НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Борисюк Марина Василівна

УДК: 612.015.13; 616.379-008.64-0929

ВИВЧЕННЯ АКТИВНОСТІ ПРОТЕОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТІВ ПАНКРЕАТИЧНОГО ТА ПОЗАПАНКРЕАТИЧНОГО ПОХОДЖЕННЯ

В ДИНАМІЦІ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ЦУКРОВОГО ДІАБЕТУ

14.03.04-патологічна фізіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2003

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано на кафедрі патологічної фізіології Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця

Науковий керівник: член-кореспондент АПН України, доктор медичних наук,

професор Биць Юрій Вікторович,

завідувач кафедри патологічной фізіології

Національного медичного університету

ім. О.О. Богомольця

Офіційні опоненти: завідувач відділу

по вивченню гіпоксичних станів

Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України,

доктор медичних наук Маньковська Ірина Микитівна.

Завідувач лабораторії патофізіології

НДІ кардіології ім.М.Д.Стражеска АМН України,

доктор медичних наук,

професор Братусь Віктор Васильович.

Провідна установа: НДІ ендокринології та обміну речовин ім. В.П.Комісаренка АМН України

Захист відбудеться „ 7 „ __10________ 2003 року о „ 15.00 „ годині на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім.О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024 Київ, вул. Богомольця 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України

Автореферат розіслано „ 6 „ _09______ 2003 року.

Вчений секретар Спеціалізованої вченої ради,

Доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми.

В останні десятиріччя спостерігається різке збільшення захворюваності цукровим діабетом (ЦД), особливо у розвинутих країнах. Відповідний показник складає 5-6% від загальної кількості населення та має тенденцію до подальшого збільшення (дані Британської діабетичної асоціації, 2000). Епідеміологічні дослідження, які проводились у багатьох країнах світу показали, що ЦД за своїм значенням займає третє місце після серцево-судинних та онкологічих захворювань. Істотні медичні та соціальні аспекти проблеми ЦД полягають ще і в тому, що це захворювання призводить до інвалідизації та летальності у зв’язку з раннім розвитком судинних ускладнень: мікроангіопатій (ретинопатія, нефропатія) та макроангіопатій атеросклеротичного та менкебергівського типу (Аткінсон М.А., 1990;Соколов Є.І.; 1996; Балаболкін М.І.,1999).

Якщо в доінсуліновий період основною причиною смертності при ЦД були різні види ком, які ускладнювали це захворювання,то насьогодні хворі на ЦД гинуть переважно від уражень серцево-судинної системи. За матеріалами Фремингемського дослідження, ЦД входить до складу головних факторів ризику атеросклероза (АС) поряд із дисліпідемією, артеріальною гіпертензією, палінням та ін.

Дослідження останніх років показали, що у судинній стінці хворих на ЦД часто зустрічаються прояви патологічного процесу, який, на відміну від атеросклерозу, уражує середній шар стінки артерій. Мова йде про артеріосклероз Менкеберга з такими його характерними проявами як медіанекроз, медіакальциноз та медіасклероз, які можуть мати самостійне і не менш важливе значення у розвитку судинних ускладнень при ЦД (Биць Ю.В., 1999; Балаболкін М.І., 2000).

Механізми патологічного впливу метаболічних порушень, які виникають в організмі при абсолютній (ЦД 1 типу) або відносній (ЦД 2 типу) інсуліновій недостатності, багатогранні. Порушення енергозабезпеченя, ліпідного обміну, кислотно-лужної рівноваги та ряд інших змін мають ушкоджуючу дію на судинну стінку. У зв'язку з особливостями трофічного та енергетичного забезпечення артерії еластичного та еластично-м'язового типів є найбільш уразливими. Саме ці два типи судин частіше всього уражуються як атеросклерозом, так і артеріосклерозом Менкеберга. (Биць Ю.В., 1973; Досенко В.Є., 1998; Єфімов А.С., 2001, Lernmark A., 1999).

Перспективним напрямком у сучасній ангіології є вивчення ролі протеолітичних ферментів та їх білкових інгібіторів у патогенезі зазначених видів артеріосклерозу (Веремєєнко К.М., 1994; Соколов Є.І., 1996; Степанов В.С.,1998; Roberts L., 1989; Hornbeck W. et al.,1990). Ферменти протеолізу та фактори, які регулюють їх активність, складають певні протеолітичні системи організму, що забезпечують участь останніх у найбільш важливих фізіологічних процесах. Порушення функції та регуляції активності протеїназ є основою багатьох патологічних процесів та станів, до яких відносяться і макроангіопатичні ускладнення при ЦД (Веремєєнко К. М., Кізім О.Й., 1988; Matsuda S.et al.,1978; James K. et al., 1980; Gray R.S. et al.,1982; Bristow C.L. et al., 1998).

Питання про роль порушень протеолітичних систем у патогенезі ускладнень ЦД залишається відкритим. Численні наукові роботи сучасних авторів підкреслюють роль дисбалансу в еластолітичній системі, яка складається з еластази та її білкових інгібіторів - альфа-1-інгібітору протеїназ та альфа-2-макроглобуліну (Биць Ю.В., Досенко В.Є., 1999; Kwan C. et al.,1988; Finotti P. t al., 1992; Kato M. et al., 1996). Клінічні дослідженя сироватки крові хворих на ЦД показали порушення рівноваги у системі протеолітичних ферментів та їх інгібіторів у бік посилення активності протеолізу. (Єфімов А.С. и соавт., 1986; Літвінова Л.В., 1994; Юданова Л.С., 1998; Ganrot P. et al., 1967; Finotti P. et al., 1992; Kobayashi T. et al., 1998). Доведено, що порушення балансу між компонентами саме цієї системи у бік активації еластолізу призводить до патологічних змін в судинній стінці та є пусковим моментом для подальшого розвитку артеріосклеротичних змін судин. Важливим є те, що ці зміни відбуваються на ранніх етапах розвитку основного захворювання, коли ще відсутня дисліпідемія як прояв атеросклерозу. Велике значення дисбалансу еластолітичної системи у розвитку судинних ускладнень полягає у тому, що всі складові ціієї системи як безпосередньо, так і опосередковано можуть викликати зміни у судинній стінці (Balo J.,Banga I.,1953; Brownlee M.,1976; Сopeland E. et al.,1980; Hornbeck W. et al.,1982; Sandler M. et al.,1998). Насамперед, це еластаза, яка при надмірній активаціі може порушувати не тільки еластинові та колагенові волокна судинної стінки, а й втручатись у роботу інших систем, які працюють за принципом обмеженого протеолізу. Крім того, продукти протеолізу еластинових волокон – пептиди еластину- взаємодіють з певними рецепторами та (при надмірній активності еластази) розширюють спектр патологічної дії ферменту: посилюють адгезію фібробластів та гладеньком'язових клітин (ГМК) до еластичних волокон, сприяють вивільненню оксиду азоту ендотеліоцитами та ГМК, посилюють хемотаксис моноцитів та фібробластів у середій шар судин, активують лізосомальні ферменти, підвищують рівень кальцію у клітинах, активують синтез іншої групи протеаз – металоферментів. Все це може мати своїм наслідком розвиток патології з боку судин еластичного та еластично-м'язового типу (Веремєєнко К.М., 1994; Roberts L. et al., 1995; Nikoloff C., 1997; Kobayashi T. et al., 1998). Роль природних інгібіторів еластази не обмежується тільки безпосереднім контролюванням протеази. Доведено, що при взаємодії цих протеїнів з еластазою відбувається ряд змін в структурі інгібіторів, які також можуть мати важливе значення у розвитку подальших подій. Так, наприклад, при взаємодії альфа-1-інгібітора протеїназ з еластазою відбувається вивільнення певного фрагменту молекули інгібітора, який здатний активувати продукцію цитокінів макрофагами та експресію рецепторів до ліпопротеїнів низької щільності (ЛПНЩ) на поверхні клітин печінки у культуральному середовищі (Mashiba S. et al., 2001).

Взаємодія еластази з альфа-2-макроглобуліном сприяє конформаційним змінам інгібітора та розширює спектр його біологічної (а при надмірному зв'язуванні – і патологічної) дії, яка призводить до змін різнобічних функцій клітин судинної стінки (Веремєєнко К. М., Кізім О.І., Досенко В.Є., 2000; Lysiak J. et al.,1995; Kato M. et al., 1996; Umans L. et al., 1998).

Зміни у системах згортання крові та фібрінолізу є одним з важливих факторів, які здатні спровокувати судинні ускладнення при діабеті. Особливу роль при цьому грає протеолітичний фермент тромбін та його інгібітори, активність яких змінюється в ураженій стінці судин (Fager G., 1995; William L. et al.,1996). Але в той же час остаточно не з'ясовано, з яких причин та в які строки при експериментальному ЦД виникають зміни між протеолітичними ферментами та їх інгібіторами в тканинах судинної стінки та підшлункової залози. Відсутність комплексного підходу до аналізу таких змін не дає можливості глибше розкрити питання патогенезу судинних ускладнень при ЦД.

Таким чином, всебічне вивчення цієї важливої проблеми дозволить створити необхідну експериментальну базу для подальшої розробки відповідних фармакологічних засобів профілактики судинних уражень та зниження показника летальності при ускладнених формах протікання цукрового діабету.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Робота виконана в рамках держбюджетної науково-дослідної роботи кафедри патологічної физіології Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця: “Вивчення активності показників системи протеоліз/інгібітори протеолізу та ліпопротеїнового обміну в крові та судинній стінці при макроангіопатіях різного генезу”.

Мета роботи: встановити патогенетичне значення змін у системі протеоліз/інгібітори протеолізу в сироватці крові, тканинах аорти та підшлунковій залозі в динаміці експериментального цукрового діабету.

Задачі дослідження:

1) вивчення кількісних змін активності еластази та її інгібіторів у сироватці крові, тканинах аорти та підшлунковій залозі у різні строки експериментального (стрептозотоцинового та алоксанового) цукрового діабету;

2) визначення можливих механізмів дії стрептозотоцину і алоксану на стан протеолітичних систем організму;

3) визначення можливого взаємозв’язку між панкреатичною та позапанкреатичною еластазою у різні строки моделювання експериментального цукрового діабету;

4) вивчення активності тромбіну та вмісту його інгібіторів в тканинах аорти при стрептозотоциновому цукровому діабеті;

5) встановлення патогенетичого зв’язку між ступенем порушення балансу у системі еластолізу при експериментальному цукровому діабеті та розвитком артеріосклеротичних змін.

Наукова новизна результатів.

Вперше на сучасному методичному рівні отримані екпериментальні докази порушення балансу активності еластази та її інгібіторів у сироватці крові, тканинах аорти та підшлунковій залозі на ранніх етапах розвитку експериментального цукрового діабету. З’ясовані особливості змін еластолітичної системи в залежності від експериментальної моделі діабету.

Встановлено зв’язок між панкреатичною та позапанкреатичою еластазою при цукровому діабеті.

Отримані нові наукові результати щодо стану системи тромбін/інгібітори тромбіну в тканинах аорти при цукровому діабеті.

Теоретичне та практичне значення роботи:

Проведені дослідження здійснені з метою визначення ролі системи еластаза/інгібітори еластази у виникненні судинних ускладнень при експериментальному цукровому діабеті. Отримані дані про порушення балансу між компонентами еластолітичної системи в процесі розвитку діабету, які, з одного боку, свідчать про зміни в еластоподібних структурах судинної стінки, а з іншого, про ушкоджуючу дію активованої еластази та тромбіну на стінку судин. Це може мати важливе значення у виникненні судинних ускладнень при цукровому діабеті. Доведено, що при розвитку експериментального цукрового діабету відбувається посилення активності як панкреатичної, так і позапанкреатичної еластази, що може мати суттєве значення при виникненні патологічних змін як у судинній стінці, так і безпосередньо у підшлунковій залозі.

Методи визначення активності еластази та її інгібіторов в клінічній практиці можуть бути використані для діагностики та контролю ефективності лікування хворих на цукровий діабет, особливо при серцево-судинних ускладненнях захворювання. Спрямований фармакологічний вплив на еластазну активність може бути рекомендовано для корекції патологічніх змін в системі еластолізу.

Особистий внесок здобувача: здобувачем проведено аналіз літературних джерел, виконано повний комплекс необхідних експериментальних досліджень, проведено обробку даних, їх аналіз та узагальнення.

Визначення показників кислотно-основного стану при експериментальних моделях цукрового діабету проводилось спільно з асистентом кафедри патологічної фізіології ім. О.О. Богомольця Трофімовою І.М.

Апробація роботи

Результати роботи були представлені та доповідались на IV Межнародному конгресі патофізіологів (Будапешт, 2002 р.) VI Межнародному медичному конгресі студентів та молодих вчених (Тернопіль, 2002 р.), Конференції студентів та молодих вчених (Київ, 2001р.), Пленумі Товариства патофізіологів України (Одеса, 2002 р.).

Публикації

За матеріалами дисертації опубліковано 6 робіт, у тому числі 3 статті в наукових журналах.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, викладення результатів та їх обговорення, висновків та списку 201 використаних джерел. Робота викладена на 110 сторінках, містить 12 таблиць та 15 малюнків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали та методи досліджень. Для моделювання стрептозотоцинового та алоксанового експериментального цукрового діабету використано 145 щурів лінії Вістар чоловічої статі середньою масою 241 5,81 г, віком від 6 до 8 місяців. Тварини утримувались у віварії НМУ, де вони знаходились на стандартному раціоні та в подібних умовах. Матеріалом дослідження були сироватка крові, тканини аорти та підшлункової залози.

Моделювання стрептозотоцинового цукрового діабету здійснювали шляхом одноразового введення стрептозотоцину (SIGMA. USA) у дозі 50 мг/кг маси тіла інтраперитонеально. Відтворювання цієї моделі експериментального цукрового діабету за допомогою стрептозотоцину пов’язане з його прямою цитотоксичною дією та здатністю викликати аутоімунну атаку на бета-клітини підшлункової залози з подальшим порушенням обміну речовин, максимально близького до інсулінозалежного діабету.

Моделювання алоксанового цукрового діабету відтворювали шляхом інтраперитонеального одноразового введення алоксану у дозі 100 мг/кг маси тіла. Введення алоксану, який має пряму цитотоксичну дію на бета-клітини, дозволяє отримати експериментальний цукровий діабет, при якому, на відміну від стрептозотоцинової моделі, відбуваються істотні порушення кислотно-осовного стану, що є однією з характерних ознак інсулінозалежного цукрового діабету.

Матеріал для досліджень брали через 5 днів, 4 та 8 тижнів після введення діабетогенних речовин. В табл. 1 представлено основний зміст проведених наукових експериментальних досліджень та поділ піддослідних тварин на експериментальні групи.

Визначення вмісту глюкози у крові проводили з використанням ферментного методу “Хромоглюкоза” (“Агат-мед”, Україна).

Активність еластази у сироватці крові, тканинах аорти та підшлункової залози визначали спектрофотометрично, відповідно до здатності еластази рощеплювати специфічний хромогенний субстрат сукциніл-(аланін)3-пара-нітроанілід (Suc-(Ala)3-p-NA) (Веремеєнко К.М., Кізім О.І, Терентьєв А.Г.,1992).

Активність тромбіну у тканинах аорти визначали спектрофотометрично, відповідно до здатності тромбіну рощеплювати специфічний хромогенний субстрат тозіл-пролін-гліцин-аргінін-пара-нітроанілід (Tos-Prol-Glic-Arg-p-NA) (Веремеєнко К.М., Кізім О.І, Терентьєв А.Г.,1992).

Визначення вмісту альфа-1-інгібітора протеїназ визначали спектрофотометрично, відповідно до здатності інгібітора пригнічувати гідроліз трипсином хромогенного субстрату N-аргінін-бензоіл-DL-пара-нітроанілід (БАПНА) (Веремеєнко К.М., Кізім О.І, Терентьєв А.Г.,1992).

Визначення вмісту альфа-2-макроглобуліна визначали спектрофотометрично, відповідно до здатності інгібітора утворювати активний комплекс з трипсином, який може рощеплювати хромогенний субстрат БАНПА (Веремеєнко К.М., Кізім О.І, Терентьєв А.Г.,1992).

Визначення кислототермостійких інгібіторів визначали спектрофотометрично, відповідно до здатності інгібіторів пригнічувати активність трипсина після дії високої температури та кислоти. (Нартикова В.Ф., 1970).

Кількість білка в гомогенатах аорти та підшлункової залози визначали за методом Lowry (1959).

Математична обробка отриманих експериментальних даних здійснювалась на ПК Pentium 300 з використанням програм Sigma Plot 5.0 Excel 97. Визначали М- середню арифметичну, m – її помилку, Р – вірогідність розбіжностей середніх величин.

Таблиця 1. Зміст експерименту та розподіл експериментального матеріалу по серіях досліджень.

№

п/п | Зміст експерименту | Діабетогенний препарат | Доза діабетогенного препара

ту | Строк після введення діабетогенного препарату | Загальна кільість тварин | Експе

римен

тальна група

Визначеня активності еластази, альфа-1-інігібітора протеїназ та альфа-2-макроглобуліну у сироватці крові,тканинах аорти та підшлункової залози у щурів :

1. | - контроль | - | контроль | 39 | 1

2. | - стрептозотоцинова модель

цукрового діабету | стрептозотоцин | 50мг/кг | 5 діб | 15 | 2

стрептозотоцин | 50мг/кг | 4 тижні | 24 | 3

стрептозотоцин | 50мг/кг | 8 тижнів | 39 | 4

- алоксанова модель

цукрового діабету | алоксан | 100мг/кг | 5 діб | 5 | 5

алоксан | 100мг/кг | 4 тижні | 23 | 6

3. | Визначення активності тромбіну в тканинах аорти щурів при моделюванні експериментального цукрового діабету | стрептозотоцин | 50 мг/кг | 5 діб | 5 | 2

стрептозотоцин | 50 мг/кг | 4 тижні | 11 | 3

стрептозотоцин | 50 мг/кг | 8 тижнів | 15 | 4

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Експериментальні дослідження активності еластази, тромбіну та вмісту їх інгібіторів в сироватці крові, тканинах аорти та підшлункової залози у щурів з стрептозотоциновим цукровим діабетом.

Вивчення стану еластолітичної системи у сироватці крові щурів при стрептозотоциновому цукровому діабеті.

Для підтвердження розвитку стрептозотоцинового діабету у щурів були досліджені основні показники крові та сечі.

Термін 5 діб, при якому ще не було визначено змін, характерних для ЦД, був використаний для вирішення питання про можливість токсичної дії стрептозотоцину (або алоксану у відповідній моделі) на активність системи “еластаза/інгібітори еластази”.

Активність еластази та її інгібіторів визначали у сироватці крові, тканинах аорти та підшлункової залози у наведені строки експерименту.

В табл. 2 представлені дані щодо активності еластази та її природних інгібіторів у сироватці крові щурів при стрептозотоциновій моделі цукрового діабету.

Таблиця 2. Активність еластази, вміст б1ІП та б2М (М??m) у сироватці крові щурів із стрептозотоциновим цукровим діабетом.

Зміст експерименту | Активність

еластази,

мкMоль ?p?NA х?год-1х л-1 | б 2-макро-глобулін,

г/л | б ??інгібітор протеїназ,

г/л | інгібітори / еластаза,

ум. од.

1 група;контроль

(n=30) | 13.62 2,45 | 1.89 0,12 | 1.82 0,10 | 272.4

2 група; 5 діб після введення стрептозотоцину (n=5) | 25.48 4,9 | 1.50 0,24 | 1.83 0.04 | 130.7

3 група; 4 тижні після введення стрептозотоцину

( n=24) | 49.69 13,84* | 1.29 0,13* | 2.13 0.39 | 68.8

4група; 8 тижнів після введення стрептозотоцину.

(n=39) | 171.06 13,20* | 1.48 0,12* | 1.74 0,03 | 18.8

* - вірогідність у порівнянні з контролем - Р<0.05

Як свідчать наведені результати досліджень, найбільш значні зміни у сироватці крові щурів відбувалися з боку активності еластази. Якщо через 5 діб після введення діабетогенного препарату активність еластази лише мала тенденцію до зростання (збільшилась у 1.9 разів по відношенню до контролю, Р> 0.05), то у тварин 3-ї експериментальної групи (після 4 тижнів з моменту введення стрептозотоцину) активність протеолітичного ферменту вірогідно збільшилась у 3.4 рази, а у щурів 5-ї групи (8 тижнів стрептозотоцинового діабету)– у 12.6 разів у порівнянні з контрольною групою тварин (Р < 0,05).

При дослідженні системи інгібіторів було доведено, що значні зміни у сироватці крові при стрептозотоциновій моделі діабету торкаються вмісту альфа-2-макроглобуліну: через 5 діб моделювання його частка зменшилась у 1.2 рази порівняно з контролем (Р > 0.05), а через 4 тижні (тварини 3-ї групи дослідження) – у 1.5 разів (Р < 0,01). При подовженні строку експерименту (через 8 тижнів) у тварин 4 групи кількість інгібітору дещо зростала, але все одно була на вірогідно низькому рівні у порівнянні з контролем. Коливання вмісту альфа-1-інгібітора протеїназ у сироватці крові щурів при стрептозотоциновому цукровому діабеті були невірогідними.

Для комплексного вивчення роботи системи „еластаза/інгібітори еластази” нами було використано сумарний показник активності еластолітичної системи - коефіцієнт еластолізу, який складається з відношення суми показників вмісту інгібіторів до показників активності еластази.

У сироватці крові щурів в різні строки СТ діабету мало місце різке зменшення коефіцієнту еластолізу (див. табл.3), що свідчило про надмірну активність еластази.

Таким чином, у сироватці крові щурів із стрептозотоциновим цукровим діабетом відбувається порушення балансу роботи системи “еластаза/інгібітори еластази” у бік збільшення активності протеолітичного ферменту. Активація еластази та зменшення вмісту її природного інгібітора (альфа-2-макроглобуліна) складають умови для пошкодження еластичних структур судинної стінки з можливим подальшим розвитком макроангіопатичних ускладнень цукрового діабету.

Стан системи еластолізу в тканинах аорти щурів в динаміці експериментального стрептозотоцинового цукрового діабету.

В результаті проведення відповідних досліджень було встановлено порушення балансу між еластазою та її інгібіторами у тканинах аорти піддослідних щурів (табл.3).

Таблиця 3. Активність еластази, вміст б 1ІП та б2М (М??m) у тканинах аорти щурів із стрептозотоциновим цукровим діабетом.

Зміст експерименту | Активність

еластази,

мкМоль?p?NAх?год-1х л-1 | б 2-макроглобулін,

г/л | б ??інгібітор протеїназ,

г/л | інгібітори / еластаза,

ум. од.

1 група;контроль (n=10) | 7.78 1,29 | 22.36 1.78 | 3.40 0.33 | 3.31

2 група; 5 діб після введення СТ;(n=5) | 18.54 4.10 | 19.64 0.83 | 0.70 0.06* | 1.09

3 група; 4 тижні після введення СТ;( n=8) | 20.21 2,11* | 6.23 + 0.61* | 2.30 0.61 | 0.42

4група; 8 тижнів після введення СТ; (n=13) | 30.97 2,56* | 10.11 0.99* | 2.53 0.53 | 0.41

*- вірогідність у порівнянні з контролем - Р<0.05

Наведені дані свідчать про порушення балансу у еластолітичній системі тканин аорти щурів, яке відбувається за рахунок декількох факторів. По-перше, це вірогідне збільшення активності еластази у тварин через 4 та 8 тижнів після введення стрептозотоцину (3-я та 4-а експериментальні групи відповідно). По-друге, це зменшення у тканинах аорти щурів альфа-2 макроглобуліну, який синтезується макрофагами in situ. Все це призводить до порушення рівноваги між інгібіторами та еластазою у бік активності останньої. Активована еластаза є фактором пошкодження еластичних структур судинної стінки та ініціюючим моментом у патологічному ланцюгу, який починається із підвищення протеолітичного розщеплення еластину та колагену та надмірної взаємодії пептидів еластину з відповідними рецепторами на багатьох клітинах організму (Roberts L. et al., 1989; Nikoloff C., 1997;). Внаслідок активації цих рецепторів відбувається порушення гомеостазису клітин судинної стінки, міграція гладеньком’язових клітин у середній шар судин, накопичення іонів кальцію, активація проліферації фібробластів та ще ряд подій, які можуть призвести до артеріосклеротичних змін судинної стінки (Досенко В.Є., 1998, Tomizawa H., Yamazaki M., Kunika K. et al.;1993) .

Визначення активності еластази, проеластази, вмісту альфа-1-інгібітора протеїназ, альфа-2-макроглобуліну та кислототермостійких інгібіторів у тканинах підшлункової залози в динаміці стрептозотоцинового цукрового діабету.

Підшлункова залоза є саме тим органом, у якому розгортаються основні події при цукровому діабеті. Крім того, підшлункова залоза має ряд морфофункціональних особливостей, які потрібно враховувати при проведенні відповідних досліджень.

Якщо виникнення вторинного цукрового діабету при панкреатиті не викликає сумніву, то питання про зміни у екзокриноцитах при розвитку ІЗЦД залишається відкритим. Літературні джерела досить по-різному описують стан секреторної частини органу - від зменшення рівню трипсину та еластази у кишковому вмісту при ЦД (Морозова Н.Н., 1980; Sato M., Yamamoto K., Mayama H. et al.,1984) до доказів розвитку панпанкреатиту при стрептозотоциновому ЦД (Li Z., Zhao L., 2000). Тому в цій серії досліджень було визначено активність еластази (враховуючи її неактивну форму – проеластазу) та вміст спектру інгібіторів, які контролюють активність протеїнази у підшлунковій залозі (? 1ІП, ? 2М та кислототермостійкі інгібітори (КТСІ)).

Проведені дослідження дозволили встановити, що у підшлунковій залозі тварин з експериментальним стрептозотоциновим цукровим діабетом відбуваються зміни в системі “еластаза/інгібітори еластази” у бік активації протеолізу.Основну увагу було зосереджено на визначенні співвідношення між неактивною формою фермента (проеластазою) та еластазою. Наведені дані свідчать про зниження активності профермента на фоні достатньо високої активності еластази у тканинах підшлункової залози. Це свідчить про те, що на ранніх стадіях експериментального ЦД ацинарні клітини органу зберігають здатність виробляти еластазу, але, у порівнянні з нормою, значно більша частина ферменту активується безпосередньо у тканинах підшлункової залози. В разі цього активована еластаза може проявляти свої властивості, в тому числі пошкоджуючу дію, не тільки в підшлунковій залозі з можливим виникненням панпанкреатиту, але і впливати відповідним чином на систему крові, структурні компоненти судинної стінки та позасудинних структур.

У табл. 4 представлені отримані дані.

Таблиця 4. Активність проеластази, еластази, вміст б2М, б1ІП та КТСІ протеїназ (М??m) в тканинах підшлункової залози щурів при моделюванні стрептозотоцинового цукрового діабету.

Зміст експеримен

ту | Активність

проеластази,

мкМоль?p?NAх?год-1х л-1 | Активність

еластази,

мкМоль?p?NAх?год-1х л-1 | б-1-?нгібітор протеїназ, мг/г |

КТСІ, мг/г |

б- 2-макро-глобулін,

мг/г | інгібітори / еластаза

ум. од.

1група; контроль

(n=10) | 62.58 8.37 | 29.91 2.17 | 1.51 0.02 | 0.13 0.02 | 0.97 0.33 | 0.09

2 група; 5 діб після введення СТ ( n=5) | Не визнач. | 23.17 3.41 | Не визнач. | Не визнач. | 0.56 0.08 | -

3 група; 4 тиж. після введення СТ

( n=8) | 25.22 9,90* | 49.54 8.10 * | 0.79 0.05 * |

0.39 0.04* |

0.80 0.09 | 0.04

4група; 8 тиж. після введення СТ

(n=13) | Не визнач. | 45.42 3.36 | Не визнач. | Не визнач. | 1.71 0.10 | -

*- вірогідність у порівнянні з контролем - Р<0.05

Досить цікавими були результати дослідження вмісту вище названих інгібіторів. Було з’ясовано, що при стрептозотоциновому ЦД вміст альфа-1-інгібітору протеїназ вірогідно зменшувався, а вміст КТСІ зростав. Рівень альфа-2-макроглобуліну невірогідно коливався. Збільшення вмісту КТСІ можна оцінювати як прояв компенсаторної реакції підшлункової залози на збільшення активності еластази. Проте, альфа-1-інгібітор протеїназ та альфа-2-макроглобулін мають більшу спорідненність з еластазою і пригнічують її активність в декілька разів більше, ніж кислототермостабільні інгібітори. Тому, при підрахунку коефіцієнту еластолізу було виявлено зменшення цього показника, що свідчило про зсув балансу еластолітичної системи у бік збільшення активності протеази.

Така ситуація є небезпечною як для ацинарних клітин підшлункової залози безпосередньо, так і для клітин острівців Лангерганса. Якщо ураження останніх пов’язано з діабетогенною дією стрептозотоцину, то патологічні зміни ацинарних клітин виникають у разі дії активованої еластази та зменшення її інгібіторів. Не виключено, що це може бути фактором, який додатково уражує бета-клітини підшлункової залози та, при розвитку панкреатичних проявів, й структур судинної стінки.

Вивчення активності тромбіну та його інгібіторів у тканинах аорти щурів при стрептозотоциновому цукровому діабеті.

Встановлений факт збільшення тромбіну безпосередньо в атеросклеротично зміненій судинній стінці (William L., Barry M.D., Lawrence W. et al.,1996) змусив нас провести серію досліджень з метою визначення активності тромбіну в стінці аорти у різні строки стрептозотоцинового цукрового діабету. В табл. 6 представлені основні результати досліджень.

Із наведених даних та даних літератури (Zoldhelyi P., Bichler J., Owen W.G. et al., 1994; Zucker S., Cooner C., DiMassimo B. et al.; 1995; Stoop A. et al., 2000) витікає, що в тканинах аорти щурів не визначається рівень одного з основних інгібіторів тромбіну сироватки крові – антитромбіну ІІІ (при додаванні до специфічного хромогенного субстрату гомогенату аорти не було зареєстровано жодного випадку пригнічення активності). Тому проведені дослідження були обмежені визначенням активності тромбіну та альфа-2-макроглобуліну, який бере на себе основну частку антитромбінового потенціалу у тканинах аорти.

Таблиця 5. Активність тромбіну та альфа-2-макроглобуліну (М??m) в тканинах аорти щурів при стрептозотоциновому цукровому діабеті.

Зміст експерименту | Активність

тромбіну,

мкМоль?pNA??х год-1

х г білка-1 | б 2-макроглобулін,

мг/г

Контроль (n=13) | 44.67 7.14 | 22.36 1.78

5 діб після введения СТ

(2 група) (n=5) | 138.92 2.72* | 19.64 + 0.83 | 4 тижні після введения СТ

(3 група) (n =11) | 103.21 16.18 * | 6.23 + 0.61* | 8 тижнів після введення СТ

(4 группа) (n =15) | 79.76 7.97* | 10.11 0.99* | Як видно з наведених даних, в тканинах аорти експериментальних щурів мають місце порушення в системі „тромбін/інгібітори тромбіну” у бік збільшення активності протеїнази. Активність тромбіну через 5 днів після введення стрептозотоцину була вище в 3.1 рази (Р< 0.005),через 4 тижні – в 2.3 рази (Р< 0.05), а через 8 тижнів – у 1.8 разів більше, ніж у контрольних тварин.

Вірогідне зменшення частки альфа-2-макроглобуліну, яке було виявлено на всіх етапах досліджень, посилює патологічну дію протеолітичного ферменту на судинну стінку. Підвищення активності тромбіну не тільки може призводити до порушення системи гемостазу (Єна Я.М., 1991; Юданова Л.С., 1998; Marongiu F. et. al.; 1990), а й опосередковано, через рецептори групи PAR, здатне активувати хемотаксис нейтрофілів та моноцитів, стимулювати проліферацію ендотеліальних та гладеньком’язових клітин та впливати на синтез металопротеїназ макрофагами (Guillin M., et al.,1995; Molino M., Barnathan E.S., Numerof R. et al., 1997). Доведено, що проліферація гладеньком’язових клітин пов’язана з синтезом металопротеїназ макрофагами (James K., Merriman J., Gray R.S. et al.,1998). Під дією металоферментів відбувається порушення колагену четвертого типу базальної мембрани та гладеньком’язових клітин, внаслідок чого останні набувають здатності мігрувати до інтими судин та відповідати на мітогенні сигнали. Таким чином, підвищення активності тромбіну безпосередньо в судинній стінці є досить важливим фактором, який може спровокувати подальші патологічні зміни та призвести до розвитку макроангіопатичних ускладнень при експериментальному цукровому діабеті.

Експериментальні дослідження активності еластази, вмісту альфа-1-інгібітора протеїназ та альфа-2-макроглобуліну при алоксановому цукровому діабеті.

Стан системи еластолізу у сироватці крові щурів в динаміці алоксанового цукрового діабету

Після введення алоксану у діабетогенній дозі (100 мг/кг маси тіла), нами було досліджено основні параметри гомеостазису. Матеріал для досліджень отримували через 5 діб та 4 тижні від моменту введення алоксану.

Крім того, у піддослідних тварин було досліджено активність еластази та вміст її природних інгібіторів у сироватці крові. В табл.6 наведено необхідні дані.

Таблиця 6. Активність еластази, вміст б 2М и б 1ІП протеїназ (М?m) у сироватці крові щурів при моделюванні алоксанового цукрового діабету.

Зміст експеримента | Активність

еластази,

мкМоль?p?NA х?год-1х л-1 | б 2-макроглобулін,

г/л | б ??-інгібітор протеїназ,

г/л | інгібітори / еластаза,

ум. од. | Контроль

(1 група) (n=15) | 13.62 2.45 | 1.89 0.12 | 1.82 0.10 | 272.3 | 5 діб після введення алоксану

(5 группа)(n=5) | 182.08 2.45* | 1.54 0.13* | 0.54 0.11* | 11.4 | 4 тижні після введення алоксану

(6 группа)(n=10) | 171.75 16.75 * | 1.90 0.06 |

0.23 0.02* |

12.4

* - вірогідність у порівнянні з контролем - Р<0.05

Як свідчать наведені дані, у піддослідних щурів спостерігалась досить підвищена активність еластази: через 5 діб після введення алоксану – у 13.36 разів порівняно з контролем (Р < 0.001), через 4 тижні – у 12.6 разів (Р < 0.001).

В системі інгібіторів вірогідне зменшеня було встановлено з боку альфа-1-інгібітору протеїназ. Зміни з боку альфа-2-макроглобуліну набували вірогідної різниці тільки у 5-добовий термін.

Таким чином, у сироватці щурів при алоксановому цукровому діабеті визначається порушення між компонентами системи ”еластаза/інгібітори еластази” у бік активації протеолітичного ферменту.

Визначення активності еластази, альфа-1-інгібітору протеїназ та альфа-2-макроглобуліну у тканинах аорти щурів з алоксановим цукровим діабетом.

В тканинах аорти щурів також були визначено зсув у еластолітичній системі.

В табл. 7 представлені отримані дані.

Таблиця 7. Активність еластази, вміст б2М та б1ІП протеїназ (М??m) в гомогенатах аорти щурів при моделюванні алоксанового цукрового діабету.

Зміст експерименту | Активність

еластази,

мкМоль?p?NA х?год-1х л-1 | б 2-макроглобулін,

г/л | б ??-інгібітор протеїназ,

г/л | інгібітори / еластаза,

ум. од.

Контрольна група

(n=8) | 7.78 1.29 | 22.36 1.78 | 3.40 0.33 | 3.31

5 діб після введення алоксану

(5 группа)

(n=5) | 29.43 1.45* | 50.98 0.93* | 2.46 0.39 | 1.81

4 тижні після введеняя алоксану

(6 группа)

(n =5) | 42.69 1.21* |

58.08 2.41* | 2.28 0.24* | 1.41

* - вірогідність у порівнянні з контролем - Р<0.05

У тканинах аорти щурів з алоксановим цукровим діабетом активність еластази різко збільшувалась, починаючи з 5-ої доби після введення діабетогенної речовини. У щурів 5-ої експериментальної групи (5-добовий строк) активність протеази була у 3.78 разів більше, ніж у контролі (Р < 0.001), а в 6-ій групі тварин (4-х тижневий строк) – перебільшувала нормальні показники у 5.49 разів (Р < 0.001).

Досить істотними були зміни у системі інгібіторів. Якщо рівень альфа-1-інгібітору протеїназ поступово знижувався і через 4 тижні моделювання був у 1.5 рази менший, ніж у інтактних щурів (Р < 0.001), то частка альфа-2-макроглобуліну, навпаки, різко збільшувалась і в ті ж самі строки експерименту перебільшувала контрольні показники в 2.6 рази (Р < 0.001). Цей досить цікавий факт можна частково пояснити дією алоксану на макрофаги, які в даному випадку є основними продуцентами альфа-2-макроглобуліну у стінці аорти. Доведено, що алоксан має здатність активувати макрофаги, в результаті чого підвищується синтез останніми інтерлейкіну-6, фактору некрозу пухлин та вільних форм кисню (Ptak W., Klimek M., Ptak M. et al., 1998; Zhao G.et al.,1999). Крім того, алоксан здатний зменшувати кількість лектинових рецепторів на поверхні макрофагів, що зменшує їх антигенну властивість (Oberg G., Hallgren R., Moberg L.et al., 1986). Тому можна припустити, що саме алоксан обумовлює істотні зміни з боку альфа-2-макроглобуліну.

Та все ж, не зважаючи на коливання в системі інгібіторів в тканинах аорти, коефіцієнт інгібітори еластази/еластаза знижувався. Це свідчило про порушення стану в еластолітичній системі в бік активації протеолізу.

Таким чином, в судинній стінці при алоксановой моделі цукрового діабету також спостерігаються зміни з боку системи „еластаза/інгібітори еластази” у бік активації еластолізу, які здатні в подальшому призвести до артеріосклеротичних змін.

При порівнянні двох моделей цукрового діабету можна зробити висновок, що на ранніх стадіях експериментального цукрового діабету як в сироватці крові, так і в тканинах аорти має місце зсув у системі еластолізу у бік підвищення активності еластази. Це відбувається за рахунок безпосереднього підвищення активності ферменту та зменшення вмісту одного із інгібіторів: при стрептозотоциновой моделі – переважно альфа-2-макроглобуліну, а при алоксановій - за рахунок альфа-1-інгібітору протеїназ. Проте, зміни в системі „еластаза/інгібітори” еластази мають деякі особливості в залежності від моделі. Після введення алоксану було виявлено дуже різке збільшення активності еластази. Цифри, які були отримані, в декілька разів перебільшували показники активності еластази у відповідні строки при стрептозотоциновому діабеті. Даний факт можна пояснити тим, що алоксановий екпериментальний діабет, на відміну від стрептозотоцинової моделі, супроводжується компенсованим кетоацидозом. Зміни кислотно-основного стану у бік ацидозу є фактором безпосередньої активаціі протеолітичних ферментів (Орехович В.Н., Локшина Л.А., 1994; Степанов В.С., 1998; Balo J., Banga I., 1953; Hicks K.K., Seifen E., Stimers J.R. et al.,1997). Крім того, ацидоз опосередковано, через збільшення рівня глюкокортикоїдів, порушує синтез гепатоцитами інгібіторів протеази (Boquist L.,1977; Miethke H. Et.al., 1986). Все це, на фоні розвитку діабету, сприяє різкому зсуву між компонентами еластолітичної системи і, як наслідок, може призводити до більш раннього розвитку артеріосклеротичних змін судинної стінки.

Дослідження активності проеластази, еластази, вмісту кислототермостійких інгібіторов, б1ІП та б2М в тканинах підшлункової залози щурів при алоксановій моделі цукрового діабету.

Порівняно із стрептозотоциновою моделлю, ця серія дослідів дозволила встановити деякі особливості змін активності проеластази, еластази та вмісту її природних інгібіторів у щурів через 5 діб та 4 тижні від початку експерименту.

В табл.8 наведені основні результати досліджень.

Таблиця 8. Активність проеластази, еластази та вміст інгібіторів протеїназ (М?m) в підшлунковій залозі щурів при моделюванні алоксанового цукрового діабета.

Зміст експерименту | Активність

проеластази,

мкМоль?p?NA х?год-1х л- | Активність

еластази,

мкМоль?p?NA х?год-1х л- | б ??інгібітор протеїназ,

г/л |

КТСІ, мг/г |

б 2-макро-глобулін,

г/л | інгібітори / еластаза,

ум. од.

1група; контроль

(n=10) | 62.58 8,37 | 29.91 2,17 | 1.51 0,02 | 0.13 0,02 | 0.97 0,33 | 0.09

5 група; 5 діб післе введення алоксану

( n=5) |

Не визнач. |

21.79 1.92 |

Не визнач.

. |

Не визнач.

. |

0.46 0.02 | -

6 група; 4тиж.після введення алоксану

( n=8) | 26.27 0.65* | 42.65 4.69 * | 0.39 0,10 * | 0.15 0.02 | 0.65 0.05 | 0.027

* - вірогідність у порівнянні з контролем - Р<0.05

Отримані дані свідчать про те, що через 4 тижні після введення алоксану визначається зменшення рівня проеластази (у 2.4 рази у порівнянні з контролем, Р < 0.05), підвищення активності еластази (у 1.4 рази більше у порівнянні з інтактними тваринами, Р < 0.05) та порушення співвідношення між інгібіторами. При невірогідному підвищенні рівня КТСІ рівень альфа-2-макроглобуліну та альфа-1-інгібітору протеїназ (Р< 0.05) знижувався. Коефіцієнт еластолізу знижувався з 0.09 у контрольних тварин до 0.027 - у піддослідних. Таким чином, при алоксановому цукровому діабеті у тканинах підшлункової залози також відбувається порушення балансу між еластазою та її природними інгібіторами у бік збільшення активності протеази.

Не виключено, що кетоацидоз, який супроводжує розвиток алоксанового діабету, спричиняє додаткову патогенну дію на вміст інгібіторів, оскільки рівень альфа-1-інгібітору протеїназ при алоксановій моделі знижувався більше, ніж при стрептозотоциновій.

Отже, порушення балансу між активованою еластазою та її природними інгібіторами у тканинах підшлункової залози при алоксановій моделі діабету може призвести до негативних змін не тільки безпосередньо у цьому органі, але й внести свою частку впливу на розвиток судинних ускладнень при алоксановому цукровому діабеті. Відомо, що протеолітичні ферменти, в тому числі і еластаза, при активаціі у підшлунковій залозі можуть руйнувати тканини органа та потрапляти у кров та кишківник (Локшина Л.А., 1979; Степанов В.С., 1998; Єфімов А.С., 2001). При надходженні у русло крові агресивна еластаза має здатність втручатися у роботу системи гемостазу та інших систем, які працюють за принципом обмеженого протеолізу. Крім того, еластаза може спричиняти вплив на стан судинної стінки – як безпосередньо, розщеплюючи волокна колагену, еластичні структури та порушуючи функції ендотеліоцитів та ГМК.

Насьогодні багато досліджень дозволяють відвести еластазі одне з центральних місць в патогенезі атеро-артеріосклерозу (Биць Ю.В., Досенко В.Є., 1999; Веремєєнко К.М., 1994; Roberts L., 1989; Hornbeck W. et al.,1990; Landi A., Bihari-Varga M. et al., 1992). Збільшення активності еластази лейкоцитарного походження в сироватці крові призводить до порушення функції та загибелі ендотеліальних клітин, а агресивна