КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

АНДРІЙЧУК ОЛЕНА МИКОЛАЇВНА

УДК 578.81

БІОЛОГІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА ФАГІВ ФІТОПАТОГЕННИХ БАКТЕРІЙ РОДІВ PSEUDOMONAS ТА XANTHOMONAS, ВИДІЛЕНИХ ІЗ АГРОЦЕНОЗІВ УКРАЇНИ

03.00.06 – вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ – 2003

Дисертація є рукописом.

Робота виконана на кафедрі вірусології біологічного факультету Київського

національного університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник: доктор біологічних наук, академік УААН та ВШ,

професор Бойко Анатолій Леонідович, Київський національний

університет імені Тараса Шевченка

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Співак Микола Якович,

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАНУ,

завідувач відділом проблем інтерферону та імуномодуляторів

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Швед Анатолій Давидович,

Інститут молекулярної біології і генетики

НАН України, завідувач відділом молекулярної вірусології

Провідна установа: Інститут епідеміології та інфекційних хвороб імені Л.В.

Громашевського АМН України, м. Київ

Захист дисертації відбудеться „10” лютого 2004 року о 16 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою:

03127, м. Київ, проспект Глушкова, 2, корп. 12, біологічний факультет.

Поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 64.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий „ 30” грудня 2003 року.

Вчений секретар

спеціалізовано вченої ради Молчанець О.В.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Бактеріофаги є широко розповсюдженими та важливими агентами регулювання чисельності бактеріальної мікрофлори в природі. При цьому, вони забезпечують передачу генетичної інформації між бактеріями та вступають у коеволюційні відносини з мікроорганізмами як їх антагоністи. Відповідно до своєї природи, фаги найбільш ефективно виявляються в умовах високої щільності бактерій з активним метаболізмом. Однією із таких систем є фітоценози, які, як відомо, підтримують широку розмаїтість бактеріальних видів. Значну питому вагу в яких складають фітопатогени родів Pseudomonas та Xanthomonas, які є збудниками багатьох захворювань сільськогосподарських рослин. Це зумовлює важливість дослідження поширення та регулюючого впливу на них фагів. Незважаючи на велике число досліджень, присвячених фагам, їх екологія в природі вивчена недостатньо. На відміну від лабораторних умов, де традиційно досліджують чисті лінії, в природі, мікробні популяції складаються із численних різновидностей фагів та чутливих бактерій, які взаємодіють між собою. При цьому, згідно модульної теорії еволюції, між фагами відбувається обмін блоками генетичної інформації. На основі чого висунуто припущення (Hendrix R.W. at al. 1999), що дволанцюгові ДНК фагів і геноми профагів являють собою мозаїки певного спільного генофонду, в рамках якого здійснюється горизонтальний обмін.

Процеси взаємовпливу популяцій фагів та бактерій, що відбуваються в природі не можуть бути обмежені рамками певної таксономічної групи. У зв’язку з чим, дослідження фагів активних по відношенню до різних таксонів (патовари одного виду, види одного роду, певні роди) бактерій, що зустрічаються в спільних біоценозах є актуальною задачею. Вирішення якої дозволить підійти до більш повного розуміння процесів еволюції та механізмів збереження популяцій фагів в природних умовах.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалася в межах науково – дослідної роботи кафедри вірусології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка за темами: “Дослідити закономірності патогенезу фітовірусних інфекцій з метою раціонального використання природних ресурсів”, держбюджетна тема 97089 (номер державної реєстрації 0197U003157) та “Моніторинг збудників вірусних інфекцій з метою розробки наукових основ екологічно чистих технологій вирощування сільськогосподарських культур”, держбюджетна тема 01БФ036 – 01 (номер державної реєстрації 0101U005076).

Мета та завдання досліджень. Виділити ізоляти фагів із агроценозів Київської, Вінницької та Чернігівської областей. Дослідити фаги, що зустрічаються в спільних агроценозах активних по відношенню до бактерій різних таксонів. Вивчити біологічні та фізико-хімічні властивості фагів родів Pseudomonas, Xanthomonas, Erwinia. Порівняти виділені ізоляти фагів між собою за основними характеристиками. Вдосконалити існуючі та розробити власні модифікації методів дослідження фагів.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

1. Провести виділення ізолятів фагів із агроценозів Київської, Вінницької та Чернігівської областей до фітопатогенних бактерій родів Pseudomonas, Xanthomonas, Erwinia. Вивчити основні біологічні властивості виділених фагів: спектр літичної активності, ефективність репродукції на чутливих штамах бактерій.

2. Дослідити динаміку чисельності та різноманіття фагів по відношенню до 13 штамів бактерій родів Pseudomonas, Xanthomonas, Erwinia.

3. Визначити наявність антигенної спорідненості фагів різних таксономічних груп в гомо- та гетерологічних системах.

4. Дослідити морфолого – структурну організацію віріонів методом електронної мікроскопії. Визначити та порівняти поліпептидний склад фагів. Виявити особливості ДНК досліджуваних ізолятів за допомогою методу рестрикційного аналізу.

5. На основі отриманих даних провести порівняльну характеристику досліджуваних фагів, що мають спільні ареали поширення, але відрізняються за своєю специфічністю.

Об’єкт дослідження - ізоляти фагів фітопатогенних бактерій.

Предмет дослідження – біологічні та фізико-хімічні властивості ізолятів бактеріофагів фітопатогенних бактерій.

Методи дослідження. Для вивчення та порівняння фагів використовували очистку вірусів методом диференційного центрифугування. Біологічну активність фагів визначали методом двошарового агару. Виявлення антигенної спорідненості ізолятів проводили із застосуванням непрямого методу ІФА. Морфолого – структурну організацію фагів вивчали за допомогою електронної мікроскопії. Капсидні білки виділених фагів досліджували методом електрофорезу в ПААГ. Виділення ДНК проводили за модифікованим методом розробленим в нашій лабораторії. Порівняння особливостей структури ДНК фагів проводили з використанням специфічних ендонуклеаз рестрикції EcoR I, EcoR V, Hind III (Serva).

Наукова новизна одержаних результатів. Із агроценозів України виділено ізоляти фагів фітопатогенних бактерій Pseudomonas, Xanthomonas. Встановлена біологічна активність та ефективність репродукції 31 ізоляту фагів до 13 бактеріальних культур. Показано, що в результаті пасирування 23% виділених із природи фагів втратили літичну активність. Встановлено, що в межах груп фаги виявляють подібні властивості. Досліджена динаміка чисельності фагів до тринадцяти бактеріальних культур (родів Pseudomonas, Xanthomonas, Erwinia) на протязі 14 місяців. Отримані результати, вперше демонструють якісний та кількісний склад популяцій фагів фітопатогенних бактерій в динаміці, які мають спільні ареали поширення.

Визначено білковий склад фагів, який представлений набором мінорних і мажорних поліпептидів та їх молекулярні маси.

Вивчено морфолого - структурну організацію 13 фагів. Вперше проведено вивчення серологічної спорідненості ізолятів фагів в гомо- та гетерологічній системах. Встановлено високу ступінь спорідненості фагів в межах груп та наявність спільних антигенних детермінант між групами.

Запропоновано модифікований метод, який дозволяє швидко та ефективно виділяти ДНК фагів для великого числа проб без застосування фенолу. Встановлено, що виділені ДНК представляють собою нативні двониткові нефрагментовані ДНК. Порівняння особливостей структури ДНК фагів проводили з використанням специфічних ендонуклеаз рестрикції EcoR I, EcoR V, Hind III (Serva). Встановлено, що за чутливістю до цих ферментів їх геноми мають індивідуальні особливості.

На основі аналізу поліпептидного складу, чутливості нуклеїнових кислот до специфічних ендонуклеаз, числа фрагментів після їх гідролізу, характеру електрофоретичної рухливості, результатів ІФА, можна судити про наявність ділянок спільної гомології в геномах вивчених фагів, що виділені із агроценозів України.

В результаті роботи виділено понад 400 зразків ізолятів фагів до фітопатогенних бактерій: P. syringae pv. aptata 185, P. savastanoi pv. phaseolicola 4013, P. syringae pv. aptata 8545, P. syringae pv. tabaci 8646, P. viridiflava 8867, P. savastanoi pv. phaseolicola 4228, P. syringae pv. tabaci 223, X. axonopodis pv. beticola 7325, P. syringae pv. lachrymans 7591, P. syringae pv. atrofaciens 1025, P. clororophis 8612, P. alliicola 8494, P. syringae pv. syringae 8653, E. carotovora 216 на основі яких створено лабораторну колекцію.

Практичне значення роботи. Проведено аналіз поширення фагів фітопатогенних бактерій родів Pseudomonas, Xanthomonas в агроценозах України. Створена лабораторна колекція фагів, яка нараховує понад 400 ізолятів. Досліджені біологічні властивості та ефективність репродукції 31 ізоляту фагів до бактерій різних таксонів. Проведено порівняльне вивчення властивостей тринадцяти фагів: фаги 223 1/1, 223 10/1, 223 14/1, 223 17/1, 7591 9/1, 7591 1/1, 7591 14/1 - чутлива культура Pseudomonas syringae pv. tabaci 223; фаги 7325 10/1, 7325 1/1, 7325 14/2, 7325 17/1 - чутлива культура Xanthomonas аxonopodis pv. beticola 7325; фаги 1025/6, 1025/К - чутлива культура Pseudomonas syringae pv. atrofаciens 1025.

Розроблена модифікація методу виділення нативної ДНК фагів. Результати досліджень по вивченню чисельності та специфічності фагів закладають основу для оцінки поширення бактерій родів Xanthomonas та Pseudomonas в природі.

На основі створеної лабораторної колекції фагів плануються їх практичне використання для фагодіагностики патогенів на сільськогосподарських угіддях України. Проведені дослідження по виявленню фагів дозволяють використовувати отримані результати як непрямий показник фітосанітарного стану агроценозів. На основі досліджень створена база даних, що може бути основою для розробки математичної моделі зміни чисельності популяцій фагів фітопатогенних бактерій в природі.

Виділені бактеріофаги можуть бути перспективними для розробки біологічних засобів захисту рослин від фітопатогенних бактерій .

Результати досліджень запроваджено у навчальний процес на кафедрі вірусології Київського університету імені Тараса Шевченка.

Особистий внесок здобувача. Інформаційний пошук, опрацювання літературних джерел, отримання експериментальних даних, їх узагальнення автором здійснено особисто. Автором проведено лабораторно – польові дослідження, які включали відбір матеріалу та його подальшу обробку. Планування основних напрямків досліджень дисертаційної роботи, підготовку публікацій за отриманими результатами, а також представлення результатів на наукових конференціях здійснено за участю наукового керівника. Розробку схеми експерименту, налагодження методів проводив разом з к.б.н. Л.І.Семчук. Частину досліджень проведено за сприяння співробітників кафедри вірусології біологічного факультету Київського національного факультету імені Тараса Шевченка, які є співавторами опублікованих робіт.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, які викладено в дисертаційній роботі, були представлені на:

III Міжнародній конференції “Біоресурси та віруси”, Київ, Україна 2001 рік;

Міжнародній конференції “Антропогенно – змінене середовище: Ризики для здоров’я населення та Екологічних систем”, Київ, Україна, 2003 рік;

Науковому семінарі кафедри вірусології Київського національного університету імені Тараса Шевченка (2003 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 11 наукових праць, з яких 8 статей у наукових виданнях, 3 - матеріали конференцій. Права співавторів не порушено.

Структура та обсяг роботи. Загальний обсяг роботи становить 147 сторінок машинописного тексту, в який входять: вступ, огляд літератури, матеріали та методи досліджень, результати власних досліджень (3 розділи), узагальнення, висновки, список використаних джерел. Список літератури включає 181 найменування, з них 129 іноземні. Робота містить 15 таблиць та 22 рисунка.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. На основі робіт останніх років вітчизняних та зарубіжних авторів висвітлено сучасні відомості про біологічні властивості, генетичні характеристики популяцій, екологію, еволюцію та виживання бактеріофагів у природі.

Матеріали та методи досліджень. Об’єктом дослідження були ізоляти фагів виділені із агроценозів Київської, Вінницької та Чернігівської областей України. В роботі використовували культури фітопатогенних бактерій, що були отримані з колекції музею відділу фітопатогенних бактерій Інституту мікробіології та вірусології ім. акад. Д.К.Заболотного НАН України, та люб'язно надані зав. відділом фітопатогенних бактерій проф. Гвоздяком Р. І. (штами: P. syringae pv. aptata 185, P. savastanoi pv. phaseolicola 4013, P. syringae pv. aptata 8545, P. syringae pv. tabaci 8646, P. viridiflava 8867, P. savastanoi pv. phaseolicola 4228, P. syringae pv. tabaci 223, X. axonopodis pv. beticola 7325, P. syringae pv. lachrymans 7591, P. syringae pv. atrofaciens 1025, P. clororophis 8612, P. alliicola 8494, P. syringae pv. syringae 8653, E. carotovora 216).

Фаги були отримані методом прямого виділення з листків чи прикореневої шийки цукрового буряку (Beta vulgaris), що росли на полі, або шляхом УФ-індукції лізогенної мікрофлори висіяної від вказаних рослин. Для роботи використовували 13 штамів культур, вказаних вище, в логарифмічній фазі росту. Бактеріофаги титрували методом двошарового агару (Адамс, 1961). Чисті лінії фагів одержували з окремих негативних колоній. Для кожної лінії було проведено не менше 6 пасажів із окремих колоній фагів на чутливих штамах. Концентрацію визначали в плямоутворюючих одиницях на мл (ПУО/мл).

З метою одержання концентрованих та очищених препаратів використовували методи:

·

·

Вивчення біологічних властивостей бактеріофагів проводили з використанням стандартних методів (Адамс, 1961; Міллер, 1976). Коло бактерій – господарів для фагів визначали з використанням набору вищевказаних штамів.

Концентрування фагів проводили методами високошвидкісного центрифугування при 90000g на протязі 2 годин, або висолюванням сірчанокислим амонієм, шляхом доведенням солі у вірусній суспензії до концентрації 50% від насичення та центрифугуванням при 8000 g. Подальша очистка вірусу проводилась методом диференційного центрифугування. Контроль чистоти виділених вірусних препаратів визначали спектрофотометричним, електрофоретичним та електронномікроскопічним методами. Електронномікроскопічний аналіз зразків проводили за загальноприйнятими методиками (Кисельов, 1965).

Електрофоретичне дослідження поліпептидного складу білків фагів проводили за методом Леммлі з використанням 14% розділяючого та 5% концентруючого поліакриламідного гелю з подальшим фарбуванням кумасі блакитним (Laemmli, 1973). Визначення молекулярних мас білків здійснювали за допомогою використання набору маркерних білків LMW (Serva) (кДа): 94; 67; 43; 30; 20,1; 14,4. Для проведення порівняння ізолятів фагів було здійснено рестрикційний аналіз їх ДНК з використанням ферментів EcoR I, EcoR V, Hind III (Serva) за загальноприйнятою методикою (Маніатіс, 1984). Молекулярну масу нуклеїнових кислот розраховували по відносній електрофоретичній рухливості стандартних фрагментів ДНК фагу оброблених ферментами Hind III + EcoR V, EcoR І. Для імунологічних методів дослідження вірусів отримували вірусспецифічні мишині поліклональні сироватки. Серологічну спорідненість вивчали методом непрямого імуноферментного аналізу.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Характеристика біологічних властивостей виділених ізолятів фагів Pseudomonas, Xanthomonas. Досліджували вірулентні та помірні фаги, виділенні із агроценозів Київської, Вінницької та Чернігівської областей України (табл.1). Вивчали біологічні властивості фагів.

Таблиця 1

Місце та методи виділення досліджуваних бактеріофагів

Примітка * - ізоляти фагів, що були відібрані для більш детального дослідження.

Вивчення спектру літичної активності фагів проводили на вищевказаних штамах бактерій. Показано, що фаги мають різний спектр літичної активності від широкого до вузькоспецифічного. Фаги 1025/6 та 1025/К, крім фітопатогенних бактерій роду Pseudomonas лізували також бактерії роду Xanthomonas. Отримані результати вказують на те, що бактеріофаги, які мають широке коло хазяїнів є досить поширені. При порівнянні титрів фагів на використаних індикаторних культурах звертала на себе увагу наступна закономірність: фаги, що пройшли лабораторні пасажі мали максимальну ефективність репродукції на власній індикаторній культурі (табл.2), що не завжди було характерно для первинновиділених ізолятів, що не проходили пасажів.

Таблиця 2

Ефективність репродукції ізолятів фагів, що досліджувались в лабораторії

До індикаторних культур E. carotovora 216, P. syringae pv. tabaci 8646, P. chlororophis 8612, P. savastanoi pv. phaseolicola 4228, P. viridiflava 8867, P. syringae pv. syringaе 8653 літична активність не була виявлена до жодного із досліджуваних ізолятів фагів.

Дослідження ефективності репродукції первинних ізолятів на різних бактеріях дозволило виявити їх особливості (табл. 3). При виділені із природи була показана літична активність цих фагів до широкого кола випробуваних штамів бактерій Pseudomonas та Xanthomonas. Для 23% ізолятів при спробі проведення другого та подальших пасажів спостерігалась інактивація їх біологічної активності. Фаги не завжди мали максимальні значення титрів при використанні штамів до яких були виділені. Зокрема це було показано для фагів 8653, 8646 (1), 8646 (2), 8867 (табл.3). Виявлені закономірності дозволяють припустити існування механізмів адаптації фагів до різних груп бактерій в біоценозах.

Таблиця 3

Спектр літичної активності та ефективність репродукції ізолятів фагів на фітопатогенних штамах Pseudomonas та Xanthomonas

Динаміка чисельності фагів виділених із дослідного агроценозу Київської області. Фагова інфекція в агроценозах регулює чисельністю бактерій та сприяє трансферу генів серед бактерій в біосфері. Тому, для повної оцінки значення фагів в природі важливим завданням було дослідити динаміку їх популяцій.

Досліджували in situ динаміку популяцій фагів, які знаходились на поверхні листків та коренів цукрового буряку (Beta vulgaris) на протязі 14 місяців. Щомісячні виділення фагів та лізогенних культур проводили із дослідного агроценозу Київської області. Влітку, проби відбирали з листків та коренів, взимку - із коренів цукрового буряку, що зберігались в овочесховищах. Чисельність визначали за показниками титрів, окремо для вірулентних та помірних фагів рис. 1.

а б

Рис. 1. Динаміка титрів а- помірних та б- вірулентних бактеріофагів ви-

ділених з рослин цукрового буряку на індикаторних культурах

Індикаторні культури: 1- X. axonopodis pv. beticola 7325; 2 - P. syringae pv. tabaci 223, 3 -E. carotovora 216, 4 -P. syringae pv. аtrofaciens 1025, 5- P. syringae pv. aptata 185; 6- P. syringae pv. tabaci 8646, 7-P. clororophis 8612,8- P. allicola 8494, 9-P. savastanoi pv. phaseolicola 4228, 10- P. savastanoi pv. phaseolicola 4013, 11- P. viridiflava 8867, 12 - P. syringae pv. aptata 8545, 13 - P. syringae pv. syringae 8653

Як видно з рис. 1а інфекційні титри помірних бактеріофагів на протязі періоду досліджень для всіх чутливих культур, за виключенням P. syringae pv. phaseolicola 4228 (виділені в березні) були невисокими.

Чисельність вірулентних фагів представлено на рис.1б. Фаги в значних титрах виявляли в період липень – серпень, що співпадав з періодом інтенсивного росту рослин. Серед виявлених домінували фаги до культур X. axonopodis pv. beticola 7325, P. syringae pv. tabaci. 223, P. syringae pv. tabaci 8646, P. syringae pv. aptata 8545, P. syringae pv. cerasi 8653. Загальна чисельність та видова специфічність фагів, коливалась та відрізнялась.

За результатами вивчення динаміки чисельності та аналізу літичної активності фагів створена лабораторна колекція первинних ізолятів, що складає понад 400 зразків.

Для проведення порівняльної характеристики фагів, виділених із агроценозів України та детальних досліджень було відібрано 13 чистих ліній ізолятів, що представляли собою групи фагів фітопатогенних бактерій. (табл. 1). Серед них 7 вірулентних та 6 помірних. Ізоляти фагів були розбиті на 3 групи за ознакою специфічності. Вони утворювали три групи вірусів відповідно до літичної активності на чутливих культурах Xanthomonas аxonopodis pv. beticola 7325, Pseudomonas syringae pv. atrofаciens 1025, Pseudomonas syringae pv. tabaci 223. Остання утворювала підгрупи - 223 та 7591. В межах групи була виявлена специфічна подібність морфології негативних плям.

Електронна мікроскопія. Вивчення будови віріонів проводили за допомогою електронного мікроскопа ЕМ - 125 методом негативного контрастування із застосуванням 2% ФВК (рН 7,0). Досліджувані фаги виявляли значне різноманіття за особливостями будови, що дало можливість віднести їх до таксономічних груп відповідно до рекомендації Міжнародного комітету по Таксономії вірусів (Ackermann, Abedon 2000) (Рис. 2).

Рис. 2. Електронограма фагів підгрупи 223: а- 2231/1; б- 223 10/1; в- 223 14/1; г- 223 17/1, підгрупи 7591: а- 7591 9/1; б- 7591 1/1; в- 7591 14/1; групи 7325: а- 7325 1/1; б- 7325 10/1; в- 7325 14/2; г- 7325 17/1; групи 1025: а-1025/6; б-1025/к (Х 40000).

Серед фагів були виявлені:

·

·

Вивчення поліпептидного складу досліджуваних фагів. Проведено порівняльне вивчення поліпептидного складу. Було визначено число поліпептидів для кожного із ізолятів та їх молекулярні маси. В структурі віріонів за поліпептидним складом в межах груп виявилась певна подібність, але для кожного із досліджуваних фагів показані індивідуальні профілі розділення, в основному за рахунок наявності мінорних компонентів (рис. 3).

1 2 3 4 М 5 6 7 8 9 10 11 12 13 М

Рис 3. Поліпептидний склад фагів: 1- 7325 10/1; 2- 7325 14/2; 3- 7325 17/1; 4- 7325 1/1; м- маркер LMW (кДа): 94; 67; 43; 30; 20,1; 14,4.; 5-223 17/1; 6- 223 1/1; 7-223 10/1; 8- 223 14/1; 9- 7591 14/1; 10- 7591 11/1; 11- 7591 9/1; 12- 1025/6; 13- 1025/к

Підгрупи фагів 223 та 7591- чутлива культура Pseudomonas syringae pv. tabaci 223, які були об’єднані в спільну групу 223 проявляли певну гетерогенність за своїм складом. Підгрупа 223 була більш гомогенна та відрізнялась за числом мінорних поліпептидів, а у випадку фагу 223 -14/1 виявився додатковий мажорний поліпептид з молекулярною масою – 55 кДа.

В підгрупі 7591 фаги 7591 11/1 та 7591 9/1 проявляли високу ступінь подібності. Фаг цієї підгрупи 7591 14/1 відрізнявся за числом, та питомою вагою поліпептидів, що входили в його склад від вищевказаних.

Для всієї підгрупи 223 однакову елекрофоритичну рухливість мали 9 поліпептидів, в підгрупі 7591 шість поліпептидів. Спільні для обох підгруп виявились 4 поліпептиди.

У складі фагів групи 7325 (чутлива культура Xanthomonas аxonopodis pv. beticola 7325) виявлено значна кількість мажорних поліпептидів, що не було характерно для попередніх груп та показані індивідуальні особливості. Число поліпептидів становило в межах від 16 до 22. Ідентична елекрофоретична рухливість виявлена у одинадцяти. Визначено їх молекулярні маси, що знаходяться в межах від 160 до 13 кДа. Число поліпептидів для фагів 1025/6 та 1025/к (чутлива культура Pseudomonas syringae pv. atrofаciens 1025) (табл.4) становило 18 та 16 відповідно.

Рестрикційний аналіз ДНК фагів. Аналіз ДНК був проведений після обробки їх специфічними ендонуклеазами рестрикції Hind III, EcoR I, Ecor V (Serva). Порівнювали їх електрофореграми, та визначали кількість фрагментів, які утворилися при гідролізі ДНК.

В результаті досліджень було встановлено, що за характером електрофоретичної рухливості Hind III-фрагментів ДНК, фаги підгруп 223 та 7591 мали ідентичні профілі, утворюючи по 7 фрагментів, за виключенням фагу 223 10/1, що гідролізувався на 4 фрагменти (рис. 4).

1 2 3 4 5 6 м

Рис. 4. Електрофоретичне розділення фрагментів ДНК після обробки ферментом Hind III: 1- 7591 9/1; 2- 223 10/1; 3 – 7591 11/1; 4 – 7591 14/1; 5- 223 14/1; 6 – 223 17/1; м – маркер молекулярної маси ДНК фагу , оброблених ферментами / Hind III + EcoR V (кВ): 22000, 5100, 4500, 4300, 3500, 2000, 1900, 1400, 950, 830.

Аналізуючи характер розподілу фрагментів ДНК фагів групи 7325 ( 10/1, 1/1, 14/2, 17/1) оброблених ферментом Hind III, можна помітити деякі особливі характеристики для кожного із чотирьох ізолятів (рис.5а). Вони проявляються в тому, що поряд із 20 фрагментами ДНК фага 7325-10/1, які для даної групи є спільні, у ДНК фагу 7325- 14/2 відсутні п’ять фрагментів, у 7325- 17/1 відсутні чотири фрагмента, а п’ять фрагментів відрізняються за електрофоретичною рухливістю від фагу 7325 – 10/1.

Найбільш суттєві відмінності виявляли ДНК фагів групи 1025 при гідролізі ферментом Hind III. Для ДНК фагу 1025/6 виявлено лише 8 фрагментів, в той час як у 1025/к їх показано 14 (рис. 5б).

М 1 2 3 4 5 6 м

а б

Рис. 5. Електрофоретичне розділення фрагментів ДНК фагів після обробки ферментом Hind III: м- маркер молекулярної маси ДНК фагу ,оброблених ферментами / Hind III + EcoR V (кВ): 22000, 5100, 4500, 4300, 3500, 2000, 1900, 1400, 950, 830; 1- 7325 10/1; 2- 7325- 1/1; 3-7325 14/2; 4- 7325 17/1; 5- 1025/6; 6- 1026/К.

1 2 3 4 5 М 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 М

а б

Рис. 6. Електрофоретичне розділення фрагментів ДНК фагів після обробки специфічною ендонуклеазою рестрикції a - EcoR I; б- EcoR V: 1-7591 9/1; 2- 223 10/1; 3- 7591 11/1; 4- 7591 14/1; 5-223 14/1; 6- 223 17/1; 7- 1025/6; 8- 1025/к; 9- 223 1/1; 10 – 7591 9/1; 11- 223 10/1; 12- 7591 11/1; 13- 7591 14/1; 14- 223 14/1; 15- 223 17/1; 16- 7325 10/1; 17- 7325 1/1; 18- 7325 14/2; 19- 7325 17/1; 20- 1025/6; 21- 1025/к; м - маркер молекулярної маси ДНК фагу , оброблених ферментами / Hind III + EcoR V (кВ): 22000, 5100, 4500, 4300, 3500, 2000, 1900, 1400, 950, 830.

Після гідролізу ДНК групи фагів 223 ендонуклеазою EcoR I вона утворювали підгрупи, що мали як спільні (7591 -14/1, 223-14/1 – по чотири, 7591-9/1, 223-10/1по сім фрагментів), так і індивідуальні (7591- 11/1, 223-17/1 – по п’ять фрагментів, які відрізнялись за мол. масою) профілі розділення (рис. 6а).

За характером чутливості до EcoR V досліджувані ДНК фагів проявляли свої особливості. Зокрема, за картиною розділення фрагментів після обробки їх ендонуклеазою EcoR V виявляли однакову кількість фрагментів в ДНК фагів 7325 14/2 та 7325 17/1 - (20), 7325 10/1 мав найбільшу кількість фрагментів (22), а 7325 1/1 – не гідролізувався .

Гідроліз ДНК групи фагів 223 ферментом EcoR V, показав, що їх геноми мають по чотири гомологічні фрагменти.

Розщеплення ДНК фагів групи 1025 при гідролізі ферментом EcoR V не відбувалось (рис. 6б).

Виявляючи подібність в профілях розділення гідролізованих ДНК, за поліпептидним складом, так і за особливостями структури ДНК фаги можна розглядати як споріднені в середині кожної із груп. Дослідження серологічних властивостей вказаних груп за допомогою методу непрямого ІФА дозволило за показниками отичної густини Е492 оцінити ступінь подібності як в середині групи так і між групами. Це може бути пов’язано з наявністю дивергенції властивостей у фагів, або обмінів модулів їх геномів в певному ареалі поширення.

Визначення серологічних властивостей проводили з використанням мишачих полівалентних антисироваток до фагів 223 17/1, 7325 17/1, 1025/к.

Як видно із рис.7, для всіх досліджуваних фагів характерна наявність спільних антигенних детермінант. Висока ступінь спорідненості показана для фагів у межах груп. Виявлена серологічна спорідненість досліджуваних фагів оцінювалась як висока між групами 223, 7325. При цьому хотілось би відмітити, що віріони групи фагів 223 мають короткі відростки, групи фагів 7325 - довгі, а їх чутливі бактерії відносяться до різних родів.

Отже, встановлено високу ступінь спорідненості фагів в межах груп та наявність спільних антигенних детермінант між групами.

Таким чином, показано, що фаги виділені із агроценозів, мають характерні властивості, які дозволяють їх об’єднати в межах груп.

· Проведені дослідження вказують, що групи фагів мають індивідуальні характеристики.

· Виявляючи подібні біологічні властивості, високу серологічну спорідненість в межах груп, наявність спільних антигенних детермінант між групами, поліпептидного складу, особливостей структури ДНК, що вивчено з використанням ендонуклеаз рестрикції фаги можуть мати спільне походження в межах груп.

Висновки:

1. Обстежено посіви цукрового буряку Київської, Вінницької і Чернігівської областей на наявність фагів фітопатогенних бактерій та проведено їх виділення. Встановлена біологічна активність та ефективність репродукції 31 ізоляту фагів до 13 штамів бактеріальних культур. Показано, що в результаті пасирування 23% виділених фагів втратили літичну активність.

2. Досліджена динаміка чисельності фагів на протязі 14 місяців до тринадцяти штамів бактеріальних культур (родів Pseudomonas, Xanthomonas, Erwinia). Встановлено максимальні титри фагів, що виявляли в січні (зимове зберігання коренів) та червні - липні (інтенсивний ріст рослин). Серед виділених, значну питому вагу становили фаги активні до X. axonopodis pv. beticola (туберкульоз цукрового буряку).

3. Вивчено морфолого - структурну організацію 13 фагів. Серед яких, дев’ять мали ізометричні головки (42,6±1 – 50±1 нм) і короткі хвостові відростки (1,8±0,2 – 10±0,5 нм) та відносились до родини Podoviridae, порядку Caudovirales. Інші чотири мали ізометричні головки (67±2 – 72,5±2 нм) і довгі нескоротливі відростки (119±2 – 131,6±2 нм) та відносились до родини Siphoviridae, порядку Caudovirales.

4. Проведено порівняльний аналіз білкового складу фагів, який представлений набором мінорних та мажорних поліпептидів. Визначено число поліпептидів для кожного із ізолятів, та їх молекулярні маси. Значення молекулярних мас знаходились в межах 13-160 кДа, а число поліпептидів становило від 14 до 23. За поліпептидним складом в межах груп виявлена подібність.

5. Вперше проведено вивчення серологічної спорідненості ізолятів фагів в гомо- та гетерологічній системах та встановлено високу ступінь спорідненості фагів в межах груп та наявність спільних антигенних детермінант між групами.

6. Встановлено, що геноми досліджуваних фагів представлені двонитковими ДНК, які за чутливістю до дії специфічних ендонуклеаз (EcoR I, EcoR V, Hind III ) мали індивідуальні особливості.

7. На основі аналізу поліпептидного складу, чутливості нуклеїнових кислот до специфічних ендонуклеаз, числа фрагментів після їх гідролізу, характеру електрофоретичної рухливості, результатів ІФА, можна судити про наявність ділянок спільної гомології в геномах вивчених фагів, що виділені із агроценозів України.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Бойко А.Л., Семчук Л.І., Ромашев С.А., Коломейцева Л.А., Андрійчук О.М. Вивчення властивостей фагів Xanthomonas аxonopodis pv. beticola, Pseudomonas syringae pv. lachrymans, Pseudomonas syringae pv. tabaci з метою встановлення впливу екологічних факторів на їх популяції. // Вісник КНУ Сер. Біол. – 1999. - №29. – С.54 –57.

2. Бойко А.Л., Семчук Л.І., Ромашев С.А., Коломейцева Л.А., Андрійчук О.М. Виявлення природних популяцій фагів фітопатогенних бактерій Xanthomonas аxonopodis pv. beticola, Pseudomonas syringae pv. lachrymans, Pseudomonas syringae pv. tabaci в агроценозах України. // Вісник КНУ Сер. Біол. – 2000. - №31. – С.61 –62.

3. Бойко А.Л., Семчук Л.І., Ромашев С.А., Андрійчук О.М. Дослідження популяцій фагів фітопатогенних бактерій. // Вісник аграрної науки – 2001. - №8. – С.51 –53.

4. Бойко А.Л., Семчук Л.І., Андрійчук О.М., Ромашев С.А., Яцковська Л.І. Аналіз популяцій фагів Xanthomonas, Pseudomonas виділених із агроценозів України. // Мат. III Міжнар. конф. “Біоресурси та віруси”. – Київ. – 2001. – с. 4.

5. Семчук Л.І., Андрійчук О.М., Ромашев С.А., Яцковська Л.І. Екологічні та біологічні аспекти дослідження фагів фітопатогенних бактерій. // Мат. III Міжнар. конф. “Біоресурси та віруси”. – Київ. – 2001. – с. 19.

6. Семчук Л.І., Андрійчук О.М., Ромашев С.А., Яцковська Л.І. Екологічні та біологічні аспекти дослідження фагів фітопатогенних бактерій. // Вісник КНУ Сер. Біол. – 2001. - №35. – С.11 –13.

7. Єфименко Т.В., Андрійчук О.М., Ромашев С.А., Яцковська Л.І. Семчук Л.І. Швидке та ефективне виділення ДНК, чутливих до специфічних ендонуклеаз, із фагів Pseudomonas та Xanthomonas. // Вісник КНУ Сер. Біол. – 2001. - №35. – С.13 –16.

8. Бойко А.Л., Семчук Л.І., Андрійчук О.М., Ромашев С.А., Яцковська Л.І. Виявлення в агроценозах фагів фітопатогенних бактерій Pseudomonas, Xanthomonas, Erwinia та Bacillus. // Агроекологічний журнал. – 2002. - №3. – с. 24 – 26.

9. Семчук Л.І., Ігнатенко Т.А., Андрійчук О.М., Ромашев С.А., Яцковська Л.І. До питання про адаптацію та виживання фагів в природі. // Вісник КНУ Сер. Біол. – 2002. - №38. – С.54 –56.

10. Семчук Л.І., Андрійчук О.М., Ромашев С.А., Ігнатенко Т.А., Яцковська Л.І. Екологічні аспекти циркуляції фагів фітопатогенних бактерій у біоценозах // Мат. Міжнар. конф. “Антропогенно - змінене середовище України: ризики для здоров’я населення та екологічних систем”. – 2003. – Київ, с. 28 -32.

11. Семчук Л.І., Андрійчук О.М., Ромашев С.А., Ігнатенко Т.А., Яцковська Л.І. Екологічні аспекти циркуляції фагів фітопатогенних бактерій у біоценозах. БІОТА. Ризики “Антропогенно- змінене середовище України: ризики для здоров’я населення та екологічних систем”. Спеціальний випуск журналу „Екологічний вісник”. 2003. – Київ, c. 498 – 504.

АНОТАЦІЇ

Андрійчук О.М. Біологічна характеристика фагів фітопатогенних бактерій виділених із агроценозів України. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю - 03.00.06 – вірусологія. Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2003.

Дисертація присвячена дослідженню біологічних властивостей ізолятів фагів, що мають різних чутливих хазяїв і поширені в агроценозах України. Досліджено динаміку чисельності конкуруючих бактеріофагів в природному агроценозі. Отримані результати, вперше демонструють динаміку декількох популяцій фагів антагоністичних до різних бактерій, які спільно зустрічаються в оточуючому середовищі.

В складі білків фагів виявлено загальні антигенні детермінанти. Досліджено їх поліпептидний склад.

Встановлено, що геноми фагів представлені двонитковою ДНК, яка характеризується відсутністю фрагментованості в структурі .

У роботі представлені методичні підходи по виділенню ДНК, який дозволяє швидко та ефективно із отриманих ізолятів виділяти нуклеїнові кислоти одночасно для великої чисельності проб без застосування фенолу.

Створено лабораторну колекцію ізолятів фагів (понад 400 зразків), виділених із агроценозів.

Ключові слова: вірулентні та помірні бактеріофаги, ізоляти, сезонна динаміка, віріони, ДНК.

Андрийчук Е.Н. Биологическая характеристика фагов фитопатогенных бактерий выделенных из агроценозов Украины. – Рукопис.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.06 – вирусология. Киевский национальный университет имени Тараса Шевченка, Киев, 2003.

Диссертация посвящена изучению биологических свойств изолятов фагов, которые имеют разных чувствительных хозяев и распространены в агроценозах Украины. Исследовано динамику численности конкурирующих бактериофагов в агроценозе. Полученные результаты, впервые демонстрируют динамику нескольких популяций фагов - антагонистов к различным бактериям, которые совместно встречаются в окружающей среде.

Изучено морфолого - структурную организацию 13 фагов. Из которых, девять имели изометрические головки (42,6±1 – 50±1 нм) и короткие хвостовые отростки (1,8±0,2 – 10±0,5 нм) и были отнесены к семейству Podoviridaе. Четыре других имели изометрические головки (67±2 – 72,5±2 нм) длинные несокращающиеся отростки (119±2 нм – 131,6±2 нм) и были отнесены к семейству Siphoviridae.

В составе белков фагов выявлено общие антигенные детерминанты. Исследован их полипептидный состав.

Установлено, что геномы фагов представлены двуспиральной ДНК, которая характеризуется отсутствием фрагментованости в структуре.

В роботе представлены методические подходы по выделению ДНК, которые позволяют быстро и эффективно выделять нуклеиновые кислоты из изолятов одновременно для большого количества проб без использования фенола.

Впервые проведено изучение серологического родства изолятов фагов с помощью метода непрямого ИФА в гомо- та гетерологической системах та установлено высокую степень родства фагов в середине групп и наличие общих антигенных детерминант между группами.

Создана лабораторная коллекция изолятов фагов (более 400 образцов), выделенных из агроценозов.

Ключевые слова: вирулентные и умеренные бактериофаги, изоляты, сезонная динамика, вирионы, ДНК.

Andriychuk E.N. Biological characteristic of the phytopatogenic bacteria' phages isolated from the Ukrainian agrocenoses - Manuscript.

The dissertation for the competition of a scientific degree of candidate of biological sciences (PhD) by speciality 03.00.06 - virology. Taras Shevchenko National University of Kyiv. Kyiv, 2003.

The dissertation is devoted to studying the biological properties of isolates which has different sensitive hosts and are distributed in agrocenoses of Ukraine. The dynamics of bacteriophage's number competing in agrocenose was investigated. The received results, for the first time show dynamics of several phages populations - antagonists to various bacteria which in common meet in an environment.

In a structure of phages proteins it is revealed the general antigenic determinants. Its polypeptides structure was investigated.

It is established, that genomes of phages is submitted by two-stranded DNA which is characterized by the absence of а fragmentation in structure.

In the work the methodical approaches on DNA' allocation which allow quickly and effectively discharge nucleic acids from isolates simultaneously for a plenty of tests without using of phenol are submitted.

The laboratory collection of phage's isolates (more than 400 samples) from agrocenoses is created.

Key words: virulent and temperate bacteriophage, seasonal dynamic, isolates, virion, DNA.