НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН І ГЕНЕТИКИ

Дьячкова Ольга Олександрівна

УДК 581.1:582.776.2.632.38

ФІЗІОЛОГІЧНІ РЕАКЦІЇ ПЕРЦЮ (CAPSICUM ANNUUM L.) НА ВІРУСНУ ІНФЕКЦІЮ

03.00.12 - фізіологія рослин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі фізіології рослин, вірусології та біотехнології Національного аграрного університету Кабінету Міністрів України

Науковий керівник: кандидат біологічних наук, доцент

Мельничук Максим Дмитрович

Національний аграрний університет

завідувач кафедри фізіології рослин, вірусології та біотехнології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,

Гуляєв Борис Іванович,

Інститут фізіології рослин і генетики

НАН України,

провідний науковий співробітник

кандидат біологічних наук

Мартин Геннадій Ігнатович,

Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного

НАН України,

старший науковий співробітник

Провідна установа: Харківський національний аграрний університет

ім. В.В. Докучаєва Мінагрополітики України

Захист відбудеться “19” червня 2003 р. о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.212.01 при Інституті фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, Київ-22, вул. Васильківська 31/17.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології рослин і генетики НАН України, Київ, вул. Васильківська 31/17.

Автореферат розісланий “ 16 ” травня 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Труханов В.А.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Поширеність хвороб вірусної етіології в біогеоценозах України і всієї Земної кулі, останнім часом набуває все загрозливіших форм і сумних наслідків. [Бойко, 1990, Поліщук, 2001,]. Незважаючи на чисельні дослідження присвячені вивченню вірусних захворювань рослин, механізми розвитку патологічного процесу залишаються не рідко маловивченими та актуальними для багатьох науковців. Більшість механізмів активування фізіологічних та біохімічних систем захисту при дії вірусної інфекції також залишаються недостатньо вивченими. А між тим знання їх необхідно для розробки шляхів регулювання вірусного патогенезу [Реунов, 1999]. На сьогоднішній день не існує надійних засобів для боротьби з вірусними інфекціями, це пов’язано з особливостями біології їх збудників [Поліщук, 2001]. За своєю природою віруси є строго облігатними паразитами і тому здатні до існування лише в живих системах. Більшість із них в тій чи іншій мірі пригноблюють ріст та розвиток рослин і тільки окремі віруси при інфікуванні рослини-господаря призводять до її загибелі. Зважаючи на це, цікавим є питання про первинну відповідь рослинного організму на інфікування вірусом як один із стресових факторів.

Фотосинтез є найбільш чутливим процесом до дії різноманітних стресорів, у тому числі і біотичної природи [Balachandran, 1997]. Саме тому для розуміння характеру відповідних реакцій на вплив стресових факторів біотичної природи важливим є з’ясування структурних змін фотосинтетичного апарату, викликаних вірусною інфекцією. Це пояснюється важливою роллю останнього в забезпеченні клітин рослин енергетичними та пластичними речовинами, які синтезуються при фотосинтезі і можуть використовуватись як рослинним організмом, так і вірусним патогеном. Проблема обумовлена відносною автономністю фотосинтетичного апарату.

Всебічне дослідження функціональних особливостей рослин, інфікованих фітовірусами, необхідне для подальшого прогресу в розумінні механізмів патологічного процесу.

Мета і задачі дослідження. Метою досліджень було з’ясувати фізіологічні та біохімічні реакції, що виникають у рослин перцю при інфікуванні вірусом тютюнової мозаїки (ВТМ), на прикладі змін активності стресових ферментів та структури фотосинтетичного апарату.

Для досягнення даної мети необхідно було дослідити:

· первинну реакцію рослин солодкого перцю на інфікування ВТМ на прикладі зміни активності стресових ферментів (пероксидази, каталази та поліфенолоксидази);

· зміни в ультраструктурній організації клітин мезофілу солодкого перцю, інфікованого ВТМ;

· зміни вмісту фотосинтезуючих пігментів солодкого перцю, інфікованого ВТМ;

· якісний та кількісний склад білків хлоропластів рослин перцю при інфікуванні ВТМ;

· локалізацію вірусної нуклеїнової кислоти на клітинному та субклітинному рівнях.

Об’єкт дослідження – модельна система ВТМ - перець солодкий Capsicum annum L. (сорт Подарок Молдови).

Предмет дослідження – фізіологічна реакція рослин перцю солодкого на дію вірусної інфекції.

Методи дослідження – фізіологічні (визначення вмісту фотосинтетичних пігментів, виділення хлоропластів), вірусологічні (інфікування рослин ВТМ, діагностика вірусної інфекції), цитологічні (дослідження ультраструктури клітин), біохімічні (визначення активності пероксидази, каталази, поліфенолоксидази; якісних та кількісних змін хлоропластних білків; концентрації білка), молекулярні (ідентифікації та визначення локалізації білка та нуклеїнової кислоти), математично-статистичні (оцінка вірогідності отриманих результатів).

Наукова новизна одержаних результатів. Розширено уявлення про особливості первинної відповіді рослинного організму на вірусну інфекцію. Встановлено, що зміни в активності досліджуваних ферментів виявляються ще до появи зовнішніх симптомів. Вивчені деструктивні зміни клітинних органоїдів перцю під впливом ВТМ, особливо хлоропластів. Показано, що світлозбиральні комплекси фотосистеми ІІ є вразливішими при дії вірусної інфекції в порівнянні з фотосистемою І. Встановлено, що структурний білок ВТМ накопичується всередині хлоропластів. Показано про ідентифікацію та локалізацію нуклеїнової кислоти ВТМ безпосередньо в стромі пластид.

Практичне значення одержаних результатів. Вивчення особливостей фізіологічної реакції перцю солодкого на дію вірусної інфекції спрямоване на пізнання механізмів взаємодії вірусу та рослини, що відкриває шляхи регуляції патологічного процесу та способів зменшення шкодочинної дії вірусної інфекції. Отримані дані можуть використовуватись у дослідницьких роботах по вивченню природи стійкості рослин до дії біотичних стресів та розробці засобів підвищення їх толерантності до вірусних патогенів.

Модифіковано метод полімеразної ланцюгової реакції для діагностики ВТМ на рослинах перцю, який може бути рекомендований для діагностики ВТМ в сільському господарстві на різних культурах.

Дані, що викладені в дисертації, використовуються під час проведення практично-лабораторних занять з дисципліни фізіологія рослин у Національному аграрному університеті.

Особистий внесок здобувача полягає в самостійному опрацюванні літератури, оволодінні необхідними методами досліджень, безпосередній участі у плануванні і проведенні експериментів, обґрунтуванні та статистичній обробці результатів досліджень, підготовці до друку наукових робіт. Матеріали дисертаційної роботи отримані автором самостійно або спільно зі співробітниками лабораторії вірусології та біотехнології НАУ та Інституту фізіології рослин і генетики НАН України.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалася в рамках науково-дослідної теми лабораторії вірусології та біотехнології НАУ на 1998 – 2002 рр. “Вивчення механізмів взаємодії фітовірусів із клітинами та розробка методів діагностики вірозів і отримання безвірусних рослин” (р/№0198U004073).

Апробація результатів дисертації. Основні наукові результати були представлені на Міжнародному симпозіумі “Plant under environmental stress” (Москва, 2001); VІІ Конференції молодих учених “Сучасні напрямки у фізіології та генетиці рослин” (Київ, 2002); І Всеукраїнській науково-практичній конференції молодих учених “Перспективні напрямки розвитку сільськогосподарської науки та виробництва в Україні” (Сімферополь, 2002); науково-практичних конференціях професорсько-викладацького складу НАУ (Київ, 2001 - 2003).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 7 робіт, з них 4 статті у провідних фахових виданнях 3 тези доповідей.

Об’єм та структура роботи. Дисертаційна робота викладена на 137 сторінках машинописного тексту й складається зі вступу, огляду літератури, 4 експериментальних розділів, заключення, висновків та списку використаної літератури (налічує 246 найменувань). Робота містить 20 рисунків та 5 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Перший розділ дисертації складається з 5 підрозділів, у яких узагальнено літературні дані стосовно особливостей фізіологічної реакції рослин на дію вірусів, а саме змін ультраструктури клітин у відповідь на вірусну інфекцію, змін у структурі та функціонуванні фотосинтезуючого апарату під дією біотичного стресу - вірусної інфекції. Розглянуто відомості про зміну активності антиокисних ферментів при інфікуванні рослин вірусами, а також про їх значення у формуванні захисних реакціях.

На підставі аналізу вітчизняних та зарубіжних літературних джерел обґрунтовано актуальність проведення досліджень за темою дисертаційної роботи.

ОБ’ЄКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Об’єктом досліджень були рослини перцю Capsicum annuum L. сорту Подарок Молдови, інфіковані ВТМ. Інокулювання рослин ВТМ здійснювали у фазі двох справжніх листків. Рослини вирощувались в умовах теплиці, забезпечувались нормальним поливом, денна температура коливалась у межах 22 - 26С. Чергування світлового та темнового періоду становило 14/10 годин.

Наявність вірусу в зразках визначали за допомогою методів: рослин-індикаторів [Legg, 1965] електронної мікроскопії [Brenner, 1959], реакції подвійної імунодифузії в агарі [Shepard, 1972]. Для досліджень використовували листки з характерними вірусспецифічними ознаками.

Зміни в структурі клітин мезофілу перцю під впливом інфікування ВТМ визначали методом електронної мікроскопії за загальноприйнятою методикою[Brenner, 1959].

Визначення концентрації хлорофілу у листках, інфікованих рослин, проводили спектрофотометричним методом за загальноприйнятою методикою [Arnon, 1949].

Активність ферментів (пероксидази, поліфенолоксидази, каталази) визначали спектрофотометричним методом за загальноприйнятими методиками [Гавриленко, 1975, Єрмаков, 1972].

Визначення вмісту білку проводили за методом [Bredford, 1976].

Електрофорез хлорофіл-білкових комплексів хлоропластів проводили у поліакріламідному гелі (ПААГ) за методом описаним раніш [Anderson, 1980].

Електрофорез білків хлоропластів перцю, інфікованих ВТМ проводили за модифікованим методом [Laemmli, 1970].

Імуноблотинг білків хлоропластів перцю проводили за методом описаним раніш [Reneiro, 1989]. Сумарну РНК виділяли з хлоропластів за допомогою набору “Рибо-Сорб” (”Амплисенс”, Москва, Росія), згідно інструкції виробника.

Реакцію зворотньої транскрипції (RT PCR) проводили в об’ємі 20 мкл при температурі 37С протягом 30 хв. з використанням набору “Реверта” (”Амплисенс”, Москва, Россия). Амплификацию проводили на амплификаторе “GeneAmp 2400” (Applied Biosystems).

Статистична обробка експериментальних даних виконана загальноприйнятим методом [Доспехов, 1985], із використанням сучасних пакетів програм Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

ЗМІНИ РОСЛИН ПЕРЦЮ ПРИ ІНФІКУВАННІ ВТМ

Вірусспецифічні симптоми на рослинах перцю, інфікованих ВТМ. Відмічено, що інфікування ВТМ рослин перцю призводить до розвитку вірусспецифічних симптомів, а саме здуття, гофрування листкової пластинки, деградації листкової пластинки, просвітлення жилок, некрозів, мозаїк, хлорозів. Такі вірусспецифічні симптоми, як мозаїка, хлороз та некроз були найбільш поширеними у рослин перцю, інфікованих ВТМ. Вони проявлялись на 10-20 добу після інфікування рослин вірусом. Одним з найперших симптомів хвороби є просвітлення жилок. На більш пізніх етапах розвитку хвороби розвивалась хлоротичність листків.

Вплив ВТМ на ультраструктуру клітин мезофілу листків перцю. Встановлено, що в клітинах хлоротичних зон накопичувалась значна кількість вірусних часток. Цитоплазма утворювала інвагінації, що містили велику кількість вірусних часток. Мітохондрії також підлягали змінам внаслідок інфікування ВТМ. Органоїди мали набубнявілий вигляд із частково зруйнованими кристами та матриксом. Значного патологічного впливу набували хлоропласти. Вірусні частки локалізувались навколо зовнішньої мембрани хлоропластів, що обумовлювало часткову агрегацію пластид. В структурі хлоропластів збільшувалась кількість осміофільних глобул. Спостерігалось необмежене розростання периферійного ретикулума. Більшість органоїдів мали видовжену форму, тилакоїди втрачали структурність, а грани перетворювались в аморфні конгломерати. Також нами відмічено зменшення кількості та розмірів крохмальних зерен в органоїдах.

Фотосинтетичні пігменти рослин перцю при інфікуванні ВТМ. В ході експериментів проводився аналіз вмісту пігментів на 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30 добу після інокулювання рослин ВТМ. Інфікування перцю ВТМ призводило до вірогідного зменшення вмісту хлорофілів а та b вже на 3-ту та 5-ту добу досліду відповідно (Рис.1). Надалі з розвитком інфекції відбувалось поступове зниження кількості хлорофілів. Подібна картина при вірусному патогенезі відмічена рядом авторів [Серова, 1973, Tu, 1968]. І хлорофіл а, і хлорофіл b деградували в середньому в два рази в порівнянні з контролем.

Кількісний вміст каротиноїдів зменшувався на початкових етапах репродукції ВТМ в рослинах перцю (Рис.2). Подальший розвиток вірусу не мав суттєвого впливу на вміст жовтих пігментів. На 30-ту добу після інфікування відмічено вірогідне збільшення кількості каротиноїдів в листках інфікованих рослин.

Рис. 1. Вміст хлорофілу а та b в рослинах перцю, інфікованих ВТМ

Рис. 2. Вміст каротиноїдів в рослинах перцю, інфікованих ВТМ

Таким чином, інфікування перцю ВТМ призводило до патологічного для рослини зменшення відносного вмісту хлорофілів та каротиноїдів на початкових етапах вірусної інфекції. Вміст каротиноїдів підвищувався при подальшому розмноженні вірусу в тканинах рослин перцю.

Зміна активності пероксидази, поліфенолоксидази, каталази рослин перцю при інфікуванні ВТМ. Адаптація рослин до абіотичного та біотичного стресу прямо пов’язана із функціонуванням антиоксидантної системи [Андреева, 1988]. Проводились дослідження зміни активності пероксидази, поліфенолоксидази та каталази у відповідь на інфікування рослин перцю ВТМ на 3, 5, 10, 15, 20, 25 добу експерименту. Рослини перцю на інфікування ВТМ відповідали зміною активності досліджуваних ферментів (Рис. 3, 4).

За перші три доби після інфікування ВТМ активність пероксидази збільшувалась в 3 рази (Рис. 3). Підвищення активності ферменту співпадало в часі з процесами некрозоутворення. Починаючи з 10-ої доби експерименту спостерігалось зменшення активності пероксидази. Надалі активність ферменту вірогідно не відрізнялась від активності ферменту контрольного варіанту.

Рис. 3. Активність пероксидази і поліфенолоксидази в рослинах перцю, інфікованих ВТМ

Стосовно зміни активності поліфенолоксидази відмічено її максимальну активность на 10-ту добу після інфікування (Рис. 3). Утворення некрозів пояснюється накопиченням в рослинній клітині великої кількості хінонів [Коваленко, 1983], а так як активність ферменту корелювала в часі з утворенням некрозів, то ми вважаємо, що підвищення її активності не пов’язано із процесами некрозоутворення, а є результатом зміни в фенольному обміні.

Активність каталази у рослин протягом досліду була значно більша, ніж у контрольних рослин (Рис. 4). Протягом всього експерименту спостерігались стабільно високі значення активності цього ферменту. Висока активність каталази призводить до руйнування перекису водню, який є фактором імунітету [Тарчевский, 1999]. Тобто висока активність цього ферменту є несприятливим фактором для стійкості рослин.

Рис. 4. Активність каталази в рослинах перцю, інфікованих ВТМ

Таким чином, ураження рослин перцю ВТМ проявлялося у підвищенні ферментативної активності (пероксидази, поліфенолоксидази, каталази), що пов’язано із змінами у метаболізму та структурі клітин.

БІЛКОВИЙ СКЛАД ХЛОРОПЛАСТІВ РОСЛИН ПЕРЦЮ, ІНФІКОВАНИХ ВТМ

Особливості методики виділення інтактних хлоропластів з інфікованих ВТМ рослин перцю. Запропоновано методику виділення інтактних хлоропластів з інфікованих ВТМ рослин перцю. Методика полягає в використанні середовища виділення наступного складу: 0,4 М сахароза, 0,05 М тріс-HCL, 5 мМ аскорбінова кислота, 0,1% БСА, рН 7,8, 20 мМ меркаптоетанол, цистеїн, рН 7,8. Введення до середовища виділення цистеїну та меркаптоетанолу виключає окислення сульфгідрильних груп ферментів. Осад ресуспендували в тому самому середовищі та нашаровували на 40 – 90% ний градієнт перколу. Після центрифугування ділянку інтактних хлоропластів збирали на межі 40 та 90% перколу. Отримані інтактні хлоропласти використовували для виділення гідрофільних білків строми та гідрофобних білків фотосинтетичної мембрани шляхом шокування пластид.

Вивчення пігмент-білкових комплексів хлоропластів, інфікованих ВТМ, рослин перцю. Відносна частка кожної смуги в загальному складі пігмент-білків та співвідношення між вмістом окремих пігмент-білкових комплексів у хлоропластах подана в таблиці.

Таблиця

Розподіл пігмент-білкових комплексів хлоропластів перцю при електрофоретичному розділенні

Пігмент-білкові комплекси та їх співвідношення | Контроль | Дослід

Інтенсивність, відн. од. | % | Інтенсивність, відн. од. | %

CР1a | 3,50,31 | 10,45 | 1,00,22 | 2,92

CР1 | 3,30,21 | 9,77 | 4,20,34 | 12,24

СР1а+СР1 | 6,80,41 | 20,22 | 5,20,31 | 15,16

СР? | - | - | 1,60,11 | 4,66

LHCP1 | 7,50,30 | 22,28 | 7,10,35 | 20,69

CPa | 4,40,23 | 13,20 | 2,20,38 | 6,42

LHCP3 | 6,60,41 | 19,54 | 8,20,37 | 23,91

FP | 8,41,20 | 24,76 | 10,00,43 | 29,16

CP1a/CР1 | 1,070,21 | 0,240,07

LHCP1/LHCP3 | 1,140,13 | 0,870,09

У хлоропластах, інфікованих рослин, співвідношення двох форм реакційного центру фотосистеми І (CP1a/Cp1) значно зменшувалось по відношенню до контролю. Дані зміни відбувалися внаслідок суттєвого зменшення відносного вмісту СР1а. У хлоропластах інфікованих рослин спостерігався перерозподіл відносних часток олігомерної (LHCP1) та мономерної (LHCP3) форм світлозбираючого комплексу на користь останньої. У випадку найближчої антени фотосистеми ІІ (СРа) спостерігалось зменшення (приблизно в 2 рази) її відносного вмісту. В інфікованому варіанті була виявлена нова смуга між СР1 та LHCP1 , відомостей про склад останньої в науковій літературі немає. Візуально смуга мала жовто-зелений колір, що свідчило про перевагу в її складі хлорофілу b. Тому ймовірна її належність до світлозбираючого комплексу фотосистеми ІІ, тобто вона може бути специфічною формою світлозбираючого комплексу фотосистеми ІІ, синтез якої відбувається за дії стресових факторів.

Таким чином, інфікування ВТМ рослин перцю призводило до деструктивних змін у складі світлозбиральних комплексів як фотосистеми І, так і фотосистеми ІІ. Світлозбиральні комплекси фотосистеми ІІ виявилися більш вразливими до дії вірусної інфекції, про що свідчило зменшення відносного вмісту СРа, а також поява нової смуги, яку ми відносимо до світлозбиральних комплексів фотосистеми ІІ.

Дослідження мембранних та стромальних білків хлоропластів здорових та інфікованих ВТМ рослин перцю. Розвиток хлорозів на листках перцю при інфікуванні ВТМ викликав деструкцію білкових компонентів мембран хлоропластів. Вірусна інфекція викликала суттєве зменшення відносного вмісту реакційного центру фотосистеми І, світлозбираючого комплексу фотосистеми ІІ, білків кисеньвидільного комплексу фотосистеми ІІ - 33 кДа та 43 кДа. Репродукція ВТМ у рослинах перцю призводила до появи нових низькомолекулярних білків, що може бути наслідком активування протеолітичних процесів у стресових умовах.

У випадку стромальних білків хлоропластів перцю вірусний процес викликав зменшення відносного вмісту великої субодиниці РУБІСКО та білків у межах 17 кДа – 50 кДа. Відносний вміст малої субодиниці РУБІСКО зменшувався внаслідок дії вірусної інфекції.

Виявлено новий білок як серед мембранних, так і стромальних білків в області 17 – 18 кДа. Використовуючи метод імуноблотингу, нами показано, що серед хлоропластних білків рослин перцю, інфікованих ВТМ, присутній капсидний білок вірусу (Рис. 6).

Серед білків строми концентрація вірусного білку вища порівняно з мембранною фракцією. Наявність вірусного білку в хлоропластах відмічена й іншими дослідниками [Reneiro, 1986].

Таким чином, інфікування ВТМ рослин перцю призводило до деструкції білків, що входять до складу фотосистему ІІ. Репродукція ВТМ в клітинах перцю викликала деструкцію РУБІСКО.

ДЕТЕКЦІЯ НУКЛЕЇНОВОЇ КИСЛОТИ ВТМ В ХЛОРОПЛАСТАХ РОСЛИН ПЕРЦЮ

Розробка умов проведення полімеразної ланцюгової реакції. Здійснена робота по тестуванню та визначенню оптимальних умов проведення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), які дозволяють отримувати максимальну кількість ПЛР продуктів з праймерами до ВТМ. Для оптимізування умов проведення ПЛР нами тестувались наступні параметри: температура відпалу праймера, концентрація MgCl2, концентрація Tag полімерази. Ампліфікацію проводили в наступному температурному режимі: початкова денатурація: 2 хв. при 94С; 36 циклів: 30 сек при 94С, 30 сек. при 63С, 2 хв. при 72С; термінальна елонгація: 5 хв. при 72С.

Для інших параметрів умов проведення ПЛР нами встановлені наступні параметри: концентрація MgCl2 в межах 1,8 – 2,5 мМ, концентрація Tag полімерази в діапазоні 0,8 – 1,5 одиниць/20 мкл реакційної суміші.

Застосування полімеразної ланцюгової реакції для ідентифікації та локалізації вірусної РНК в хлоропластах перцю. Результати ПЛР аналізу представлені на рисунку 7.

Наявність вірусної нуклеїнової кислоти може служити непрямим індикатором місця синтезу вірусного білка в хлоропластах [Almasi A., 2001]. Використання методу ПЛР дозволило встановити наявність нуклеїнової кислоти ВТМ в інтактних хлоропластах та стромальній фракції гідрофільних білків. Показано, що РНК вірусу тютюнової мозаїки була відсутня в фракції гідрофобних білків фотосинтетичних мембран.

Таким чином, проведені нами дослідження показали наявність і локалізацію вірусної РНК в стромі хлоропластів перцю, інфікованого ВТМ, що може свідчити про безпосередню участь хлоропластів у процесах реплікації вірусної РНК та синтезі білку.

ВИСНОВКИ

1. ВТМ викликає найбільші деструктивні зміни в структурі хлоропластів, що проявляється в руйнуванні ламелярної структури органоїду, зменшенні кількості крохмальних зерен, розростанні периферійного ретикулума та підвищенні кількості осміофільних глобул.

2. В інфікованих ВТМ рослинах перцю відбувається зменшення концентрації хлорофілів а і b на 30 - 40% та підвищення каротиноїдів на 20% на кінцевих етапах вірусного патогенезу.

3. Підвищення активності пероксидази обумовлює утворення некрозів. Високий рівень активності каталази визначає системну відповідь рослин на інфікування ВТМ. Зміна активності поліфенолоксидази є наслідком порушення фенольного обміну рослин при інокулюванні ВТМ.

4. ВТМ викликає зміни в організації пігмент-білкових комплексів. Світлозбираючий комплекс фотосистеми ІІ є більш вразливим до дії вірусної інфекції, про що свідчить зменшення відносного вмісту СРа, а також поява нової смуги у складі фотосистеми ІІ.

5. Інфікування ВТМ призводить до руйнування мембранних білків, які формують поліпептиди фотосистеми ІІ та появи низькомолекулярних білків. Вірусний патогенез викликає деструкцію стромальних білків.

6. Показано, що РНК ВТМ локалізується в стромі хлоропластів перцю, а накопичення вірусного білку відбувається в стромі та мембранах пластид.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Мельничук М.Д., Дьячкова О.О., Смирнова С.О. Морфофізіологічні та біохімічні зміни рослин перцю (Capsicum annuum L.) при інфікуванні вірусом тютюнової мозаїки // Науковий вісник Національного аграрного університету, 2002, №50. – С.13-18.

2. Мельничук М.Д., Дьячкова О.О., Кожукало В.Є., Ситник С.К. Особливості виділення хлоропластів з рослин перцю Capsicum annuum, інфікованих ВТМ // Аграрна освіта і наука. – 2002. – 3, №3-4. – С. 5-8.

3. Мельничук М.Д., Кожукало В.Е., Дьячкова О.А., Сытник С.К., Алексеенко И.П., Смирнова С.А. Влияние вируса табачной мозаики на ультраструктуру клеток мезофилла листа перца Capsicum annuum // Мікробіологічний журнал. – 2002. – 64, №6. – С. 35 – 40.

4. Мельничук М.Д., Дьячкова О.О., Смирнова С.О., Олексієнко І.П. Зміни ферментативної активності рослин під впливом інфікування вірусом тютюнової мозаїки. // Физиология и биохимия культурных растений. – 2003. – 34, №1. – С.43 – 47.

5. Мельничук М.Д., Дьякова О.О., Смирнова С.О. Зміни активності поліфенолокидази рослин перцю та тютюну під впливом інфікування вірусом тютюнової мозаїки // Научные труды Крымского Государственного Аграрного Университета. Симферополь. – 2002. – 72. – С. 89 – 91.

6. Дьячкова О.О. Зміни ультраструктури хлоропластів рослин перцю Capsicum anuum L., індуковані вірусом тютюнової мозаїки // IV Міжнародна конференція молодих вчених Сучасні напрямки у фізіології та генетиці рослин, (Інститут фізіології рослин та генетики НАНУ), 23 – 25 жовтня 2002, с. 46.

7. Melnychuk M.D., Dyachkova O.O., Smirnova S.O. Some reciprocal morphophisiological and biochemical reactions of plants at biological stress under virus infection. // Plant under environmental stress - International Symposium, Moscow, K.A. Timiryazev Institute of Plant Physiology, October 23-28, 2001, -342p.

АНОТАЦІЯ

Дьячкова О.О. Фізіологічні реакції перцю (Capsicum annuum L.) на вірусну інфекцію. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.12 – фізіологія рослин. – Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, Київ, 2003.

Дисертацію присвячено вивченню особливостей фізіологічної відповіді рослин перцю Capsicum annuum L. на вірусну інфекцію.

Встановлено, що інфікування ВТМ рослин перцю призводило до підвищення активності пероксидази, що має відношення до локальної відповіді рослини на вірусну інфекцію. Підвищення активності поліфенолоксидази пов’язане з вторинними змінами фенольного метаболізму і не являє собою первинну захисну реакцію рослинного організму на вірусну інфекцію. ВТМ спричинював збільшення активності каталази.

Інфікування ВТМ рослин перцю викликало деструктивні зміни на рівні клітинних органоїдів. Найбільшим змінам підлягали хлоропласти. Репродукція вірусу викликала зменшення вмісту фотосинтезуючих пігментів.

Репродукція ВТМ у рослинах перцю призводила до деструктивних змін пігмент-білкових комплексів хлоропластів перцю. Світлозбиральні комплекси фотосистеми ІІ виявилися більш вразливими до дії вірусної інфекції, про що свідчить зменшення відносного вмісту СРа, а також поява нової смуги, яку ми відносимо до світлозбиральних комплексів фотосистеми ІІ.

Розмноження ВТМ призводило до руйнування мембранних білків, які формують поліпептиди ФС ІІ та появі низькомолекулярних білків. Вірусний патогенез викликав деструкцію стромальних білків. У хлоропластах, інфікованих ВТМ рослин перцю, відбувалося накопичення капсидного білку вірусу

Вперше експериментально методом ПЛР показана наявність і локалізація вірусної РНК в стромі хлоропластів перцю, інфікованого ВТМ, що може свідчити про участь хлоропластів у процесах реплікації вірусної РНК та синтезі білка.

Ключові слова: Capsicum annuum L, ВТМ, біотичний стрес, ультраструктура клітини, пероксидаза, поліфенолоксидаза, каталаза, фотосинтез, хлорофіл, каротиноїди, пігмент-білкові комплекси, капсидний білок.

АННОТАЦИЯ

Дьячкова О.А. Физиологическая реакция перца (Capsicum annuum L) на вирусную инфекцию. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.12. – физиология растений. – Институт физиологии растений и генетики НАН Украины, Киев, 2003.

Диссертация посвящена изучению особенностей физиологического ответа растений перца Capsicum annuum L. на вирусную инфекцию.

Установлено, что инфицирование ВТМ растений перца приводит к повышению активности пероксидазы, что имеет отношение к локальному ответу растений на вирусную инфекцию. Повышение активности полифенолоксидазы связано с вторичными изменениями фенольного обмена и не представляет собой первичную защитную реакцию растительного организма на вирусную инфекцию. ВТМ вызывал увеличение активности каталазы в течение всего эксперимента. Высокая активность этого фермента являет собой неблагоприятный фактор для явления устойчивости растений.

Инфицирование ВТМ растений перца вызывало деструктивные изменения на уровне клеточных органоидов. Вирусные частицы в большом количестве накапливались в цитоплазме клеток и вакуолях. Наибольшим изменениям подвержены хлоропласты. Вирусные частицы локализовались возле внешней мембраны органоидов. Пластиды приобретали чашеобразную форму, наблюдалось разрушение ламелярной структуры. В ответ на биотический стресс в хлоропластах происходило разрастание периферического ретикулума, уменьшение количества и размеров крахмальных зерен, а также увеличение осмиофильных глобул.

Установлено, что репродукция вируса вызывает изменение содержания пигментов, а именно уменьшение относительного содержания хлорофиллов a и b. Репродукция ВТМ в тканях растений перца приводила к увеличению содержания каротиноидов на поздних этапах вирусного патогенеза.

Инфицирование растений перца ВТМ вызывало изменения пигмент-белковых комплексов хлоропластов. Светособирающие комплексы фотосистемы ІІ более чувствительны к действию вирусной инфекции в сравнении со светособирающими комплексами фотосистемы І. Данный факт проявлялся в уменьшении относительного содержания антенны фотосистемы ІІ (СРа) и появлении новой полосы, которую мы относим к светособирающим комплексам фотосистемы ІІ. Вирусная инфекция вызывала уменьшение стабильности олигомерной формы светособирающего комплекса фотосистемы ІІ (LHCP1) с преобразованием его на мономерную форму (LHCP3).

Инфицирование ВТМ растений перца приводило к изменению количественного и качественного состава мембранных и стромальных белков хлоропластов. Установлено, уменьшение относительного содержания реакционного центра фотосистемы І, светособирающего комплекса фотосистемы ІІ, белков 33 кДа и 43 кДа, относящихся к кислородвыделяющему комплексу фотосистемы ІІ. Вирусный патогенез вызывал уменьшение относительного содержания большой и малой субъединицы РУБИСКО. Среди мембранных и стромальных белков хлоропластов обнаружен капсидный белок ВТМ.

Впервые экспериментально методом ПЦР показано наличие и локализация вирусной РНК в строме хлоропластов перца, инфицированного ВТМ, что может свидетельствовать об участии хлоропластов в процессах репликации вирусной РНК и синтезе белка.

Полученные результаты позволяют углубить представление об особенностях физиологических реакций перца на действие стрессоров биотической природы, а также могут использоваться для дальнейшего изучения природы устойчивости растений к вирусной инфекции и разработке способов ее повышения.

Ключевые слова: Capsicum annuum L, ВТМ, биотический стресс, ультраструктура клеток, пероксидаза, полифенолоксидаза, каталаза, фотосинтез, хлорофилл, каротиноиды, пигмент-белковые комплексы, капсидный белок.

ANNOTATION

Dyachkova O.O. Physiological reaction of pepper (Capsicum annuum L.) on virus infection. – Manuscript.

Thesis for Ph. D. Degree (Biology) on specialty 03.00.12 – plant physiology – Institute of Plant Physiology and Genetics of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 2003.

The thesis is dedicated to analysis of features of the physiological answer of pepper plants Capsicum annuum L. on a virus infection contamination.

It has been established, that TMV infection of pepper plants led to an increasing of a peroxidase activity that relates to the local answer of plants to a virus infection contamination. The increasing of a polyphenoloxidase activity is connected to secondary changes of phenolic metabolism and does not represent a primary defence reaction of a plant organism on a virus infection contamination. TMV invoked increases of a catalase activity.

TMV infection of pepper plants invoked destructive changes at a level of cell organoids. To the greatest changes were subject the chloroplasts. The reproduction of a virus has called of decreasing photosynthetic pigments.

The reproduction of TMV in pepper plants led to destructive changes of chloroplasts pigment - protein complexes of pepper. The light-harvesting complex of photosystem II has appeared by more sensing to operating a virus infection contamination in matching with the light-harvesting complex of photosystem І, to what the reduction relative kept in repair СPа, and also appearance of a new band, which one we fall into light-harvesting complex of photosystem II.

The reproduction of TMV led to destruction of membranous proteins, which one reshapes a photosystem ІІ and appearance of low molecular weight proteins. The virus pathogenesis has called a destruction of stromal proteins. In pepper plants chloroplasts infected of TMV there was an accumulation of a capsid protein of the virus.

For the first time availability and localization virus RNA in a stroma of chloroplasts of pepper infected by TMV experimentally using PCR method is rotined that can testify to participation of chloroplasts during replication virus RNA and synthesis of protein.

Key words: Capsicum annuum L, TMV, biotic stress, ultrastructure of cells, peroxidase, polyphenoloxidase, catalase, photosynthesis, chlorophyll, carotenoids, pigment - protein complexes, capsid protein.