НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

ДУБРОВСЬКА Анна Миколаївна

УДК 616-006:577.2.575

ВИВЧЕННЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНИХ МЕХАНІЗМІВ ПУХЛИННОЇ ПРОГРЕСІЇ ПРИ Ph'-ПОЗИТИВНИХ ЛЕЙКЕМІЯХ ТА ЇХ ДІАГНОСТИКА

03.00.15- генетика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2003

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Інституті молекулярної біології і генетики НАН України

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, професор,

член-кор. НАН України

Малюта Станіслав Станіславович,

Інститут молекулярної біології і генетики

НАН України, м. Київ,

завідувач відділу молекулярної генетики.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор,

член-кореспондент НАН України

Риндич Алла Володимирівна,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,

завідувач відділу молекулярної онкогенетики.

кандидат біологічних наук,

доцент

Дробот Людмила Борисівна,

Інститут біології клітини НАН України, м. Львів,

в.о. завідувача відділу сигнальних механізмів клітини.

Провідна установа:

Інститут агроекології та біотехнології УААН, м. Київ.

Захист відбудеться “27” березня 2003 року о годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.202.01. в Інституті клітинної біології і генетичної інженерії за адресою: м. Київ 03143, вул. ак. Заболотного, 148

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту клітинної біології і генетичної інженерії НАН України за адресою: м. Київ 03143, вул. ак. Заболотного, 148.

Автореферат розіслано “21” лютого 2003 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук В. Д. Науменко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Філадельфійська (Ph’) хромосома, описана в 1960 р. Новелом та Хандерфордом [Nowell, 1960], була першим цитогенетичним маркером, асоційованим із певним типом пухлинного захворювання системи крові. Утворення даної хромосоми зумовлено реципрокною транслокацією між 9 і 22 хромосомами t(9;22)(q34;q11).

Ph’-хромосома виявляється приблизно в 95% хворих на хронічний мієлолейкоз (ХМЛ), а також у 25-30% дорослих та 2-10% дітей, хворих на гостру лімфобластну лейкемію (ГЛЛ) [Rowley, 1973; Gishizky , 1996; Butturini et al., 1996 ].

На молекулярному рівні реципрокна транслокація t(9;22)(q34;q11) супроводжується утворенням двох гібридних генів - гена bcr/abl на Ph’ хромосомі (представленого на 5'-кінці ділянкою гена bcr, а на 3'-кінці - ділянкою гена abl ) та abl/bcr на хромосомі 9q+ [Gishizky , 1996] . В залежності від центру розривів в межах гена bcr продукт транскрипції гена bcr/abl може мати молекулярну масу 190, 210 або 230 кДа. Білок Bcr/Abl є головним маркером Ph’- лейкемій і володіє тирозинкіназною активністю. До білкових доменів, які суттєво впливають на пухлиногенний потенціал Bcr/Abl, відносять Dbl-гомологічний (DH) та плекстрин-гомологічний (РН) домени, які представлені лише в р210, але не в р190 формі білка Bcr/Abl (498-866 а. з.). Наявність зазначених доменів корелює із характером перебігу захворювання: якщо експресія р190 виявляється лише у хворих на ГЛЛ, то р210 переважно виявляється у хворих на ХМЛ [Gishizky , 1996; Butturini et al., 1996]. Фізіологічна роль DН та PH - доменів полягає у модулюванні внутрішньоклітинного розташування онкобілка Bcr/Abl, опосередковано, шляхом впливу на організацію актинового цитоскелету (DН-домен) [Chuang et al., 1995], або безпосередньо, завдяки зв’язуванню з мембранними фосфоліпідами (PH-домен) [Shaw et al., 1996]. Внутрішньоклітинний розподіл білка Bcr/Abl визначає його взаємодію із певним спектром сигнальних білків і характер клітинної відповіді. Аналіз мутацій в DН та PH доменах та дослідження їхнього впливу на фізіологію клітини буде сприяти більш глибокому розумінню молекулярних механізмів пухлинної прогресії та переходу ХМЛ до бластної кризи. Відкритим також залишається питання про рівень експресії та функціональну активність нормального білка Bcr, який експресується в Ph'- клітинах поряд з онкобілком Bcr/Abl. Відомо, що білок Bcr є негативним регулятором Bcr/Abl [ Wu et al., 1999]. Отже, аналіз рівня експресії нормального Bcr білка у хворих на ХМЛ і ГЛЛ має прогностичне значення для передбачення подальшого перебігу захворювання.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота відповідає основному плану фундаментальних досліджень, які проводяться у відділі молекулярної генетики Інституту молекулярної біології і генетики НАН України (зав. відділом - доктор біол. наук, професор, чл.-кор. НАН України С. С. Малюта) за бюджетною темою № 2.2.4.7. шифр 2.34.6.1 - "Мінливість молекулярно-генетичних маркерів в процесах пухлинної трансформації клітин", а також проводилися в рамках міжнародного проекту CRDF, UB 1-294 "Investigation of molecular-genetics mechanism of blast transformation in patients with chronic myecytic leukemia (CML)."

Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи було дослідження можливого впливу мутаційних змін Bcr–послідовності онкобілка Bcr/Abl на зміни структури цитоскелету, розробка підходів для детекції нормального білка Bcr та комплексного підходу до діагностики та моніторінгу ХМЛ та ГЛЛ.

Відповідно до зазначеної мети були поставлені такі завдання:

1) Здійснити порівняльний аналіз змін в організації актинового цитоскелету в поліморфноядерних лейкоцитах периферійної крові хворих на ХМЛ ( хронічна стадія, бластна криза), хворих на ГЛЛ та здорових донорів;

2) Провести мутаційний аналіз Dbl-кодуючої ділянки гена bcr/abl у хворих на ГЛЛ та у хворих на стадії бластної кризи ХМЛ методом хімічного розщеплення ДНК-ДНК гетеродуплексів та провести секвенування зазначеної ділянки гена bcr/abl з метою уточнення мутантних локусів;

3) Екстраполювати виявлені мутаційні зміни на рівень білка для прогнозування можливих конформаційних і функціональних змін гібридного онкобілка;

4) Здійснити клонування DH- та PH – гомологічних ділянок гена bcr/abl у вектор для бактерійної експресії серії pET, оптимізувати умови експресії та очищення рекомбінантих DН та РН доменів гібридного онкобілка Bcr/Abl, отримати і охарактеризувати поліклональні антитіла проти них;

5) Оптимізувати умови детекції гібридного онкобілка Bcr/Abl і його нормального гомолога Bcr в клітинах хворих на ХМЛ та ГЛЛ методом Вестерн-блотингу для використання разом з ЗТ-ПЛР у комплексній діагностиці Ph'-позитивних лейкемій людини.

Об'єкт дослідження - химерний онкоген bcr/abl і його нормальний клітинний гомолог bcr.

Предмет дослідження - мутаційні зміни РН та DН доменів онкобілка Bcr/Abl під час пухлинної прогресії та рівень експресії білка Bcr у хворих на ХМЛ.

Методи дослідження - накопичення вторинних мутаційних змін гена bcr/abl під час прогресії ХМЛ досліджували на рівні фізіології клітини аналізом змін актинового цитоскелету в клітинах хворих на ХМЛ та ГЛЛ та на рівні первинної структури Dbl-кодуючої ділянки гена bcr методами ПДРФ, методом хімічного розщеплення ДНК-ДНК гетеродуплексів, секвенуванням dbl районів гена bcr/abl . Клінічні діагнози “Ph’-позитивний ХМЛ” та “Ph’-позитивний ГЛЛ” верифікувалися методом ЗТ-ПЛР. Білки Bcr/Abl та Bcr детектували методом Вестерн-блотингу із використанням отриманих поліклональних антитіл проти DН та РН доменів білка Bcr.

Наукова новизна отриманих результатів. У даній роботі вперше виявлено взаємозв'язок між мутаціями у Dbl-кодуючому районі гена bcr/abl і організацією актинового цитоскелету в поліморфноядерних лейкоцитах хворих на ХМЛ на стадії бластного кризу.

Детектовані мутаційні зміни Dbl-гомологічного домена білка Bcr/Abl були локалізовані секвенуванням (Phe547Leu, Thr654Lys) і екстрапольовані на рівень білкової структури і функції.

Вперше розроблено схему клонування, експресії і очищення рекомбінантних DН та РН доменів гібридного онкобілка Bcr/Abl у бактерійній системі рЕТ та отримано поліклональні антитіла проти них.

Розроблено підходи для комплексної діагностики та прогнозування перебігу ХМЛ та ГЛЛ з використанням отриманих поліклональних антитіл у поєднанні з ЗТ-ПЛР.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані свідчать, що в окремих випадках прогресія ХМЛ пов'язана з дисфункцією bcr області злитого гена bcr/abl, яка може бути вирішальним фактором переходу до бластної кризи, або діяти разом із іншими молекулярними механізмами пухлинної прогресії.

Стандартною практикою діагностики de novo і верифікації діагнозу при Ph’- позитивних лейкеміях є детекція bcr/abl мРНК методом зворотньо-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції (ЗT-ПЛР). Хоча такий метод діагностики має високий рівень чутливості (10-5 лейкемічних клітин у проаналізованих зразках), є дані про наявність фонової кількості транскриптів гена bcr/abl у клітинах здорових донорів. Це визначає необхідність розробки комплексних підходів до діагностики та моніторінгу Ph’-позитивних лейкемій людини. Отримані анти-Bcr антитіла можна рекомендувати для аналізу рівня експресії онкобілка Bcr/Abl і нормального білка Bcr, який є природним інгібітором тирозинкіназної активності Bcr/Abl, в клітинах хворих на різних стадіях захворювання і під час проведення терапевтичного курсу. Використання імунологічних підходів поряд із методом ЗТ-ПЛР може бути покладено в основу для розробки комплексної діагностики Ph'-позитивних лейкемій людини.

Особистий внесок здобувача. Робота виконувалася під керівництвом д. б. н., професора, чл.-кор. НАН України С. С. Малюти. Особистий внесок здобувача полягає у плануванні та виконанні експериментів і аналізі отриманих результатів. Всі експериментальні дані, наведені в дисертації, отримані безпосередньо здобувачем або за його участю.

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи були представлені на виставці BioTechnica'2001 (Ганновер, 2001), на I-й міжнародній конференції для молодих науковців, аспірантів та студентів з молекулярної біології та генетики (Київ, 2001), 6-й Пущінській школі-конференції молодих вчених (Пущіно, 2002), конференції "Проблеми онкогенетики: наукові і прикладні аспекти" (Київ, 2002), на 3-й Парнасівській конференції "Mechanisms of cellular signal transduction and communication" (Львів, 2002), на 4-й Парнасівській конференції "Molecular mechanisms of cell activation: biological signals and their target enzymes" (Вроцлав, 2002), доповідалися на наукових семінарах відділу молекулярної генетики.

Публікації. За темою дисертації опубліковано чотирнадцять друкованих праць, з них сім статей у співавторстві, а також сім тез, серед яких п’ять тез доповідей на міжнародних наукових конференціях.

Структура та обсяг роботи. Дисертацію викладено на 154 сторінках. Вона містить вступ, огляд літератури, експериментальні дослідження, результати досліджень, їх обговорення, висновки. Дисертацію проілюстровано 33 рисунками та 2 таблицями. Список цитованої літератури охоплює 250 найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали та методи досліджень. Виділення РНК із поліморфноядерних лейкоцитів.. РНК виділяли із використанням гуанідинізотіоціанатного методу [Chomczynski et al., 1987] або із використанням набору RNeasy Mini Kit фірми Qiagen (США). Вихід РНК складав від 20 до 50 мкг із 1012 клітин в залежності від методу виділення.

Отримання кДНК. кДНК синтезували в 200 мкл реакційної суміші, яка містила 5 мкг РНК, 1 мМ дНТФ (“Promega”, США), 20 од. зворотньої транскриптази M-MLV (“Promega”, США) і буфер для неї, 10 од. РНазину, 15 пмоль праймеру А1 (5’- TGATTATAGCCTAAGACCCGGA-3’) або оліго(dT)12. Синтез проводили за температури 370С протягом 1.5 год. Аліквоти реакційної суміші об’ємом 10 мкл використовували для проведення першого раунду ампліфікації.

Полімеразна ланцюгова реакція. Детекцію філадельфийської хромосоми проводили методом двохраундової ПЛР згідно з методичними розробками [Телегеєв та ін., 1997].

Ампліфікацію фрагмента ДНК (1923-2787 п.о.), що кодував DН домен, здійснювали в два етапи. На першому етапі використовували зовнішні праймери

Ext1dbl (прямий) 5‘-GGCTGCCCTACATTGATGACTCGC-3‘ та Ext1rdbl (зворотній) 5‘-GATGTTGGGCACTGCCTCCAGTTC-3‘; на другому етапі використовували праймери bcr1(прямий) 5'-GCCCTGGAGTCCACTAAAGC-3' та BCR2 (зворотній) 5'-CGGTGCTCTCCCTTCTTC-3'.

Для ампліфікації РН ділянки гена bcr/abl використовували на першому етапі ПЛР праймери Ph1-f ( прямий) 5'-GTCTTCCTGTTCACCGAGCTG-3' та Ph1-r (зворотній) 5'-GCTTAGAGTGTTATCTCCACTGGC3', на другому етапі ПЛР використовували праймери Ph-f (прямий) 5'-CTGCAAATGGTACATTCCGCTCAC-3' та Ph-r (зворотній) 5'-AACGAGCGGCTTCACTCAGACC-3'. Кожний раунд ПЛР складався з 30 циклів з таким режимом: 940С – 30 сек, 560С – 30 сек, 720С – 1 хв 30 сек. Реакційна суміш об’ємом 30 мкл включала такі компоненти: 200 мкМ дНTФ, 1,5 мM MgCl2, 5 од. Рfu ДНК полімерази та буфер до неї, 10 пмоль кожного праймеру, 10 мкл кДНК.

Культивування клітин. Під час досліджень було використано клітини ліній К562 (Рh'-позитивні клітини еритролейкемії людини) і U937 ( Рh'-негативні клітини промоноцитарної лейкемії), а також тимчасові культури поліморфноядерних лейкоцитів хворих на ХМЛ і ГЛЛ. Поліморфноядерні лейкоцити крові виділяли в градієнті густини з використанням Histopaque 1077 (“Sigma”, США). Клітини культивували в середовищі RPMI 1640 (“Sigma”, США), що містило 10% ембріональної телячої сироватки (“Gibco”, США), 2 мМ L-глутаміну, 100 од/мл пеніциліну, 200 мкг/мл стрептоміцину.

Специфічне забарвлення F-актину. Для візуалізації актину в клітинах використовували FITC-мічений фалоідин [Wulf et al., 1979]. Розподіл цитоскелету спостерігали за допомогою імерсійної системи флуоресцентного мікроскопа Nikon Microscope Optiphot-2 (збільшення 1000, збудження 450-490 нм; випромінення 510 нм). Фотографії були отримані з використанням фотосистеми Nikon Photomicrographik Attachment Microflex UFX-DX.

Аналіз мутацій Dbl - кодуючої ділянки гена bcr/abl. Аналіз мутацій проводили методом хімічного розщеплення ДНК-ДНК гетеродуплексів [Cotton et al., 1988]. Для формування гетеродуплексів готували суміш, що містила еквівалентну кількість (50-100 мкг) продуктів-ампліфікації dbl - кодуючої ділянки гена bcr/abl, отриманих від здорового і хворого донорів. Продукти розщеплення аналізувались електрофорезом у 12% денатуруючому ПААГ ( U = 90 V, t = 12 год).

Секвенування клонованих фрагментів ДНК. Секвенування ДНК здійснювали за допомогою набору “Т7SequencingТМ Kit” ("Amersham Pharmacia Biotеch, Inc.", США), відповідно до інструкцій виробника.

Виділення плазмідної ДНК. Для аналітичного (2 мл) та препаративного (200 мл нічної культури бактерій) виділення плазмідної ДНК зі штаму E. coli XL1 bluetet використовували метод лужного лізису з наступною фенол-хлороформною екстракцією [ Birnboim et al., 1979] або хроматографічні колонки "Qiaprep Miniprep Kit (Tip 20)" "Qiaprep Midiprep Kit (Tip 100)" фірми Qiagen (Німеччина).

Клонування РН та DН районів гена bcr/abl у вектор для бактерійної експресії. Ампліфіковані фрагменти кДНК гена bcr/abl, що відповідали ділянці гомології до гена плекстрину (2744 - 3333 п. о.) та Dbl-гомологічній ділянці (2015-2597 п.о. відповідно до послідовності кДНК гена bcr/abl ) було клоновано за центрами впізнавання для ендонуклеаз рестрикції Eco RI та Eco RV, відповідно, у вектор для бактерійної експресії pET32b фірми Novagen (Німеччина). Відбір рекомбінантних клонів здійснювали з використанням тесту на б-комплементацію. Орієнтацію клонованої послідовності аналізували методом рестрикційного аналізу. Коректність рамки зчитування перевіряли секвенуванням. Отримані конструкції дістали назви pDDBA3 (рекомбінантний вектор, що кодує Dbl-гомологічну ділянку) та pPDBA138 (вектор, що містить ділянку гомології до гена плекстрину). Аналітична експресія рекомбінантних білків у клітинах E. coli BL21/DE3 показала наявність продуктів трансляції розміром 58 кДа для конструкції pDDBA3 та 44 кДа для конструкції pPDBA138.

Очищення рекомбінантних білків. Препаративну експресію рекомбінантних білків проводили у 200 мл культурального середовища LB. Вихід білка за спектрофотометричними даними після очищення тілець включення складав 80-90 мг/л культурального середовища, а для розчинної фракції 10-20 мг/л. Очищення рекомбінантних білків здійснювали хроматографією на Ni-NTA агарозі фірми Qiagen (Німеччина) в присутності 2 М сечовини для білка DDBA3 або в нативних умовах для білка PDBA138 згідно з рекомендаціями виробника. Концентрація білка після хроматографічного очищення складала 0.5 мг/мл для білка DDBA3 із чистотою 90% та 0.25 мг/мл для білка РDBA138 із чистотою 95-98%. Визначення концентрації білка проводили спектрофотометрично на спектрофотометрі “Specord UV-VIS” (Німеччина). Концентрацію визначали за OD280нм з урахуванням коефіцієнту екстинкції білка та довжини оптичного шляху. Вимір проводили у кварцових кюветах з довжиною оптичного шляху 0,5 см. Коефіцієнт екстинкції визначали за даними амінокислотного аналізу за допомогою програми ProtParam (http://expasy.ch/cgi-bin/protparam). Коефіцієнт екстинкції білка DDBA3 при довжині хвилі 280 нм складав 42060 М-1 см-1, білка PDBA138 - 41820 М-1 см-1.

Одержання поліклональних антитіл проти рекомбінантних білків DDBA3 та PDBA138.

Для одержання поліклональних кролячих антитіл використовували хроматографічно очищені рекомбінантні білки DDBA3 та PDBA138, діалізовані проти буфера ЗФР, рН 7.4 [ Рожко та ін., 1997]. Для усунення реактивності антисироватки до бактерійних білків і константної частини рекомбінантних білків сироватку виснажували пропусканням крізь афінну колонку з імобілізованими на BrCN-активованій сефарозі ("Amersham Pharmacia Biotеch, Inc.", США) сумарними білками клітин штаму E. coli BL21(DE3) та константною частиною рекомбінантних білків відповідно до інструкцій виробника. Специфічність отриманих антитіл тестувалася Вестерн-блот аналізом.

Імуноблотинг. Для проведення Вестерн-блот аналізу проводили гель-електрофорез у 12,5% ДСН-ПААГ для білків DDBA3 та PDBA138 і 7.5% ДСН-ПААГ для детекції білків Bcr/Abl та Bcr у загальних лізатах лейкоцитів. Після електрофоретичного розділення білки переносили на нітроцелюлозну мембрану HybondTM-C (виробництва "Amersham Pharmacia Biotеch, Inc.", США) за допомогою системи для напівсухого електроперенесення TRANS-BLOT ("Bio-Rad", США). Поліклональні антитіла проти DDBA3 або PDBA138 використовували у розведенні 1:100 у 0.5% розчині БСА у ЗФР з 0,1% Твін-20 . Як другі антитіла використовували козлячі поліклональні антитіла проти константної частини Ig кролів, кон’юговані з пероксидазою хрону ("Amersham Pharmacia Biotеch, Inc.", США) у розведенні 1:2000 у 0.5% БСА у ЗФР з 0,1% Твін-20. Для візуалізації результатів блотингу використовували реагенти для ECL детекції (ECL detection kit, "Amersham Pharmacia Biotеch, Inc." США) згідно до інструкції виробника.

Результати досліджень та їх обговорення. Дослідження організації актинового цитоскелету в лейкоцитах хворих на Рh’-позитивні лейкемії і здорових донорів. Клінічні діагнози “Рh’–позитивний ХМЛ” і “Рh’–позитивний ГЛЛ” верифікували методом ЗТ-ПЛР. Серед зразків клітин хворих на лейкемії для дослідження організації актинового цитоскелету методом ЗТ-ПЛР було відібрано лише ті, в яких експресується p210 Bcr/Abl.. Поліморфноядерні лейкоцити периферійної крові хворих С. і К. (бластна криза ХМЛ), хворих Ф. і Я. (ГЛЛ), здорових донорів А. і В., Ph’-позитивні клітини лінії К562 були використані для приготування цитологічних препаратів. Порівняльний аналіз структури актинового цитоскелету в поліморфноядерних лейкоцитах різних донорів дозволив виділити 3 типи клітинного фарбування (рис.1)

В клітинах ліній К562, U937, як і в клітинах хворих на Ph’позитивні-лейкемії, найбільш яскраво виявлявся кортикальний цитоскелет, в той час як в клітинах здорових донорів кортикальний цитоскелет менш виражений. Цілком можливо, що виявлені особливості організації актинового цитоскелету пов’язані із проліферативним статусом клітин у культурі та поліморфноядерних лейкоцитів хворих, що вимагає активації багатьох сигнальних шляхів за участю білків, які асоційовані із мембранними актиновими комплексами. В ряді випадків, крім кортикального F-актину, нам вдалось детектувати крупні пунктати (хворий К., бластна криза ХМЛ). Наявні дані літератури [ McWhirter et al., 1997; Ron, 1991] свідчать на користь припущення, що виявлені зміни в організації актинового цитоскелету можуть бути пов’язані із нагромадженням мутацій в dbl- гомологічному районі гена bcr/abl і дисфункцією DН домена. DH домен Bcr білка виконує функцію фактора, що стимулює обмін гуанілових нуклеотидів в нуклеотидзв’язуючому центрі ГТФаз підродини Rho, залучених до регуляції функціонального стану актинового цитоскелету і необхідних для стабілізації актинових стресових волокон і утворення фокальних контактів.

Можна припустити, що транслокація B1/AII, що призводить до формування р190 Bcr/Abl білка і до втрати DН домена, так само як і мутація цього домена в р210 Bcr/Abl, може призводити до зміни структури цитоскелету і до появи в клітинах хворих пунктатів F-актину . Було зроблено припущення, що для хворого К., на відміну від інших випадків бластної кризи ХМЛ і ГЛЛ, характерні деякі структурні і функціональні зміни Dbl-гомологічного домена білка Bcr/Abl, що відбивається на організації F-актину поліморфноядерних лейкоцитів.

Аналіз мутацій гена bcr/abl методом ПДРФ. Для аналізу зв'язку між особливостями організації актинового цитоскелету і можливими змінами первинної структури dbl – ділянки у складі гена bcr/abl був проведений порівняльний аналіз мутацій для ДНК хворих Ф., К. і клітинної лінії К562 методом ПДРФ та хімічного розщеплення ДНК-ДНК гетеродуплексів. Аналіз поліморфізму довжини рестрикційних фрагментів проводили із використанням ендонуклеаз рестрикції Ear I, Xcm I, Bst I, HaeIII, BsaI, Bam HI, PleI, Xba I, Hinf I. При використанні ендонуклеаз рестрикції Xcm I, Bst I,HaeIII, BsaI, Bam HI, PleI, Xba I, Hinf I не виявлено розбіжностей між dbl – кодуючими ділянками гена bcr/abl. Проте, для рестриктази Ear I спостерігалася поява додаткового центру рестрикції CTCTTC (2127-2132) у випадку К. (ХМЛ, бластна криза), рис. 2.

Заміна Т на С відбувалася у положенні 2127 нуклеотидної послідовності кДНК гена bcr/abl. Раніше, при аналізі dbl - кодуючого фрагменту гена bcr/abl Рh'-позитивних клітин лінії К562, нами було виявлено точкову мутацію саме в положенні 2127, що відповідає положенню 547 амінокислотної послідовності білка Bcr/Abl і супроводжується заміщенням консервативного Phe 547 на Leu 547 внаслідок заміни кодона ТТС (2127-2129) на СТС. Проте, як це випливає із дослідження структури цитоскелету, заміщення одного амінокислотного залишку 547 не впливає на функції Dbl-гомологічного домена, або його вплив неможливо візуалізувати на рівні організації актинового цитоскелету.

Отже, нами було зроблено припущення щодо наявності додаткових мутаційних змін у dbl - гомологічному фрагменті гена bcr/abl у випадку хворого К., які б мали кумулятивний вплив на функціональну активність Dbl-гомологічного домену, тобто, на характер структури цитоскелету. Низька роздільна здатність методу ПДРФ лімітувала можливість детекції додаткових мутацій, тому метод ПДРФ було доповнено методом хімічного розщеплення ДНК-ДНК гетеродуплексів.

Аналіз мутацій гена bcr/abl методом розщеплення ДНК-ДНК гетеродуплексів. Під час проведення аналізу як “дику форму” використовували ДНК dbl області гена bcr донора А. В основу підходу був покладений метод хімічного розщеплення помилково спарованих основ гідроксиламіном і тетроксидом осмію, запропонований [Cotton et al., 1988]. Після ампліфікації dbl - гомологічних фрагментів розміром 670 п.н. проводили хімічне розщеплення ДНК дуплексів А+К, А+Ф, А+U937, А+А. Продукти розщеплення аналізували за допомогою електрофорезу в 12% денатуруючому ПААГ. Серед проаналізованих зразків лише гетеродуплекси А+К утворювали продукти розщеплення розміром близько 320, 200 та 150 п.н. (рис. 3).

Таким чином, дані аналізу мутацій за методом хімічного розщеплення ДНК-ДНК гетеродуплексів свідчать, що спільна для випадків К. та К562 мутація в положенні 2127 п. н., доповнюється в dbl - кодуючому фрагменті гена bcr/abl хворого К. ще однією точковою мутацією.

Секвенування гена bcr/abl. Для уточнення положення мутаційних змін у dbl – кодуючому районі нуклеотидної послідовності гена bcr/abl відклоновані фрагменти 1929-2608 п. о. кДНК гена bcr/abl було секвеновано. У клітинах лінії К562 і у випадку хворого К. було виявлено трансверсії у dbl - кодуючому районі гена bcr/abl в положенні 2127 (Т/С), а у хворого К. - додаткову мутацію у положенні 2449 ( С/А) (рис.4).

1981 TGAGAAAATG GGTCCTGTCG GGAATCCTGG CTAGCGAGGA GACTTACCTG AGCCACCTGG

2041 AGGCACTGCT GCTGCCCATG AAGCCTTTGA AAGCCGCTGC CACCACCTCT CAGCCGGTGC

2101 TGACGAGTCA GCAGATCGAG ACCATCСTCT TCAAAGTGCC TGAGCTCTAC GAGATCCACA

2161 AGGAGTTCTA TGATGGGCTC TTCCCCCGCG TGCAGCAGTG GAGCCACCAG CAGCGGGTGG

2221 GCGACCTCTT CCAGAAGCTG GCCAGCCAGC TGGGTGTGTA CCGGGCCTTC GTGGACAACT

2281 ACGGAGTTGC CATGGAAATG GCTGAGAAGT GCTGTCAGGC CAATGCTCAG TTTGCAGAAA

2341 TCTCCGAGAA CCTGAGAGCC AGAAGCAACA AAGATGCCAA GGATCCAACG ACCAAGAACT

2401 CTCTGGAAAC TCTGCTCTAC AAGCCTGTGG ACCGTGTGAC GAGGAGCAАG CTGGTCCTCC

2461 ATGACTTGCT GAAGCACACT CCTGCCAGCC ACCCTGACCA CCCCTTGCTG CAGGACGCCC

2521 TCCGCATCTC ACAGAACTTC CTGTCCAGCA TCAATGAGGA GATCACACCC CGACGGCAGT

2581 CCATGACGGT GAAGAAG

Рис. 4. Результати часткового секвенування dbl – гомологічної ділянки гена bcr/abl хворого К. Цифрами позначено відповідність зазначеного району послідовності кДНК гена bcr. Заливкою позначено локуси мутацій: трансверcія Т / С (2127 п. н.) у хворого К. та у клітинах лінії К562; трансверсія С / A ( 2449 п. н.) у хворого К. У рамку взятий центр впізнавання для рестриктази Ear I (CTCTTC).

Таким чином, отримані нами дані із використанням методів ПДРФ та хімічного розщеплення ДНК-ДНК гетеродуплексів узгоджуються із результатами секвенування dbl – гомологічного фрагменту гена bcr/abl і свідчать про наявність мутаційних замін гена bcr/abl у випадку хворого К.

Екстраполяція знайдених мутацій на білкову структуру і функцію. Множинне вирівнювання послідовностей здійснювали із використанням сервера Clustal W (http://www2.edi.ac.uk/clustaw/). Аналіз множинного вирівнювання послідовностей Dbl-гомологічних доменів білків еукаріотів показав, що мутація, спільна для клітин лінії К562 і хворого К., призводить до заміщення консервативного фенілаланіну у положенні 547 на лейцин, в той час як мутаційна зміна, притаманна лише випадку хворого К., локалізується в межах консервативного району Dbl-гомологічного домену CR3 і супроводжується заміною нейтрального амінокислотного залишку Thr 654 основним залишком лізину. Екстраполяція знайдених амінокислотних замін на рівень третинної структури білка дозволила локалізувати їх просторове розташування (рис.5).

Заміна Phe547/Leu може носити нейтральний характер і не впливати на каталітичну функцію DH домена, тому що вона не призводить до зміни класу амінокислотного залишку і належить до ділянки б-спіралі Н2а, яка знаходиться на внутрішньому боці б-спірального угрупування DH домена, що не бере участі у взаємодіях із ГДФ, ГТФазами та сусідніми білковими доменами. Навпаки, мутація Thr654/Lys, яку було знайдено лише у хворого К., призводить до заміщення нейтрального амінокислотного залишку основним залишком і належить найбільш консервативному району DH домена CR3. Мутацію Thr654/Lys виявлено в межах послідовності CR3, яка формує гідрофобну кишеню для зв’язування ГТФази. Це дозволяє стверджувати, що поява зарядженої амінокислоти в цьому районі може мати вирішальний вплив на біологічну активність Dbl-гомологічного домена.

Клонування DН та РН доменів гена bcr/abl та отримання поліклональних антитіл. Важливим для розуміння молекулярних основ пухлинної прогресії під час ХМЛ було б дослідження експресії нормального білка Bcr, який є негативним регулятором тирозинкіназної активності білка Bcr/Abl [Arlinghaus et al., 1998; Hawk et al., 2002]. Для отримання анти-Bcr-антитіл нами було зібрано експресуючу конструкцію pDDBA3 на основі вектора рЕТ32b, що кодувала Dbl – гомологічний домен білка Bcr, з наступною експресією рекомбінантного білка в клітинах E. coli штаму BL21/DE3. З метою отримання антитіл до різних епітопів, які впізнавали б нормальний білок Bcr і білок Bcr/Abl, нами було додатково зібрано експресуючу конструкцію рРDBA138 на основі вектора рЕТ32b, що кодувала РН домен білка Bcr. Рекомбінантні білки було очищено афінною хроматографією на Ni-NTA агарозі і використано для отримання поліклональних антитіл.

Отримані поліклональні антитіла виснажували на BrCN-активованій сефарозі ("Amersham Pharmacia Biotеch, Inc.", США) з імобілізованими сумарними бактерійними білками та пептидом, що експресується самим вектором рЕТ32. Результати Вестерн-блот аналізу представлено на рис. 6. У експерименті були використані загальні лізати поліморфноядерних лейкоцитів периферійної крові хворих та здорових донорів і Ph’-позитивних клітин лінії К562. На кожну доріжку було нанесено аліквоти проб, що відповідали 106 клітинам. Всі клінічні діагнози “Ph’-позитивний ХМЛ” та “Ph’-позитивний ГЛЛ” було верифіковано нами методом ЗТ-ПЛР. В усіх клітинних зразках детектувався нормальний білок Bcr з молекулярною масою 160 кДа. Серед зразків Ph’-позитивних клітин у хворого В. на ХМЛ, доріжка 2, білок р210Bcr/Abl не детектується, проте інтенсивність сигналу, що відповідає білку р160Bcr, у випадку В. була максимальною. Разом із цим, у зразку 3, (хворий П. на ХМЛ ), спостерігався максимальний рівень експресії химерного білка р210 Bcr/Abl, що супроводжувалося зниженням рівня експресії нормального білка р160 Bcr.

Денситометричний аналіз результатів Вестерн-блотингу дав змогу зробити припущення про зворотній зв'язок між рівнем експресії білка Bcr/Abl та його нормального клітинного гомолога Bcr. Згідно з отриманими in vivo результатами [Wu Y. et al., 1999], білок Bcr є інгібітором кіназної активності Bcr/Abl. Проте, питання щодо реципрокного впливу білків Bcr і Bcr/Abl на рівень експресії один одного залишається відкритим. Випадки хворого В. та П. (ХМЛ) можуть свідчити на користь існування такої регуляції, яка потребує подальшого детального вивчення.

Отже, отримані нами антитіла дозволили детектувати як нормальний білок Bcr, так і р210 Bcr/Abl, що дозволяє рекомендувати їх для розробки комплексного підходу для детекції філадельфійської перебудови. Це забезпечує проведення диференційної діагностики для хворих з підозрою на ХМЛ і прогнозування подальшого перебігу захворювання.

ВИСНОВКИ

1. Встановлено зв’язок між мутаційними змінами в Dbl-гомологічному домені білка Bcr/Abl та характером організації актинового цитоскелету.

2. Детектовано локуси нуклеотидних замін dbl-гомологічного району кДНК гена bcr/abl, виявлені зміни екстрапольовано на третинну структуру Dbl-гомологічного домена білка Bcr/Abl .

3. Розроблено схему клонування, експресії та очищення рекомбінантних DH та PH доменів гібридного онкобілка Bcr/Abl і отримані поліклональні антитіла проти них.

4. Оптимізовано умови детекції онкобілка Bcr/Abl і нормального білка Bcr у здорових та хворих донорів методом Вестерн-блот аналізу.

5. Виявлено існування негативного зворотнього зв’язку між рівнем експресії онкобілка Bcr/Abl і його нормального гомолога Bcr.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ

ДИСЕРТАЦІЇ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13. Волкова И. А., Дубровская А. Н., Телегеев Г. Д., Дыбков М. В. Клонирование и бактериальная экспрессия Dbl-гомологичного домена слитого BCR/ABL белка // Материалы 6-й Пущинской школы-конференции молодых ученых “Биология - наука XXI века”.- T1.-Пущино (Российская Федерация).-2002.-C. 227.

14. Telegeev G.D., Dybkov M.V., Dubrovska A.N., Maliuta S.S. Influence of Bcr/Abl fusion proteins on course of Ph' leukemias // Abstr. 4rd Parnas Conference Molecular mechanism of cell activation: biological signals and their target enzymes.-Wroclaw (Poland). -2002. -P.22.

АНОТАЦІЇ

Дубровская А. Н. Изучение молекулярно-генетических механизмов опухолевой пргрессии при Ph'-позитивных лейкемиях и их диагностика. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 - генетика.-Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2003.

Накопление вторичных мутационных изменений гена bcr/abl во время прогрессии ХМЛ было исследовано на уровне клеточной физиологии (анализом характера распределения актинового цитоскелета в клетках больных ХМЛ и ОЛЛ) и на уровне первичной структуры Dbl-кодирующего участка гена bcr (анализом мутаций методом ПДРФ, методом химического расщепления ДНК-ДНК гетеродуплексов, секвенированием dbl регионов гена bcr/abl ). Сравнительный анализ распределения актина в полиморфноядерных лейкоцитах разных доноров позволил выделить 3 типа клеточного окрашивания: 1) диффузное – к нему относились клетки нормальных доноров; 2) кортикальное – характерное для большинства больных – С. (ХМЛ, бластный криз), Ф. и Я. (ОЛЛ), а также для клеточных линий К562 и U937; 3) цитоскелетное распределение третьего типа – dot-like – наблюдалось лишь в одном случае К. (ХМЛ, бластный криз). Все медицинские диагнозы “Ph'-позитивный ХМЛ” и “Ph'-позитивный ОЛЛ” были верифицированы нами методом ОТ-ПЦР.

Анализ мутаций позволил в случае больного К. установить трансверсии в Dbl - кодирующем регионе гена bcr/abl в положении 2127 ( замена Т на С), и в положении 2449 ( трансверсия С - А). Выявленные мутации могут быть самодостаточным или дополнительным фактором опухолевой прогрессии.

С целью исследования наличия и уровня экспрессии нормального белка Bcr нами были экспрессированы, очищены и использованы для получения поликлональных антител рекомбинантные Dbl и плекстрин-гомологичные домены белка Bcr. Результаты Вестерн-блот анализа с использованием лизатов клеток больных ХМЛ дают возможность сделать предположения 1) о наличии отрицательной обратной связи между экспрессией белков Bcr и Bcr/Abl 2) о существовании механизмов регуляции экспрессии гена bcr/abl на уровне трансляции - в случае наличия транскриптов и отсутствии транслятов гена bcr/abl. Таким образом, полученные антитела дают возможность детектировать нормальный белок Bcr и позволяют разработать комплексный подход для детекции филадельфийской перестройки . Это обеспечивает более глубокий анализ молекулярных основ опухолевой этиологии, проведение дифференциальной диагностики для больных с подозрением на ХМЛ и прогнозирование дальнейшего хода заболевания.

Ключевые слова: хроническая миелоидная лейкемия, острый лимфобластный лейкоз, Bcr/Abl, Dbl-гомологичный домен, актиновый цитоскелет, молекулярная диагностика.

Дубровська А. М. Вивчення молекулярно-генетичних механізмів пухлинної прогресії при Ph'-позитивних лейкеміях та їх діагностика. - Рукопис.

Дисертація на здобутття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03. 00. 15 - генетика.-Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 2003.

Накопичення вторинних мутаційних змін гена bcr/abl під час прогресії ХМЛ було досліджено на рівні клітинної фізіології (аналізом характеру розподілу актинового цитоскелету у клітинах хворих на ХМЛ та ГЛЛ) та на рівні первинної структури Dbl-кодуючої ділянки гена bcr (аналізом мутацій методом ПДРФ, методом хімічного розщеплення ДНК-ДНК гетеродуплексів, секвенуванням dbl регіонів гена bcr/abl ). Порівняльний аналіз розподілу актину поліморфноядерних лейкоцитах різних донорів дозволив виділити 3 типи клітинного фарбування: 1) дифузійне – до нього відносилися клітини нормальних донорів; 2) кортикальне – характерне для більшості хворих – С. (ХМЛ, бластна криза), Ф. і Я. (ГЛЛ), а також для клітинних ліній К562 та U937; 3) цитоскелетний розподіл третього типу – dot-like – спостерігався лише в одному випадку К. (ХМЛ, бластна криза). Всі медичні діагнози “Ph’-позитивний ХМЛ” та “Ph’-позитивний ГЛЛ” було верифіковано нами методом ЗТ-ПЛР.

Аналіз мутацій дозволив у випадку хворого К. встановити трансверсії у Dbl - кодуючому регіоні гена bcr/abl в положенні 2127 ( заміна Т на С), та у положенні 2449 ( трансверсія С - А). Виявлені мутації можуть бути самодостатнім або додатковим фактором пухлинної прогресії.

З метою дослідження наявності та рівня експресії нормального білка Bcr нами було проекспресовано, очищено і використано для отримання поліклональних антитіл рекомбінантні Dbl та PH-гомологічні домени білка Bcr. Результати Вестерн-блот аналізу із використанням лізатів клітин хворих на ХМЛ дають змогу зробити припущення 1) про наявність негативного зворотнього зв'язку між ескпресією білків Bcr та Bcr/Abl 2) про існування механізмів регуляції експресії гена bcr/abl на рівні трансляції - у випадку наявності транскриптів та відсутності транслятів гена bcr/abl. Отже, отримані антитіла дають змогу детектувати нормальний білок Bcr і дозволяють розробити комплексний підхід для детекції філадельфійської перебудови . Це забезпечує більш глибокий аналіз молекулярних основ пухлинної етіології, проведення диференціальної діагностики для хворих з підозрою на ХМЛ і прогнозування подальшого перебігу захворювання.

Ключові слова: хронічна мієлоїдна лейкемія, гострий лімфобластний лейкоз , Bcr/Abl, Dbl-гомологічний домен, актиновий цитоскелет, молекулярна діагностика.

Dubrovskaya A. N. Investigation of molecular ang genetic mechanisms of tumor progression during Ph'-positive leukemias and diagnostics of them.- Manuscript.

Thesis for a candidat degree by speciality 03. 00. 15 - genetics.- Institute of Molecular Biology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2003.

Formation and expression of the fusion bcr/abl oncogene is the molecular hallmark of chronic myelogenous leukemia (CML) and Ph'-positive acute lymphoblastic leukemia (ALL). It is known two types of Bcr-Abl fusion protein: p190 Bcr-Abl which is mostly found in ALL and posses of greater transforming potential and p210 Bcr-Abl mostly found with CML. Dbl-homology (DH) domain of Bcr presented in p210 Bcr-Abl but not in p190 Bcr-Abl. This domain encodes a guanine nucleotide exchange factor activity specifically for Rho GTPase and modulates of the cell actin structure. The modulator effect of Dbl domain on actin structure may underlay the different transforming properties of two types of Bcr-Abl fusion proteins. Comparative analysis of