Академія медичних наук україни

Інститут епідеміології та інфекційних хвороб

ім. Л.В. Громашевського

БОНДАР ОЛЕКСАНДР ЄВГЕНОВИЧ

УДК: 616.36-002-022.6-07:612.017.1

Клініко-мОРФоЛОГічні ПРОЯВИ ТА ПОКАЗНИКИ Імунної вІдповіді у хворих на HCV-інфекцію

14.01.13 – інфекційні хвороби

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2003

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано в Харківському державному медичному університеті МОЗ України

Науковий керівник:

доктор медичних наук, професор Козько Володимир Миколайович, Харківський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедрою інфекційних хвороб

Офіційні опоненти:

Заслужений діяч науки і техніки України, академік МАП, доктор медичних наук, професор Барштейн Юрій Аркадійович, Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України, науковий консультант

доктор медичних наук, професор Дикий Богдан Миколайович, Івано-Франківська державна медична академія МОЗ України, завідувач кафедрою інфекційних хвороб

Провідна установа:

Одеський державний медичний університет МОЗ України

Захист відбудеться 27.03. 2003 року о 11 годині на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д 26.614.01 при Інституті епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України за адресою: 01015, м. Київ, вул. Січневого повстання, 23.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України за адресою: 03038, м. Київ, узвіз Протасів Яр, 4.

Автореферат розіслано 25.02.2003 року

Вчений секретар Спеціалізованої вченої ради

кандидат медичних наук Ж.Б. Клименко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Вірусні гепатити з парентеральним механізмом передачі являють собою одну з найбільш актуальних проблем сучасної гепатології та інфекційної патології людини (Возіанова Ж.І., Городецкий М.М., 1998; Соринсон С.Н., 1998; Андрейчин М.А., 2001; Барштейн Ю.А., Федорченко С.В., 2001; Hoofnagle J.H., Di Bisceglie A.M. 1997; Шерлок Ш., Дулі Дж., 1999). Особливу увагу дослідників привертає HCV-інфекція. Повідомляється, що у світі інфіковано HCV не менш 500 млн людей (Балаян М.С., Міхайлов М.І., 2000). Україна відноситься до регіонів із досить високим рівнем розповсюдженості HCV-інфекції (Гураль А.Л., 2001). В індустріально розвинутих країнах HCV є причиною розвитку гострих гепатитів у 20% хворих, ХГ – у 70%, ЦП в термінальній стадії – у 40%, ГЦК – у 60-80% (Маммаєв С.Н., 2001; Івашкін В.Т., Надинська М.Ю., 2001).

Спільність шляхів передачі, широка поширеність, висока частота хронізації створюють умови для виникнення великої кількості різних комбінацій мікст-гепатитів, особливо гепатитів В і С, росту кількості яких слід очікувати в Україні (Румянцев О.М. та співавт., 1999; Возiанова Ж.I. та співавт., 2000). Відомості, наведені різними авторами, про особливості перебігу мікст HBV/HCV-гепатиту часом розрізнені і багато в чому суперечливі (Вовк А.Д., Громашевська Л.Л., Гураль А.Л., 2001; Alberti A., 1995; Liaw Y., 1998; Zarski J.-P., 1998).

Підвищення ефективності лікування хворих на HCV-інфекцію залишається складною й далекою від свого рішення проблемою (Лобзін Ю.В., Жданов К.В., 1997; Блохіна Н.П., 1999; Вовк А.Д., 2001; Возіанова Ж.І., Корчинский Н.Ч., 2001; Stadhouders P.H., 1997; Moussalli J. et al., 1998). Обов'язковими умовами успіху лікування є відбір пацієнтів з урахуванням прогнозу терапевтичного ефекту, у зв'язку з чим особливе значення надається факторам і показникам, що дозволяють передбачати можливу відповідь на противірусну терапію (Апросіна З.Г, 1999; Мороз Л.В., 1999; Іваніков О.І., Сюткін В.Є., 2002; Poynard T. et al., 1995; Gross J.B., 1998).

В даний час більшість дослідників вважають, що одним із основних факторів, що визначають подальший перебіг HCV-інфекції, є взаємодія вірусу та імунної системи людини (Дикий Б.М., 1998; Ющук Н.Д. та співавт., 1998; Горбаков В.В., 1998; Буєверов А.О., 1998; Нікітін І.Г. та співавт., 1999; Семененко Т.А., 2000; Івашкін В.Т. та співавт., 2000, 2001; Tsai J.-E, 1996). Відомо, що елімінація вірусів із організму забезпечується адекватною імунною відповіддю, а недостатня інтенсивність імунного запалення сприяє персистенції вірусної інфекції (Гейвандова Н.І. та співавт., 2000).

Незважаючи на велику кількість публікацій, котрі стосуються різних аспектів вивчення HСV-інфекції, до цього часу практично не аналізувались стан систем імунітету та ІФН при різних формах захворювання, взаємозв'язок імунологічних показників і морфологічних змін у печінці, значення показників імунної відповіді, як факторів, що визначають клінічний перебіг, прогноз та ефективність лікування.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертаційну роботу виконано згідно з планом науково – дослідної роботи Харківського державного медичного університету “Вивчення стану компенсаторних механізмів адаптації до інфекційного процесу, патогенетичне обґрунтування використання та удосконалення медикаментозних засобів лікування захворювань, що викликані бактеріями, вірусами, вірусно-бактеріальними і вірусними асоціаціями при гострому та затяжному перебігу”, № державної реєстрації 01980002614.

Мета дослідження: удосконалення підходів до терапії хворих на HCV-інфекцію на підставі вивчення клініко-патогенетичного та прогностичного значення показників імунної відповіді.

Задачі дослідження:

1.

2.

3.

4.

5.

Об?єкт дослідження. Хворі на HCV-інфекцію, лімфоцити периферичної крові, сироватка крові, біоптати печінки хворих на ХГС.

Предмет дослідження. Клініко-патогенетична та прогностична значущість показників імунної відповіді у хворих на HCV-інфекцію.

Методи дослідження. Загальноклінічні аналізи крові, сечі; біохімічні дослідження крові; серологічне й молекулярно-біологічне дослідження крові з метою підтвердження етіології захворювання та оцінки ефективності лікування; визначення вмісту субпопуляцій лімфоцитів периферичної крові, рівня сироваткового ІФН-альфа; ультразвукова ехографія органів черевної порожнини; пункційна біопсія печінки і гістологічне дослідження біоптатів.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше в Харківській області проведено генотипування РНК HCV у хворих на HCV-інфекцію. Виявлено переважне поширення генотипів HCV 1b (41,7%), 3а (23,3%) та їх сполучення (20%).

Вивчено вміст основних субпопуляцій лімфоцитів периферичної крові та рівень сироваткового ІФН-альфа у хворих на HCV-інфекцію і встановлено залежність імунологічних порушень від форми захворювання.

Встановлено зворотну кореляційну залежність між вмістом CD4+ і CD8+ лімфоцитів периферичної крові та гістологічним індексом ступеня активності патологічного процесу в печінці, пряму кореляцію між розвитком фіброзу печінки та вмістом CD20+ лімфоцитів у хворих на ХГС, рівнем сироваткового ІФН-альфа та ступенем гістологічної активності. Показано патогенетичну роль імуноопосередкованих механізмів у розвитку портального та перипортального запально-некротичного процесу.

Проведено терапевтичну та прогностичну оцінку динаміки показників імунної відповіді у хворих на HCV-інфекцію при різних формах захворювання на тлі терапії циклофероном. Встановлено залежність ефективності лікування від результатів імунокорекції. Виявлено прогностичну значущість підвищення вмісту CD4+ лімфоцитів периферичної крові на тлі терапії для біохімічної та вірусологічної ремісії у хворих на ХГС.

Практичне значення отриманих результатів. Результати дослідження дозволили рекомендувати, для уточнення ступеня активності та стадії патологічного процесу в печінці, проведення хворим на латентну та маніфестну форми хронічного гепатиту С біопсії печінки та гістологічного дослідження біоптатів.

З метою підвищення ефективності лікування рекомендовано диференційований підхід до терапії хворих на HCV-інфекцію в залежності від форми захворювання та показників імунної відповіді.

Рекомендовано визначення динаміки вмісту CD4+ лімфоцитів периферичної крові у хворих на хронічний гепатит С до початку та через 3 місяці терапії циклофероном. Підвищення на тлі терапії вмісту CD4+ лімфоцитів периферичної крові (зміна другого ступеня (34-66%) їх недостатності на перший (1-33%) або нормалізація) є прогностичним критерієм стійкої біохімічної та вірусологічної ремісії.

Особистий внесок здобувача. Автор самостійно проаналізував і систематизував сучасну наукову літературу та виконав інформаційно-патентний пошук за темою дисертації. Клінічні, імунологічні дослідження, пункційна біопсія печінки, статистична обробка, інтерпретація, узагальнення й викладення результатів дослідження здійснені автором особисто, сформульовані висновки і практичні рекомендації.

Апробація результатів дисертації. Основні положення результатів досліджень висвітлено та викладено у формі доповідей на науковій сесії Харківського державного медичного університету та конференціях молодих вчених “Медицина третього тисячоліття”, (Харків, 2001-2002 рр.); Харківській обласній науково-практичній конференції “Вирусные гепатиты с парентеральным механизмом передачи и СПИД: проблемы и пути их решения” (Харків, 2001 р.); науково-практичній конференції з міжнародною участю “Сучасна терапія хворих із інфекційною та паразитарною патологією на догоспітальному та госпітальному етапах, методи профілактики” (Харків, 2002 р.); науково-практичній конференції “Екологічна безпека – минуле, сучасне, майбутнє” (Харків, 2002 р.); 57-й науково-практичній конференції студентів та молодих вчених Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця з міжнародною участю “Актуальні проблеми сучасної медицини” (Київ, 2002 р.); 2-й регіональній науково-практичній конференції “Вопросы профилактики и лечения ВИЧ/СПИДа, заболеваний, передающихся половым путем и наркоманий в Харьковском регионе” (Харків, 2002 р.); засіданнях Харківського суспільства інфекціоністів (1999-2002 рр.).

Публікації. Основні положення роботи опубліковано в 8 статтях і 11 тезах доповідей, з них 8 – у фахових виданнях, що затверджені ВАК України.

Структура й обсяг дисертації. Роботу виконано за загальноприйнятою формою на 168 сторінках машинописного тексту; вона складається зі вступу, огляду літератури, розділу власних досліджень із 5 глав, аналізу та узагальнення результатів, висновків і практичних рекомендацій, списку використаної літератури, який включає кирилицею – 157 джерел, латиницею – 119 . Робота містить 25 таблиць, 11 рисунків і 6 мікрофотографій.

Основний Зміст роботи

Об’єкт, об’єм та методи досліджень. Дисертаційну роботу виконано в 1999-2002 рр. в клініці кафедри інфекційних хвороб Харківського державного медичного університету. У роботі представлено результати клініко-лабораторного та інструментального обстеження 146 хворих на HCV-інфекцію віком 15-56 років. Серед них ГГС встановлено у 32 хворих, ЛФ ХГС – у 21, МФ ХГС – у 55 та мікст HBV/HCV-гепатит (гостра HBV/HCV-коінфекція, HBV-суперінфекція на ХГС) – у 38. Контрольну групу склали 20 практично здорових осіб.

Клініко-патогенетичні варіанти перебігу, розмежування гострих і хронічних форм інфекційного процесу, форму і ступінь тяжкості гострого гепатиту визначали згідно зі загальноприйнятими в клінічній практиці критеріями. Діагноз хронічного гепатиту встановлювали відповідно до сучасної міжнародної класифікації хвороб печінки (1994). Підтвердження етіології захворювання здійснювали у всіх хворих виявленням специфічних серологічних маркерів HCV (anti-HCV IgM, anti-HCV IgG, anti-HCV core / NS -3, -4, -5) і HBV (anti-HBcor IgM, HBsAg, HBeAg, anti-HBeAg) методом ІФА з використанням тест-систем виробництва НВО “Диагностические системы” (Росія). Молекулярно-біологічні дослідження включали визначення реплікативної активності HCV і HBV на підставі виявлення в сироватці крові РНК HCV і ДНК HBV якісним методом ПЛР за допомогою тест-систем виробництва НВФ “Литех” (Росія) і напівкількісним методом ПЛР із типуванням геному HCV із використанням тест-систем виробництва ЦНДІ Епідеміології МОЗ Російської Федерації.

Імунологічні дослідження включали визначення вмісту основних субпопуляцій лімфоцитів периферичної крові (CD3, CD4, CD8, CD20, CD56) методом імунофлюоресцентної мікроскопії з використанням набору моноклональних антитіл виробництва “Клоноспектр” (Росія) і рівня сироваткового ІФН-альфа твердофазним імуноферментним методом із використанням набору реагентів “ProCon IF2 plus” виробництва ТОВ “Протеиновый контур” (Росія). Кількісну оцінку імунних розладів розраховували універсальним методом за А.М. Земським (1995), коефіцієнт діагностичної цінності імунологічних показників (Kj) обчислювали за формулою А.Д. Гореліка та В.А. Скрипника (1995).

Аспіраційну пункційну біопсію печінки проведено нами 13 хворим на ХГС голкою Менгіні (Hepafix, B|BRAUN, Німеччина). Біоптати фарбували гематоксиліном та еозином, пірофуксином за Ван-Гізоном. Якісну оцінку стану печінки визначали на основі рангових систем рахунку – гістологічного індексу ступеня активності (ГІСА) і стадії хронізації (ГІСХ) хронічного вірусного гепатиту В і/чи С за В.В. Сєровим, Л.О. Севергіною (1996).

У якості етіотропної терапії використовували індуктор ендогенного інтерферону циклоферон (“Полисан”, Росія) та препарати ІФН-альфа (Лаферон, “Біофарма”, Україна; Інтрон А, “Shering-Plough”, США). Ефективність проведеної терапії у хворих на HCV-інфекцію оцінювали на підставі досягнення біохімічної (нормалізація рівня сироваткової АлАТ) і вірусологічної (зникнення із сироватки пацієнта РНК HCV) ремісії відповідно до рекомендацій Європейської групи по вивченню печінки (Eurohep, 1996).

Результати досліджень оброблено методом варіаційної статистики. Вірогідність розходжень встановлено за критерієм Стюдента.

Результати досліджень та їх обговорення. Серед пацієнтів з HCV-інфекцією захворювання перебігало у формі гострого гепатиту С у 21,9% хворих, латентної форми хронічного гепатиту С – у 14,4%, маніфестної форми хронічного гепатиту С – у 37,7% та мікст HBV/HCV-гепатиту – у 26%. Характер і виразність клініко-лабораторних проявів у хворих на HCV-інфекцію істотно розрізнялись і залежали від форми захворювання.

Для ГГС були характерними поступовий (78,1% хворих) початок захворювання, переважно легкий (75%) перебіг із коротким (4,7±0,5 днів) переджовтяничним періодом по змішаному (65,7%) типу, що включав астеновегетативні та диспепсичні симптоми, помірно виражені в період розпалу хвороби інтоксикаційний і жовтяничний синдроми, збільшення печінки (1,9±0,11 см), біохімічні прояви цитолізу (АлАТ 18,3±1,8 ммоль/(л·г), гіпербілірубінемія, помірна диспротеїнемія.

Латентна форма ХГС характеризувалася відсутністю суб'єктивних проявів захворювання у більшості пацієнтів, нормальним рівнем біохімічних “печінкових” показників (АлАТ 0,37±0,71 ммоль/(л·г) при наявності збільшення печінки (1,8±0,14 см; 76,4% хворих), астеновегетативного і абдомінально-больового синдромів (33,3%), диспепсичних розладів (28,6%) та позитивних тестів індикації РНК HCV у сироватці крові усіх хворих. Клініко-лабораторні показники та результати інструментальних досліджень дозволили розглядати латентну форму HCV-інфекції як хронічний гепатит з мінімальним або слабким ступенем активності у стадії ремісії.

Для клінічного перебігу МФ ХГС була типова відсутність циклічності захворювання, гепатомегалія (2,5±0,3 см; 97,4% хворих) та ущільнення консистенції печінки (26,9%), абдомінально-больовий (73,7%), астеновегетативний (61,8%) і диспепсичний (31,6%) синдроми, збільшення селезінки (31,2%), незначна жовтяниця (28,9%), помірно виражені цитолітичний синдром (АлАТ 3,7±0,71 ммоль/(л·г), порушення пігментного обміну, диспротеїнемія. У більшості хворих (76,4%) встановлено слабкий ступінь активності гепатиту в стадії загострення.

Мікст HBV/HCV-гепатит характеризувався поступовим початком (76,3%) захворювання, переважно легким (55,2%) і середньотяжким (39,5%) перебігом, більш тривалим (8,4±1,4 днів) переджовтяничним періодом, частіше по змішаному (78,9%) типу, шкірно-алергійними проявами (21,1%), вираженою у період розпалу жовтяницею, явищами інтоксикації, гепатомегалією (2,5±0,21 см) з ущільненням консистенції печінки в третини хворих, можливим двохвильовим перебігом хвороби (10,5%), біохімічними ознаками цитолітичного (АлАТ 25,1±2,21 ммоль/(л·г), холестатичного і мезенхимально-запального синдромів. Мікст HBV/HCV-гепатит репрезентован частіше HBV/HCV-коінфекцією (60,5%), рідше – HBV-суперінфекцією на ХГС (39,5%). Фактором ризику HBV/HCV-інфекції було ін'єкційне вживання наркотиків (44,7%).

Застосування напівкількісного ПЛР-аналізу та типування геному РНК HCV у хворих на ЛФ і МФ ХГС дозволило оцінити залежність клінічного перебігу ХГС від вірусного навантаження та генотипу HCV. Так, встановлено, що в групі хворих на МФ ХГС, порівняно з пацієнтами ЛФ ХГС, рідше зустрічалися мінімальна (32,7 і 42,8% осіб, відповідно) і низька (25,5 і 28,6%) концентрації вірусу і частіше реєструвалися середній (32,7 і 23,8%) і високий (9,1 і 4,8%) рівні віремії. Результати генотипування РНК HCV свідчили про найбільшу розповсюдженість у пацієнтів двох груп генотипів HCV 1b (44,1 і 37,5%, відповідно) і 3а (26,5 і 25%), а також їх комбінації (23,5 і 18,8%), що частіше зустрічалися у хворих на МФ ХГС. Навпаки, генотипи HCV 2 і 1а частіше спостерігалися у пацієнтів на ЛФ ХГС.

Взагалі, проведене нами генотипування РНК вірусу гепатиту С у хворих на різні форми HCV-інфекції дозволило встановити, що у Харківській області переважають генотипи HCV 1b (41,7%), 3а (23,3%) та їх сполучення (20%).

Вивчення вмісту основних субпопуляцій лімфоцитів периферичної крові та рівня сироваткового ІФН-альфа у хворих на HCV-інфекцію виявило імунологічні порушення і розходження в імунній відповіді при різних формах захворювання (табл. 1).

Таблиця 1

Вміст субпопуляцій лімфоцитів периферичної крові у хворих на HCV-інфекцію в залежності від форми захворювання (M±m)

Групи обстежених | ЗЧЛ

(10і/?кл) | CD3

(%) | CD4

(%) | CD8

(%) | CD4/CD8 |

CD20

(%) | CD56

(%)

ГГС

(n=30) | 1,97±0,13І?і | 61,8±1,7№?і | 31,9±1,2№?і | 23,7±0,82 | 1,34±0,07№ | 6,8±0,93І?і?* | 9,6±0,82№?і

ЛФ ХГС

(n=21) | 1,52±0,1№ | 54,8±3,7№ | 36,8±2,9і | 23,6±1,21 | 1,56±0,11 | 11,75±1,04 | 7,1±1,38№?і

МФ ХГС

(n=50) | 1,25±0,12№ | 49,1±2,9№ | 25,4±1,9№ | 19,6±1,97 | 1,29±0,08№ | 12,4±1,38№ | 3,9±0,76№

HBV/HCV

(n=30) | 1,65±0,11і | 59±2,3№?і | 33,8±1,8№?і | 24,5±1,36і | 1,38±0,12 | 16,1±1,7№?І | 8,4±1,29№?і

Контроль

(n=20) | 1,8±0,05 | 71,6±1,2 | 39,1±1,1 | 23,1±0,9 | 1,69±0,12 | 8,6±1,3 | 13,8±0,8

Примітка: № - p<0,05 стосовно до групи контролю; І - p<0,05 – до групи ЛФ ХГС;

і - p<0,05 – до групи МФ ХГС; * - p<0,05 – до групи HBV/HCV.

У хворих на гостру форму HCV-інфекції, порівняно з контрольною групою, спостерігалося вірогідне (p<0,05) зниження відносного числа лімфоцитів, що експресують антигени CD3+, CD4+ і CD56+, коефіцієнта CD4/CD8. Крім цього, відзначено тенденцію до підвищення ЗЧЛ і зниження відсотка CD20+ В-лімфоцитів. Серед досліджуваних показників у хворих на ГГС найбільш діагностично інформативними були відносний вміст лімфоцитів CD3+ (Kj=0,09), CD4+ (Kj=0,09) і CD56+ (Kj=0,15), що свідчить про недостатню активність клітинної ланки імунної відповіді, що, можливо, сприяє збереженню збудника і хронізації захворювання. У пацієнтів із ЛФ ХГС ознаки помірної недостатності клітинного імунітету поєднувалися з активацією його гуморальної ланки. Відзначалося вірогідне (p<0,05) зниження ЗЧЛ, вмісту CD3+ і CD56+ лімфоцитів, статистично невірогідне зниження CD4+ лімфоцитів, коефіцієнта CD4/CD8, підвищення відсотка CD8+ і CD20+ клітин у порівнянні з показниками в контрольній групі. Більшою діагностичною значущістю відрізнявся вміст лімфоцитів CD3+ (Kj=0,11), CD56+ (Kj=0,11) і CD20+ (Kj=0,56). Найбільш виражені порушення імунологічних показників як кількісного, так і якісного характеру було виявлено у хворих на МФ ХГС. Реєструвалося вірогідне (p<0,05) зниження, відносно контрольної групи, ЗЧЛ, кількості лімфоцитів, що експресують антигени CD3+, CD4+ і CD56+, індексу CD4/CD8, статистично невірогідне – вмісту CD8+ лімфоцитів. Більш діагностично значущою була кількість лімфоцитів CD56+ (Kj=0,03), CD3+ (Kj=0,04) і CD4+ (Kj=0,05). У цій групі хворих недостатність клітинного імунітету сполучалася з збільшенням відсотка В-лімфоцитів, що може свідчити про підвищення активності та неефективність гуморальної відповіді при хронічній HCV-інфекції. В групі хворих на мікст HBV/HCV-гепатит, порівняно з контролем, вірогідно (p<0,05) був зниженим вміст CD3+, CD4+ і CD56+ лімфоцитів. Відсоток лімфоцитів, що експресують антиген CD20+, вірогідно (p<0,05) перевищував відповідний показник у контрольній групі. Також, спостерігалася тенденція до зниження ЗЧЛ і коефіцієнта CD4/CD8, підвищення відсоткового вмісту CD8+ лімфоцитів. Висока діагностична цінність була притаманна вмісту CD3+ (Kj=0,09), CD56+ (Kj=0,16) і CD20+ (Kj=0,16) лімфоцитів. Взагалі, при знижених показниках клітинної імунної відповіді при мікст HBV/HCV-інфекції виявлено виражену активацію гуморальної ланки імунітету.

З метою визначення клінічного значення імунних порушень нами проведено порівняльну оцінку досліджуваних показників у хворих на різних стадіях HCV-інфекції, при гострому моно-гепатиті С та мікст-інфекції HВV/HCV. У групі хворих на ГГС ЗЧЛ вірогідно (p<0,05) було вищим, ніж у пацієнтів із ЛФ та МФ ХГС. При цьому відзначалася тенденція до подальшого зниження ЗЧЛ від латентної до маніфестної стадії ХГС. Аналогічні прогресуючі зміни виявлено у відносному вмісті CD3+ і CD56+ лімфоцитів, однак, вірогідні розходження цих показників відзначено лише на стадіях ГГС і МФ ХГС. Рівень CD4+ лімфоцитів у групі ГГС і ЛФ ХГС вірогідно (p<0,05) перевищував відповідний показник у хворих на МФ ХГС. Максимальним відносний вміст CD4+ Т-клітин був у пацієнтів із ЛФ ХГС. Це може вказувати на важливу роль CD4+ лімфоцитів у збереженні “рівноваги” між вірусом і організмом, попередженні прогресу хвороби. Аналогічні розходження зафіксовано в значеннях коефіцієнта CD4/CD8. Рівень CD8+ лімфоцитів статистично не відрізнявся в досліджуваних групах, але був вищим при ГГС і ЛФ ХГС. Відносний вміст CD20+ лімфоцитів підвищувався від стадії ГГС до МФ ХГС і в групах хворих на ЛФ і МФ ХГС вірогідно (p<0,05) перевищував рівень В-лімфоцитів у хворих на ГГС. Встановлений прогресуючий характер імунологічних порушень від стадії ГГС до МФ ХГС указує на формування вторинного клітинного імунодефіциту при HCV-інфекції і залежність активації патологічного процесу, клінічного перебігу захворювання від виразності імунної недостатності при хронічному гепатиті.

Порівняння імунологічних показників у групах хворих на ГГС і мікст HBV/HCV-гепатит виявило вірогідне (p<0,05) перевищення вмісту CD20+ В-лімфоцитів у групі хворих на мікст-гепатит, що дозволяє припустити зв'язок і значний ступінь активації гуморальної відповіді з HBV. Також відзначено тенденцію до збільшення у хворих на HBV/HCV-інфекцію відсотка CD4+ і CD8+ лімфоцитів, коефіцієнта CD4/CD8. У групі хворих на ГГС були вищими ЗЧЛ, кількість клітин CD3+ і CD56+.

У хворих на HCV-інфекцію досліджуваних груп реєструвався підвищений рівень ІФН-альфа в сироватці крові, порівняно з групою контролю (рис. 1). При цьому у хворих на ГГС, МФ ХГС і мікст-гепатит рівень ІФН-альфа вірогідно (p<0,05) перевищував значення у контролі.

Рисунок 1. Рівень сироваткового ІФН-альфа у хворих на HCV–інфекцію в залежності від форми захворювання.

Аналіз вмісту сироваткового ІФН-альфа в залежності від стадії HCV-інфекції виявив вірогідно (p<0,05) більш високий рівень у хворих на ГГС у порівнянні із групами хворих на ЛФ і МФ ХГС. Різниця у вмісті ІФН-альфа в хворих на ЛФ і МФ ХГС була статистично невірогідною, однак більш високим був рівень ІФН у групі хворих на МФ ХГС. У хворих на ГГС і мікст HBV/HCV-гепатит рівень сироваткового ІФН-альфа статистично не відрізнявся (p>0,05), що дозволяє зробити припущення про незалежність ступеня підвищення досліджуваного показника від виду (моно- чи мікст-інфекція) гострого гепатиту.

Пункційну біопсію печінки і гістологічне дослідження біоптатів виконано 13 хворим на ХГС до призначення етіотропної терапії. Морфологічні дослідження дозволили уточнити ступінь активності процесу, наявність фіброзу печінки та співставити ці зміни зі клінічною картиною захворювання, активністю вірусної реплікації, показниками імунної відповіді і виразністю цитолітичного синдрому.

Ознаки гепатиту зі слабкою активністю (ГІСА 17±0,81 балів) були встановлені в 4 випадках, з помірною активністю (ГІСА 24±0,83 балів) – у 8 хворих. В одного пацієнта не виявлено ознак патологічного процесу; випадків гепатиту з вираженою активністю нами не зафіксовано. Перипортальні некрози гепатоцитів мали сегментарний характер і в більшості випадків (8) спостерігалися в частині портальних трактів, рідше (4 випадки) – у всіх портальних трактах. Мостовидні некрози не зустрічалися. У 3 випадках реєструвалися інтролобулярні фокальні некрози в частині часточок. Гідропічна та жирова дистрофія гепатоцитів спостерігалась у 12 хворих, переважно була вираженою (5±0,34 балів) і носила змішаний характер. Балонна дистрофія самостійно чи в сполученні зі тільцями Каунсильмена відзначалася у 7 випадках. Запальний інфільтрат у портальних трактах і перипортальній зоні був відзначений у 12 хворих і репрезентований переважно лімфоцитами. За ступенем виразності переважала помірна перипортальна інфільтрація (3,2±0,25 балів). Запальний інфільтрат у середині часточок виявлено у 5 випадках. Нами не спостерігалось лімфоїдних фолікулів у портальних трактах та у середині часточок, що, ймовірно, пов'язано з відсутністю вираженої активності патологічного процесу. Зміни синусоїдів у вигляді гіперплазії зірчастих ретикулоендотеліоцитів і ендотелію, ланцюжків лімфоцитів у синусоїдах реєструвалися в 11 хворих. Деструкції жовчних проток не спостерігалося. В одного хворого відзначено слабко виражену проліферацію жовчних проток.

Про стадію захворювання (ступінь хронізації) судили за виразністю фіброзу печінки. У більшості пацієнтів (10 осіб) реєструвались фіброз і розширення портальних трактів. Сегментарний перипортальний фіброз і синусоїдальний фіброз більшості часточок відзначалися у 2 випадках. У трьох хворих спостерігався фіброз із утворенням портальних септ. Слабкий фіброз і 1-у стадію хронізації гепатиту (ГІСХ 2±0,15 балів) зафіксовано у 9 хворих, помірний фіброз (2-а стадія хронізації, ГІСХ 7 балів) і тяжкий фіброз (3-я стадія, ГІСХ 12 балів) – відповідно в 1 і 2 випадках.

Розходження морфологічних змін у печінці, що характеризують активність запально-некротичного процесу і стадію хронізації, у хворих на ЛФ (5 осіб) і МФ (8 осіб) ХГС носили переважно кількісний характер. Встановлено вірогідно (p<0,05) більш високу гістологічну активність гепатиту в групі хворих на МФ ХГС (ГІСА 23,4±1,35 балів) у порівнянні з хворими на ЛФ ХГС (ГІСА 14,2±4,1 балів). Розвиток фіброзу печінки у хворих на МФ ХГС (ГІСХ 5,1±1,74 балів) і ЛФ ХГС (ГІСХ 1,8±0,55 балів) вірогідно не відрізнялися (p>0,05).

Серед 5 пацієнтів із латентним перебігом HCV-інфекції лише в одному випадку в біоптаті печінки не виявлено патологічних змін; слабкий ступінь гістологічної активності встановлено у 3 хворих, помірний – в одного. Слабкий фіброз і 1-а стадія хронізації мали місце у 4 хворих цієї групи. Таким чином, ЛФ ХГС в більшості випадків супроводжується гістологічними ознаками гепатиту, що свідчить про наявність патологічного процесу в печінці на цій стадії захворювання.

Кореляційний аналіз не виявив взаємозв'язку між активністю вірусної реплікації при напівкількісному ПЛР-аналізі та гістологічним індексом ступеня активності патологічного процесу в печінці і його складовими, виразністю цитолітичного синдрому за рівнем АлАТ.

Встановлено вірогідний зворотний кореляційний зв'язок між відсотковим вмістом CD4+ лімфоцитів і ГІСА (rs=0,55; p<0,05), перипортальними сегментарними некрозами гепатоцитів (rs=0,52; p<0,05). Рівень CD8+ лімфоцитів зворотньо корелював із ГІСА (rs=0,64; p<0,025) і гістологічними показниками, що характеризують активність патологічного процесу в портальних трактах, зокрема, перипортальними сегментарними некрозами гепатоцитів (rs=0,52; p<0,05), портальною і перипортальною інфільтрацією (rs=0,54; p<0,05). Встановлений зворотний характер зв'язку між вмістом CD4+ і CD8+ лімфоцитів і ГІСА свідчить про залежність активності гепатиту від стану клітинної ланки імунітету. При недостатності клітинного імунітету, що характеризується зниженим вмістом у крові CD4+ і CD8+ Т-лімфоцитів, відзначається вища активність патологічного процесу в печінці. Зв'язок вмісту CD4+ і CD8+ лімфоцитів периферичної крові з гістологічними параметрами, що характеризують портальний і перипортальний компонент запально-некротичного процесу, вказує на можливу міграцію антиген-специфічних Т-хелперів і цитотоксичних лімфоцитів у печінку та особисту участь цих субпопуляцій лімфоцитів у розвитку порто-перипортальної інфільтрації і некрозів, реалізуючи тим самим імуноопосередкований механізм ушкодження печінки.

Між відсотковим вмістом CD20+ лімфоцитів і виразністю фіброзу печінки встановлено прямий вірогідний кореляційний зв'язок (rs=0,6; p<0,05). Взаємозв'язок між цими параметрами, встановлена раніше тенденція до активації гуморальної ланки імунітету у хворих на хронічні форми HCV-інфекції може свідчити про залежність гіперфункції гуморального імунітету і ступеня розвитку фіброзу від тривалості хронічного гепатиту. Отже, характеристика В-системи імунітету, зокрема, вміст CD20+ лімфоцитів периферичної крові, може відображати розвиток фіброзу та стадію хронізації ХГС.

Рівень сироваткового ІФН-альфа у хворих на ХГС вірогідно прямо корелював із ГІСА (rs=0,65; p<0,05), інтралобулярними некрозами гепатоцитів (rs=0,64; p<0,05), балонною дистрофією гепатоцитів і гіперплазією ендотелія (rs=0,62; p<0,05), що свідчить про залежність цього показника від активності гепатиту.

Аналіз взаємозв'язку морфологічних змін у печінці з виразністю цитолітичного синдрому виявив вірогідний кореляційний зв'язок рівня АлАТ із ГІСА (rs=0,65; p<0,05), інтралобулярними некрозами гепатоцитів (rs=0,59; p<0,05), перипортальними некрозами гепатоцитів і порто-перипортальною запальною інфільтрацією (rs=0,54; p<0,05). Установлені зв'язки свідчать про залежність цитолізу гепатоцитів та активності патологічного процесу в печінці.

З метою визначення терапевтичного та прогностичного значення показників імунної відповіді при HCV-інфекції нами проведено порівняльну оцінку динаміки вмісту основних субпопуляцій лімфоцитів периферичної крові та клінічної ефективності терапії у хворих з різними формами захворювання. Дослідження проведені в 32 хворих на ГГС, 21 – ЛФ ХГС, 50 – МФ ХГС і 36 – HBV/HCV-інфекцію (з легким і середньотяжким перебігом), які отримували індуктор ендогенного ІФН циклоферон, що володіє імуномодулюючою, противірусною та антипроліферативною дією. Групи пацієнтів були репрезентативними. Циклоферон застосовували за стандартною схемою протягом 3 місяців. Хворим на ЛФ і МФ ХГС лікування циклофероном продовжували до 6 місяців за підтримуючою схемою.

Імунологічні показники оцінювали до і після завершення тримісячного курсу терапії циклофероном. Для кількісної оцінки динаміки імунологічних показників на тлі лікування за допомогою коефіцієнта діагностичної цінності з усіх вивчених параметрів, починаючи від вихідного рівня, відбирали три ведучі параметри та визначали формулу мішеней імунокорекції.

У групі хворих на ГГС (рис. 2) після завершення курсу терапії спостерігалося вірогідне (p<0,05) підвищення вмісту CD4+, CD20+ лімфоцитів і коефіцієнта CD4/CD8. Рівень клітин, що експресують антигени CD3+, CD8+ і CD56+, незначно збільшився, а ЗЧЛ – зменшилося. При цьому більшість показників не відрізнялися від контрольних значень, за винятком вірогідно (p<0,05) зниженої кількості CD3+ і CD56+ лімфоцитів. Найбільш диагностично значущим були підвищення коефіцієнта CD4/CD8 (Kj=0,01), відносного вмісту CD4+ (Kj=0,12) і CD20+ лімфоцитів (Kj=0,25), що свідчило про активацію як клітинної, так і гуморальної імунної відповіді в процесі лікування.

У групі пацієнтів із ЛФ ХГС (рис. 3) не зафіксовано вірогідних змін в ЗЧЛ і вмісті субпопуляцій лімфоцитів периферичної крові на тлі терапії. Відповідно, діагностична цінність досліджуваних параметрів, що відображає ефективність імунокорекції, у цій групі хворих була низькою: CD8+ (Kj=1,06), CD56+ (Kj=3,29), CD4/CD8 (Kj=5,31).

Рисунок 2. Динаміка вмісту субпопуляцій Рисунок 3. Динаміка вмісту субпопуляцій лімфоцитів периферичної крові у хворих лімфоцитів периферичної крові у хворих на ГГС на тлі терапії. на ЛФ ХГС на тлі терапії.

У хворих на МФ ХГС (рис. 4) у процесі лікування вірогідно (p<0,05) підвищився вміст CD3+, CD4+ лімфоцитів і коефіцієнта CD4/CD8. Крім цього відзначалися тенденції до збільшення ЗЧЛ і CD56+ лімфоцитів, зменшення кількості клітин, що експресують антигени CD8+ і CD20+. Порівняно з показниками в контрольній групі, у хворих на МФ ХГС після трьох місяців терапії зберігалося вірогідне (p<0,05) зниження ЗЧЛ, вмісту CD3+, CD4+, CD8+ і CD56+ лімфоцитів. Найбільш диагностично інформативним результатом імунокорекції було підвищення коефіцієнта CD4/CD8 (Kj=0,26), рівня CD4+ (Kj=0,27) і CD3+ лімфоцитів (Kj=0,5). Однак, вірогідні відмінності від нормальних значень рівня більшості імунокомпетентних клітин свідчили про зберігання імунодефіцитного стану.

Рисунок 4. Динаміка вмісту субпопуляцій Рисунок 5. Динаміка вмісту субпопуляцій

лімфоцитів периферичної крові у хворих лімфоцитів периферичної крові у хворих на МФ ХГС на тлі терапії. на мікст HBV/HCV-гепатит на тлі терапії.

У хворих на мікст HBV/HCV-гепатит (рис. 5) на тлі терапії вірогідно (p<0,05) підвищився рівень CD4+ і CD8+ Т-лімфоцитів. Збільшення ЗЧЛ, вмісту CD3+, CD20+, CD56+ клітин і співвідношення CD4/CD8 було статистично невірогідним. У порівнянні з групою контролю, у хворих на мікст-гепатит відзначалися вірогідно (p<0,05) знижене число CD3+ лімфоцитів і CD4/CD8, підвищена відносна кількість CD8+ і CD20+ клітин. Диагностично значимими показниками імунокорекції були CD4+ (Kj=0,15), CD8+ (Kj=0,32) і CD20+ лімфоцити (Kj=0,79), рівень яких у процесі лікування підвищився і перевищив нормальні значення.

Оцінка клінічної ефективності терапії у хворих на HCV-інфекцію свідчить про більшу частоту біохімічної та вірусологічної ремісії (паст-інфекція) у хворих на гостру форму захворювання (табл. 2, 3). У хворих на маніфестну форму ХГС ефективність терапії, насамперед, частота вірусологічній ремісії, на всіх тимчасових етапах контролю значно перевищувала ефект лікування пацієнтів із латентною формою хвороби.

Ефективність терапії у хворих на мікст HBV/HCV-інфекцію незначно відрізнялася від ефекту лікування хворих на ГГС. Це може свідчити про взаємопригнічувальну дію вірусів В та С, важливе значення початку специфічного лікування в гостру фазу гепатиту. Хронізація (інтегративна форма) HBV-інфекції через 12 місяців спостереження встановлено в одного хворого (2,8%).

Зіставлення результатів імунологічних досліджень і клінічної ефективності терапії у хворих на HCV-інфекцію дозволило визначити характер імунної відповіді організму при різних формах хвороби і оцінити значення динаміки імунологічних показників щодо розвитку ремісії захворюваня та елімінації вірусу.

Таблиця 2

Ефективність терапії циклофероном хворих на HCV-інфекцію.

Біохімічна оцінка

Групи хворих | Первинна ремісія | Стійка ремісія

(паст-інфекція) | Рецидив на тлі лікування | Рецидив після лікування | стійкість до лікування

Абс. ч. | % | Абс. ч. | % | Абс. ч. | % | Абс. ч. | % | Абс. ч. | %

ГГС (n=32) | 32 | 100 | 30 | 93,75 | 0 | 0 | 2 | 6,25 | 0 | 0

ЛФ ХГС (n=21) | 20* | 95,2* | 19 | 90,5 | 4 | 19,1 | 2 | 9,5 | - | -

МФ ХГС (n=50) | 43 | 86 | 34 | 68 | 3 | 6 | 9 | 18 | 7 | 14

HBV/HCV (n=36) | 34 | 94,4 | 31 | 86,1 | 2 | 5,6 | 3 | 8,3 | 2 | 5,6

Примітка: * - збереження нормального рівня АлАТ.

Таблиця 3

Ефективність терапії циклофероном хворих на HCV-інфекцію.

Вірусологічна оцінка

Групи хворих |

3 міс | 6 міс | 12 міс

Абс. ч. | % | Абс. ч. | % | Абс. ч. | %

ГГС (n=32) | 21 | 65,6 | 18 | 56,3 | 12 | 37,5

ЛФ ХГС (n=21) | 3 | 14,3 | 2 | 9,5 | 2 | 9,5

МФ ХГС (n=50) | 17 | 34 | 18 | 36 | 12 | 24

HBV/HCV (n=36) | 20 | 55,6 | 17 | 47,2 | 13 | 36,1

Найбільш висока клінічна ефективність терапії у хворих на ГГС свідчить, що активація як клітинної (CD4+), так і гуморальної (CD20+) імунної відповіді асоціюється з ефектом лікування. Відповідно, вихідний стан і динаміка імунологічних показників, відзначені при гострій формі HCV-інфекції, сприяють, а можливо і визначають адекватну противірусну стратегію організму, сприятливий перебіг захворювання та прогноз для терапії. У хворих на ХГС ефективність терапії і динаміка показників імунної відповіді суттево відрізнялися на латентній та маніфестній стадіях. Активація клітинного імунітету, насамперед підвищення вмісту CD4+ лімфоцитів, ймовірно, посилення Т-хелперної проліферативної відповіді на антигени HCV, спостерігалася при МФ ХГС і супроводжувалась більш високим ефектом лікування. Відповідно, відсутність діагностично значимої динаміки імунологічних показників і посилення імунної відповіді, неефективна імунокорекція не призводили до високого терапевтичного ефекту при латентному перебігу ХГС. Отримані результати дозволили розглядати підвищення вмісту CD4+ лімфоцитів (зміну другого ступеня їх недостатності на перший або нормалізацію) на тлі терапії як сприятливий прогностичний критерій стійкої біохімічної та вірусологічної ремісії у хворих на ХГС і свідчили про доцільність продовження терапії циклофероном. Виражена активація імунної відповіді (CD4+, CD8+), в тому числі гуморальної ланки імунітету (CD20+), асоціювалася із високою ефективністю терапії при мікст HBV/HCV-інфекції.

ВИСНОВКИ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1.

2.