ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ім. В.Н.Каразіна

ДЕГТЯР Марина Віталіївна

УДК 577.323

ВЗАЄМОДІЯ ІОНІВ ДВОВАЛЕНТНИХ МЕТАЛІВ З НЕКАНОНІЧНИМИ СТРУКТУРАМИ НУКЛЕЇНОВИХ КИСЛОТ

03.00.02 - біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фізико - математичних наук

Харків – 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Фізико-технічному інституті низьких температур ім. Б.І. Вєркіна НАН України.

Науковий керівник доктор фізико-математичних наук, старший науковий співробітник, Сорокін Віктор Олександрович, Фізико-технічний інститут низьких температур ім Б.І. Вєркіна НАН України, провідний науковий співробітник.

Офіційні опоненти:

доктор фізико-математичних наук, професор, Веселков Олексій Никонович, Севастопольський національний технічний університет, завідувач кафедри фізики (м. Севастополь).

кандидат фізико-математичних наук, старший науковий співробітник, Круглова Олена Борисівна, Інститут радіофізики та електроніки ім. О.Я. Усікова НАН України, старший науковий співробітник (м. Харків).

Провідна установа

Інститут теоретичної фізики ім. М.М. Боголюбова НАН України, м. Київ.

Захист відбудеться “_16_” __05__2003 року о _15_ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 у Харківському національному університеті ім. В.Н. Каразіна, за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. 7-4.

З дисертацією можна ознайомитися у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна, за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий “_11_” __04__2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Гаташ С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Однією з найважливіших задач біофізики і фізики нуклеїнових кислот (НК) є з'ясування молекулярних механізмів, які забезпечують виконання їх біологічних функцій. Іони металів беруть участь в підтриманні нормального функціонування генетичного апарата клітини, а також можуть призводити до його порушення. Це викликає інтерес до вивчення взаємодії іонів з природними та синтетичними нуклеїновими кислотами, у тому числі з їх неканонічними структурами. В теперішній час проводяться численні дослідження можливостей використання багатоланцюгових структур НК для лікування вірусних, генетичних та онкологічних захворювань. Основою антигенної та антизмістової стратегій виборчого пригнічення експресії генів є формування триплексів. Управління утворенням квадруплексів в теломірних кінцях хромосом також представляє потенціальний механізм регулювання функціонування клітини. Проте умови стабільності триплексів та квадруплексів вивчені недостатньо, тому представляє інтерес вивчення конформаційних переходів в системах, що містять одно- та багатоланцюгові спіралі, в присутності іонів металів. В якості модельних систем особливий інтерес представляють гомополінуклеотиди, тому що в залежності від умов вони можуть знаходитися в стані клубка, одноланцюгових спіралей, а також утворювати канонічні та неканонічні багатоланцюгові структури.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Результати дисертації одержані в ході виконання планових науково-дослідницьких робіт за темою: "Дослідження структурних і фізико-хімічних властивостей комплексів нуклеїнових кислот з біологічно активними речовинами" (шифр теми 1.4.10.18.2), а також Міжнародного гранта US Civilian Research and Development Foundation (CRDF) "Study of Me2+ ion interaction with noncanonical multi-chain structures of nucleic acids" N UN1-435 (1997-1999).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було встановлення основних закономірностей впливу температури та концентрації іонів двовалентних металів (Mg2+, Ca2+, Mn2+, Ni2+, Cu2+) на конформаційну рівновагу в водних розчинах гомополінуклеотидів різного рівня структурної організації та з'ясування фізичної природи структурних переходів, що індукуються іонами Mt2+, а також встановлення особливостей форми фазових діаграм металокомплексів при різних іонних силах розчину.

Для досягнення поставленої мети вирішувалися наступні задачі:

1.

2.

3.

4.

Об’єкт дослідження: конформаційні переходи в водних розчинах гомополінуклеотидів.

Предмет дослідження: молекулярні механізми зміни термостабільності та конформації полінуклеотидів, індуктовані іонами одно- та двовалентних металів.

Методи дослідження: метод диференційної УФ спектроскопії використовувався для встановлення місць звя’зування іонів металів з гомополінуклеотидами; конформаційні переходи, індуктовані іонами металів, реєструвалися методом термічної денатурації.

Наукова новизна одержаних результатів.

1.

2.

3.

4.

5.

6.

Практичне значення одержаних результатів. Встановлений температурно-концентраційний діапазон стійкості вивчених дуплексів, триплексів та квадруплексів в присутності різних іонів Mt2+, а також механізм їх впливу на конформаційний стан полінуклеотидів може представляти інтерес при дослідженні методів лікування генетичних захворювань, які основані на утворенні триплексів між ДНК або РНК клітини та олігонуклеотидами, що введені в клітину. Одержані результати можуть бути використані для вибору іонів металів, що сприяють формуванню триплексів і квадруплексів та забезпечують їх стабільність.

Особистий внесок здобувача. В опублікованих з співавторами наукових роботах особистий внесок здобувача полягає: в роботах [1,2,5] – у пошуку та критичному аналізі літературних даних, участі в проведенні експериментальних досліджень, розрахунках констант зв'язування; в роботах [3,4] – у розробці програм розрахунку констант зв'язування іонів Mt2+ з використанням теорії лігандів та експериментальних концентраційних залежностей температур конформаційних переходів; в роботах [6-19] - в участі в постановці задачі, аналізі та інтерпретації одержаних даних, розробці комп'ютерних програм автоматичної реєстрації та обчислювання диференціальних УФ-спектрів та кривих плавлення.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень за темою дисертації були представлені та обговорені на:

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 5 статей у наукових фахових журналах і 14 тез доповідей на національних та міжнародних конференціях.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, п'яти розділів та висновків. Повний обсяг дисертації складає 148 сторінок, 55 малюнків, з них 4 на окремих сторінках, 11 таблиць, список використаних джерел (123 найменувань) займає 13 сторінок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність обраної теми, сформульовано мету та задачі досліджень, наведена загальна характеристика дисертації.

Розділ 1 містить огляд літератури, присвяченої експериментальному та теоретичному дослідженню комплексів неканонічних структур НК з іонами металів. Розглянуто біологічну роль неканонічних структур НК. Наведені методи теоретичного опису взаємодії НК з низькомолекулярними лігандами, які надалі використовувалися в роботі для визначення констант зв'язування.

Детально проаналізована існуюча інформація про комплекси іонів одно- та двовалентних металів з багатоланцюговими структурами НК. Показано, що в випадку A?U та A?2U (мал 1.) подібні дослідження були виконані тільки для іонів Na+ і K+. Для комплексів цих полінуклеотидів з Mg2+ і Ni2+ дослідження були проведені тільки при окремих концентраціях іонів, що не дозволяє отримати повні фазові діаграми. Дані про взаємодію іонів Mt2+ з 1I і 4I малочисельні та мають якісний характер. Дані про константи зв'язування перехідних металів з A?U, AЧ2U ? 4ЧI ?рактично відсутні.

Розглянуто теоретичне описання переходу спіраль-клубок в присутності низькомолекулярних речовин (теорія лігандів, Франк - Каменецкий, 1972). Показано, що викликане зв'язуванням лігандів змінення температури переходу визначається формулою:

(1)

де Tm і Н - відповідно температура та ентальпія переходу спіраль - клубок, Tm - температура, що відповідає переходу в нову конформацию 50% ланок полінуклеотиду, Tm0 - Tm в відсутності лігандів, Af - вільна концентрація лігандів, K2 та K1 - константи зв'язування з спіральною та клубкоподібною фазами полінуклеотиду, відповідно.

В Розділі 2 наведена загальна характеристика матеріалів та методів дослідження.

Об'єктами дослідження є гомополінуклеотиди polyA, polyU, A?U, AЧ2U, 1I і 4I (Sigma, Serva).

Полінуклеотиди та хлориди Mg2+, Ca2+, Mn2+, Ni2+ і Cu2+ розчиняли в ацетатному (pH 6.0, [Na+] = 10-3-10-1 M) або какодилатному (pH 7.0, [Na+] = 10-2 М) буферах. Для одержання чотирьохланцюгової polyI одноланцюгову polyI розчиняли в ацетатному буфері, що містив 1 М Na+, та витримували при 20С протягом 300 годин. При вимірюванні диференційних УФ спектрів концентрація НК (Р) складала (1±0.1)?10-4М, в експериментах по плавленню Р=(6.5±0.5)?10-4М. Похибка визначення концентрації Р та іонів металів складала 0.5%.

Експериментальні методи: диференційна УФ спектроскопія, термічна денатурація.

Метод УФ спектроскопії має високу чутливість до змін поглинання НК, що дозволяє використовувати розведені розчини, зводжуючи до мінімуму агрегацію полінуклеотидів в відсутності іонів, а також збільшити діапазон досліджених концентрацій іонів. Форма диференційних УФ спектрів (ДУФС) залежить від природи атомів, з якими взаємодіє іон (Сорокин, Благой, 1991). Метод ідентифікації зв'язуючих центрів грунтується на порівнянні форми ДУФС полінуклеотидів з формою диференційних спектрів мономерів, для яких місця зв'язування іонів відомі, а також з ДУФС, зумовленими протонуванням, оскільки для протонів іонізовані атоми визначені з великим ступенем надійності. Експериментальні ДУФС реєстрували з використанням 4-кюветної схеми. Похибка вимірювання оптичної щільності складала 0.5%. Вимірювання проводилися на спектрофотометрі Specord M 40, Carl Zeiss Jena.

Термічну денатурацію полінуклеотидів проводили в герметичних кварцевих кюветах, розміщених в 2 ідентичних мідних блоках, що знаходилися в камері спектрофотометра Specord UV VIS фірми Carl Zeiss Jena. Нагрів проводився із швидкістю 0.25 0С/мин. Криві конформаційних переходів 21, 31 та 32 реєструвались в максимумі поглинання полінуклеотидів, переходи 23 і 32 спостерігались в ізобестичній точці спектра гіперхромізму подвійної спіралі (? = 35700см-1). Похибка вимірювання температури знаходилась в межах ±0.50С.

Розділ 3 містить експериментальні дані про комплекси A?U та A?2U з іонами Mg2+. Як видно з мал. 2., форма ДУФ спектрів A?U і A2U (Деа) є "дзеркальним" відображенням спектрів ?еh, зумовлених плавленням подвійної спіралі A?U та потрійної спіралі A2U, відповідно. Це

означає, що при 200С і 10-2 M Na+ AЧU ?а A2U мають деяку кількість невпорядкованих ланок, які при додаванні Mg2+ переходять в спіральний стан.

Одержані криві плавлення комплексів AU та A2U з іонами Mg2+ були використані для побудови діаграм конформаційних переходів. За винятком фазових діаграм комплексів A2U з іонами Mg2+ при низьких іонних силах розчину, усі інші мають “критичну” точку, в якої змінюється тип конформаційного переходу. Відповідна їй концентрація іонів Mg2+ слабо залежить від початкової конформації полінуклеотиду. Крім того, при 10-1M Na+ накладення фазових діаграм комплексів AU та A2U з іонами Mg2+ (мал. 3) показує наявність

"критичної" точки, спільної для обох полінуклеотидів. Їй відповідає температура (Tm)cr=(5558)0C і концентрація [Mg2+t]cr = (3,55,5)10-5М. Якщо співвідношення концентрацій polyA та polyU в розчині дорівнює 1:2, то при більш високих температурах і вищих від “крітичної” концентраціях іонів Mg2+ при плавленні потрійної спіралі A2U подвійна спіраль AU не утворюється, а при співвідношенні 1:1 при плавленні подвійної спіралі утворюється потрійна при температурах, більш низьких, ніж “критична”.

В роботі також були отримані повні фазові діаграми AU і A2U з іонами Mg2+ (мал. 4). Форма фазових діаграм суттєво залежить від іонної сили розчину. Так, при 10-2 М Na+ при руйнуванні потрійної спіралі A?2U в якості проміжної конформації утворюється подвійна спіраль, яка існує в вузькому температурному інтервалі (3-50С). При 10-1 М Na+ AЧ2U ?бласть існування подвійної спіралі звужується з підвищенням вмісту Mg2+ і при концентрації іонів вищє, ніж критична, A2U при нагріванні розпадається безпосередньо на одноланцюгові клубки.

Аналіз температурних інтервалів конформаційних переходів показав, що перехід 32 має суттєво меншу кооперативність, ніж переходи 21 і 31 (мал.4). Інтервал переходу (T) визначається, в основному, величинами його ентальпії та фактора кооперативності () (Lazurkin Yu.S., Frank-Kamenetskii M.D., Trifonov E.N. 1970)

(2)

Показано, що фактори кооперативності для всіх вивчених переходів є величинами одного порядку (10-4 - 10-5). Таким чином, причиною меншої кооперативності переходу

32 є низьке значення його ентальпії (величини H переходів 31, 21 і 32 складають 12.7, 7.8 і 2.0 ккал/моль, відповідно, Krakauer H., 1968, Pilch D.S., 1995).

Фазові діаграми дозволили розрахувати значення констант зв'язування Mg2+ з polyA та polyU по теорії лігандів. Знайдені константи погоджуються з експериментально одержаними результатами інших авторів в межах розсіяння їх значень. Це свідчить про те, що термодинамічний опис конформаційних переходів в досліджених системах, оснований на теорії лігандів, є коректним. Підтвердженням цього є також задовільна згода експериментальної та розрахованої теоретично залежностей інтервалу переходу 31 від ступеню зв'язування (мал. 5) при (табл).

В разділі 4 наведені експериментальні дані про взаємодію Ni2+ з A?U і A?2U. Форма ДУФС комплексів Ni2+ з A?U і A?2U (мал. 2.) показує, що іони Ni2+, подібно Mg2+, не зв'язуються з основами подвійних та потрійних спіралей, а взаємодіють тільки з фосфатними групами, що призводить до упорядкування розупорядкованих ділянок полінуклеотидів. Причиною відсутності взаємодії з N7 аденіна в разі AU є, можливо, жорсткість подвійної спіралі, що перешкоджає утворенню хелатних комплексів N7 - Ni2+ - О(Р). В A2U N7 бере участь в утворенні водневих зв'язків (мал. 1), що додатково утруднює взаємодію Ni2+ з цим гетероатомом.

Подібність форм ДУФС AMP і polyA, індукованих іонами Ni2+ (мал. 6), показує, що в обох випадках координуючим іон атомом є N7 аденіну. В разі polyA при кімнатній температурі ця взаємодія спостерігається при [Ni2+]>4Ч10-4М. При [Ni2+]>10-3М відбувається утворення компактних часток з ефективним радіусом Rэф ~100 Е, ?цінка якого проведена по хвильовій залежності оптичної щільності від хвильового числа в області = (16000 - 30000)см-1.

Вплив іонів Mg2+ і Ni2+ на конформаційні переходи AU і A2U якісно подібний, але є й деякі відрізнення. Як для Mg2+, так і для Ni2+ зростання вмісту іонів призводить до підвищення температур переходів 21 та 31 (мал. 4,7). Значення критичної концентрації для цих іонів співпадає, однак, в разі іонів Ni2+ температура переходу 23 не залежить від концентрації іонів, тоді як для Mg2+ при концентрації вище критичної, стабільність подвійної спіралі знижується з підвищенням вмісту іонів, внаслідок чого область існування потрійної спіралі розширюється (рис 3, рис 7).

Розрахунок констант зв'язування Ni2+ з AU і A2U було виконано в рамках теорії

лігандів. Зв'язування Ni2+ характеризується негативною кооперативністю (мал. 8), що зумовлено

кулонівським відштовхуванням іонів, що адсорбуються з розчину, іонами, вже зв'язаними з полімером. Одержані значення констант зв'язування дозволяють пояснити деякі особливості фазових діаграм. Так, причиною дестабілізації AU іонами Mg2+ є виконання умови KA2U > KAU (табл.). Відсутність залежності температури переходу 23 від вмісту Ni2+ (мал. 7) обумовлена близькими значеннями констант зв'язування Ni2+ з AU, A2U і polyA (табл). Підвищення термостабільності подвійних та потрійних спіралей в присутності іонів Mg2+ і Ni2+ викликано тим, що константи зв'язування іонів з багатоланцюговими спіралями вище, ніж з одноланцюговою polyU.

Таблиця.

Константи зв'язування іонів Mg2+ та Ni2+ з polyA, polyU, AU і A2U при С = 0. |

polyA | polyU | AU | A2U

Mg2+ (10-1М Na+ ) | 200 | 250 | 345 | 1000*

Ni2+ (310-2М Na+ ) | 6,2104 (а) | 280 (а) | 7,8104 * | 6104 *

- значення, одержані в роботі.

(а) - дані Diebler, 1987, перераховані на 310-2М Na+, інші - Krakauer, 1974

Розділ 5 присвячений вивченню взаємодії іонів Mg2+, Ca2+, Mn2+, Ni2+ та Cu2+ з одно-

та чотирьохланцюговою polyI. Для 4I спектр a складається з конформаційної та координаційної (b) складових. Останній обумовлений взаємодією іонів з гетероатомами основ. Порівняння індукованих іонами Cu2+ спектрів a для 1I, з координаційною складовою ДУФС 4I, а також з спектрами протонування по N7 та депротонування по N1 (мал. 9) дозволяє припустити, що іони Cu2+ утворюють хелатні комплекси, взаємодія з N7 та через молекулу води гідратної оболонки іона з О6, що призводить до депротонування N1 (мал. 10).

Руйнування упорядкованої структури 4I іонам Cu2+, що відбувається при цьому, зумовлено, можливо, розривом системи водневих зв'язків, що забезпечують її стабільність (мал. 10).

В цьому розділі представлені також розрахунки констант зв'язування іонів Cu2+ з 1I і 4I. На відмінність від антикооперативністі зв'язування Cu2+ з 4I, взаємодія з 1I характеризується позитивною кооперативністю. Зростання відмін між K4 та K1 при зростанні ступеню зв'язування є додатковим фактором руйнування чотирьохланцюгової структури.

Іони Mn2+ та Ni2+ взаємодіють з 4I подібно до іонів Cu2+ тільки при суттєво більш високих концентраціях. При великому вмісті іонів Ni2+ та Cu2+ спостерігається компактизація 1I, що утворилася в результаті розпаду 4I. Як і в випадку polyA в присутності іонів Ni2+, ефективний радіус компактних часток 1I складає ~100 A. Ця компактизація повинна супроводжуватися дегідратацією полімеру, що може бути причиною позитивної кооперативністі взаємодії іонів Cu2+ з 1I. Іони Mg2+ і Ca2+ в вивченому діапазоні концентрацій не зв'язуються з основами 4I та не змінюють її конформацію.

ВИСНОВКИ

В дисертації встановлені основні закономірності впливу температури та концентрації іонів одно- та двовалентних металів на конформаційну рівновагу в водних розчинах гомополінуклеотидів. Встановлені температурні та концентраційні області стабільного стану окремих конформацій. Показано, що форма діаграм конформаційної рівноваги визначається значеннями констант зв’язування іонів Mt2+ з різними конформаціями полінуклеотида.

1. Впереше отримані фазові діаграми конформаційної рівноваги одно- (polyA, polyU), дво- (polyApolyU) та трьохланцюгових (polyA2polyU) полінуклеотидів в розчинах, що містять іони Mg2+ та Ni2+, в широкому інтервалі температур (20 - 960С) та концентрацій іонів (10-5 – 10-2)М, визначена "критична" концентрація іонів Mg2+ та Ni2+, перевищення якої призводить до зміни типу конформаційного переходу;

2. Знайдено, що перехід 32 є значно менш кооперативним, ніж переходи 21 та 31. Причиною цього є низька величина ентальпії переходу 32;

3. Форма фазових діаграм комплексів AU та A2U з іонами Mg2+ та Ni2+ суттєво залежить від концентрації іонів Na+. Так, при їх концентрації, близькій до фізіологічної (0.1М), підвищення вмісту іонів Mg2+ в розчині AU призводить до безперервного розширення діапазону стабільного стану потрійної спіралі, тоді як при 10-2 М Na+ він не залежить від концентрації Mg2+. При цьому "критична" точка на фазових діаграмах комплексів A2U з ионами Mg2+ та Ni2+ відтсутня;

4. Показано, що теорія лігандів задовільно описує зміну параметрів переходів 31, 32 та 21 в AU та A2U, викликану іонами Mg2+ та Ni2+. З термодинамічного аналізу, виконаного в рамках цієї теорії, випливає, що зміна температур конформаційних переходів визначається константами зв'язування іонів Mt2+ з одно- та багатоланцюговими спиралями;

5. Знайдено, що подібно до іонів Mg2+, іони Ni2+ зв'язуються тільки з атомами кисню фосфатних груп AU та A2U. Взаємодія з N7 аденіну цих полінуклеотидів відсутня, в той час як вона спостерігається в AMP та polyA;

6. Встановлено, що іони Cu2+, Ni2+, Mn2+ зв'язуються з N7 гіпоксантину, що призводить до руйнування упорядкованої структури чотирьохланцюгової polyI. В присутності високих концентрацій цих іонів спостерігається утворення компактних часток одноланцюгової polyI з ефективним радіусом ~100 Е. Іони Mg2+ та Cа2+ не взаємодіють з N7 4polyI і відповідно не змінюють її конформацію;

7. Впереше встановлена залежність від ступеню зв'язування констант асоціації Cu2+ з гіпоксантином чотирьох- та одноланцюгової polyI і іонів Ni2+ з фосфатами AU та A2U. Взаємодія іонів з мультиланцюговими спіралями характеризується негативною кооперативністю, зв'язування іонів Cu2+ з одноланцюговою polyI має позитивну кооперативність.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

АНОТАЦІЯ

Дегтяр М.В. Взаємодія іонів двовалентних металів з неканонічними структурами нуклеїнових кислот – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеню кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02 – біофізика. – Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, Харків, 2002.

Проведено експериментальне дослідження комплексів іонів лужноземельних (Ca2+, Mg2+) та перехідних (Cu2+, Ni2+, Mn2+) металів з одно- та багатоланцюговими гомополінуклеотидами (polyA, polyU, polyI, AU, A2U, 4polyI) в водних розчинах. Виміряні диференційні УФ-спектри металокомплексів, що дозволило визначити вплив іонів на конформацію полінуклеотидів, а також встановити міста зв'язування іонів, запропонувати структуру комплексу, що утворюється, та механізм викликаного іонами руйнування спіралі. В широкому діапазоні концентрацій іонів одержані діаграми конформаційних рівноваг. Виконані розрахунки констант зв'язування іонів з одно- та багатоланцюговими спіралями. Одержані значення констант зв'язування дозволили в рамках теорій лігандів пояснити деякі особливості фазових діаграм. Зареєстровано утворення компактних часток в присутності високої концентрації іонів металів та визначені розміри цих часток.

Ключові слова: іони перехідних металів, полінуклеотиди, диференційна УФ спектроскопія, термічна денатурация.

АННОТАЦИЯ

Дегтяр М.В. Взаимодействие ионов двухвалентных металлов с неканоническими структурами нуклеиновых кислот – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук по специальности 03.00.02 – биофизика. – Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина, Харьков, 2002.

Проведено экспериментальное исследование комплексов ионов щелочно-земельных (Ca2+, Mg2+) и переходных (Cu2+, Ni2+, Mn2+) металлов с одно- и мультицепочечными гомополинуклеотидами (polyA, polyU, polyI, AU, A2U, 4polyI) в водных растворах. Измерены дифференциальные УФ-спектры металлокомплексов, что позволило определить влияние ионов на конформацию полинуклеотидов, а также установить места связывания ионов, предложить структуру образующегося комплекса и механизм вызванного ионами разрушения спирали. В широком диапазоне концентраций ионов получены диаграммы конформационных равновесий. Выполнены расчеты констант связывания ионов с одно- и мультицепочечными спиралями. Полученные значения констант связывания позволили в рамках теории лигандов объяснить некоторые особенности фазовых диаграмм. Зарегистрировано образование компактных частиц в присутствии высокой концентрации ионов металлов и определены размеры этих частиц.

Ключевые слова: иони переходних металлов, полинуклеотиды, дифференциальная УФ спектроскопия, термическая денатурация.

SUMMARY

Degtyar M.V. Divalent metal ions interaction with noncanonical nucleic acid structures. – Manuscript.

Thesis for Candidate’s degree of Physical and Mathematical Sciences in Biophysics - Specialty 03.00.02 – V.N. Karazin Kharkov National University, Kharkov, 2002.

Interest in nucleic acid metallocomplexes is caused by the great role which metal ions play in the support of native polynucleotides functioning. All biochemical reactions running with nucleic acids participation require metal ions as coenzymes. The rate and results of reactions depend on the nature and concentration of an ion. In is impossible to understand of metal ions participation in normal functioning of the cell genetic apparatus without studies of metal ions interactions with native and synthetic polynucleotides as well as with noncanonical nucleic acid structures. At the present time a possibility of using triplexes and quadruplexes to treat viral, genetic and carcinogenic diseases is intensively investigated. However under physiological conditions multi stranded helices are usually less stable then corresponding duplexes. Therefore, it is of great interest to study triplexes and quarduplexes stability in the presence of metal ions.

In the present work an experimental study of alcohol – earth (Ca2+, Mg2+) and transition (Cu2+, Ni2+, Mn2+) metal ions complexes with single- (polyA, polyU, polyI), double- (polyApolyU), three (polyA2polyU) and four- (4polyI) stranded homopolynucleotides in aqueous solutions has been performed. Differential UV spectra of metallocomplexes were measured, that gave a possibility to reveal influences of ions on polynucleotides conformations, to establish ions binding sites, to suggest the structure of the complexes formed. Homopolynucleotides conformational transitions induced by heating were observed by the method of thermal denaturation.

It has been shown that Mg2+ and Ni2+ ions interact with phosphate groups of polyApolyU and polyA2polyU, ions binding causes the ordering of these polynucleotides. Cu2+, Ni2+, Mn2+ bind to bases of four stranded polyI that results in the destruction of its helical structure. By the ability to destroy the 4polyI ordered structure these ions follow the sequence Cu2+ > Ni2+ > Mn2+. The dependence of the 4polyI disordering degree on the Cu2+ content was obtained. Mg2+ and Ca2+ ions do not interact with 4ЧpolyI bases and do not change its conformation.

The formation of particles of single stranded polyA and polyI in the presence of high divalent metal ions concentrations is registered. Effective radia of these particles (about 100A) are by order of magnitude less then the inertial radius of one stranded statistical coil, that evidences compaction of polynucleotides, induced by the high content of metal ions.

Conformational equilibrium diagrams were built in the wide region of temperatures (20-960C) and divalent metal ions concentrations (10-5 – 10-2 M) at different (10-2 – 10-1 M) ionic strengths. The “critical” concentration of Mg2+ and Ni2+ were found at which the conformational transition type changes: in polyAЧ2polyU instead of successive transitions 32 and 21, 31 transition takes place, in polyAЧpolyU, instead of 21 transition, 23 and 31 transitions are observed.

Phase diagrams of polyAЧpolyU and polyAЧ2polyU complexes with Mg2+ are essentially dependent on the Na+ content. Thus, at the Na+ concentration close to the physiological one (0.1М) the increase of the Mg2+ content in polyAЧpolyU solution results in continuous extension of the temperature range of the triple helix stable state, while at 10-2 М Na+ this range does not depend on Mg2+ concentration. Under these conditions the "critical" point at phase diagrams of polyA2polyU with Mg2+ and Ni2+ ions is absent.

Mg2+ and Ni2+ effects on polyApolyU and polyA2polyU conformational transitions are mainly similar. The differences observed are caused by different values of association constants and by the fact that Ni2+ is able to interact with polyA bases while Mg2+ binds to phosphate groups only.

It has been found that 32 transition is essentially less cooperative then 21 and 31 transitions. Cooperativity factors for 32 и 31 were estimated, that permit us to conclude that the reason of the wide temperature range of the 32 transition is the low value of this transition enthalpy.

Ni2+ association constants with phosphate groups of polyApolyU and polyA2polyU as well as Mg2+ binding constants with polyA and polyU have been calculated in the framework of the ligand binding theory (Frank-Kamenetskii, 1972). Interaction of metal ions with multi stranded polynucleotides is characterized by negative cooperativity, binding of Cu2+ to single stranded polyI has positive cooperativity. Negative cooperativity of ions binding is due to the electrostatic repulsion between ions absorbed from solution and ions already bound to the polynucleotide. A possible reason of positive cooperativity is the entropy increase which results from polynucleotide dehydration caused by Cu2+ ions induced compaction.

Values of association constants obtained permit us to explain some features of phase diagrams: increase of 32, 31 and 21 transitions temperatures with the rise of divalent metal ions content is due to the low values of metal ions binding constants to single stranded polyU, decrease of the 23 transition temperature in the presence of Mg2+ results from the condition KA2U > KAU.

Key words: divalent metal ions, differential UV spectroscopy, thermal denaturation, polynucleotides.