НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ

ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

ЧУЙКО НЕЛЯ ВІТАЛІЇВНА

УДК 579.841.31

ХЕМОТАКСИСНІ ВЛАСТИВОСТІ BRADYRHIZOBIUM JAPONICUM

03.00.07 – мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ - 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі мікробіологічних процесів на твердих поверхнях Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Курдиш Іван Кирилович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу мікробіологічних процесів на твердих поверхнях

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Антипчук Адель Федорівна,

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, про-

відний науковий співробітник відділу загальної та ґрунтової мікробіології

доктор медичних наук, старший науковий співробітник Глоба Леонід Іванович, Інститут колоїдної хімії і хімії води ім. А.В. Думанського НАН України, завідувач відділу мікробіології очистки води

Провідна установа: Дніпропетровський національний університет,

кафедра мікробіології і вірусології

Захист відбудеться "19" лютого 2003 р. о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 по захисту докторських дисертацій при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154)

Автореферат дисертації розіслано "_ 16 " січня 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Хемотаксис мікроорганізмів, тобто спрямований рух по відношенню до хімічних речовин, дозволяє їм займати сприятливі для виживання екологічні ніші [Брезгунов с соавт., 1989]. Вважається, що він відіграє важливу роль і на початковій стадії взаємодії бобових рослин з бульбочковими бактеріями, які проявляють хемотаксисну відповідь до екстрактивних речовин рослинного походження [Aquilar et al., 1988, Caetano-Anolles et al., 1988, Barbour et al., 1991, Yuichi et al., 1991, Ponyi et al., 1992, Karpati, Sik, 1992, Кацы, 1996, Spaink, 2000, Кириченко, 2002]. Препарати Bradyrhizobium japonicum використовують для підвищення врожайності сої та екологізації рослинництва [Толкачев, 1997, Малиновская, Михайлов, 1997, Патыка с соавт., 1997, Кожемяков, 1997]. Однак відомості про хемотаксисні властивості повільноростучих бульбочкових бактерій сої, які можуть визначати первісні етапи встановлення симбіотичних взаємовідносин, дуже обмежені.

В ґрунтах, де відбувається взаємодія бактерій з рослинами, широко поширені високодисперсні матеріали, в тому числі глинисті мінерали. Ці матеріали впливають на функціонування мікроорганізмів різних таксономічних груп [Звягинцев, 1973, Курдиш, 2001]. Ймовірно, що процес взаємодії з високодисперсними матеріалами буде відбиватися на хемотаксисних властивостях бульбочкових бактерій. Це питання є не з'ясованим.

Дослідження впливу ряду абіотичних і біотичних факторів на хемотаксис повільноростучих бульбочкових бактерій сої дозволить розкрити певні аспекти їх поведінкових відгуків. У зв'язку з цим хемотаксисні властивості B. japonicum є актуальним предметом дослідження.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась в межах науково-дослідної роботи відділу мікробіологічних процесів на твердих поверхнях Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за темою "Закономірності впливу високодисперсних матеріалів на функціонування змішаних культур мікроорганізмів, що мобілізують ряд біогенних елементів", держбюджетна тема 2.28.9.3.

Мета і задачі досліджень. Метою роботи було дослідження хемотаксисних властивостей повільноростучих бульбочкових бактерій сої Bradyrhizobium japonicum.

Для досягнення мети передбачалось вирішення ряду завдань:

1. Модифікувати капілярний метод дослідження хемотаксису бактерій. Оптимізувати умови вивчення хемотаксисних властивостей B. japonicum капілярним методом та в напіврідкому середовищі.

2. Дослідити вплив деяких фізико-хімічних факторів навколишнього середовища на хемотаксисні властивості B. japonicum.

3. Вивчити хемотаксис B. japonicum до різних хімічних речовин, в тому числі й екстрактів насіння сої різних сортів, які відрізняються за симбіотичними властивостями по чутливості до бульбочкових бактерій.

4. Визначити вплив природних і синтетичних високодисперсних матеріалів на хемотаксисні властивості B. japonicum.

Об'єктом дослідження були представники повільноростучих бульбочкових бактерій сої B. japonicum.

Предметом дослідження були хемотаксисні властивості B. japonicum.

Методи дослідження. Хемотаксис досліджували модифікованим нами капілярним методом [Adler, 1973] та в напіврідкому середовищі. Для культивування мікроорганізмів застосовували мікробіологічні методи. Визначення чисельності бактерій проводили методами серійних розведень, мікроскопічним методом прямого підрахунку за допомогою поляризаційно-інтерференційного мікроскопу "Biolar" та шляхом визначення радіоактивності мічених 14С-лейцином клітин з використанням сцинтиляційного лічильника "Beckman". Біохімічні методи використовували для вивчення вмісту білків (за Бредфордом) і вуглеводних сполук (фенол-сірчаний метод) у екстрактах насіння сої. Наявність контактної взаємодії B. japonicum з високодисперсними матеріалами визначали методом мікроелектрофорезу. Отримані результати підлягали статистичній обробці при довірчій ймовірності 95%.

Наукова новизна одержаних результатів. Запропонована нова модифікація капілярного методу дослідження хемотаксису. Визначені оптимальні для хемотаксису B. japonicum 634б і 10К фізико-хімічні фактори навколишнього середовища. З'ясовано, що максимальний хемотаксис у цих бактерій спостерігався при рН 6.5–7.5 і температурі 20–250С. Встановлено, що повільноростучим бульбочковим бактеріям сої властивий позитивний хемотаксис до широкого кола органічних сполук. Поряд з цим виявлені міжштамові відмінності в хемотаксисній відповіді B. japonicum 634б, 10К і 604К до деяких з них. Показано, що екстракти насіння сої сортів Чорнобура і Безбульбочкова містять не лише атрактанти, а й репеленти для досліджених мікросимбіонтів, в той час як екстракти насіння сої сорту Мар'яна виступали позитивними ефекторами.

Виявлено, що контактна взаємодія B. japonicum 634б і 604К з високодисперсними матеріалами (ВДМ) монтморилонітом, палигорськітом, діоксидом кремнію (ВДК) призводила до підвищення, а з модифікованим оксидом алюмінію діоксидом кремнію (МВДК) – до зниження їх рухливості. При цьому спостерігали позитивну кореляцію між впливом ВДМ на рухливість та ріст даних мікроорганізмів. Показано, що взаємодія з природними (монтморилоніт, палигорськіт) та синтетичними (ВДК, МВДК) високодисперсними матеріалами супроводжувалась зниженням хемотаксису бактерій до атрактанта (глюкози).

Практичне значення одержаних результатів. Запропонована нова та легко відтворювана модифікація капілярного методу дослідження хемотаксису. Вона може бути застосована для вивчення хемотаксисних властивостей не лише бульбочкових бактерій сої, а й мікроорганізмів інших таксономічних груп.

Результати проведених досліджень можуть бути корисними при розробці методу оцінки компліментарності партнерів бобово-ризобіального симбіозу. Вони також можуть стати підставою для оптимізації умов застосування бактеріальних препаратів B. japonicum для рослинництва.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора. Автором дисертаційної роботи особисто здійснено критичний аналіз літературних даних, проведено більшість експериментальної роботи, аналіз, узагальнення і математичну обробку експериментальних даних, підготовку публікацій за результатами досліджень і їх представлення на наукових конференціях. Інтерпретацію та формулювання основних положень і висновків проведено спільно з науковим керівником. Частину досліджень з оцінки впливу абіотичних і біотичних факторів на хемотаксис B. japonicum 634б та вивченню хемотаксисних властивостей бактерій цього штаму по відношенню до ряду хімічних речовин виконано сумісно з інженером І категорії відділу мікробіологічних процесів на твердих поверхнях ІМВ НАНУ Антонюк Т.С., що є співавтором опублікованих робіт, вивчення сорбційної взаємодії B. japonicum з високодисперсними матеріалами було проведено сумісно зі старшим науковим співробітником цього ж відділу Гордієнко А.С. В дослідженні хемотаксису бульбочкових бактерій із застосуванням радіоактивних ізотопів брав участь старший науковий співробітник відділу вірусів водоростей Сирчін С.О.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи були представлені на конкурсах експериментальних робіт молодих дослідників Інституту мікробіології і вірусології НАН України (Київ, 1999, 2000, 2002), Міжнародній науково-практичній конференції "Оцінка екологічного стану навколишнього середовища при реструктуризації вугільної промисловості. Методи захисту довкілля" (Слав'яногірськ, 1999), Міжнародній конференції "Микробиология и биотехнология на рубеже ХХІ столетия" (Мінськ, 2000), ІІ установчому з'їзді Українського мікробіологічного товариства (Чернігів, 2000), Міжнародній конференції "Екологія і біогеохімічна діяльність мікроорганізмів" (Одеса, 2001), Міжнародній науково-практичній конференції "Аграрна освіта і наука на початку третього тисячоліття" (Львів, 2001), Всеукраїнській конференції молодих вчених "Засади сталого розвитку аграрної галузі" (Київ, 2002).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 8 наукових робіт, з яких 4 – статті в наукових фахових журналах, 4 – матеріали конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 156 сторінках машинописного тексту і складається із структурних частин: "Вступ", "Огляд літератури", "Матеріали і методи досліджень", "Результати досліджень" (включає три розділи власних досліджень), "Заключна частина", "Висновки", "Список використаних джерел", який містить 335 посилань (з них 239 іноземних авторів). Робота містить 20 таблиць та 35 рисунків.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Огляд літератури представлений двома розділами, в одному з яких описані властивості бульбочкових бактерій роду Bradyrhizobium (їх таксономія, морфологія, культурально-фізіологічні особливості та закономірності взаємодії з рослиною–хазяїном). В другому розділі висвітлено питання хемотаксису і його ролі у функціонуванні мікроорганізмів (наведено аналіз даних сучасної літератури щодо особливостей таксисів, рухливості у мікроорганізмів, молекулярним механізмам хемотаксису та хемотаксису бульбочкових бактерій).

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Об'єктами досліджень були повільноростучі бульбочкові бактерії сої Bradyrhizobium japonicum (Kirchner 1896) Jordan 1982 (Rhizobacterium japonicum Kirchner 1896; Rhizobium japonicum (Kirchner 1896) Buchanan 1926). В роботі використовували два виробничі штами: B. japonicum 634б (селекції Всеросійського інституту сільськогосподарської мікробіології, Санкт-Петербург – Пушкін) та B. japonicum 10К (селекції відділу загальної та ґрунтової мікробіології Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАНУ, Київ, який увійшов в Українську колекцію мікроорганізмів під номером 6023). В якості штама–антипода було взято високовірулентний неактивний штам B. japonicum 604К селекції Кримського філіалу ґрунтової мікробіології Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН.

Як ефектори при дослідженні хемотаксису використовували речовини фірми “Реахім” (чда), а також приготовані нами водні та водно-спиртові екстракти насіння сої сорту Безбульбочкова, яка не утворює бульбочок, та районованих сортів сої Київська–27, Чорнобура, Соєр, Мар'яна (селекції Інституту фізіології рослин та генетики НАНУ і Інституту землеробства УААН), що вступають в симбіотичні взаємовідносини з бульбочковими бактеріями.

При дослідженні впливу високодисперсних матеріалів на хемотаксис бактерій застосовували природні глинисті мінерали монтморилоніт і палигорськіт Черкаського родовища бентонітових глин. Монтморилоніт є мінералом шаруватого типу. Він представлений пластівцеподібними частками, що утворюють ізометричні форми. Розмір часточок – 0.05 мкм. Палигорськіт – це алюмосилікат шарувато-стрічкового типу з голкоподібними частками. Їх розмір досягає 0.2–0.5 мкм [Тарасевич, Овчаренко, 1975]. Крім того, в дослідах використовували синтетичний високодисперсний діоксид кремнію та модифікований оксидом алюмінію діоксид кремнію. Ці матеріали надані Інститутом хімії поверхні НАНУ. Розмір їх часток коливається від 5 до 40 нм [Чуйко, 1971]. Всі високодисперсні матеріали застосовували в вигляді суспензій колоїдної дисперсності, які вносили в суспензію бактерій, перемішували і витримували 30 хвилин для встановлення контактної взаємодії, після чого досліджували хемотаксис.

Для вивчення хемотаксису використовували культуру бактерій логарифмічної фази росту (культивування проводили на манітно-дріжджовому середовищі). Клітини бактерій тричі відмивали шляхом центрифугування (2000 g, 15 хвилин) і ресуспендували в калій-фосфатному буфері (0.01 М, рН 7.0), який готували на бідистильованій воді [Adler, 1973]. Суспензія, що використовували в дослідах, містила 4.5ґ108 кл/мл.

Хемотаксис бактерій вивчали двома методами. В першому варіанті дослідження проводили в напіврідкому середовищі [Adler, 1966, Masduki, 1995, Barak, Eisenbach, 1999, Begonia, Kremer, 1994, Bergman et al., 1988, Caetano-Anolles et al., 1988, Баканчикова с соавт., 1989]. При цьому на поверхню застиглого середовища наносили краплю суспензії клітин досліджуваних мікроорганізмів (20 мкл). Бактерії інкубували 72 години при 280С, після чого досліджували чашки на наявність хемотаксисного кільця, яке розповсюджувалося від центру. Ширину зон поширення мікроорганізмів вимірювали від краю краплі суспензії, нанесеної на агар. Оскільки раніше хемотаксисні властивості B. japonicum цим методом не вивчали, виникла потреба в оптимізації умов проведення таких експериментів. Показано, що застосування середовища з 0.35% агару і концентрацією ефекторів 10-3М дозволяло отримати чіткі хемотаксисні кільця B. japonicum та можливість оцінки ступеня ефекторних властивостей при застосуванні різних речовин.

Крім того, нами запропонована нова модифікація капілярного методу досліджень хемотаксису [Pfeffer, 1888, Adler, 1966, Adler, 1973, Palleroni, 1976]. Схема камери для вивчення зображена на рис. 1. Дана модифікація методу дозволяє щільно герметизувати капіляри, стандартизувати їх заповнення та об'єм досліджуваних зразків. Метод не потребує застосування важкодоступних приладів і може бути легко відтворений в кожній мікробіологічній лабораторії. По кількості клітин, які заходили в нижню частину капілярів (0.01 мл) з калій-фосфатним буфером, судили про рухливість бактерій. Хемотаксис оцінювали по різниці в кількості клітин, що містилися в капілярах з ефектором і з буфером. Висновок про хемотаксис робили також на основі значень хемотаксисного індексу, під яким розуміють відношення кількісних показників дослідних варіантів з ефектором до показників контрольних варіантів без ефектора. Значення хемотаксисного індексу більші одиниці в тому випадку, коли ефектор є атрактантом і менше одиниці в присутності репеленту.

Рис. 1. Схема камери для вивчення хемотаксису:

1 – ємність для суспензії мікроорганізмів;

2 – суспензія мікроорганізмів;

3 – платівчатий фіксатор;

4 – капіляр з калій-фосфатним буфером;

5 – капіляр з ефектором;

6 – силіконова трубка з гумовою пробкою.

Всі досліди повторювали мінімум 3 рази із трьома повтореннями кожного варіанту в межах окремого досліду. Для статистичного аналізу результатів досліджень використовували методи варіаційної статистики [Лакин, 1990].

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

1. Вплив деяких біотичних і абіотичних факторів на хемотаксис Bradyrhizobium japonicum.

Ризосфера різних бобових рослин характеризується певними відмінними рисами, що залежать від абіотичних та біотичних факторів навколишнього середовища [Антипчук, 1994]. Модифікованим капілярним методом нами вперше досліджена залежність хемотаксису B. japonicum 634б і 10К від ряду цих факторів. Встановлено, що при збільшенні щільності популяції B. japonicum 634б зростала чисельність клітин в капілярах як з атрактантом, так і без нього. Однак з підвищенням кількості бактерій в суспензії значення хемотаксисного індексу знижувались, на підставі чого можливо говорити про зменшення інтенсивності їх хемотаксисної відповіді.

Хемотаксисні властивості повільноростучих бульбочкових бактерій сої залежали від стадії розвитку культури (рис. 2). Найбільших значень показники рухливості і хемотаксису B. japonicum 634б досягали на початку та середині стадії логарифмічного росту (2-3 доба культивування) та знижувались при досягненні культурами кінця лог-фази (4 доба культивування).

Помітний вплив на рухливість і хемотаксис повільноростучих бульбочкових бактерій сої спричиняла рН середовища. Максимальних значень для B. japonicum 634б ці показники досягали при нейтральних та близьких до них рН (6.5 – 7.5) (рис. 3). Температурний оптимум для хемотаксису B. japonicum 634б до глюкози становив 20–250С (рис. 4). Подібні результати щодо залежності хемотаксису від стадії росту культури, рН та температури навколишнього середовища були отримані для B. japonicum 10К.

Експериментальні дані, що стосуються залежності хемотаксису B. japonicum від фізико-хімічних факторів навколишнього середовища, надають можливість прогнозування його впливу на взаємодію даних бактерій з рослинами сої. Так, в ґрунтах, які характеризуються кислою або лужною реакцією середовища або слабко прогріті, хемотаксис B. japonicum до сої може лімітуватись, що, ймовірно, буде відбиватися на процесі встановлення бобово-ризобіального симбіозу.

2. Хемотаксисні властивості Bradyrhizobium japonicum по відношенню до різних хімічних речовин.

Хемотаксис бактерій до хімічних речовин, що екстрагуються з насіння рослин чи надходять у прикореневу зону, може відігравати певну роль на первинних етапах симбіотичних взаємовідносин [Barbour et al., 1991, Yuichi et al., 1991, Karpati, Sik, 1992, Ponyi et al., 1992]. Виходячи з того, що одними з основних компонентів виділень рослин є амінокислоти, вуглеводи і органічні кислоти [Гродзинский, 1991, Кириченко, 2002], предметом подальшого дослідження став хемотаксис B. japonicum до ряду органічних сполук.

Методом вивчення в напіврідкому середовищі показано, що всі досліджувані амінокислоти були хемоатрактантами для активних по азотфіксації штамів B. japonicum 634б, 10К та неактивного штаму 604К (табл. 1). Вуглеводи (крім лактози) та органічні кислоти також виступали позитивними ефекторами. Капілярним методом із прямим підрахунком клітин під мікроскопом встановлено, що пороговою концентрацією глюкози, сахарози і маніту, під якою розуміють найменшу концентрацію атрактанта, хемотаксис до якої ще спостерігається [Adler, 1973], для B. japonicum є 10-6М. По відношенню до глюкози ці дані підтверджені визначенням із застосуванням мічених 14С-лейцином клітин.

Рис. 2. Залежність рухливості та хемотаксису Bradyrhizobium japonicum 634б від часу культивування бактерій. Чисельність бактерій в капілярах без атрактанта (1) і з 5.6ґ10–2М глюкози (2).

Рис. 3. Рухливість і хемотаксис Bradyrhizobium japonicum 634б в залежності від рН середовища. Чисельність бактерій в капілярах без атрактанта (1) і з 5.6ґ10–2М глюкози (2).

Рис. 4. Рухливість і хемотаксис Bradyrhizobium japonicum 634б в залежності від температури навколишнього середовища. Чисельність бактерій в капілярах без атрактанта (1) і з 5.6ґ10–2М глюкози (2).

Таблиця 1

Хемотаксис Bradyrhizobium japonicum до

амінокислот, вуглеводів і органічних кислот

Речовина Ширина зон поширення бактерій, мм

Штам

634б 10К 604К

L-аргінін гідрохлорид 1.0 0.5 2.0

DL-b-фенілаланін 10.0 3.0 6.0

DL-лізинмоногідрохлорид 7.0 2.0 5.6

DL-метіонін 2.0 3.0 5.0

DL-серін 1.0 3.3 6.6

DL-a-аланін 1.0 4.0 10.0

L-глютамінова кислота 12.0 4.0 7.6

L-цистеїн 2.0 2.6 6.0

DL-аспарагінова кислота 2.0 5.0 9.0

L-ізолейцин 2.0 1.2 2.0

L-гістидингідрохлорид водний 3.0 3.7 4.3

DL-треонін 13.6 1.0 3.0

L[+]-арабіноза 10.0 9.3 14.0

L[+]-рамноза 3.0 2.0 3.0

D-глюкоза 6.0 5.0 6.0

Сахароза 5.0 3.0 6.0

D[+]-мальтоза 5.0 6.0 6.0

D[+]-лактоза1 водна 0.0 0.0 0.0

Сорбіт 6.0 5.0 7.0

D[–]-маніт 8.0 10.0 15.0

Дульцит 7.0 5.0 9.0

i-інозіт 5.0 4.0 10.0

Янтарна кислота 5.0 3.0 4.0

Лимонна кислота 10.0 9.0 10.0

Оцтова кислота 5.0 3.0 6.0

Контроль (без ефектора) 1.0 1.0 1.0

Примітки:

1. Вміст ефекторів у середовищі складав 10–3М.

2. Показники довірчих інтервалів не перевищували 10% значень

середніх арифметичних.

Однак в ступені хемотаксисної відповіді різних штамів B. japonicum по відношенню до деяких органічних сполук спостерігали певні відмінності (табл. 1). Наприклад, B. japonicum 10К і 604К характеризувались позитивним хемотаксисом до серіну та аланіну, а B. japonicum 634б був хемотакcиcно неактивний по відношенню до них. В той же час треонін був найбільш сильним атрактантом для B. japonicum 634б, в незначній мірі – для B. japonicum 604К і не впливав на хемотаксис B. japonicum 10К. В літературі є відомості про слабкий хемотаксис до арабінози, глюкози, сахарози і маніту у B. japonicum USDA110 [Barbour et al., 1991]. Однак, для досліджених нами штамів Bradyrhizobium ці речовини виступали сильними позитивними ефекторами. Як відомо, різні рослини, в тому числі й бобові, виділяють в навколишнє середовище різноманітні речовини, від якісних та кількісних характеристик яких залежить склад мікрофлори їх ризосфери [Головко, 1984, Karpati, Sik, 1992, Ponyi et al., 1992]. Виходячи з цього, міжштамові відмінності в хемотаксисі B. japonicum до таких речовин можуть бути одним з факторів, що лежать в основі спорідненості окремих штамів бактерій до певних сортів сої.

Переважна більшість досліджень по хемотаксису мікроорганізмів, як одного з доконтактних етапів їх взаємодії з рослинами, присвячена вивченню ролі кореневих екстрактів макроорганізмів [Parke et al., 1985, Bergman et al., 1988, Caetano-Anolles et al., 1988]. Поряд з цим існує думка про значимість хемотаксису до насіння рослин у подальшому розвитку їх взаємовідносин із бактеріями [Scher et al., 1985, Barbour et al., 1991, Gamliel, Katan, 1992]. Вважається, що такий хемотаксис може призводити до колонізації спермосфери і, в подальшому, ризосфери [Begonia, Kremer, 1994]. Але інформація з цього приводу в літературі дуже обмежена, а дослідження по хемотаксису брадіризобій до насіння різних сортів сої взагалі не проводились.

Нами показано, що нерозведені водні екстракти оболонок та сім'ядоль насіння сої сорту Безбульбочкова виступали як атрактанти для B. japonicum (табл. 2). При розведенні екстрактів в 100 і 1000 раз проявлявся їх негативний вплив на хемотаксис мікроорганізмів. Водні екстракти насіння сої сорту Мар'яна в усіх досліджених варіантах викликали позитивну хемотаксисну відповідь у B. japonicum (табл. 3).

Таблиця 2

Хемотаксис Bradyrhizobium japonicum 634б до водних екстрактів

насіння сої сорту Безбульбочкова

Варіанти досліду Кількість клітин (?108/мл) в капілярах Хемотаксисний індекс

Калій-фосфатний буфер (контроль) 0.51±0.06 –

Екстракт оболонок нерозведений 1.44±0.11 2.82

1:100 0.36±0.05 0.71

1:1000 0.48±0.07 0.94

сім'ядоль нерозведений 1.59±0.14 3.12

1:100 0.44±0.08 0.86

1:1000 0.42±0.04 0.82

Таблиця 3

Хемотаксис Bradyrhizobium japonicum 634б до водних екстрактів

насіння сої сорту Мар'яна

Варіанти досліду Кількість клітин (?108/мл) в капілярах Хемотаксисний індекс

Калій-фосфатний буфер (контроль) 0.48±0.05 –

Екстракт оболонок нерозведений 2.09±0.13 4.35

1:100 1.01±0.09 2.10

1:1000 0.68±0.06 1.42

сім'ядоль нерозведений 1.64±0.15 3.42

1:100 0.83±0.08 1.73

1:1000 0.70±0.05 1.46

Як відомо, насіння сої містить флавоноїди, які можуть виступати хемоефекторами для ризобій і екстрагуються етанолом [Barbour et al., 1991]. З метою можливості екстракції з насіння якомога більшої кількості речовин та вилучення не лише водорозчинних, а й спирторозчинних сполук, були виготовлені водно-спиртові екстракти та досліджено хемотаксис брадіризобій до них.

Як видно з табл. 4, водно-спиртові екстракти насіння сої сортів Безбульбочкова і Чорнобура містили негативні ефектори для досліджених штамів бактерій (кількість клітин, які зайшли в капіляри під впливом екстрактів, була меншою порівняно з контрольними капілярами з буфером). В той же час присутність водно-спиртових екстрактів насіннєвих оболонок і сім'ядоль насіння сої сорту Мар'яна підвищувало показники хемотаксисної відповіді у бактерій, що свідчить про наявність атрактантів (табл. 4). Нами відмічено, що різниці в хемотаксисній відповіді до водно-спиртових екстрактів насіння сої у активних по азотфіксації штамів B. japonicum 634б і 10К та неактивного штаму 604К не було.

При визначенні впливу екстрактивних речовин насіння різних сортів сої на ростову активність бульбочкових бактерій з'ясовано, що екстракти оболонок сої сортів Чорнобура і Безбульбочкова, які містили репеленти хемотаксису, пригнічували й ріст B. japonicum 634б. Екстракти насіння сої сортів Мар'яна, Київська-27, Соєр не спричиняли такої дії. З літературних джерел відомо про інгібування росту бактерій деякими амінокислотами і речовинами фенольної природи, що містяться в насінні бобових [Emmert et al., 1998, Іутинська зі співавт., 2001]. Ймовірно, що інгібітори росту та репеленти хемотаксису B. japonicum в досліджених нами екстрактах є одними й тими ж речовинами і також мають білкову або фенольну природу.

Виходячи з того, що контактній взаємодії бульбочкових бактерій з рослинами передує сигналінгове "спілкування" за допомогою хімічних речовин, хемотаксис до неспецифічних та специфічних репелентів і атрактантів насіннєвого походження може відігравати роль при встановленні симбіотичних взаємовідносин між B. japonicum і соєю. Однак, соя сорту Чорнобура здатна вступати в симбіоз з брадіризобіями, хоча, за результатами нашої роботи, містить в екстрактах насіння репеленти і інгібітори росту. У зв'язку з цим можливо допустити, що хемотаксис B. japonicum до екстрактивних речовин насіння сої у деяких випадках відіграє певну, але не ключову роль у формуванні бобово-ризобіального симбіозу.

Таблиця 4

Хемотаксис Bradyrhizobium japonicum до водно-спиртових екстрактів

насіння різних сортів сої

Ступінь розведення екстрактів Кількість клітин (х108) різних штамів в капілярах, що містили екстракти сортів сої

Безбульбочкова Чорнобура Мар'яна

насіннєвих оболонок сім'ядоль насіннєвих оболонок сім'ядоль насіннєвих оболонок сім'ядоль

634б 604К 634б 604К 634б 10К 634б 10К 634б 10К 634б 10К

1:50 0.65 0.54 0.63 0.51 0.45 0.39 0.37 0.36 0.45 0.46 0.63 0.49

1:100 0.63 0.52 0.53 0.48 0.31 0.34 0.42 0.31 0.50 0.43 0.67 0.40

1:500 – – – – 0.26 0.36 0.37 0.34 – – – –

1:1000 0.44 0.46 0.42 0.43 0.13 0.35 0.42 0.35 0.51 0.51 0.90 0.37

1:2000 0.45 0.32 0.45 0.34 0.38 0.31 0.41 0.39 0.64 0.41 0.62 0.36

Контроль 0.60 0.53 0.52 0.52 0.42 0.40 0.39 0.38 0.44 0.31 0.46 0.34

Примітки:

1– контроль–кількість клітин в капілярах, які містили калій-фосфатний буфер;

2– в таблиці представлені дані по кількості клітин, які зайшли в капіляри під впливом водно-спиртових екстрактів за вирахуванням впливу на хемотаксис бактерій водно-спиртового розчину (екстрагента);

3– середні значення похибки середнього арифметичного для всіх варіантів дослідів, визначені при довірчій ймовірності 95%, складали 6.5%.

3. Особливості хемотаксисних властивостей бульбочкових бактерій сої в присутності високодисперсних матеріалів.

Мікроорганізми різних таксономічних груп можуть вступати в контактну взаємодію з високодисперсними матеріалами, що в значній більшості випадків призводить до змін їх фізіологічних властивостей [Курдиш, 2001]. Особливий інтерес викликає варіант, коли мікробна клітина знаходиться в оточенні мінеральних часток колоїдної дисперсності, що супроводжується їх сорбцією на бактеріальній поверхні [Звягинцев, 1973]. В природних умовах бульбочкові бактерії можуть взаємодіяти з глинистими мінералами, які є компонентами багатьох типів ґрунтів [Тарасевич, Овчаренко, 1975]. Тому природні мінерали будуть виступати одним з абіотичних факторів, що можуть спричиняти дію на хемотаксис бульбочкових бактерій. Це питання залишається не дослідженим.

Методом мікроелектрофорезу було показано, що B. japonicum вступає в контактну взаємодію з глинистими мінералами [Курдиш, Антонюк, 1999]. В нашій роботі капілярним методом продемонстровано, що взаємодія B. japonicum з монтморилонітом (0.1–1.0 г/л) супроводжувалась підвищенням рухливості бактерій штамів 634б і 604К на 25–188% (рис. 5). В той же час хемотаксис B. japonicum 634б і 604К до глюкози в тих варіантах, коли до суспензії додавали монтморилоніт, зменшувався порівняно з варіантами без мінералу. Наприклад, вміст 0.1 г/л мінералу інгібував хемотаксис цих штамів ризобій на 32% та 47% відповідно. При обробці бактеріальних суспензій палигорськітом в тих же концентраціях в капіляри з калій-фосфатним буфером заходило на 28–73% більше клітин досліджуваних мікроорганізмів (рис. 6). Однак хемотаксисна відповідь бактерій на глюкозу зменшувалась. Інгібуючий вплив на хемотаксис B. japonicum 634б і 604К спричиняли всі досліджені концентрації палигорськіту (кількість клітин у капілярах з глюкозою зменшувалась на 38–54%). Ці результати підтверджені дослідженнями в напіврідкому середовищі.

Глинисті мінерали – це алюмосилікати, які на 70% складаються з оксиду кремнію і оксиду алюмінію. Певною моделлю окремих складових цих комплексних сполук є синтетичні високодисперсні матеріали на основі діоксиду кремнію. Вони характеризуються хімічною чистотою, біологічною і термічною стійкістю [Кремнезёмы…, 1993].

Оскільки раніше не була вивчена можливість взаємодії бульбочкових бактерій сої з синтетичними високодисперсними матеріалами діоксидом кремнію (ВДК) та модифікованим оксидом алюмінію діоксидом кремнію (МВДК), нами досліджено це питання. Методом мікроелектрофорезу показано, що B. japonicum вступає в контакт-тну взаємодію з цими матеріалами, причому з ВДК бактерії взаємодіють краще, ніж з МВДК.

Капілярним методом вивчення хемотаксису продемонстровано, що взаємодія клітин з ВДК стимулювала рухливість B. japonicum 634б, але менш помітно, ніж взаємодія з природними глинистими мінералами (рис. 7). За умов вмісту його в суспензії бактерій в найменшій концентрації (0.05 г/л) спостерігали найсильніший позитивний вплив – кількість клітин в капілярах з калій-фосфатним буфером зростала на 32 %. Поряд з цим синтетичний діоксид кремнію, як і глинисті мінерали, негативно впливав на хемотаксис бульбочкових бактерій сої (кількість клітин в капілярах з глюкозою зменшувалась максимально при концентрації високодисперсного матеріа-

Рис. 5. Вплив монтморилоніту на хемотаксисні властивості Bradyrhizobium japonicum 634б (А) і 604К (Б). Кількість клітин в капілярах без ефектора (1, 2) і з 5.6ґ10–2М глюкози (3, 4). Суспензія B. japonicum 634б не оброблена монтморилонітом (1, 3) та оброблена цим мінералом (2, 4).

Рис. 6. Вплив палигорськіту на хемотаксисні властивості Bradyrhizobium japonicum 634б (А) і 604К (Б). Кількість клітин в капілярах без ефектора (1, 2) та з 5.6ґ10–2М глюкози (3, 4). Суспензія B. japonicum 634б не оброблена палигорськітом (1, 3) та оброблена цим мінералом (2, 4).

Рис. 7. Вплив високодисперсного діоксиду кремнію (ВДК) на хемотаксисні властивості Bradyrhizobium japonicum 634б. Кількість клітин в капілярах з калій-фосфатним буфером ( ) і 5.6ґ10–2 М глюкози ( ). Вміст ВДК: 1– без ВДК, 2– 0.05 г/л, 3– 0.1 г/л, 4– 0.2 г/л, 5– 0.5 г/л, 6– 1.0 г/л.

лу 1.0 г/л – на 33%).

МВДК виявився єдиним з досліджених високодисперсних матеріалів, наслідком присутності якого в суспензії B. japonicum 634б в кількості 0.05–1.00 г/л було зниження рухливості бактерій на 14–28% (рис. 8). Він інгібував і хемотаксис брадіризобій, причому майже в 2 рази інтенсивніше (на 59% при його концентрації 1.0 г/л), ніж немодифікована форма діоксиду кремнію. Подібні результати щодо впливу синтетичних високодисперсних матеріалів на хемотаксисні властивості були отримані для неактивного по азотфіксації штаму B. japonicum 604К.

Виходячи з того, що досліджені високодисперсні матеріали по-різному впливали на рухливість B. japonicum, викликало інтерес порівняння даних ефектів з впливом цих матеріалів на фізіологічну активність бактерій. Відомо, що глинисті мінерали монтморилоніт і палигорськіт стимулювали фізіологічну активність азотфіксуючих мікроорганізмів, в тому числі і ріст B. japonicum [Курдиш, 2001, Титова с соавт., 1994, Курдиш, Титова, 2001]. Як зазначалось вище, вони характеризувались і стимулюючою дією на рухливість брадіризобій.

Особливості росту бульбочкових бактерій сої в присутності синтетичних високодисперсних матеріалів були не вивчені. Нами показано, що ВДК в концентрації 0.05 г/л, при якій ми спостерігали максимальне стимулювання рухливості бульбочкових бактерій сої, спричиняв найбільший позитивний вплив і на ріст B. japonicum 634б – кількість життєздатних бактерій зростала на 29.8% (табл. 5).

Рис. 8. Вплив модифікованого оксидом алюмінію високодисперсного діоксиду кремнію (МВДК) на хемотаксисні властивості Bradyrhizobium japonicum 634б. Кількість клітин в капілярах з калій-фосфатним буфером ( ) і 5.6ґ10–2 М глюкози ( ). Вміст МВДК: 1– без МВДК, 2– 0.05 г/л, 3– 0.1 г/л, 4– 0.2 г/л, 5– 0.5 г/л, 6– 1.0 г/л.

Таблиця 5

Вплив високодисперсного діоксиду кремнію (ВДК)

на ріст Bradyrhizobium japonicum 634б

Вміст ВДК в живильному середовищі, г/л Чисельність бактерій в культуральній рідині

клітин ґ108/мл % до контролю

0.00 (контроль) 5.77±0.10 100

0.05 7.49±0.80 129.8

0.10 5.73±0.25 99.3

0.20 5.86±0.32 101.6

0.50 0.71±0.13 12.3

1.00 0.85±0.08 14.7

Примітка. Вміст бактерій на початку досліду складав 4.4ґ106 кл/мл.

МВДК, який негативно впливав на рухливість бульбочкових бактерій в усіх досліджених концентраціях, при внесенні в живильне середовище в тих же кількостях інгібував і їх ріст (чисельність бактерій в культуральній рідині становила 92.1– 78.7% по відношенню до контрольного варіанта без даного дисперсного матеріалу) (табл. 6).

Таблиця 6

Вплив модифікованого оксидом алюмінію високодисперсного діоксиду

кремнію (МВДК) на ріст Bradyrhizobium japonicum 634б

Вміст МВДК в живильному середовищі, г/л Чисельність бактерій в культуральній рідині

клітин ґ108/мл % до контролю

0.00 (контроль) 5.07±0.52 100.0

0.05 4.49±0.21 88.6

0.10 4.67±0.38 92.1

0.20 4.50±0.32 88.8

0.50 4.02±0.46 79.3

1.00 3.99±0.23 78.7

Примітка. Вміст бактерій на початку досліду складав 2.95ґ106 кл/мл.

Виходячи з вищевикладеного, можливо зробити висновок про позитивну кореляцію між впливом високодисперсних матеріалів на рухливість бульбочкових бактерій та характер їх росту. Ймовірно, природа механізмів цих залежностей є спільною, що потребує подальшого дослідження.

Хемотаксис бульбочкових бактерій до глюкози, як нами вперше показано, знижувався в присутності як природних, так і синтетичних високодисперсних матеріалів. Зважаючи на те, що B. japonicum вступає в контактну взаємодію з високодисперсними частками, можливо пов'язати зменшення рівня хемотаксисної відповіді з сорбцією цих часток на поверхні бактерій. Така сорбція призводить до змін властивостей поверхні клітин. Не виключно, що в даних умовах білки-рецептори хемотаксису будуть блоковані та чутливість B. japonicum до атрактанта зменшена.

ВИСНОВКИ

1. Досліджений вплив абіотичних та біотичних факторів на хемотаксисні властивості повільноростучих бульбочкових бактерій сої. Запропонована нова модифікація капілярного методу дослідження хемотаксису бактерій. Оптимізовані умови вивчення хемотаксисних властивостей B. japonicum капілярним методом та в напіврідкому середовищі.

2. Вперше визначені оптимальні для хемотаксису B. japonicum 634б і 10К фізико-хімічні фактори навколишнього середовища. Найвищих показників хемотаксисна відповідь цих бактерій досягає в діапазоні рН 6.5–7.5 і температурі 20–250С.

3. Встановлено, що широке коло органічних сполук (амінокислот, вуглеводів та органічних кислот) є атрактантами для B. japonicum 634б, 10К і 604К. Показано, що між різними штамами спостерігаються певні відмінності в хемотаксисній відповіді до даних речовин.

4. Вперше показано, що екстракти насіння сої сортів Чорнобура і Безбульбочкова містять речовини, які викликають негативну хемотаксисну відповідь у B. japonicum. Екстракти насіння сої сорту Мар'яна мають в своєму складі лише позитивні ефектори для досліджених бактерій. Не виявлено різниці в хемотаксисі до екстрактів у активних (634б, 10К) і неактивного (604К) по азотфіксації штамів B. japonicum.

5. Екстрактивні речовини насіння сої сортів Чорнобура і Безбульбочкова пригнічують ростову активність B. japonicum 634б, а насіння сої сортів Мар'яна, Київська-27, Соєр – не спричиняють такої дії.

6. Вперше встановлено, що природні високодисперсні матеріали (глинисті мінерали монтморилоніт і палигорськіт) та синтетичні високодисперсні матеріали (високодисперсний діоксид кремнію і модифікований оксидом алюмінію високодисперсний діоксид кремнію) впливають на рухливість B. japonicum 634б і 604К. При цьому монтморилоніт, палигорськіт і діоксид кремнію стимулюють, а модифікована форма діоксиду кремнію інгібує її.

7. Вперше виявлена позитивна кореляція між впливом високодисперсних матеріалів на ріст бульбочкових бактерій сої та їх рухливість. З'ясовано, що високодисперсний діоксид кремнію стимулює як рухливість, так, в певних концентраціях, і ріст B. japonicum 634б, в той час як модифікований оксидом алюмінію високодисперсний діоксид кремнію негативно впливає на ці властивості бактерій.

8. Вперше показано, що присутність в суспензії B. japonicum 634б і 604К глинистих мінералів монтморилоніту і палигорськіту, що є природними компонентами багатьох типів ґрунтів, а також синтетичного високодисперсного діоксиду кремнію і модифікованого оксидом алюмінію високодисперсного діоксиду кремнію викликає зниження хемотаксису цих бактерій до атрактанта. Встановлено, що хемотаксисні властивості B. japonicum в присутності високодисперсних матеріалів не залежать від азотфіксувальної активності штамів.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Чуйко Н.В., Антонюк Т.С., Курдиш И.К. Влияние экстрактивных веществ семян сои на хемотаксис Bradyrhizobium japonicum // Бюлетень сільськогоспод. мікробіології.– 2000.– № 6.– С. 48–49.

2. Курдиш И К., Антонюк Т.С., Чуйко Н.В. Влияние некоторых факторов внешней среды на хемотаксис Bradyrhizobium japonicum // Микробиология.– 2001.–Т. 70, № 2.– С. 106–110.

3. Чуйко Н.В., Курдиш И.К. Влияние глинистых минералов на хемотаксис Bradyrhizobium japonicum 634б // Вісник Одеського національного університету.– 2001.– Т. 6, вип. 4.– С. 350–353.

4. Чуйко Н.В., Антонюк Т.С., Курдиш И.К. Хемотаксис Bradyrhizobium japonicum к различным органическим соединениям // Микробиология.– 2002.– Т. 71, № 4.– С.460–466.

5. Курдиш И.К., Чуйко Н.В. Азотфиксирующие бактерии как первичное звено накопления связанных форм азота при озеленении терриконов // Матер. міжнар. науково-практичн. конференції (Слав'яногірськ Донецької обл., 14-18 грудня 1999 р.) – К., 1999.– С. 155–156.

6. Чуйко Н.В., Антонюк Т.С., Курдиш И.К. Хемотактические свойства клубеньковых бактерий сои // Матер. междунар. конф. "Микробиология и биотехнология на рубеже XXI столетия" (Минск, 1-2 июня 2000 г.) – Минск: ЗАО "ПРОПИЛЕИ", 2000.– С. 96–97.

7. Чуйко Н.В., Антонюк Т.С., Курдиш И.К. До питання хемотаксису Bradyrhizobium japonicum і його значення у формуванні бобово-ризобіального симбіозу // Матер. Міжнар. науково-практичн. конф. (Львів, 18-20 вересня 2001 р.) – Львів, 2001.– С. 304–310.

8. Чуйко Н.В., Курдиш І.К. Вплив синтетичних високодисперсних матеріалів на хемотаксисні властивості Bradyrhizobium japonicum // Матеріали Всеукраїнської конференції молодих вчених "Засади сталого розвитку аграрної галузі" (Київ, 28–30 жовтня 2002 р.) – Київ, 2002.– С. 99–100.

АНОТАЦІЯ

Чуйко Н.В. Хемотаксисні властивості Bradyrhizobium japonicum.– Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія.– Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2003.

Дисертація присвячена дослідженню хемотаксисних властивостей повільноростучих бульбочкових бактерій сої. Вивчено залежність хемотаксису Bradyrhizobium japonicum від щільності популяції бактерій, стадії розвитку культури, рН, температури навколишнього середовища.

Досліджено хемотаксис різних за активністю по азотфіксації штамів B. japonicum до ряду амінокислот, вуглеводів, органічних кислот, а також до екстрактів насіння сої сортів, що відрізняються за симбіотичними властивостями по чутливості до бульбочкових бактерій.

Показано негативний вплив на хемотаксис B. japonicum до глюкози природних високодисперсних матеріалів (глинистих мінералів монтморилоніту і палигорськіту), які є компонентами багатьох типів ґрунтів, і синтетичних високодисперсних матеріалів (діоксиду кремнію (ВДК) та модифікованого оксидом алюмінію діоксиду кремнію (МВДК)). Зниження рівня хемотаксисної відповіді пояснюється сорбцією дисперсних часток на поверхні бактерій, і, як наслідок, блокуванням білків-рецепторів хемотаксису та зменшенням чутливості B. japonicum до атрактанта.

Виявлена позитивна дія на рухливість бульбочкових бактерій сої монтморилоніту, палигорськіту, ВДК та негативна – МВДК, що корелює з впливом даних високодисперсних матеріалів на ріст B. japonicum. Висловлюється припущення про спорідненість природи механізмів цих залежностей.

Ключові слова: хемотаксис, рухливість, Bradyrhizobium japonicum, високодисперсні матеріали.

АННОТАЦИЯ

Чуйко Н.В. Хемотаксисные свойства Bradyrhizobium japonicum.– Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 – микробиология.– Институт микробиологи и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 2003.

В диссертации рассмотрено влияние абиотических и биотических факторов на хемотаксисные свойства медленнорастущих клубеньковых бактерий сои. Предложена новая легко воспроизводимая модификация капиллярного метода исследования хемотаксиса, которая может быть использована для изучения хемотаксисных свойств не только Bradyrhizobium japonicum, но и других микробных объектов. Оптимизированы условия изучения хемотаксиса B. japonicum капиллярным методом, а также в полужидкой среде. Исследована зависимость хемотаксиса B. japonicum от плотности популяции,