НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

БАРАНЕНКО ВАЛЕНТИНА ВАСИЛІВНА

УДК 54.024;66.094.1;628.16.094

ПЕРОКСИДНЕ ОКИСНЕННЯ ЛІПІДІВ ТА АКТИВНІСТЬ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗИ В РОСЛИНАХ ГОРОХУ ЗА УМОВ КЛІНОСТАТУВАННЯ

03.0011 – цитологія, клітинна біологія, гістологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі клітинної біології та анатомії рослин Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, м. Київ

Науковий керівник: - член-кореспондент НАН України,

доктор біологічних наук, професор

Кордюм Єлизавета Львівна,

Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного

НАН України, завідувач відділу

клітинної біології та анатомії

Офіційні опоненти: - член-кореспондент НАН України,

доктор біологічних наук, професор

Кунах Віктор Анатолійович,

Інститут молекулярної біології та

генетики НАН України, завідувач

відділу генетики клітинних популяцій

- кандидат біологічних наук

Бурлака Анатолій Павлович,

Інститут експериментальної патології,

онкології та радіобіології ім. Р.Є.

Кавецького НАН України, старший

науковий співробітник відділу

біофізики канцерогенезу

Провідна установа: Київський національний університет ім.

Тараса Шевченка.

Захист відбудеться “22травня 2003 р. о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.202.01 в Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, Київ-143, вул. акад. Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, Київ – 143, вул. Акад. Заболотного, 148.

Автореферат розісланий “17квітня 2003 року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук ______________ Кравець О.А.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Окисно-відновні процеси є важливою складовою метаболізму і безперервно відбуваються в організмах рослин будь-якого рівня організації. Серед окиснювальних реакцій важливим є процес пероксидного окислення ліпідів (ПОЛ). За звичайних умов функціонування рівень ПОЛ незначний і виключає накопичення токсичних продуктів окислення в концентраціях, шкідливих для організму. Проте, за дії різноманітних несприятливих факторів інтенсивність ПОЛ зростає (Чиркова, 1998; Liu and Huang, 2000; Shalata and Tal, 1998). Аналіз літературних джерел засвідчує, що активація ПОЛ є універсальним механізмом пошкодження мембранних структур клітин за несприятливих впливів та в процесі старіння рослин [Blokhina et al,1999; Kung and Kao,1998]. Інтенсифікація ПОЛ супроводжується змінами жирнокислотного складу ліпідів мембран, їх вязкості та провідності іонів і води, активності мембранозвязаних ферментів тощо (Лукаткин и Левина,1997; Мерзляк,1989; Чиркова, 1998). Характер змін значною мірою залежить від напруженості дії стресового фактора, чутливості організму, стадії його розвитку тощо. Оскільки, активація ПОЛ є неспецифічною реакцією, припускається, що перебудови метаболізму рослин за умов зміни сили тяжіння певною мірою спричинюються активацією процесів ПОЛ. За умов зміни сили тяжіння виявлено широкий спектр перебудов як на рівні клітин, так і всього організму, причини яких повністю ще не з?ясовані (Кордюм и др., 1989; Kordyum, 1997). Інтенсивність ПОЛ за умов зміненої сили тяжіння висвітлена в поодиноких працях феноменологічного характеру (Жадько, 1991). Відсутні дані щодо перебігу ПОЛ у фотосинтезуючих тканинах (листках) рослин, а також у хлоропластах. Водночас літературні дані засвідчують, що хлоропласти з їх досить сильним окислювальним потенціалом можуть бути особливо чутливими до окислювальних пошкоджень (Asada, 1996; Foyer, 1994). Також відсутні дані стосовно утворення активних форм кисню (АФК) – ініціаторів ПОЛ у клітинах і тканинах рослин за умов зміни сили тяжіння.

Важливим регулятором ПОЛ є багатокомпонентна антиоксидантна система; зміни інтенсивності ПОЛ супроводжуються певними перебудовами в системі захисту, від яких значною мірою залежить адаптація рослин до умов існування. Провідним ферментом системи захисту є супероксиддисмутаза (СОД), яка каталізує дисмутацію супероксидного аніон-радикалу до пероксиду водню та кисню. Систему захисту від окислювальної деструкції в умовах зміненої сили тяжіння вивчали лише на основі вимірювання загальної кількості спирторозчинних антиоксидантів (Жадько, 1991). Дані щодо активності СОД відсутні.

Отже, перебіг процесів ПОЛ, а також стан системи захисту за умов зміни сили тяжіння вивчені недостатньо і потребують детальнішого зясування, особливо в звязку з їх можливою участю у перебудовах метаболізму рослин за цих умов.

Звязок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано за науковими темами відділу клітинної біології та анатомії рослин Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України № 242 (1996-1997 pр.) "Космобіологія: біологія клітин в умовах мікрогравітації, методологія діагностування фізіолого-біохімічного та імунологічного стану біологічних систем”, № державної реєстрації 01934032386; № 305 (1998-1999 pр.) “Обгрунтування пропозицій щодо досліджень впливу мікрогравітації на ріст та розвиток організмів”, № державної реєстрації 0198U004498; № 312 (2000-2002 рр.) “Розробка та створення польотного обладнання для космічних біологічних і біотехнологічних експериментів та проведення наземних досліджень”, № державної реєстрації 0100V004187.

Мета роботи та завдання дослідження. Мета роботи полягала у вивченні характеру перебігу ПОЛ та активності СОД в рослинах гороху (Pisum sativum L.) на клітинному й органному рівнях за умов зміненої гравітації в звязку з питаннями участі ПОЛ у перебудовах метаболізму та адаптації рослин до цих умов.

Для досягнення поставленої мети потрібно було виконати наступні завдання:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

Об?єкт дослідження – листки, корені та хлоропласти рослин гороху (Pisum sativum L.), що зростали за умов стаціонарного контролю та кліностатування (7 і 14 діб).

Предмет дослідження – інтенсивність ПОЛ в листках, коренях та хлоропластах гороху за умов кліностатування.

Методи дослідження. Спонтанна та люмінолзалежна хемілюмінесценція (ЛЗХЛ), спектрофотометрія, тонкошарова і газорідинна хроматографія, полярографічний метод. Статистичну обробку результатів досліджень здійснювали за стандартними методиками.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено комплексне вивчення перебігу процесу ПОЛ в листках, коренях і хлоропластах рослин гороху за умов зміненої гравітації, що дало змогу проаналізувати взаємозвязки між активацією ПОЛ та перебудовами в рослинних клітинах і тканинах за зазначених умов. Встановлено зростання інтенсивності ПОЛ в клітинах і тканинах гороху за умов кліностатування, особливо зі збільшенням терміну впливу. Відмічено більш високий рівень пероксидації в листках порівняно з коренями.

Вперше вивчено продукцію АФК – ініціаторів ПОЛ - в листках, коренях і хлоропластах рослин гороху за умов зміненої гравітації. Зафіксовано посилення їх утворення в клітинах та тканинах гороху за зазначених умов із тенденцією до зростання в разі подовження терміну впливу. Співвідношення між окремими АФК також змінювалося за умов кліностатування. Якщо у контрольних рослин переважало продукування радикалів супероксиду, то за умов кліностатування зростала частка інших АФК, зокрема досить реакційноздатних гідроксильних радикалів.

З?совано, що зміни в ліпідному та жирнокислотному складі фотосинтезуючих тканин рослин гороху за 7-добового кліностатування пов?язані з адаптивними процесами. При цьому виявлено зростання вмісту гліко- та фосфоліпідів у листках гороху зі збереженням співвідношення між окремими класами ліпідів. Вміст ненасичених жирних кислот ліпідів мембран хлоропластів також зростав за умов 7-добового впливу і ці зміни були спрямовані на попередження переходу мембран із рідинно-кристалічного стану в твердий гель внаслідок селективного окислення ненасичених жирних кислот (ЖК). За умов 14-добового кліностатування знижувались вміст ліпідів та індекс ненасиченості ЖК, що може бути пов?язано з подальшою активацією ПОЛ.

Вперше прояналізовано взаємозв?язки між інгібуванням швидкості електронного транспорту в повному ланцюзі і на рівні окремих фотосистем (ФС) та активацією вільнорадикального окислення в хлоропластах за умов зміненої гравітації.

Вперше відмічено зростання активності СОД в листках, коренях і хлоропластах гороху за 7-добового кліностатування, що мало важливе значення для адаптації рослин до зазначених умов. За умов 14-добового кліностатування активність СОД незначно перевищувала показники у відповідних контрольних зразках, наслідком чого було подальше зростання продукування вільних радикалів.

Практичне значення одержаних результатів. Результати роботи поглиблюють існуючі уявлення щодо біологічних ефектів мікрогравітації та причин перебудов в клітинах та тканинах рослин за умов зміни сили тяжіння.

Результати досліджень можуть бути використані для надання практичних рекомендацій стосовно розробки технологій космічного рослинництва., а також у курсі занять спеціалізованих біолого-хімічних класів при середніх школах, лекцій з клітинної біології рослин у вищих закладах освіти та ввійти до підручника з клітинної біології. Зокрема, результати дочсліджень були використані в курсі лекцій та практичних занять науково-практичного семінару з клітинної біології для молодих вчених, що проходив на базі Інституту ботаніки НАНУ 19-29 червня, 2001 року у місті Києві.

Особистий внесок здобувача. Основні результати досліджень, представлені у дисертації, отримані автором самостійно у відділі клітинної біології та анатомії рослин Інституту ботаніки НАНУ. Автором було проаналізовано отримані результати та сформульовано висновки.

Апробація результатів дисертації. Основні результати роботи були представлені на міжнародній конференції “Кисень, вільні радикали та окислювальний стрес в рослинах” (Гранада, Іспанія, 1998), 19 Міжнародній конференції з гравітаційнійної фізіології (Рим, Італія, 1998); ІV зїзді товариства фізіологів рослин Росії (Москва, Росія, 1999), Всеукраїнській молодіжній науково-практичній конференції “Людина і космос” (Дніпропетровськ, Україна, 1999), 32 Науковій асамблеї КОСПАР (Варшава, Польша, 2000), Міжнародному симпозіумі “Внутрішньоклітинний сигналінг в рослиних та тваринних системах” (Київ, Україна, 2001), 2 Українській конференції з перспективних космічних досліджень (Кацивелі, Крим, 2002), VIII Ураїнському біохімічному з?їзді (Чернівці, 2002), а також на засіданнях вченої ради Інституту ботаніки НАН України.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 11 праць, з них - 4 статті у фахових наукових виданнях та 7 тез доповідей на наукових конференціях і зїздах.

Структура та об?єм роботи. Дисертація робота викладена на 160 сторінках машинописного тексту і складається з вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідженнь, 5 розділів результатів дослідженнь та їх обговорення, заключної частини, висновків і списку використаних літературних джерел з 349 назв, зних 277 іноземних. Дисертація ілюстрована 23 рисунками та 8 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Обєктами досліджень були листки, корені та хлоропласти рослин гороху Pisum sativum L. сорту Інтенсивний. Рослини вирощували протягом 7 і 14 діб за 16-годинного світлового режиму, температури 25оС/20оС (день/ніч), вологості повітря 70%, освітлення 7000 лк. Рослини поливали поживним розчином Кнопа. Контрольні рослини вирощували в аналогічних умовах за винятком кліностатування. В дослідженнях були використані гомогенати листків і коренів, а також фракція хлоропластів.

Умови мікрогравітації в лабораторних умовах моделювали за допомогою горизонтальних кліностатів, що повільно оберталися (2 обхв, 2,7 10-4 g).

Інтенсивність ПОЛ вивчали на різних етапах розвитку процесу: на етапі утворення АФК - ініціаторів ПОЛ, на проміжному - утворення пероксидних радикалів ліпідів та кінцевому етапі - утворення малонового діальдегіду. В даних дослідженнях було використано два незалежні методи: реєстрацію інтенсивності хемілюмінесценції (спонтанної і люмінолзалежної) та спектрофотометричне дослідження вмісту ТБКАП. Ці методи були використані тому, що вони характеризують ПОЛ різнобічно – на вільнорадикальному та молекулярному рівнях.

Інтенсивність хемілюмінесценції визначали за допомогою хемілюмінометра ХЛМ1Ц-01 із детектором світіння ФЕУ-130. Для вивчення спонтанної (СХЛ) хемілюмінесценції були використані лише корені; від зелених тканин сигнал СХЛ не реєструється, оскільки кванти світла поглинаються хлорофілом і за межі клітин не виходять (Тарусов и Веселовский, 1978). Для визначення інтенсивності СХЛ відрізали головні корені проростків гороху завдовжки 30 мм (15 штук) і вміщували у скляну кювету приладу. Фіксували кількість імпульсів за 2 хв. Після вимірювання СХЛ корені зважували й інтенсивність світіння перераховували в імпульсах за 1 хв на 1 г сирої маси.

Люмінолзалежна хемілюмінесценція зумовлена АФК (Владимиров и Шерстнев, 1989), тому даний метод було використано для вивчення утворення АФК в листках, коренях і хлоропластах гороху в контролі та за умов кліностатування. Для вивчення ЛЗХЛ брали люмінол у концентрації 10-2М у разі листків і хлоропластів та 10-4М - коренів. Люмінол практично не змінює концентрацію АФК під час хемілюмінесцентного аналізу, чим і зумовлений його вибір для наших досліджень. Інтенсивність ЛЗХЛ виражали числом імпульсів за 1 хвилину, оскільки наважки у всіх випадках були однаковими.

Для зясування, які саме АФК беруть участь у хемілюмінесцентному перетворенні люмінолу в котролі та під час кліностатування використовували наступні інгібітори АФК: СОД (100, 150 і 200 мкг/мл) та 1% розчин тетраоксиду осмію - для зясування можливої участі радикалів супероксиду; бензоат натрію (25, 50 та 100 мМ) та манітол (25, 50; 100 мМ) - як дезактиватори гідроксильних радикалів; гістидин (50, 100 мМ) та гідрохінон (25, 50 та 100 мМ) - як гасники синглетного кисню; каталазу (100, 150 та 200 мкг/мл) - як інгібітор Н202. Концентрації інгібіторів підбирали експериментально і збільшували доти, доки інтенсивність ЛЗХЛ не переставала змінюватись. На діаграмах наведено результати досліджень з використанням кінцевих концентрацій інгібіторів, що вказують на повне звязування відповідних АФК.

Малоновий діальдегід є одним із стабільних продуктів ПОЛ і за його вмістом у тканинах оцінюють інтенсивність цього процесу (Мерзляк, 1989; Draper and Hadley, 1990). Проте, він не єдиний продукт, що взаємодіє з тіобарбітуровою кислотою (ТБК), тому доцільніше говорити про ТБК-активні продукти (ТБКАП). Вміст ТБКАП вивчали за допомогою кольорової реакції з ТБК згідно з методом R.Heath та L.Packer (1968] у модифікації R.Dhindsa та співавт. (1981). Концентрацію ТБКАП вираховували з використанням коефіцієнта екстинції (155 мМ-1см-1) (Dhindsa et al., 1981). У наших дослідженнях для якомога повнішого аналізу процесу ПОЛ за умов кліностатування вміст ТБКАП перераховували на 1 грам сирої та сухої маси та на 1 мг білка.

Хлоропласти виділяли за допомогою диференційного центрифугування в буферному розчині, що містив 0,33 М сорбітолу, 1 мМ МgCl2, 1 мМ ЕДТА-Na, 10 мМ NaCl, 5 мМ аскорбату натрію, 50 мМ Тріцину, рН 7.8. У разі визначення інтенсивності ПОЛ та активності СОД хлоропласти ресуспендували в буферному розчині без сорбітолу для осмотичного шоку. Якість суспензії хлоропластів перевіряли за допомогою світлового мікроскопа; чистоту фракції хлоропластів на наявність мітохондрій - за допомогою маркерного ферменту мітохондрій сукцинат-цитохром-с-редуктази. Активність ферменту визначали за коефіцієнтом екстинкції 18,5 мкМ-1. При цьому фракція хлоропластів містила незначну домішку мітохондрій (5,1 %).

Ліпіди екстрагували за методом Фолча (1957). Розділяли їх на фракції методом тонкошарової хроматографії на силікагелі. Сумарний вміст ліпідів в отриманому екстракті визначали ваговим методом: 1 мл екстракту вносили в бюкс, випарювали хлороформ, а осад висушували до сталої маси в термостаті за температури 105оС. Вміст гліколіпідів визначали шляхом елюювання плям із хроматограм за методом Свеннерхольма з використанням орцинового барвника (1956). Вміст фосфоліпідів визначали за вмісом фосфору після мінералізації сухого ліпідного залишку (Кейтс, 1975). Калібрувальну криву будували за КН2РО4. Оптичну густину зразків визначали на спектрофотометрі СФ-46 за довжини хвилі 820 нм.

Жирнокислотний склад ліпідів хлоропластів аналізували методом газорідинної хроматографії (Кейтс, 1975), який грунтується на переведенні жирних кислот у легкі метилові ефіри з подальшим визначенням їх кількості за допомогою газового хроматографа Сhrom-5 (Чехословаччина) з полуменево-іонізаційним детектором. Індекс ненасиченості жирних кислот розраховували за формулою, запропонованою Дж. Лайонсом та співавт. (1964).

Швидкість електронного транспорту в ізольованих хлоропластах вимірювали полярографічним методом за допомогою універсального полярографа ОН-105 (фірма “Radeliks”, Венгрія) з використанням електрода типу Кларка: для фотосистеми II – за виділенням кисню, для фотосистеми I та в повному ланцюзі – за його поглинанням.

Активність СОД визначали згідно з C. Giannopolitis and S. Ries (1977). Метод грунтується на здатності СОД інгібувати відновлення нітросинього тетразолію (НСТ) радикалами супероксиду на світлі за наявності рибофлавіну та метіоніну. За одиницю активності ферменту брали таку його кількість, яка інгібує відновлення НСТ на 50%. Отримані показники перераховували на 1 г сирої та сухої маси та на 1 мг білка.

Ультраструктурну організацію клітин листків гороху вивчали за допомогою трансмісіонного електронного мікроскопу марки JEM 1200-EX. Для цього фрагменти листків спочатку фіксували протягом 1,5 години в 2,5% розчині глютаральдегіду на 0,1М фосфатному буфері, рН 7,2. Потім зразки дофіксовували протягом 2,5 годин в 1% 0s04, зневоднювали в серії спиртів та ацетоні і заливали в суміш епон-аралдиту. Зрізи були отримані за допомогою ультрамікротому та контрастовані 2% розчином цитрату свинцю протягом 5 хвилин.

Вміст білка в досліджуваних пробах визначали згідно з методом Бредфорд (1976).

Вміст хлорофілу в хлоропластах визначали у 80 розчині ацетону за методом Арнона (1949).

Усі спектрофотометричні показники реєстрували за допомогою спектрофотометра СФ-46 (Росія).

Суху масу визначали висушуванням сирих листків та коренів (наважки по 2,0 г) до постійного значення в термостаті за температури 105оС.

Біологічна повторність експериментів 8-кратна, аналітична – 3-кратна. Отримані дані опрацьовували статистично за загальноприйнятими в біології методиками (Плохинский, 1970). В роботі наведено середні арифметичні дані з урахуванням похибок.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Інтенсивність пероксидного окиснення ліпідів

Утворення активних форм кисню – ініціаторів ПОЛ. Початковим етапом у розвитку ПОЛ є посилення продукції АФК у клітинах і тканинах (Мерзляк, 1989). Результати досліджень засвідчили зростання продукування АФК в листках, коренях та хлоропластах гороху за умов кліностатування, особливо за 14-добового впливу (рис.1, А-В). Так, якщо за 7-добового кліностатування інтенсивність ЛЗХЛ гомогенатів листків зросла в 1,6 раза, то за 14-добового – майже у 2,5 раза (рис.1, А). З рисунка також видно, що в листках продукування АФК за умов кліностатування посилюється значно інтенсивніше, ніж у коренях. Якщо за 7-добового впливу інтенсивність ЛЗХЛ гомогенатів листків зросла в 1, 6 раза, то в коренях – в 1,4 раза. Це вказує на те, що фотосинтезуючі тканини є важливим джерелом АФК у клітині. І дійсно, у хлоропластах також зафіксовано зростання утворення АФК за умов кліностатування з аналогічною тенденцією до посилення з подовженням терміну впливу (див. рис.1, В).

А Б

В

За допомогою інгібіторів АФК вдалося зясувати, які саме форми кисню утворюються в клітинах і тканинах рослин гороху та беруть участь у хемілюмінесцентному перетворенні люмінолу. Серед окремих форм активованого кисню виявлено утворення гідроксильних (0Н.), супероксидних радикалів (02-.) та пероксиду водню (Н202) в контролі й за умов кліностатування. Співвідношення між окремими АФК у клітинах контрольних та кліностатованих рослин різнилися (рис. 2). У контрольних рослин переважаючими в хемілюмінесцентній реакції були радикали супероксиду з відносно невисокою реакційною здатністю; за кліностатування дані радикали також домінували, проте їх частка зменшилася, особливо за 14-добового кліностатування, а частка інших, більш реакційноздатних АФК, зокрема гідроксильних радикалів зросла (див. рис. 2).

Рис. 2. Співвідношення між окремими АФК у клітинах листків гороху контрольних рослин та за умов кліностатування

Збільшення концентрації АФК за умов зміненої гравітації зумовлює активацію ПОЛ в клітинах і тканинах рослин гороху за даних умов, а також може спричинювати інші окислювальні пошкодження, що впливають на функціонування клітин і тканин рослин, зокрема хлоропластів.

Інтенсивність спонтанної хемілюмінесценції коренів контрольних рослин гороху та за умов кліностатування. Вивчення ПОЛ на проміжному етапі процесу, а саме на етапі утворення радикалів ліпідів (L00.) показало, що кліностатування призводить до посилення їх утворення в коренях гороху, причому значніше за 14-добового впливу (рис. 3). Якщо за 7-добового кліностатування інтенсивність світіння коренів зростала на 57%, то за 14-добового – на 138% порівняно з контрольними зразками. Звісно, лише частина пероксидних радикалів ліпідів бере участь у хемілюмінесцентній реакції, інша частина може взаємодіяти з антиоксидантами, а також з молекулами субстрату (Мерзляк, 1989). Отже, цілком ймовірно, що рівень цих радикалів in vivo вищий за зареєстрований шляхом СХЛ.

Пероксидні радикали, що утворились, у подальшому можуть ініціювати нові ланцюги окислення, сприяючи поширенню реакцій ПОЛ у мембранних структурах.

Вміст ТБКАП у листках, коренях і хлоропластах контрольних рослин гороху та за умов кліностатування. Вивчення інтенсивності ПОЛ в листках, коренях і хлоропластах гороху на одному з кінцевих етапів процесу, а саме на етапі утворення малонового діальдегіду (ТБКАП), виявило накопичення продуктів окислення за умов кліностатування (рис. 4, А-В). Хоча вміст ТБКАП було перераховано на 1г сирої і сухої маси та 1 мг білка, у всіх випадках спостерігалася аналогічна тенденція до зростання цього показника в клітинах і тканинах рослин гороху за умов кліностатування, особливо за 14-добового впливу. Якщо за 7-добового кліностатування вміст ТБКАП в коренях гороху зріс у 1,3 раза, то за 14-добового – у 2,1 раза. Також вищий рівень ТБКАП зареєстровано у листках порівняно з коренями як контрольних, так і кліностатованих рослин (див. рис. 4, А,Б). Крім того, в листках виявлено більш значне зростання вмісту продуктів окислення, ніж у коренях. Якщо за 7-добового кліностатування вміст ТБКАП у листках гороху зріс у 1,6 раза у перерахунку на 1 г сирої маси, то в коренях – лише в 1,3 раза. Це засвідчує, що внесок фотосинтезуючих клітин досить вагомий у розвиток ПОЛ в тканинах рослин гороху.

В хлоропластах відмічено аналогічну тенденцію зростання вмісту ТБКАП за умов кліностатування зі збільшенням терміну впливу ( див. рис.4, В).

А Б

В

Порівняння вмісту ТБКАП у хлоропластах і гомогенаті листків виявило, що у контрольних рослин вміст продукту окислення в хлоропластах становив в середньому 28% від загального вмісту ТБКАП в гомогенаті листків, а за умов кліностатування ~ 30% (рис.5). Отже, частка хлоропластів досить значна у розвитку ПОЛ в клітинах листків гороху.

Між інтенсивністю ЛЗХЛ та вмістом ТБКАП в листках, коренях та хлоропластах рослин гороху в контролі та за умов кліностатування спостерігався досить високий ступінь кореляції даних параметрів ПОЛ (r=0.980.02 для листків, r=0.930.01 для коренів та r=0,86±0,06 для хлоропластів, Р0,05). Отже, обрані методи адекватно відображають перебіг процесу ПОЛ в рослинах гороху в контролі та за умов кліностатування і засвідчують інтенсифікацію ПОЛ за умов кліностатування з тенденцією до зростання у разі збільшення терміну впливу.

Рис.5. Співвідношення між вмістом ТБКАП у гомогенаті листків (¦) і у фракції хлоропластів (?) контрольних рослин гороху та за умов кліностатування (вміст ТБКАП у хлоропластах наведено у відсотках стосовно загального вмісту ТБКАП у гомогенаті листків)

Ліпідний склад листків рослин гороху в контролі та за умов кліностатування. Активація ПОЛ супроводжується змінами ліпідного та жирнокислотного складу мембран, адже саме ненасичені жирні кислоти є субстратом ПОЛ (Мерзляк, 1989). Зміни у складі ліпідів та їх жирних кислот були виявлені за умов мікрогравітації, але причини їх не з?ясовані (Полулях, 1988; Румянцева и др., 1988). Тому нами було вивчено їх склад за умов кліностатування для з?ясування можливої участі ПОЛ в цих змінах. За умов кліностатування відмічено зміни як загального вмісту ліпідів, так і окремих їх класів. Так, за умов 7-добового вливу загальна кількість ліпідів у листках гороху зросла порівняно з контролем, тоді як за умов 14-добового впливу мало місце незначне їх зниження (табл.1).

Таблиця 1.

Вміст ліпідів у листках гороху в контролі та за умов кліностатування (мг/г сухої речовини)

Групи ліпідів | 7 діб | 14 діб

контроль | кліностатування | контроль | кліностатування

Гліколіпіди | 52,71 ± 2,15 | 57,58 ± 2,54 | 54,58 ± 2,35 | 53,11 ± 2,16

Сульфоліпіди | 8,82 ± 1,62 | 10,87 ± 1,55 | 9,56 ± 1,63 | 9,05 ± 1,15

Фосфоліпіди | 13,30 ± 1,34 | 17,23 ± 1,68 | 15,62 ± 1,45 | 14,85 ± 3,98

Загальний вміст ліпідів | 74,83 ± 2,28 | 85,68 ± 1,71 | 80,76 ± 2,16 | 77,01 ± 2,47

Аналіз окремих класів ліпідів показав, що змін зазнавали як гліколіпіди так і фосфоліпіди. Кліностатування впродовж 7 діб спричинювало зростання вмісту моно- та дігалактозилдіацилгліцеролів (МГДГ та ДГДГ відповідно) у фракції гліколіпідів (рис. 6). При цьому, незначне зростання кількості МГДГ може бути спрямоване на збереження двошарової конфігурації клітинних мембран. Кількість СГДГ зросла більш суттєвo (на 23%) порівняно з контрольними рослинами.

Рис. 6. Вміст гліколіпідів (А) і фосфоліпідів (Б) в листках гороху у контролі (1, 3) та за умов кліностатування (2, 4) (мкмоль / г сухої маси ліпідів).

Щодо фосфоліпідів, також відмічено зростання їх вмісту в листках гороху за умов 7-добового кліностатування. Як свідчать літературні дані, зростання вмісту ліпідів під дією різноманітних несприятливих впливів спрямоване на збереження структури та функціонування клітинних мембран, тобто є адаптивним (Оканенко та ін., 1994; Quartacci et al., 1995). Підтвердженням того, що зміни у складі ліпідів за 7-добового кліностатування спрямовані на забезпечення стійкості рослин гороху за цих умов, є збереження співвідношення між окремими класами ліпідів (рис. 7).

За умов 14-добового кліностатування відмічено незначне зниження вмісту гліко- та фосфоліпідів в листках гороху (див. табл. 1 та рис. 6). Зменшення вмісту ліпідів може бути наслідком їх окислення у процесі подальшої інтенсифікації ПОЛ, а також активації ліпоксигеназ з утворенням оксиліпінів, важливих регуляторів захисних реакцій рослин.

А Б

Рис. 7. Співвідношення між окремими класами гліколіпідів листків гороху у контролі (А) та за умов 7-добового кліностатування (Б) (дані наведені у відсотках стосовно загального вмісту гліколіпідів)

Вплив кліностатування на жирнокислотний склад хлоропластів рослин гороху. За умов кліностатування змін зазнавали всі класи ліпідів, що входять до складу мембран хлоропластів, тому було проаналізовано жирнокислотний склад хлоропластів листків рослин гороху. Виявлено, що за даних умов змін зазнавали як насичені, так і ненасичені жирні кислоти. Під впливом кліностатування впродовж 7 діб збільшувався вміст усіх ідентифікованих ненасичених жирних кислот (ЖК) з одночасним зниженням вмісту насичених (ЖК) (табл. 2). У звязку з наведеними вище змінами у відносному складі (ЖК) кислот також зростав індекс їх ненасиченості.

Збільшення вмісту ненасичених ЖК за умов 7-добового кліностатування, очевидно, є одним із механізмів, що забезпечує адаптацію мембран хлоропластів до умов зміненої гравітації. Значення цього в стійкості рослин полягає в тому, що молекули ненасичених жирних кислот, окислившись, замінюються на нові молекули жирних кислот, що запобігає переходу мембран із рідинно-кристалічного стану в твердий гель і мембрани залишаються функціонально активними. У свою чергу, зростання вмісту ненасичених жирних кислот за 7-добового кліностатування може сприяти подальшому розвитку ПОЛ у хлоропластах, оскільки відомо, що швидкість ПОЛ зростає зі збільшенням кількості подвійних зв?язків у молекулах ЖК (Каган и др., 1989). Збільшення вмісту ненасичених ЖК може відбуватися шляхом їх синтезу, а також десатурацією їх попередників (Klyachko-Gurvich et al., 1999).

Таблиця 2.

Жирнокислотний склад ліпідів хлоропластів рослин гороху в контролі та за умов кліностатування

Варіант досліду | Вміст жирних кислот, % від суми | Жирні кислоти | Індекс ненаси-ченості

пальмітинова,

С16:0 | пальміто

леїнова,

С16:1 | стеари

нова,

С18:0 | олеї-нова,

С18:1 | ліно-лева,

С18:2 | лінолeнова,

С18:3 | наси-чені | ненасичені

7 діб:

контроль |

21,4 |

2,1 |

3,6 |

2,5 |

5,3 |

65,1 |

25,0 |

75,0 |

8,6

kліностат |

15,9 |

2,5 |

1,9 |

3,1 |

7,1 |

69,5 |

17,8 |

82,2 |

11,8

14 діб

контроль |

18,2 |

2,4 |

3,1 |

2,6 |

5,9 |

68,8 |

21,3 |

78,7 |

9,7

кліностат |

23,4 |

2,2 |

5,1 |

2,1 |

4,8 |

63,4 |

27,5 |

71,5 |

7,3

За тривалішого кліностатування (14 діб) кількість ненасичених жирних кислот знижувалась з одночасним збільшенням вмісту насичених пальмітинової та стеаринової кислот. Відповідно зменшувався й індекс ненасиченості ЖК.

Зниження вмісту ненасичених жирних кислот за умов 14-добового кліностатування може бути наслідком порушення їх синтезу, а також окислення у разі подальшого розвитку ПОЛ у хлоропластах. Цікавим є факт, що малоновий діальдегід у хлоропластах гороху утворюється в процесі окислення ліноленової та лінолевої жирних кислот (Мерзляк, Погосян, 1986). У наших дослідженнях збільшення вмісту МДА в хлоропластах рослин гороху супроводжувалось відповідним зменшенням вмісту цих кислот. Отже, зниження вмісту ненасичених жирних кислот за умов 14-добового кліностатування можна пояснити селективним їх окисленням.

У свою чергу, від якісного та кількісного складу жирних кислот у мембранах рослинних клітин значною мірою залежить вязкість мембран та активність мембранозв?язаних ферментів (Владимиров, Арчаков, 1989; Мерзляк, 1989) зміни яких зафіксовано за умов мікрогравітації, але причини не встановлені (Kordyum, 1997). Тобто, цілком ймовірно, що вони можуть відбуватися за рахунок перебудов у жирнокислотному складі ліпідів внаслідок активації ПОЛ за даних умов.

Вплив кліностатування на швидкість електронного транспорту на рівні окремих фотосистем та в цілому ланцюзі. За умов кліностатування швидкість електронного транспорту на рівні окремих фотосистем (ФС) знижувалася, причому більш значно на рівні ФСІ, особливо зі зростанням терміну впливу (табл. 3). За умов мікрогравітації також відмічено інгібування активності фотосистем, причини яких не з?ясовано (Tripathy et al., 1996). Однією з можливих причин інгібування може бути зростання утворення АФК та активація ПОЛ у хлоропластах за даних умов. Причому істотніше інгібування ФСІ порівняно з ФС II може бути зумовлене тим, що ФСІ є головним джерелом АФК у фотосинтетичному електроннотранспортному ланцюзі (ФЕТЛ) (Asada, 1999). Радикали 0Н. та 102 є надзвичайно реакційноздатними, не мігрують від місць свого утворення, а, утворившись, відразу взаємодіють з найближчою молекулою свого оточення, якими можуть бути молекули ліпідів, білків світлозбираючих комплексів та реакційних центрів, молекули акцепторів та хлорофілу, наслідком чого є порушення їх роботи (Asada, 1999). Тому, утворюючись в ФСІ, АФК пошкоджують в першу чергу компоненти цієї фотосистеми.

АФК утворюються також і в ФСІІ (Ananyev et al., 1994; Chen et al., 1995), проте досить швидка репарація білка D1 реакційного центру ФСІІ, очевидно, зумовлює менш значне інгібування активності даної фотосистеми.

Таблиця 3.

Швидкість електронного транспорту на рівні окремих фотосистем та в цілому ланцюзі в хлоропластах гороху в контролі та за умов кліностатування (мкмоль 02 мг хл-1 год-1)

Фотореакція | 7 діб | 14 діб

контроль | кліностатування | контроль | кліностатування

Активність ФСІІ | 220,58 2,8 | 217,26 5,0 | 225,12 4,3 | 200,94 9,1

% від контролю | 100 | 98,49 | 100 | 89,26

Активність ФСІ | 1254,36 8,4 | 1213,00 7,1 | 1086,33 8,1 | 906,98 12,4

% від контролю | 100 | 96,70 | 100 | 83,49

Повний елект-ронний транспорт | 188,86 4,7 | 186,34 4,2 | 238,56 5,1 | 184,45 7,0

% від контролю | 100 |

98,66 | 100 | 77,31

Повний електронний транспорт, визначений за поглинанням кисню від Н20 до метилвіологену також знизився за умов кліностатування, причому з відповідною тенденцією до зниження зі зростанням терміну впливу (див. табл. 3). Сповільнення повного електронного транспорту може бути наслідком зниження активностей обох ФС, а також повязаним з порушенням структурної та функціональної цілісності ФЕТЛ. Останнє можливе за умов посилення вільнорадикальних процесів у хлоропластах за умов окисленням компонентів ФЕТЛ активними формами кисню (Мерзляк, 1989). Також можливі конформаційні зміни компонентів ФЕТЛ внаслідок окислення ліпідів безпосереднього їхнього оточення, тобто порушення структурної цілісності мембран тилакоїдів, а звідси і їх стабільності та функціонування.

Активність супероксиддисмутази в листках, коренях і хлоропластах рослин гороху в контролі та за умов кліностатування. За умов кліностатування зростала продукція АФК та активувалось ПОЛ, тому важливо було з?ясувати адаптивну спроможність рослин за даних умов.

7-добове кліностатування призводило до зростання активності супероксиддисмутази в листках, коренях і хлоропластах рослин гороху (рис. 8) за різних перерахунків активності ферменту: на 1 г сирої та сухої маси, 1 мг білка.

А Б

Рис. 8. Активність СОД у листках і коренях (А) та хлоропластах (Б) рослин гороху у контролі (?) та за умов кліностатування (¦) (одиниць активності / мг білка)

Отримані результати засвідчують, що в листках, в яких виявлено вищий рівень вільнорадикального окислення порівняно з коренями, активність СОД також була вищою і за умов кліностатування мало місце значніше зростання активності ферменту в листках, ніж у коренях. Отже, одночасно з посиленням ПОЛ зростала активність СОД у клітинах і тканинах гороху за умов 7-добового кліностатування, що має важливе значення в адаптації рослин до цих умов.

У хлоропластах активність СОД становила 37-39% загальної активності ферменту в гомогенаті листків, тобто частка хлоропластів у захисті клітин листків гороху від окислювального пошкодження досить значна.

Вивчення активності СОД у рослинах гороху за умов 14-добового кліностатування показало зростання лише на 17% у листках і на 14% у коренях порівняно з контрольними зразками, тоді як продукування АФК та інтенсивність ПОЛ збільшилися більш, ніж удвічі. Наслідком зменшення активності СОД за умов 14-добового впливу є подальше зростання рівня радикалів О2.- та інших АФК, що й відмічено нами.

ВИСНОВКИ

Вперше проведено комплексне вивчення перебігу пероксидного окислення ліпідів у листках, коренях і хлоропластах рослин гороху за умов зміненої гравітації у зв?язку з можливою участю процесу ПОЛ у перебудовах клітинного метаболізму за цих умов.

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.