 17,0% (р<0,05). Таким чином, гальмування мітозу проходило на стадії метамієлоцитів з наступним порушенням спеціалізації та диференціювання нейтрофілів.

Комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну знижував значення НСТ-тесту і нормалізував величини фагоцитарного індексу нейтрофілів (62,6±1,54% у дослідних тварин, проти 55,8±2,69% у контрольних тварин, р<0,05). Дослідження взаємодії регуляторного комплексу з рецепторними білками клітинної поверхні лейкоцитів показало, що його застосування приводило до зниження експресії манозовміщуючих мембранних структур лімфоцитів на 57,4% (р<0,05) і поліморфноядерних лейкоцитів на 24,8 % (р<0,01) (рис.2).

Пептидний комплекс гемоглобіну гальмував розвиток гіперкоагуляції. Про це свідчило подовження часу рекальцифікації в 1,2 рази (р<0,05), тромбінового часу в 1,5 рази (р<0,05). Можливо, пептидні фрагменти гемоглобіну блокують реакції обмеженого протеолізу та запобігають перетворенню проензимів в ензими і тим самим гальмують зовнішній шлях зсідання крові.

Враховуючи стимулюючу дію комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну на репарацію крові і його вплив на процеси проліферації і диференціювання клітин кісткового мозку, нам було цікаво відтворити експериментальну модель, при якій відбувалось пошкодження синтезу порфіринів і гему. Нами була обрана модель хронічної інтоксикації солями свинцю. Солі свинцю, як і деяких інших металів, відносяться до канцерогенних і токсичних речовин. Зі стрес-індукованою дією свинцю пов'язують експресію генів металотіонеінів, які можуть запобігати як некрозу, так і апоптозу (Кудрин А.В., 1998).

Проведені нами імуноцитохімічні дослідження дали змогу встановити особливості експресії і локалізації в тканинах кісткового мозку біомолекулярних маркерів апоптозу. Рівень експресії всl-2 в клітинах кісткового мозку тварин, що отримували розчин свинцю, був нижче на 16,4% (р<0,05), а експресія білка р53 зростала на 61,4% (р<0,05) відносно інтактної групи тварин. Відомо, що продукція клітинами організму природного типу білка р53 є стимулятором “програмованої смерті” (Белушкина Н.Н. и соавт., 2001). За даними А.В.Лихтенштейн (1998), пошкодження ДНК призводить до збільшення вмісту р53 (головним чином, за рахунок посттранскрипційної регуляції) і індукції апоптозу. За умов ушкодження солями свинцю нами були визначені зміни в структурі ДНК, нуклеосомній організації хроматину. Виявлене методом електрофорезу збільшення фрагментації ДНК може свідчити про те, що іони свинцю сприяють міжнуклеосомному розщепленню ДНК клітин кісткового мозку.

Наші дослідження підтвердили, що серед патогенетичних механізмів свинцевої інтоксикації провідне місце належить порушенням біосинтезу порфіринів та гема (нами виявлено збільшення вмісту копропорфирину в сечі тварин в 3,7 рази (р<0,05), рівня метгемоглобіну в еритроцитах в 1,6 рази (р<0,05). Порушення утилізації заліза приводило до появи сидероцитів та еритроцитів з базофільною зернистістю. Імовірно, при дефіциті заліза в результаті зниження активності залізозалежних ферментів, які забезпечують антиоксидантний захист гемоглобіну, гем виявляється недостатньо захищеним, з'являються умови для впливу ряду окислювачів на гемове залізо та його перетворення з двох у тривалентний стан. Поряд зі збільшенням вмісту метгемоглобіну нами відмічено зниження кількості гемоглобіну в еритроцитах тварин після хронічного впливу свинцю. Певно, дефект синтезу гема йде на етапі приєднання заліза до протопорфірину, наслідком чого є накопичення невикористаного заліза в цитоплазмі еритробластів (Мошинська О.В., 1997). В кістковому мозку ми відмітили гальмування мітозу базофільних та поліхроматофільних нормобластів. В мієлоїдному ростку відмічено порушення процесів спеціалізації та диференціювання паличкоядерних та сегментоядерних нейтрофілів з наступним гальмуванням дозрівання паличкоядерних форм у сегментоядерні.

Дослідження останніх років у галузі біохімічної токсикології дозволили зробити висновок, що в основі розвитку молекулярної патології клітини при дії ксенобіотиків і важких металів, зокрема свинцю, лежить утворення вільних радикалів різної хімічної природи (Губський Ю.І., 1993, 1999). Вільно-радикальні продукти біотрансформації ксенобіотика викликають мутагенні та інші генотоксичні ефекти та суттєво впливають на процеси експресії регуляторних генів, що було нами підтверджено збільшенням деградації ядерної ДНК клітин кісткового мозку.

Свинцева інтоксикація сприяє пошкодженню ліпідного матриксу біомембран за рахунок утворення перекисних молекулярних продуктів поліненасичених ацилів (нами відмічено підвищення приросту МДА у 3,8 рази, р<0,01 за час інкубації еритроцитів в залізо-аскорбатному буфері.). Позитивна кореляційна залежність встановлена між рівнем накопичення МДА за час інкубації еритроцитів та кількістю сидероцитів у крові (r=0,96; p<0,05). Крім того, встановлені кореляції між кількістю лімфоцитів у кістковому мозку (r=0,93; p<0,05) та накопиченням МДА, перекисною резистентністю еритроцитів та швидкістю їх осідання (r=0,89;p<0,05). Наступним джерелом активних форм кисню в еритроцитах є продукція перекису водню супероксиддисмутазою в умовах підвищення активності цього субстратіндуцибельного ферменту (Цебржинский О.И.,1992) при зниженні у 1,4 рази (р<0,05) активності гемвмісткої каталази.

При свинцевій інтоксикації нами виявлено зниження фагоцитарної активності у 1,5 рази (р<0,01), що вказує на функціональну недостатність нейтрофілів. Послаблення прояву дихального вибуху нейтрофілів можливо пов'язати з недостатністю активності цитохрому b 245 (НАДФН-оксидази) внаслідок гальмування іоном двохвалентного свинцю синтезу гема. Таким чином, при свинцевій інтоксикації оксидативна активність нейтрофілів не є джерелом активних форм кисню, що ініціює пероксидацію у крові.

Порушення початкової асиметрії фосфоліпідного складу клітинних мембран, придбання ними гетерофазної структури перетворює їх в матриці для активації факторів зсідання крові. Нами відмічена гіперкоагулемічна реакція після хронічного введення солей свинцю. Скорочення часу рекальціфікації у 1,2 рази, (р<0,05), протромбінового часу у 1,3 рази, (р<0,05), що можливо, пов'язано з посиленням активності VII-го плазменного фактору.

Внутрішньомўязове введення тваринам комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну за умов розвитку експериментальної свинцевої інтоксикації прискорювало відновлення морфологічної картини крові: були відсутні еритроцити з базофільною зернистістю, нормалізувалась кількість сидероцитів (0,36±0,07% у дослідних тварин проти 3,90±0,07% у контрольних тварин, р<0,01). Застосування комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну сприяло збільшенню швидкості оновлення еритроідних елементів кісткового мозку з посиленим виходом в кровоток більш стійких еритроцитів, на що вказували дані еритрограми (рис.3).

Збільшення молодих клітин еритроїдного ряду може свідчити про наявність сильної стимуляції процесів проліферації клітин і вказувати на посилення еритропоезу. Так, у червоному кістковому мозку у 8,4 рази (р<0,01) зростав відсоток базофільних та у 32,2 рази (р<0,01) поліхроматофільних нормобластів, на 40,0% (р<0,01) знижувався відсоток паличкоядерних нейтрофілів. Тобто затримка лейкопоезу проходила на рівні паличкоядерних форм, тоді як вихід сегментоядерних форм нейтрофілів у кров збільшувався.

Застосування комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну приводило до помітного зниження числа апоптозних клітин та зменшення олігонуклеосомної фрагментації ДНК клітин кісткового мозку, наслідком чого може бути покращення гематологічних показників, так як гемопоетичні клітини мають змогу зберігати нормальну тривалість життя. У тварин, яким поряд з розчином оцтовокислого свинцю вводили комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну, відносно контролю збільшився відсоток клітин з маркером апоптозу bcl-2 на 11,88% (р<0,01), а вміст онкопротеїну р53 в ядрах клітин кісткового мозку зменшився на 20,6% (р<0,01). Посилена експресія всl-2 здатна усувати загибель клітин шляхом апоптозу і модулювати р53-індукований апоптоз (Ревской С.Ю., 2001). Можливо, пептидний комплекс гемоглобіну є сигналом, який супресує апоптотичні зміни в клітинах кісткового мозку. Ці зміни можуть проходити за допомогою протеінів-посередників, які передають сигнал на цитоплазматичний каспазний каскад. Не виключено, що комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну, блокує протеазний каскад, гальмує активацію мітохондрій та підвищення концентрації Са++ в клітині (підвищена експресія bсl-2 приводить до усунення градуальної втрати Са++ з ретикулума і накопичення його в мітохондріях), накопичення супероксид-аніонів та ферментів, які приймають участь в процесі апоптозу. В свою чергу, комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну, можливо, запобігав активації ендонуклеаз, які відповідальні за розщеплення ядерної ДНК.

Подальші дослідження продемонстрували, що пептидний комплекс, отриманий шляхом ферментативного гідролізу гемоглобіну, сприяв нормалізації фагоцитарної активності нейтрофілів (39,5±2,02 % у дослідних тварин проти 26,25±0,76% у контрольних тварин, р<0,01) та активності супероксиддисмутази еритроцитів. Зниження активності продуктів, що реагують з тіобарбітуровою кислотою, до інкубації крові вказують на ослаблення пероксидації, мабуть за рахунок молодих та стабільних еритроцитів. Спостерігався зворотний взаємозвўязок між кількістю еритробластів та початковою концентрацією продуктів, що реагують з тіобарбітуровою кислотою (r=-0,95; p<0,05), активністю каталази еритроцитів та кількістю сидероцитів в периферичній крові (r=-0,93; p<0,05). В свою чергу, запобігання пошкодження ліпідних компонентів мембран може бути пов'язано з підвищенням експресії всl-2 у тварин, які одержували комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну. Sandau K.B. (2000) показано, що надекспресія гену всl-2 повністю гальмує пероксидацію ліпідів та процеси фрагментації ДНК. Отже, комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну під час введення тваринам за умов свинцевої інтоксикації прискорював розвиток компенсаційно-пристосувальних реакцій в периферичній крові, регенерацію еритроїдних елементів кісткового мозку, сприяв терапевтичному пригніченню апоптозу.

Враховуючи здатність комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну впливати на процеси проліферації, диференціювання, механізми клітинної смерті, нормалізацію фагоцитарної активності нейтрофілів, ми вирішили оцінити його радіопротекторний ефект на систему крові в умовах екстракорпорального гама-опромінення тварин.

Нами показано, що кістковий мозок тварин після гострого сублетального опромінення на 8-му добу знаходився в стані аплазії. Клітинний склад був представлений, головним чином, стромальними елементами, плазматичними клітинами і поодинокими полінуклеарними лейкоцитами. Спустошення кісткового мозку супроводжувалось некробіозом кровотворних елементів, який, як дозволили встановити використані нами методи, протікав шляхом апоптозу. Важливим патологічним феноменом в картині променевого ураження кісткового мозку є пригнічення мітотичної активності мієлокаріоцитів за рахунок майже повного зникнення мієлобластів, мієлоцитів (1,8±0,58% у контрольних тварин проти 11,2±0,86 % у інтактних тварин,