МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

ОДЕСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Дзизенко Тімур Святославович

УДК 616.36 - 008.51 – 074 - 092.4:577.125.5

Патофізіологічні механізми зрушень у тканинах печінки

і їх регуляція до та після операції декомпресії обтураційного холестазу

14.03.04 – патологічна фізіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Одеса 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Одеському державному медичному університеті МОЗ України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Напханюк Володимир Клеонтійович,

Одеський державний медичний

університет МОЗ України, завідувач кафедри гістології,

ембріології та цитології

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Клименко Микола Олексійович Харківський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри патологічної фізіології.

доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки ш техніки України Макулькін Руслан Федорович Одеський державний медичний університет МОЗ України, професор кафедри загальної та клінічної патофізіології

Провідна установа:

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця, відділ фізіології кровообігу, НАН України, м. Київ

Захист дисертації відбудеться “24” січня 2003 року о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.600.01 при Одеському державному медичному університеті (65026, м. Одеса, пров. Валіховський, 2).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Одеського державного медичного університету (65026, м. Одеса, пров. Валіховський, 3).

Автореферат розісланий “22” грудня 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

к. мед. н., ст.н.сп. Соболєв Р.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Проблема патологічних уражень жовчовивідних шляхів, які супроводжуються холестазом, незважаючи на значні успіхи у її дослідженні, постійно привертає увагу дослідників внаслідок значного поширення захворювань і, зокрема, серед осіб молодого віку. Відомо (Бурков С.А., Грєбєнєв А.Л., 1995; Єрмолов А.С., 1997), що на сьогодення патологією жовчовивідних шляхів страждає 10-15% населення світу, а за останнє десятиріччя кількість таких хворих зросла приблизно у два рази. Лише пацієнти з гострим обтураційним холестазом складають біля 30% загального числа хворих із гострими хірургічними захворюваннями (Усиченко Л.С., Березницкий Я.С., 1999). Згідно існуючих даних (Кузнєцов М.Р., 1998), післяопераційна летальність при обтураційних холестазах складає в середньому 6-9%, а у людей старшого віку – 15-26%. У зв’язку з цим, хворих з обтураційним холестазом відносять до групи ризику у відношенні розвитку печінкової недостатності, яка нерідко розвивається, або посилюється після виконання декомпресійної операції (Гавриленко Г.А., 1995). На сьогодення у доступній літературі (Вохрущев Я.М., Хохлаченко Н.А., 1999) відсутня єдина точка зору щодо патогенезу печінкової недостатності, яка розвивається після операції декомпресії обтураційного холестазу. Одні автори (Кузнєцов М.Р., Істомін Д.І., 1998) пов’язують виникнення печінкової недостатності у післяопераційному періоді із застійним повнокров’ям органа, що розвивається внаслідок швидкого випорожнення жовчних шляхів. На думку інших авторів (Логінов А.С., Матюшин С.М. та інші, 1998), в основі патогенезу печінкової недостатності лежать порушення внутрішньоорганного кровообігу, аноксія, порушення вуглеводного обміну, дезамінування, процесів перекисного окислення ліпідів у печінці, і морфологічним субстратом цієї патології є дистрофія, некроз і порушення структури органу. Незважаючи на таку значну кількість вищенаведених робіт, проблема залишається не вирішеною і, на наш погляд, одним із напрямків для її рішення є дослідження механізмів, що лежать в основі репаративних процесів ушкоджених тканин печінки. На жаль, у всьому різноманітті літературних даних, що торкаються патогенезу уражень печінки за умов холестазу, ми не знайшли подібних досліджень. Не зовсім з’ясованими на сьогодення є і пускові метаболічні процеси, які лежать в основі деструктивних процесів у печінці на морфологічному рівні.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до плану науково-дослідних робіт Одеського державного медичного університету і є фрагментом теми “Патогенетичні механізми розвитку захворювань в умовах дії агресивних факторів середовища та шляхи їх корекції” (№ держреєстрації 0199U004330). Дисертант є співвиконавцем цієї теми.

Мета дослідження. З’ясувати патофізіологічні механізми, що лежать в основі репаративних процесів тканин печінки та розробити можливі шляхи їх фармакокорекції до та після операції декомпресії гострого обтураційного холестазу.

Завдання досліджень:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

Об’єкт дослідження: позапечінковий холестаз.

Предмет дослідження: активність системи ПОЛ-АОС, вміст циклічних нуклеотидів, сульфгідрильних і дисульфідних груп, активність реакцій посттрансляційної модифікації білків хроматину клітин печінки, морфологічна структура печінки.

Методи дослідження: патофізіологічні, біохімічні, біофізичні, гістологічні, статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. На підставі проведених експериментальних досліджень вперше встановлено, що перев’язка загальної жовчної протоки викликає посилення інтенсивності процесів перекисного окислення ліпідів, яке у динаміці холестазу продовжує зростати і при цьому супроводжується зниженням активності основних ферментів антиоксидантної системи як у печінці, так і у периферійній крові. Вперше доведено, що надмірні кількості продуктів перекисного окислення ліпідів викликають модифікацію системи циклічних нуклеотидів, сприяючи різкому зниженню цАМФ та збільшенню цГМФ, що супроводжується зменшенням вмісту SS- і накопиченням SН- груп у печінці та крові. Вперше доведено, що гострий обтураційний холестаз супроводжується дезорганізацією процесів посттрансляційної модифікації білків хроматину ядер клітин печінки, яка виявляється до появи видимих деструктивних змін паренхіми органу. Вперше доведено, що введення гептралу після обтурації жовчної протоки сприяє зменшенню інтенсивності процесів ПОЛ посиленню активності ферментів АОС та у значній мірі стабілізує активність реакцій посттрансляційної модифікації білків хроматину ядер клітин печінки, що позитивно відображається на структурі паренхіми органу. Вперше встановлено, що провідну роль у процесах регенерації печінки після операції декомпресії холестазу відіграють процеси посттрансляційної модифікації білків хроматину ядер гепатоцитів і на цій підставі з’ясовано, що найбільш ефективною є операція декомпресії на протязі першої доби. Вперше доведено, що введення гептралу після операції декомпресії посилює відновлення функціональної активності реакцій посттрансляційної модифікації білків хроматину ядер клітин печінки, що, у свою чергу, сприяє активації процесів репарації ушкодженої паренхіми органу.

Практична значимість одержаних результатів. Отримані експериментальні дані дозволили розкрити раніше невідомі патофізіологічні механізми, які лежать в основі молекулярних зрушень морфофункціонального стану печінки в динаміці розвитку гострого обтураційного холестазу та встановити залежність регенеративних процесів від їх стану у післяопераційному періоді. Така комплексна оцінка стану системи ПОЛ-АОС, циклічних нуклеотидів, тіол-дисульфідного обміну у крові і печінці та активності реакцій посттрансляційної модифікації білків хроматину клітин печінки і морфологічних зрушень її паренхіми перспективна у плані підвищення ефективності передопераційної підготовки, тактики оперативного втручання та посилення репаративних процесів в органі після операції декомпресії. Отримані експериментальні дані, які свідчать про позитивний вплив гептралу на процеси регенерації печінкових тканин після операції декомпресії обтураційного холестазу є певним вкладом у вирішення проблем попередження розвитку печінкової недостатності після операції і створює передумови для подальшої розробки і вдосконалення способів лікування цієї патології.

Отримані результати досліджень впроваджені і використовуються у науковій роботі та навчальному процесі кафедр загальної хірургії, загальної і клінічної патологічної фізіології, загальної та клінічної фармакології, гістології, ембріології та цитології Одеського державного медичного університету.

Особистий внесок здобувача. Автором виконано патентно-інформаційний пошук, визначено мету та задачі досліджень, методичні підходи, відпрацьовано моделі, розроблено алгоритм, згідно якого виконано дослідження на експериментальному матеріалі. Автором самостійно проведено статистичну обробку результатів досліджень, оформлено таблиці та сформульовано висновки дисертаційної роботи, оформлені публікації.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були оприлюднені на наукових конференціях молодих вчених та спеціалістів (Одеса, 1997-2000), на засіданні Одеського обласного відділення Українського товариства патофізіологів (Одеса, 1999); Одеського обласного товариства АГЕТА (Одеса, 2000); на VІ Міжнародній науково-практичній конференції “Сучасні досягнення валеології та спортивної медицини” (Одеса, 2000); на науково-практичній конференції “Актуальні питання морфогенезу та регенерації” (Луганськ, 2000); на VІІ Міжнародній науково-практичній конференції “Сучасні досягнення валеології та спортивної медицини” (Одеса, 2001);

Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 9 наукових робіт, з них 6 статей у фахових журналах, та 3 у збірниках конференцій.

Обсяг і структура дисертації Дисертаційна робота викладена на 199 сторінках машинопису і складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, трьох розділів, що відображають результати власних досліджень, Обговорення власинх досліджень, висновків та літератури, що включає 130 джерел вітчизняних та 85 - зарубіжних авторів. Дисертація ілюстрована 44 таблицями та 22 рисунком, які займають 16 повних сторінок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Експериментальні дослідження проведені на 480 статевозрілих щурах-самцях популяції Вістар масою 180,0-200,0 г. У відповідності до мети та задач дослідження всі експериментальні тварини були розподілені на наступні групи: 1) інтактні тварини (контроль); 2) тварини після перев’язки загальної жовчної протоки; 3) тварини після перев’язки загальної жовчної протоки та курсового введення гептралу; 4) тварини після операції декомпресії гострого холестазу; 5) тварини, яким після операції декомпресії вводили гептрал.

З експерименту тварин другої та третьої групи виводили через 12, 24 та 48 годин після перев’язки загальної жовчної протоки. Тварин четвертої та п’ятої груп з експерименту виводили через 12 годин після зняття лігатури 12, 24 та 48-годинної обтурації загальної жовчної протоки. Через 10 хвилин після перев’язки загальної жовчної протоки, а потім кожні 6 годин експериментальним тваринам третьої групи внутрішньочеревинно із розрахунку 5 мг на 100 г маси тіла вводили гептрал. Тваринам, яким проводили операцію декомпресії гептрал вводили із розрахунку 5 мг на 100 г маси тіла після операції, а потім кожні шість годин.

Об’єктом досліджень була печінка та її субклітинні структури (цитозоль, мітохондрії, ядро), еритроцити та сироватка периферійної крові.

Гістологічні та морфометричні дослідження проводили за класичними методами (Автандилов Г.Г., 1980; 1990; А.А. Артишевський, А.С. Леонтюк, Б.А. Слука, 1999). Морфологічні аспекти роботи проконсультовані доцентом кафедри гістології ембріології та цитології ОДМУ Горяновою Н.О.

Хроматин отримували з ядер клітин печінки за методом Teng G.S. та співавторів (1979). Лабільно зв’язані з ДНК негістонові білки отримували шляхом обробки очищеного хроматину 0,35 М NaCl pH 7,5 (Уманський С.Р., Ковалев Ю.И., Пикер Е.Г. 1975). Індивідуальні гістони вилучали фракціонуванням сумарних гістонів методом гельфільтрації на біогелі Р-60, сефадексі G-100 (Panyim S., et al., 1969). Шляхом обробки хроматину 0,5 N HClO4 при температурі 1000 С отримували фракцію міцно зв’язаних з ДНК негістонових білків (Р.С. Уманский, 1976). Сумарні гістонові білки отримували методом К. Босток (1981). Електрофорез гістонів проводили у гелевих блоках. Забарвлені гелі сканували на електрофотометрі Specord-UV-Vis. Підрахунок радіоактивності у зонах гелю проводили за методом Aloye V.J. (1979), концентрацію білка визначали за Desoye G. (1980). Для дослідження активності реакцій модифікації білків хроматину ядер гепатоцитів експериментальним тваринам внутрішньочеревинно вводили із розрахунку на 100,0 г маси тіла: при дослідженні реакцій фосфорилювання – 6,0 МБк NaH232HO4 за дві години до декапітації, реакцій ацетилювання – 6,0 МБк 14СН3СООNa за 1,5 години до декапітації; реакцій АДФ-рибозилювання – 8,0 МБк 3Н-рибози за дві години до декапітації; реакцій метилювання – 8,0 МБк 3Н-метилметионіну за 1,5 години до декапітації. Вміст циклічних нуклеотидів визначали з використанням наборів Ria Kit фірми Amersham (Великобританія). Вміст –SH, -SS-груп визначали з використанням 5,5/-дитіобіс-2-нітробензойної кислоти (Ellmor G.L. 1959). Активність супероксиддисмутази визначали методом R. Fried (1975). Про каталазну активність по швидкості руйнування перекису водню (R. Holmes, C.E. Masters, 1970). Вміст дієнових кон’югатів визначали методом І.Д. Стальної (1971), малонового діальдегіду – методом І.Д. Стальної і Т.Г. Гарішвілі (1971). Статистичну обробку виконували з використанням стандартних пакетів програм “Primer Biostatistics” Sigma Start (США, 1994).

Результати досліджень та їх обговорення.

В результаті проведених досліджень встановлено, що перев’язка загальної жовчної протоки вже через 12 годин призводить до інтенсифікації процесів перекисного окислення ліпідів як у печінці, так і еритроцитах та сироватці крові. При цьому характерним є те, що на початку експерименту (12 годин) інтенсивність ПОЛ зростає за рахунок різкого збільшення вмісту МДА (Р<0,05) у той час, як вміст дієнових кон’югатів майже не відрізняється від рівня контролю. Зі збільшенням терміну обтурації вміст малонового диальдигіду та дієнових кон’югатів і у печінці і в еритроцитах та сироватці крові продовжує збільшуватися, досягаючи максимальних змін на 48 годину холестазу. Звертає на себе увагу і той факт, що інтенсивність утворення як початкових, так і кінцевих продуктів ПОЛ у динаміці розвитку гострого обтураційного холестазу в еритроцитах та сироватці крові є вищою, ніж у печінці. Характерним є те, що ріст активності супероксиддисмутази на цьому етапі у цитоплазмі клітин печінки та сироватці крові є більшою, ніж у мітохондріях та еритроцитах крові. Активність каталази на цей час у всіх досліджених структурах майже не відрізняється від показників здорових щурів (Р<0,05). Зі збільшенням терміну (24 години) оклюзії позапечінкових жовчних шляхів активність супероксиддисмутази (СОД) вірогідно посилюється як по відношенню до попереднього терміну, так і до контролю. У цей же час активність каталази різко пригнічується, можливо, що причиною такого пригнічення активності ферменту є надмірні кількості супероксиданіон-радикалу, який, як відомо, інгібує цю реакцію (Губський Ю.И., Левицький Е.Л., Волков Г.Л. 1991). У подальшому (48 годин) активність супероксиддисмутази у всіх досліджених структурах різко гальмується як по відношенню до попередніх показників, так і до контролю. Різкого зниження на цьому етапі дослідження зазнає і активність каталази.

Встановлено також, що починаючи з 12 години після перев’язки холедоху у печінці та еритроцитах крові спостерігається поступове зменшення вмісту цАМФ і збільшення кількості цГМФ, при цьому відзначається зниження коефіцієнту взаємовідношення між цими нуклеотидами, що очевидно засвідчує посилення катаболічних процесів у тканині печінки.

Активність АДФ-рибозилювання білків хроматину на цьому етапі досліджнь має різні значення у залежності від типу білків. Так, активність АДФ-рибозилювання сумарних гістонів, індивідуальних гістонів Н2А, Н2В, лабільно і міцно зв’язаних з ДНК негістонових білків на цей час є вірогідно нижчою за рівень контролю. Поряд з цим активність АДФ-рибозилювання індивідуальних гістонів Н1, Н3 та Н4 посилюється порівняно з контролем відповідно на 25,0%, 30,0% і 17,0% (Р<0,05). Досить істотних змін через 12 годин повної оклюзії жовчних шляхів зазнає і активність реакцій ацетилювання білків хроматину ядер клітин печінки. При цьому активність ацетилювання сумарних гістонів, індивідуальних гістонів Н1, Н2А і Н2В різко гальмується, а гістонів Н3, Н4 та лабільно зв’язаних з ДНК негістонових білків вірогідно посилюється відносно контролю. Зі збільшенням терміну окклюзії жовчних шляхів (24 години) явища дезінтеграції активності реакцій метилювання, фосфорилювання, АДФ-рибозилювання та ацетилювання різко посилюється як по відношенню до попередніх показників, так і до контролю. Особливо значного пригнічення на цьому етапі зазнає активність реакцій метилювання та фосфорилювання сумарних гістонів, індивідуальних гістонів Н1, Н2А та міцно зв’язаних з ДНК негістонових білків. У подальшому (48 годин) активність більшості реакцій посттрансляційної модифікації як гістонів, так і негістонових білків змінює свій напрямок ,посилюючи явища дезінтеграції цих процесів.

При повній оклюзії жовчних шляхів морфологічні зміни у печінці являли собою досить гетероморфну картину. Поряд з відносною збереженістю більшої частини паренхіми спостерігалися осередкові деструктивні явища. Архітектоніка органу у цілому не порушувалась. Реакція сполучнотканинних компонентів зводилась в основному до незначного набряку та помірної клітинної інфільтрації. Через 48 годин після перев’язки загальної жовчної протоки морфологія печінки піддавалась досить істотним змінам. Зокрема, збільшувалась площа зрізу, що займала некротично змінена паренхіма. Осередки некрозу мали більш масивний характер.

Внаслідок проведених досліджень встановлено, що введення гептралу після повної окклюзії позапечінкових жовчних шляхів сприяє значному зниженню структурно-метаболічних зрушень у тканині печінки та посиленню компенсаторно-відновних процесів.

Так, через 12 годин після окклюзії жовчних шляхів на фоні введення гептралу вміст малонового диальдегіду є нижчим у печінці, еритроцитах та сироватці крові порівняно з тваринами, яким не вводили гептрал, відповідно на 21,3%, 41,7% і 37,5%. Кількість дієнових кон’югатів на цьому етапі досліджень знаходиться на рівні інтактних тварин. Введення гептралу після оклюзії жовчних шляхів у значній мірі посилює на даному етапі досліджень активність супероксиддисмутази і каталази у мітохондріях і цитоплазмі клітин печінки і еритроцитах та сироватці крові як по відношенню до контролю, так і до групи тварин, яким після операції не вводили гептрал. Введення гептралу на цьому етапі досліджень також сприяє збільшенню вмісту сульфгідрильних та зниженню кількості дисульфідних груп у всіх досліджених структурах порівняно з тваринами, яким не вводили гептрал. Позитивним є вплив гептралу після перев’язки холедоху на цьому етапі досліджень на вміст та взаємовідносини циклічних нуклеотидів у досліджених структурах.

Введення гептралу також позитивно впливає на активність реакцій метилювання всіх білків хроматину ядер клітин печінки порівняно з показниками тварин, яким після оклюзії не вводили гептрал, а метилювання сумарних гістонів, гістонів Н2В і Н3 відновлюється до фізіологічного рівня. Активність процесів фосфорилювання більшості білків хроматину після введення гептралу вірогідно посилюється порівняно з тваринами, яким не вводили гептрал. Позитивних змін після введення гептралу порівняно з тваринами, яким не вводили після обтурації препарат, зазнають на цьому етапі досліджень процеси АДФ-рибозилювання та ацетилювання білків хроматину ядер клітин печінки. Значно меншими після введення гептралу за умов 12-годинної оклюзії були і морфологічні зміни тканин печінки. Вони зводились до деструкції незначної кількості гепатоцитів, розміщених переважно субкапсулярно. При цьому не відзначалося характерної для тварин, яким після обтурації не вводили гептрал, імбібіції клітин жовчними пігментами та не зустрічались жовчні екстравазати.

Через 24 години після перев’язки холедоху та курсового введення гептралу вміст малонового диальдегіду у печінці та еритроцитах і сироватці крові є нижчим за показники тварин, яким після обтурації не вводили гептрал, відповідно на 51,7%, 41,7% 37,5% (Р<0,05) (рис 1). Значно нижчою на цьому етапі досліджень, порівняно з тваринами, яким не вводили гептрал, є і кількість дієнових кон’югатів у досліджених структурах. Активність ключових ферментів антиоксидантної системи СОД і каталази через 24 години після перев’язки холедоху та курсового введення гептралу є також вірогідно вищою в усіх досліджених структурах печінки та крові за показники тварин, яким після обтурації не вводили гептрал, а активність СОД навіть переважає рівень контролю (рис 2). Позитивним на цьому етапі досліджень на фоні курсового введення гептралу є також зміни вмісту сульфгідрильних і дисульфідних груп та кількості циклічних нуклеотидів порівняно з показниками тварин, яким після перев’язки холедоху не вводили гептрал.

Через 24 години після перев’язки холедоху та введення гептралу активність метилювання сумарних гістонів, індивідуальних гістонів Н1, Н2А, Н3 і міцно зв’язаних з ДНК негістонових білків вірогідно посилюється порівняно з аналогічними показниками тварин, яким після обтурації не вводили гептрал, але водночас вона є нижчою за рівень контролю. Паралельно з означеними змінами, активність метилювання гістонів Н2В, Н4 знижується по відношенню до показників тварин, яким після обтурації не вводили гептрал.

Введення гептралу на протязі 24 годин після повної окклюзії позапечінкових жовчовивідних шляхів також сприяє усуненню явищ дезорганізації і активності реакцій АДФ-рибозилювання та ацетилювання білків хроматину ядер клітин печінки і відновлює певний стаціонарний рівень міжгістонних взаємовідносин цих реакцій, що є набагато нижчим за контроль і дещо меншим ніж у попередньому терміні.

Використання гептралу на цьому етапі досліджень значно зменшувало і виразність морфологічних зрушень у печінці.

Через 48 годин після окклюзії жовчних шляхів та введення гептралу інтенсивність процесів перекисного окислення ліпідів є нижчою за рівень у тварин, яким після обтурації не вводили гептрал і водночас вона є вірогідно вищою, ніж у контролі. Паралельно з означеними змінами спостерігається різке пригнічення активності СОД і каталази у всіх досліджених структурах порівняно з контролем, але при цьому необхідно відзначити, що активність цих ферментів була вищою, ніж у тварин яким не вводили гептрал. Отже, незважаючи на введення гептралу, у печінці та крові тварин після 48-годинного холестазу спостерігається зрушення рівноваги у системі ПОЛ-АОС вліво, що, як відомо (Вагнер Е.А., Хлебников В.В., Терехина Н.А., Палатова Л.Ф. 1997), є ознакою виснаження функціональної потужності антирадикальних механізмів. Підтвердженням цього є також зміни взаємовідносин між вмістом SH- та SS-груп.

Значно більших змін на цьому етапі досліджень зазнають і процеси посттрансляційних модифікацій білків хроматину ядер клітин печінки порівняно з

аналогічними показниками за умов обтураційного холестазу на протязі 24 годин та одночасного введення гептралу. Все ж таки, порівняльний аналіз цих результатів показує, що введення гептралу за умов 48-годинної обтурації сприяє збереженню функціональної активності процесів посттрансляційної модифікації білків хроматину ядер клітин печінки на більш високому рівні, порівняно з тваринами, яким після обтурації не вводили гептрал.

Введення гептралу на протязі 48-годинної обтурації жовчних шляхів не сприяє повному запобіганню деструктивних зрушень у тканинах печінки, але ознаки регенеративної активності гепатоцитів і ретикуло-ендотеліальної системи були більш виразними ніж у тварин, яким після окклюзії не вводили зазначений препарат.

В результаті досліджень встановлено, що через 12 годин після операції декомпресії 12-годинного обтураційного холестазу активність реакцій метилювання сумарних гістонів та більшості індивідуальних гістонів відновлюється до рівня інтактних тварин. Виключення складає тільки метилювання гістону Н4 та лабільно зв’язаних з ДНК негістонових білків, інтенсивність цих процесів в яких вища за рівень контролю. Активність АДФ-рибозилювання сумарних гістонів, індивідуальних гістонів Н1, Н2А, Н2В, Н4 та лабільно зв’язаних з ДНК негістонових білків у цій серії дослідів також відновлюється до рівня контролю, а активність цього процесу у гістону Н3 є вищою ніж у інтактних тварин, а у міцно зв’язаних з ДНК негістонових білків - нижчою. Значним позитивним змінам підлягає і активність реакцій фосфорилювання і ацетилювання білків хроматину ядер клітин печінки.

Слід зазначити також, що у цій серії дослідів відновлюється до фізіологічного рівня тіол-дисульфідний обмін та вміст циклічних нуклеотидів. Такі позитивні зміни досліджених процесів супроводжуються посиленням відновлювання структурних компонентів печінки. При цьому у паренхімі печінки спостерігались виразні ознаки компенсаторних процесів: виразна гіперхромія і гіпертрофія гепатоцитів, збільшення індексу поліплоїдизації та коефіцієнту відновлення паренхіми, порівняно з показниками на 12 годину.

* Р > 0,05 – відносно контролю

Рис. 1 Вміст малонового диальдегіду та дієнових кон’югатів у печінці за умов

обтураційного холестазу та при введенні гептралу

* Р > 0,05 - відносно контролю

Рис. 2. Активність супероксиддисмутази та каталази у мітохондріях клітин печінки за умов

обтураційного холестазу та при введені гептралу

Дослідження активності реакцій посттрансляційної модифікації білків хроматину ядер клітин печінки через 12 годин після операції декомпресії 24-годинного холестазу виявили істотні відмінності їх показників порівняно з аналогічними у попередній серії дослідів. При цьому активність метилювання сумарних гістонів, індивідуальних гістонів Н1, Н2А і Н3 та міцно зв’язаних з ДНК негістонових білків була вірогідно нижчою за контроль та показники попередньої серії дослідів. Паралельно з цим спостерігалось посилення активності метилювання гістону Н4 та лабільно зв’язаних з ДНК негістонових білків. Неоднозначних змін на цьому етапі досліджень зазнає і активність реакцій АДФ-рибозилювання, при цьому інтенсивність цих процесів у сумарних гістонів, індивідуальних гістонів Н2А, Н2В і міцно зв’язаних з ДНК негістонових білків є нижчою, а гістонів Н1, Н3 і Н4 – вищою як за рівень контролю, так і стосовно показників попереднього терміну. На цьому етапі досліджень також значно відрізняється активність реакцій фосфорилювання як по відношенню до попередньої серії дослідів, так і до контрольних тварин і ці відмінності мають дезінтеграційний характер, хоча їх виразність є меншою, ніж у тварин з 24 годинним холестазом без компенсації. Подібних змін зазнають і процеси ацетилювання білків хроматину ядер клітин печінки.

Через 12 годин після операції декомпресії 48-годинного холестазу активність реакцій посттрансляційної модифікації білків хроматину ядер клітин печінки підлягає більш виразним змінам та дезорганізації порівняно з показниками у попередніх двох серіях дослідів, але відносно аналогічних змін на 48 годину обтурації вона є більш позитивною.

Досить істотно відрізняється і вміст сульфгідрильних, дисульфідних груп та циклічних нуклеотидів від аналогічних показників попередніх серій дослідів. При цьому необхідно все ж таки підкреслити, що глибина виявлених зрушень є значно меншою, ніж на 48 годину холестазу без компенсації.

Морфологічна картина печінки через 12 годин після операції декомпресії 48-годинного обтураційного холестазу досить істотно відрізнялась від попередніх серій дослідів ступінню виразності як деструктивних, так і репаративних процесів. У паренхімі печінки визначались жовчні екстравазати, кількість яких у різних тварин була не однозначною. Морфометрично встановлено збільшення площі зрізу, яку займала некротично змінена паренхіма, проте печінкові клітини відносно неушкодженої паренхіми губили ознаки як протеїнової, так і гідропічної дистрофій.

Встановлено, що введення гептралу на протязі 12 годин після операції декомпресії 12-годинного холестазу сприяє посиленню активності реакцій метилювання сумарних гістонів, більшості індивідуальних гістонів та лабільно зв’язаних з ДНК негістонових білків як порівняно з контролем, так стосовно показників у тварин, яким після операції декомпресії не вводили гептрал. Активність метилювання гістону Н2А та міцно зв’язаних з ДНК негістонових білків у цей час відповідає рівню контролю і водночас є вищою ніж у тварин, яким не вводили гептрал. Означені зміни є свідченням активації процесів клітинної диференціації, яка, як відомо (Laks H.S., Jagman B.A.; 1980), залежить від активності метилювання. Активність процесів АДФ-рибозилювання практично всіх білків хроматину на цьому етапі досліджень є також вищою як за контроль, так і показники тварин, яким після операції не вводили гептрал. Виключення у цьому випадку складає АДФ-рибозилювання міцно зв’язаних з ДНК негістонових білків, активність якого на цей час знаходиться на рівні контролю і одночасно є вищою ніж у тварин, яким не вводили гептрал. Рівномірно на цьому етапі досліджень посилюється і активність реакцій фосфорилювання і ацетилювання. Введення гептралу після операції призводить також до збільшення вмісту цАМФ та сульфгідрильних груп.

Введення гептралу на протязі 12 годин після операції декомпресії 12-годинної окклюзії викликає позитивні зміни структури печінки. При цьому гепатоцити збільшувались у розмірах, часто набували базофілії, ядра мали добре структурований хроматин. Збільшувалась порівняно з тваринами, яким не вводили після операції гептрал, кількість поліплоїдних та двоядерних клітин. Сполучна тканина портальних полів у більшості випадків мала вигляд інтактної.

Активність реакцій метилювання через 12 годин введення гептралу після операції декомпресії 24-годинного холестазу посилювалась у більшості білків, як по відношенню до контролю, так до і тварин, яким після операції не вводили гептрал. АДФ-рибозилювання на даному етапі досліджень майже всіх білків хроматину не відрізнялось від фізіологічного рівня. Значного посилення на цей час також зазнавали, порівняно з тваринами, яким не вводили після операції гептрал, і процеси фосфорилювання та ацетилювання. Морфологічна картина печінки цієї серії дослідів була більш розмаїтою, ніж у попередній серії дослідів. Масивні і субмасивні некрози були інтенсивно інфільтровані мононуклеарами гістоцитарного і лейкоцитарного походження. Зустрічались поліплоїдні і двоядерні гепатоцити у більшій кількості ніж у тварин, яким після операції не вводили гептрал. Для ендотеліоцитів і клітин Купфера характерними були базофілія цитоплазми і гіперхромія ядер.

В результаті проведених досліджень також встановлено, що введення гептралу на протязі 12 годин після операції декомпресії 48-годинного холестазу викликало стабілізацію активності реакцій посттрансляційної модифікації білків хроматину ядер клітин печінки на стаціонарному рівні, значно нижчому, ніж у попередніх двох серіях досліджень і близькому до фізіологічних показників і, водночас, більш високому ніж, у тварин, яким після операції не вводили гептрал. На цьому етапі досліджень також встановлено і меншу інтенсивність відновлення гістологічних структур печінки. Некротично змінені ділянки паренхіми за площею були близькими до таких у групі дослідів без гептралу, і являли собою слабооксифільний клітинний детрит, густо інфільтрований гістіоцитами, лімфоцитами з незначною сумішшю інших клітинних форм. Деякі осередки залишались просякнутими жовчними пігментами, хоча накопичення жовчі у міжклітинних просторах і імбібіції нею гепатоцитів не відзначалося. Гепатоцити відносно неушкоджених ділянок паренхіми мали ознаки активації компенсаторно-відновних процесів.

Таким чином, використання гептралу у ранньому періоді після операції декомпресії обтураційного холестазу викликало посилення активності реакцій посттрансляційної модифікації білків хроматину та їх стабілізацію на більш високому рівні (12 і 24-годинний холестаз) і на дещо нижчому рівні після операції декомпресії 48-годинного холестазу. Такі позитивні зміни на молекулярному рівні сприяли у свою чергу посиленню репаративних процесів у тканинах печінки. Ефективність використання гептралу у післяопераційному періоді залежала від тривалості холестазу, але у всіх випадках він значно посилював процеси регенерації тканин печінки, що надає нам можливість рекомендувати його для використання як до операції, так і у післяопераційному періоді для прискорення репаративних процесів, і запобігання розвитку печінкової недостатності.

Висновки.

У дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове розв’язування наукової проблеми вивчення патофізіологічних механізмів, які лежать в основі морфофункціональних зрушень тканини печінки за умов гострого обтураційного холестазу та можливостей попередження розвитку печінкової недостатності у післяопераційному періоді. На підставі проведених досліджень вперше доведено, що процеси регенерації печінки залежать від стану реакцій модифікації білків хроматину клітин органа та запропоновано використання гептралу у передопераційній підготовці до операції декомпресії холестазу.

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

Список наукових праць, опублікованих за темою дисертації

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.