НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИКИ

ДОМЕНЮК ВАЛЕРІЙ ПЕТРОВИЧ

УДК 633.15:631.524:575.113:542.1

ДНК-МАРКЕРИ ЛОКУСІВ КІЛЬКІСНИХ ОЗНАК КУКУРУДЗИ

03.00.22 – молекулярна генетика

А в т о р е ф е р а т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2003

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у Південному біотехнологічному центрі у рослинництві

УААН (м. Одеса).

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор, академік УААН

СИВОЛАП Юрій Михайлович,

Південний біотехнологічний центр

у рослинництві УААН, директор.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор,

член-кореспондент НАН України

Кунах Віктор Анатолійович,

Інститут молекулярої біології і генетики НАН України,

завідувач відділу генетики клітинних популяцій;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Терновська Тамара Костянтинівна,

Інститут агроекології та біотехнології УААН,

завідувач лабораторії геномної та хромосомної інженерії рослин.

Провідна установа:

Інститут клітинної біології та генетичної інженерії

НАН України, м. Київ.

Захист дисертації відбудеться “ 25 ” листопада 2003 р. о 10.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ-143, вул. Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ-143, вул. Заболотного, 150.

Автореферат розіслано “ 23 ” жовтня 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук О. В. Підпала

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Дослідження механізмів реалізації генетичної інформації є одним з основних завдань молекулярної генетики. За останні 15 років одержано численні дані про організацію геномів злакових культур, виконано картування та маркування багатьох локусів господарсько-цінних ознак. Вирішальним завданням молекулярно-генетичного дослідження сьогодні є використання теоретичних узагальнень для розробки ДНК-технологій з метою практичного використання. Важливе значення має впровадження таких біотехнологій в селекцію сільськогосподарських рослин, зокрема такої важливої культури як кукурудза.

Тривалість термінів добору вихідного матеріалу та ресурсовитратність є важливою проблемою у гібридній селекції кукурудзи. Більшість агрономічно-цінних ознак, що підлягають добору, мають неперервний характер мінливості. Прогнозування поведінки нащадків за розщепленням ускладнюється полігенним контролем кількісних ознак, маскуванням генотипних ефектів умовами середовища, складною системою генетичних взаємодій.

Застосування молекулярних маркерів відкриває перспективи для вивчення генетичної природи кількісних ознак шляхом маркування локусів (QTL’s), які визначають їхній розвиток, і на цій основі практичного підвищення ефективності методів селекції. Цей напрямок пов’язаний з розвитком сучасного підходу МАS (добір, заснований на маркерах) і ґрунтується не на результатах стандартного картування, а на інформації про динаміку характеру зв’язків маркерів із рівнем розвитку кількісної ознаки у природних популяціях. Незважаючи на актуальність та прикладну важливість цей підхід є мало впроваджуваним. Досягнення світової практики щодо застосування ДНК-маркерів QTL’s для добору, у більшості, складають приватну інформацію біотехнологічних центрів. Отже, країнам СНД, зокрема Україні, потрібно розробляти власні засоби впровадження ДНК-технологій в селекційну практику.

У зв’язку з цим теоретичний та практичний інтерес становить розробка системи прогнозування прояву локусів кількісних ознак в популяціях на основі зв’язку ДНК-маркерів з QTL. Необхідним етапом такої роботи є маркування кількісних ознак з використанням методів ДНК-аналізу, зокрема, продуктами полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Комплексне залучання таких підходів, як RAPD-, ISSR- та SSR-аналіз, дозволяє детектувати поліморфізм різних ділянок геному, що є особливо важливим для дослідження полігенних ознак. Добір за ДНК-маркерами QTL, що ґрунтується на специфічності зв’язку між успадкуванням поліморфних ампліконів (алелів) у сегрегуючій популяції та фенотипічною варіацією кількісних ознак вважається одним із найперспективніших шляхів не лише підвищення ефективності традиційних методів добору, а і якісної зміни селекційної стратегії за умов створення системи прогнозування рівня розвитку кількісних ознак у наступних дочірніх популяціях.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано у відділі молекулярної генетики Південного біотехнологічного центру у рослинництві (до 1999 року у складі СГІ) в межах програми (НТП) УААН “Сільськогосподарська біотехнологія 2001-2005 р.” (№ держ. реєстрації: 318/92 від 24.10.01), підпрограми 1 “Новітні біотехнології в рослинництві” за напрямом 03 “Використання молекулярно-біологічних методів в генетико-селекційній роботі” із виконання завдання 3.1.2.2. “Створення ефективної системи прогнозування гетерозису на основі дослідження характеру зв’язку молекулярних маркерів з ознаками продуктивності кукурудзи”.

Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи є детекція ДНК-маркерів до локусів кількісних ознак кукурудзи та розроблення на їхній основі нових технологій підвищення ефективності селекційного процесу.

Для досягнення поставленої мети вирішували такі завдання:

1. Детекція молекулярно-генетичного поліморфізму генотипів інбредних батьківських ліній ГК26 і Мо17 – контрастних за комплексом агрономічних ознак і джерелами зародкової плазми.

2. ДНК-маркування локусів кількісних ознак (QTL), які визначають розвиток важливих господарських ознак кукурудзи, зокрема ознак габітусу рослини, морфології волоті, продуктивності та біохімічних показників.

3. Перевірка істотності зв’язку ДНК-маркерів з локусами кількісних ознак.

4. Розробка та апробація моделей прогнозування та добору на основі ДНК-маркерів локусів кількісних ознак.

Об’єкт дослідження – геном кукурудзи.

Предмет дослідження – ДНК-маркерів локусів кількісних ознак (QTL).

Методи дослідження – різновиди ПЛР-аналізу (SSRP, ISSR, RAPD), біометричні методи маркування QTL, генетико-статистичне моделювання.

Наукова новизна одержаних результатів полягає у постановці нової наукової проблеми змістом якої є використання специфіки зв’язків ДНК-маркерів з локусами кількісних ознак для добору в популяціях кукурудзи. Вперше детектовані ДНК-маркери до QTL комплексу агрономічно-цінних ознак кукурудзи було використано для добору на індивідуальному та популяційному рівнях. Запроваджено деякі нові наукові поняття, зокрема маркерна тестова система (ефективний комплекс маркерів, що складає основу моделі прогнозу чи добору), узагальнена маркерна мітка (можливі варіанти генотипів при поєднанні маркерних алелів певної тестової системи), термін “селективна вага” у застосуванні до інформаційної цінності алелів ДНК-маркерів. Обґрунтовано використання функціонального зв’язку між узагальненим маркерним генотипом та рівнем фенотипічної варіації, визначеного регресійним аналізом, за основу ДНК-прогнозу. У процесі роботи були використані деякі нові методи та апарат дослідження зокрема, розроблений експрес-метод екстракції ДНК з листя кукурудзи, маловживаний метод 6 % ПААГ-електрофорезу для фракціонування продуктів ПЛР ISSR- та RAPD-локусів, модифікований під генетичні параметри регресійний аналіз. Показана можливість ДНК-моніторингу процесів розвитку та успадкування кількісних ознак в популяціях кукурудзи.

Практичне значення одержаних результатів полягає у розробці моделей ДНК-прогнозу та маркерного добору, які рекомендуються для використання в селекційній практиці у вигляді нового “Способу прогнозування рівня розвитку кількісних ознак в популяціях злакових культур” (подано заявку на винахід) та методичних рекомендацій “Генетичне поліпшення популяцій кукурудзи шляхом добору за ДНК-маркерами локусів кількісних ознак”. Отримані під час дослідження самозапилені потомства I3, які виділені в результаті маркерного поліпшення популяції, є цінним вихідним матеріалом для подальшої селекції.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційну роботу було виконано під керівництвом д.б.н., професора, академіка УААН Сиволапа Ю.М.. Здобувачем особисто проаналізовано літературні дані за темою дисертаційної роботи, проведено виділення ДНК та генотипування близько 200 рекомбінантів популяції кукурудзи (ГК26 х Мо17) F2-F3. Детектовано молекулярно-генетичний поліморфізм між генотипами батьківських інбредних ліній ГК26 і Мо17 за допомогою різновидів ПЛР-аналізу (RAPD, ISSR та SSRР). Проаналізовано розщеплення за поліморфними локусами ДНК і проведено маркування локусів кількісних ознак в сегрегуючій популяції F2. Перевірено істотність зв’язку ДНК-маркерів із впливовими QTL в F3. Розроблено принципи ДНК-прогнозування та прямого добору за ДНК-маркерами QTL та перевірено їхню ефективність в процесі експериментального моделювання. Польові роботи, зокрема ізоляцію та самозапилення індивідуальних рослин популяції (ГК26 х Мо17) F2-F5, оцінку фенотипічного прояву комплексу кількісних та якісних ознак виконано самостійно на експериментальній базі “Дачна” Біляївського району, Одеської області.

Здобувач висловлює подяку за планування селекційних дослідів, ідеї та творчу участь у розробці принципів ДНК-прогнозу та маркерного добору д.б.н., зав. лабораторії генетико-біотехнологічних методів селекції кукурудзи Селекційно-генетичного інституту – Національного центру насіннєзнавства та сортовивчення Бєлоусову А.О., за проведення біохімічних аналізів к.с-г.н., п.н.с. лабораторії біохімії і фізіології рослин СГІ Адамовській В.Г.

Обговорення, аналіз, інтерпретацію отриманих експериментальних даних, а також підготовку частини публікацій до друку проводили разом із д.б.н., професором, академіком УААН Сиволапом Ю.М., д.б.н. Бєлоусовим А.О., к.б.н., с.н.с. Інституту нових медичних технологій і проблемних захворювань Вербицькою Т.Г., к.б.н., с.н.с. Південного біотехнологічного центру Солоденко А.Е. Усім цим фахівцям автор висловлює щиру подяку.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були повідомлені на Міжнародній конференції з генетики та молекулярної біології для студентів і молодих вчених (Львів, 2000 р.); на 2-й Міжнародній конференції “Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии” (Москва, Росія, 2001 р.); на Міжнародній конференції молодих вчених “Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений” (Харків, 2001 р.); на Міжнародному симпозіумі “Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология” (Мінськ, Білорусія, 2001 р.); на Міжнародній конференції “Plant, Animal and Microbe Genomes” (Cан-Дієго, США, 2002); на Конференції для студентів, аспірантів та молодих вчених з молекулярной біології та генетики (Київ, 2001 р.); на Конференції для молодих вчених і спеціалістів “Досягнення і перспективи розвитку агробіотехнології в Україні” (Київ, 2002 р.); на Міжнародній конференції “Молекулярно – генетические маркеры растений” (Ялта, 2002 р.); на 2-й Міжнародній конференції молодих вчених “Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений” (Харків, 2003 р.).

Публікації. Результати дисертаційної роботи опубліковані у п’яти статтях і тезах восьми доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів і методів, експериментальної частини, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, практичних рекомендацій.

Роботу викладено на 176 сторінках машинописного тексту. Дисертацію проілюстровано 14 рисунками і 46 таблицями. Список використаної літератури охоплює 176 джерел.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Вихідний матеріал – лінії ГК26, Мо17, гібрид F1, сегрегуюча популяція (ГК26 х Мо17) F2. Батьківські інбредні лінії суттєво різняться за основними морфо-біологічними ознаками і належать до різних гетерозисних груп – Iodent та Lancaster відповідно. Генерації F3 та F4 створено під час дослідження. Матеріал люб’язно наданий завідувачем лабораторії генетико-біотехнологічних методів селекції кукурудзи Селекційно-генетичного інституту – Національного центру насіннєзнавства та сортовивчення (м. Одеса), д.б.н. Бєлоусовим А. О.

Оцінка фенотипічної мінливості кількісних ознак. Розмноження популяцій (ГК26 х Мо17) F2, F3, F4 проводили шляхом ізоляції з подальшим індивідуальним самозапиленням кожного відібраного генотипу. На рослинах популяцій F2, F3, F4 оцінювали мінливість 24-х фенотипічних ознак. Якісні ознаки (колір тичинкових ниток, колір листя, колір луски волоті, колір пиляків, колір квіткової луски стрижня, колір корони зерна) використано на етапі картування. Дослідження було зосереджено на вивченні 18-ти кількісних ознак, що мають селекційне та господарське значення: “висота рослини”, “висота прикріплення качана”, “ширина листа”, “довжина листа”, “довжина волоті”, “величина розгалудженого простору волоті”, “кількість первинних розгалуджень волоті”, “кількість рядів зерен”, “маса 100 зерен”, “діаметр основи качана”, “глибина зерна”, “довжина качана”, “індивідуальна продуктивність”, “волога зерна”, “вміст білка”, “вміст крохмалю”, “вміст олії”, “стійкість до полягання”.

Значення ознаки “волога зерна” визначали на приладі “LABQUIP AP 6060 Moisture Analyzer” фірми Sinar. Значення ознаки “індивідуальна продуктивність” розраховували за формулою: (“вага качана” – “вага стрижня”) x (100% – “вологість зерна”) / (100% – 14%), де 14% – стандартна волога зерна. Значення ознаки “глибина зерна” визначали як різницю між значеннями ознак “діаметр качана” та “діаметр стрижня”. Ознаку “стійкість до полягання” визначали за десятибальною шкалою згідно стандарту “UPOV”. Біохімічні ознаки: вміст білка визначали методом К’ельдаля на аналізаторі “Kjeltek Auto 1030 Analyzer” (“Tecator”); вміст крохмалю визначали антроновим методом визначення вуглеводів; вміст олії – екстракційним методом визначення олії у рослинній сировині з використанням екстракторів нового типу. Значення решти ознак визначали простим вимірюванням чи підрахунком.

Виділення ДНК. ДНК з листя кукурудзи виділяли згідно методик, які були модифіковані у відділі молекулярної генетики ПБЦ. Листовий матеріал подрібнювали у епендорфі з 0,6 мл лізуючого буфера (0,1 М трис-НСl, pH 8,0 (25С); 0,15 М ЕДТА; 2,1 М NaCl; 2 % PVP; 2 % СТАВ; 1 М DTT) за допомогою гомогенізатора (4-8 тис. об/хв). Інкубували на водяній бані протягом години при 60С. Депротеїнізацію здійснювали, додаючи рівний об’єм хлороформ-ізоамілової суміші (24 : 1). Центрифугували 5 хв при 10000 об/хв, супернатант переносили у новий епендорф. У супернатант додавали 5 М NaCl (до 2,1 М) та 800 мкл холодного ізопропанолу, перемішували і тримали при кімнатній температурі 20 хв, далі у холодильнику протягом ночі для формування осаду. Центрифугували декілька разів, після чого надосад обережно зливали. Осад промивали розчинами 1 (76 % С2Н5OH; 0,2 М NaOH) та 2 (76 % С2Н5OH; 10 мM NH4OH), висушували у вакуумній сушці, розчиняли у розчині ТЕ (10мM трис-HCl, pH 8,0; 1 мM Na3EДTA) з РНК-азою (1 мкг /мл ). Інкубували при 37С 2 години.

Концентрацію ДНК вимірювали на флуориметрі ТКО Hoefer-100 у розчині 1 х TNE (10 мM трис-HCl, pH 7,4 (25С); 100 мM NaCl; 1 мM Na3ЕДTA) з 100 мкг/мл інтеркалюючого барвника Hoechst 33258.

Умови ампліфікації ДНК. Реакційна суміш для ПЛР об’ємом 20 мкл містила: 50 мМ KCl, 20 мМ трис-HCl (рН 8,4 при 25С); 2-3-4 мМ MgCl2 (залежно від типу праймерів); 0,01% Tween-20; 0,15 мМ кожного dNTP; 0,2 мкМ праймера; 10-20 нг ДНК; 0,8-1 од. Tag-полімерази. Ампліфікацію проводили на приладі MJ Research (PTC-200). Температурні режими для ампліфікації продуктів ISSR- та RAPD-локусів різняться етапом гібридизації: початкова денатурація – 94С 2 хв, далі 40 с, гібридизація – 53-58С (ISSR), - 48С (RAPD) 30 с, елонгація - 72С 2 хв, повторення цих етапів 30 разів, остання елонгація – 5 хв. Умови ПЛР для SSR-праймерів: денатурація – 94С 1 хв, гібридизація – 60С 40 с, елонгація – 72С 1,5 хв, повторення цих етапів 30 разів, остання елонгація – 5 хв.

Фракціонування та візуалізація продуктів ампліфікації ДНК. Продукти ампліфікації фракціонували електрофорезом у агарозних та поліакриламідних гелях. Агарозні гелі використовували для попередньої оцінки отриманих ампліконів. Склад: 2% чи 4% агароза (залежно від розмірів продуктів ампліфікації); ТВЕ-буфер. Умови електрофорезу: 4-5 годин при 50 V. Фрагменти ДНК в гелі забарвлювали бромистим етидієм. Фотографували гелі у УФ-промені крізь червоний світлофільтр на плівку “Мікрат-300”. Для кращої виразності застосовували поліакриламідні гелі (ПАА гелі). Склад: для продуктів ампліфікації SSR-локусів – 10% акриламід, 1 х ТВЕ (0,89 М трис-НСl, 0,89 М HзBOз, 20 мМ Naз-ЕДТА, рН 8,0, 8 М сечовина); для продуктів ампліфікації RAPD- та ISSR-локусів – 6% акриламід, 1 х ТВЕ. Для нанесення зразків використовували буфер: 0,25% бромфеноловий синій; 0,25% ксилолціанол. Електрофорез проводили на обладнанні Hoefer SE600, під напругою 500 В при 55С. Забарвлення продуктів ампліфікації у ПАА гелях проводили 0,012 М AgNO3. Молекулярну масу продуктів ампліфікації визначали згідно маркера – плазміди рUС18(19), розрізаної рестриктазою MspI (Fermentas), за допомогою комп’ютерної програми “Image Master 1D Elite”. Фрагменти маркера у п.н.: 1116, 883, 692, 501, 489, 404, 331, 242, 190, 147, 111-110, 67. Документували отримані електрофореграми відеосистемою VDS (Pharmacia Biotech).

Статистична обробка даних. Для статистичної обробки розщеплень за фенотипом та генотипом використано пакет комп’ютерних програм “Gene – Stat” і “Statistica”, для ДНК-маркування QTL – підходи, описані у Taksley. Розрахунки зчеплення виконано за допомогою комп’ютерної програми “МАРМАКЕR” ver. 3.0. Прогнозуючі моделі ґрунтувалися на регресійному аналізі, модифікованому під генетичні параметри. Моделі добору ґрунтувалися на модифікації традиційних схем шляхом залученння до них даних маркерного аналізу мінливості полігенних ознак.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

1. Детекція молекулярно-генетичного поліморфізму батьківських форм. Для пошуку молекулярно-генетичного поліморфізму у генотипів ліній ГК26 і Мо17 використано 20 пар SSR-праймерів. З використанням п’яти пар праймерів не вдалося отримати виразних продуктів ПЛР. Одинадцять пар SSR-праймерів детектували тотожні алельні стани досліджуваних локусів у батьківських ліній. У чотирьох локусах отримано поліморфні продукти ампліфікації: phi064 (78-86 п.н.); phi083 (170-178 п.н.); nc030 (108-112 п.н.); phi061 (80-88 п.н.).

Для детекції молекулярно-генетичного поліморфізму у генотипів ліній ГК26 і Мо17 використали 18 ISSR-праймерів. П’ять праймерів не дозволили отримати чітких продуктів ПЛР. З використанням десяти праймерів не вдалося розрізнити генотипи батьківських ліній. Поліморфізм був детектований за допомогою трьох праймерів. Кожен праймер дозволяв апліфікувати ділянки ДНК з 10-15 локусів. Поліморфними серед них були: за праймером isp5 – 6 локусів, isp13 – 8 локусів, isp7 – 7 локусів.

Для детекції молекулярно-генетичного поліморфізму між генотипами ліній ГК26 і Мо17 використали 15 RAPD-праймерів. З використанням чотирьох праймерів не вдалось отримати виразної ампліфікації. Вісім праймерів не дозволяли розрізнити геноми батьківських ліній. Поліморфізм детектували три праймери, але спектри, що стабільно відтворювались, вдалося отримати лише з праймером Р21.

На цьому етапі були детектовані поліморфні фрагменти ДНК, серед яких 8 належали SSR-, 21 – ISSR- та 9 – RAPD-локусам.

2. Маркування кількісних ознак популяції F2 за поліморфними локусами. На підставі оцінки 180 рослин було створено базу фенотипічних даних, що характеризує популяцію (ГК26 х Мо17) F2 за розщепленням кількісних ознак. Статистична обробка бази фенотипічних даних дозволила отримати показники неперервної варіації, а також вилучити ті варіанти ознак, що знаходилися за межами довірчих інтервалів.

Генотиповано 180 рекомбінантів популяції F2 відомого фенотипу за поліморфними локусами, гетерогенність яких була встановлена у батьківських ліній (приклад – рис. 1). Це дозволило простежити успадкування поліморфних ампліконів та перевірити їх розщеплення.

Рис. 1. Електрофореграма продуктів ампліфікації ДНК рекомбінантів F2 за праймером іsp 5. Контроль: Р1 – ГК26, Р2 – Мо17, F1. М – маркер pUC19/MspI

Проаналізовано мінливість 18 фенотипічних ознак у зв’язку з успадкуванням поліморфних ампліконів. Для кожного маркерного алеля (“АА”, “АВ”, “ВВ” – для SSR-локусів; “А-”, “аа” – для ISSR- та RAPD-локусів) визначали “селективну вагу” як середнє значення певної ознаки усіх особин популяції, що мають даний алель. Маркерним вважали локус за умов виявлення достовірної різниці середніх значень кількісної ознаки для популяційних класів за його алелями. Результати маркування QTL досліджених ознак, на прикладі SSR-маркування деяких ознак групи продуктивності, наведено у таблиці 1.

Ознаки “кількість рядів зерен”, “довжина качана”, “волога зерна” не марковано. Кількість маркерів, що припадає на ознаку коливалась від 2 (“маса 100 зерен”) до 4 (“індивідуальна продуктивність”, “глибина зерна”). Ознаку “діаметр основи качана” маркують три поліморфні локуси. Локус phi 083 маркує всі ознаки даної групи, phi 064 та phi 061 – три ознаки “діаметр основи качана”, “індивідуальна продуктивність”, “глибина зерна”, nc 030 – три ознаки “маса 100 зерен”, “індивідуальна продуктивність”, “глибина зерна”. Максимальна різниця значень ознаки “маса 100 зерен” встановлена у генотипів “АА” та “ВВ” локусу nc 030, а також у генотипів “АА” та “АВ” локусу phi 083 (d = 3,4 г); ознаки “діаметр основи качана” – у генотипів “АА” та “ВВ” локусу phi 061 і phi 083 (d = 0,2 cм); ознаки “індивідуальна продуктивність” – у генотипів “АА” та “ВВ” локусу phi 083 (d = 15,3 cм). Різниця між значеннями ознаки “глибина зерна” в усіх генотипів була однаковою (d = 0,1 см).

За такою ж схемою проаналізовано результати маркування QTL’s решти ознак.

Такий підхід забезпечив не лише статистично коректне ДНК-маркування QTL, але й автоматично визначав селекційну цінність маркерних алелів і, як наслідок, надавав можливість добору потрібних генотипів в потрібному напрямку.

Інформативними у популяції F2 були всі використані поліморфні локуси. Однак їхня маркувальна здатність, тобто кількість ознак, маркованих одним локусом, була різною і змінювалася у межах від 1 ознаки на маркер (“вміст олії” на локуси isp 13_580 і Р 21_805) до 8 (isp5_1008, P 21_488, nc 030, phi 083).

Таблиця 1

Інформативність алельного складу маркерних SSR-локусів у рекомбінантів F2 з різними значеннями ознак продуктивності

Маркерний локус |

Середнє значення

ознаки у генотипів | Кількість

генотипів | Достовірність різниці середніх при Р<

АA | AВ | ВВ | АA | AВ | ВВ

“маса 100 зерен”, г

nc 030 | 24,3±0,82 | 27,1±0,60 | 42 | 86 | 0,01

24,3±0,82 | 27,7±0,78 | 42 | 52 | 0,005

phi 083 | 24,5±0,80 | 27,9±0,67 | 44 | 85 | 0,005

27,9±0,67 | 25,7±0,70 | 85 | 51 | 0,05

“діаметр основи качана”, см

phi 064 | 3,6±0,04 | 3,45±0,05 | 54 | 38 | 0,05

phi 061 | 3,4±0,05 | 3,6±0,05 | 40 | 38 | 0,01

phi 083 | 3,4±0,05 | 3,6±0,04 | 43 | 51 | 0,005

“індивідуальна продуктивність”, г

nc 030 | 77,3±2,79 | 85,9±2,24 | 42 | 86 | 0,025

77,3±2,79 | 89,4±2,63 | 42 | 51 | 0,005

phi 064 | 91,6±2,65 | 83,3±2,25 | 54 | 86 | 0,025

91,6±2,65 | 82,3±3,03 | 54 | 38 | 0,025

phi 061 | 83,9±2,02 | 92,2±2,99 | 101 | 37 | 0,05

80,2±3,35 | 92,2±2,99 | 40 | 37 | 0,01

phi 083 | 83,7±1,96 | 94,2±3,02 | 84 | 51 | 0,005

78,9±3,15 | 94,2±3,02 | 44 | 51 | 0,001

“глибина зерна”, см

nc 030 | 1,5±0,02 | 1,6±0,03 | 86 | 52 | 0,01

1,5±0,02 | 1,6±0,03 | 42 | 52 | 0,025

phi 064 | 1,6±0,02 | 1,5±0,03 | 86 | 39 | 0,01

phi 061 | 1,6±0,04 | 1,5±0,02 | 40 | 101 | 0,025

phi 083 | 1,5±0,03 | 1,6±0,02 | 44 | 85 | 0,01

1,6±0,02 | 1,5±0,03 | 85 | 51 | 0,005

Примітка: *”А“ – алель більшої молекулярної ваги, “В“ – меншої.

Низька маркувальна здатність пояснюється віддаленістю маркованої послідовністі в геномі від решти локусів кількісних ознак. Висока, як варіант певної універсальності маркера, передбачає, що поліморфна послідовність є ділянкою певного кластеру (блоку), наприклад генів розвитку, які беруть участь у формуванні багатьох функцій організму. Результативність маркування певної ознаки (кількість локусів, що маркують одну ознаку) коливалася від 1 маркера на ознаку (isp13_236 – “волога зерна”, isp13_330 – “вміст білка”) до 25 (“глибина зерна”). За цим показником найбільш маркованою є група ознак продуктивності, найменш – група біохімічних ознак. Низька результативність маркування ознаки є певним доказом унікальності її генетичного контролю. Висока результативність, як наслідок отримання декількох маркерів до певної ознаки, вважалася найбільш об’єктивною інформацією для нашого дослідженя, з огляду на кількісний характер вивчених ознак.

Розробка системи планованого маркерного добору повинна ґрунтуватися на конкретних і, що головне, негроміздких даних. У випадку зчеплення маркерних локусів, логічно було б використовувати найбільш інформативний з них, не втрачаючи загальної інформації. З цієї точки зору, практично важливим є встановлення взаємного розташування поліморфних локусів і відстані між ними у групах зчеплення.

3. Картування маркерних локусів. На основі даних генотипування рекомбінантів F2, а також даних фенотипічної мінливості 6-ти якісних ознак, були отримані чотири групи зчеплення. Одну з них віднесено до третьої хромосоми за мікросателітним локусом nc 030. Попередній “two point”-аналіз виявив зчеплення дванадцяти маркерних локусів. Наступний “three point”-аналіз дозволив картувати десять з них, для двох не вдалося встановити унікального місця розташування у межах картованих локусів (рис. 2).

P21_351 : isp5_1008 : isp5_789 : S : isp7_594 : isp7_466 : isp7_797 : P21_470 : isp5_950 : nc 030

----------44----------- 31 ---------- 35 - 44 --------- 26 --------- 45 --------- 17 --------- 47 --------- 36 -- (сМ)

Рис. 2. Схема групи зчеплення (326,5 cM, хр. ІІІ). S – локус, що кодує мінливість якісної ознаки “колір тичинкових ниток”

На підставі результатів маркування можна припустити, що у межах даної групи зчеплення розташовані локуси (QTL), які впливають на мінливість ознак загальної морфології (найбільш представлені локуси, що впливають на “довжину листа”), морфології волоті (“величина розгалудженого простору волоті”), продуктивності (“глибина зерна”).

За такою ж схемою проаналізовано інформативність інших трьох груп зчеплення маркерних локусів, хромосомну локалізацію яких не встановлено.

Відомо, що адаптивні зміни в експресії генотипу перш за все позначаються на прояві кількісних ознак. Тому, остаточне визнання цих локусів маркерними потребувало перевірки тісноти їхнього зчеплення з QTL в декількох поколіннях.

4. Перевірка істотності зв’язку ДНК-маркерів з локусами кількісних ознак. Підставою надійного маркування є близьке розташування маркера з локусом (ами), що впливає на розвиток ознаки. Маркерним вважається локус, алелі якого мають нерівновагу за зчепленням з алелями QTL у фазі “притягання”, тобто маркерний локус і QTL розташовані настільки близько у групі зчеплення, що не відокремлюються кросинговером.

Метою дослідження передбачалося використання ДНК-маркерів на різних етапах селекції, тому в представленій роботі використано дві можливості такої перевірки: 1) оцінка нерівноваги за зчепленням між алелями маркерних локусів та QTL від батьків до рекомбінантів F2 та 2) від рекомбінантів F2 до наступного покоління F3. Перший спосіб – є найбільш обґрунтованим для попереднього або експрес-аналізу, з огляду на схему селекційного експерименту: сполучення фенотипічного контрасту і молекулярно-генетичного поліморфізму батьківських форм було основою ДНК-маркування QTL в популяції F2. Другий спосіб дозволяє врахувати адаптивні зміни в експресії генотипу, які перш за все позначаються на прояві кількісних ознак шляхом “перевизначення” генетичних формул, тобто зміни набору генів, що відповідали за розвиток певної ознаки у попередніх умовах середовища (роки дослідження 2000-2002 були контрастними за умовами).

Результати перевірки істотності зв’язків поліморфних локусів з QTL, що впливають на розвиток ознак габітусу рослини, в популяції F2, показали, що із загальної кількості (55 локусів) маркерними можна вважати 27, за першим способом (батьки-F2), і 8 за другим (F2-F3); для ознак морфології волоті із загальної кількості (22 локуси) – відповідно 9 і 6; для ознак продуктивності із загальної кількості (67 локусів) – відповідно 27 і 16; для біохімічних ознак із загальної кількості 12 – відповідно 5 і 1. На рис. 3 наведено приклади маркерних SSR- та ISSR-ампліконів локусів, за якими у F3 було отримано підтвердження маркерної здатності.

А

Б

Рис. 3. Електрофореграми продуктів ампліфікації ДНК рекомбінантів F3 (позначені цифрами) з праймерами: А - nc 030; Б - isp 7. Контроль: Р1 – ГК26, Р2 – Мо17, F1. М – маркер молекулярної ваги pUC/MspI. Стрілками позначено маркери: nc 030_108 – до ознак “висота рослини”, “висота прикріплення качана”, “ширина листа”, “індивідуальна продуктивність”; nc 030_108-112 – до ознаки “величина розгалудженого простору волоті”; isp 7_797 – “маса 100 зерен”; isp 7_503 – “глибина зерна”; isp 7_466 – “величина розгалудженого простору волоті”

Дослідження сегрегуючої популяції, де різні генотипи мали однакову можливість розвитку, дозволило розглянути основу генотипної мінливості і детектувати найбільш стабільні (“каркасні”) QTL, які зберегли свій вплив у контрастних умовах існування. Отримання маркерів саме до таких локусів відкриває перспективи їхнього застосування в селекції для добору генотипів з потрібними рівнями розвитку кількісних ознак у популяціях кукурудзи.

5. Теоретичні та прикладні аспекти моделювання добору за ДНК-маркерами QTL. Розробка принципу ДНК-прогнозу: залежно від завдань селекції об’єктами добору можуть бути різні (оптимальні) рівні розвитку агрономічних ознак. ДНК-маркери можуть бути основою прогнозу за умов створення адекватної генетико-статистичної моделі добору за полігенними ознаками. Для цього, попередньо, були відпрацьовані деякі параметри, за якими повинна працювати модель. Метою розробки способу ДНК-прогнозу є ранній добір особин, які мають позитивно оцінені в попередньому поколінні генотипи. Вихідними даними є ДНК-маркери QTL, отримані в популяції F2, з підтвердженою маркувальною здатністю за гаметичною нерівновагою між їхніми алелями порівняно батьківських генотипів з рекомбінантними в F2. Основою моделі є регресійний аналіз, де ДНК-маркери є незалежними перемінними, тобто стабільною основою добору протягом декількох поколінь, а фенотип кількісної ознаки є залежною перемінною, мінливість якої певним чином пов’язана з першою. Цей зв’язок має цифровий вираз у коефіцієнті регресії, на якому ґрунтується прогноз.

Експериментальне моделювання дозволило сформулювати вимоги до формування маркерних тестових систем: 1) перевага надається маркерам одного типу – за таких умов можна досягнути повної адекватності у формуванні маркерних тестових систем; 2) комбінування домінантних маркерів в одній тестовій системі вимагає, щоб ідентичні алелі цих локусів були характерні для генотипів з бажаним рівнем розвитку ознаки; 3) комбінування домінантних і кодомінантних маркерів в одній тестовій системі вимагає відповідності маркерних алельних станів, тобто маркерними в кодомінантному локусі повинні бути гетерозиготний стан локусу і один з гомозиготних; 4) при можливості, за “каркасний” використовувати SSR-локус. За умов дотримання цих вимог поліпшуються такі показники моделі як: інформативність, описові та прогнозувальні властивості, генетична адекватність.

Для перевірки прогнозувальної здатності розробленої моделі (на прикладі ознаки “величина розгалудженого простору волоті”) оцінено маркерні генотипи та відповідні фенотипи за кількісними ознаками рекомбінантів популяції F3. Порівняння фактичних значень цієї ознаки певних рослин з прогнозованими для їхніх маркерних генотипів, показало високий ступінь кореляції між ними (r = 0,83). Враховуючи стандартні статистичні рівні надійності прогнозу, за якими r > 0,7 вважається високим рівнем, можна стверджувати про значну ефективність прогнозувальної моделі на основі тестової системи ДНК-маркерів. Основні результати цього етапу роботи такі: моделювання ДНК-прогнозу для ознаки “індивідуальна продуктивність” дозволило визначити ефективні тестові системи: на базі ISSR-маркерів “isp5_950-isp7_594” надійність прогнозу складала 40%, на базі SSR- та ISSR-маркерів “nc030-isp7_594” – 50%; для ознаки “висота прикріплення качана” – тестову систему “nc030-phi083”, надійність прогнозу за якою склала 50%; для ознаки “величина розгалудженого простору волоті” – тестову систему “phi083 – isp7_466” з надійністю прогнозу 83%.

Розробка принципу маркерного добору в популяціях кукурудзи: одним із напрямків селекції кукурудзи є генетичне поліпшення популяції. Короткотривалим результатом може бути безпосереднє господарське використання популяції, поліпшеної за комплексом агрономічно-важливих ознак. Віддалені наслідки – можливість добору з такої популяції вихідного матеріалу для гібридної селекції. Маркери, отримані в процесі нашого дослідження, є, до певної міри, індикаторами генотипів ознак. З цієї точки зору, інтерес становить підвищення ефективності традиційних схем добору шляхом залучення до них ДНК-маркерів.

Моделювання маркерного добору передбачало: 1) визначення ефективної кількості маркерів для тестової системи; 2) визначення ефективного поєднання маркерів у тестову систему за критеріями, які обговорюються далі. Для забезпечення задовільної роботи моделі обґрунтовано такі теоретичні положення: 1) зважаючи на полігенний контроль досліджуваних ознак, інформація одного маркера вважається некоректною. Крім того, за висновком Животовського (1984), більша кількість маркерних алелів обумовлює більшу різноманітність (дисперсію) “селективної ваги” маркерних алелів і, як наслідок, значну відповідь на добір в популяції; 2) критерії залучення маркерів до тестової системи: а) тип маркера – перевага надається SSR-маркерам, адже тільки в цьому випадку візуалізуються всі алелі локусу, б) алельний стан маркерного локусу – лише гомозиготні маркери, оскільки гетерозиготні локуси у наступному поколінні розщеплюються, захоплюючи також і небажані рівні мінливості за певною ознакою, в) рівень достовірності маркування – вважається достатнім значення t-критерію – P<0,05, його збільшення є додатковим свідченням тісноти зчеплення маркера і QTL, г) зчеплення маркерних локусів – має подвійний зміст: по-перше, два зчеплених маркера можуть значно конкретизувати інформацію про мінливість QTL, розташованого між ними, по-друге, оскільки зчеплені маркери, ймовірно пов’язані з одним QTL, можна залучати їх до тестової системи по одному, змінюючи тим самим умови добору; 3) кількість маркерів у тестовій системі –для вибірки з 200 рослин доцільно використовувати інтегровану інформацію не більше чотирьох маркерів. За таких умов зберігається можливість знаходження всіх кросоверних класів маркерних генотипів.

Запропоновано таку схему експериментального досліду:

1. Вихідні дані – маркери, які були інформативні у двох суміжних популяціях F2-F3;

2. Формування тестової системи (за критеріями наведеними вище). На цьому етапі визначаються варіанти моделей добору, тобто варіанти маркерних тестових систем;

3. Маркерний добір кращих генотипів з покоління F3. Результатом є самостійна група рослин F3доб., відібраних за маркерами;

4. Визначення селекційного диференціалу (Sd) за різницею (d) середніх значень ознаки між групою рослин, відібраних за маркерами, F3доб. і вихідною популяцією F3вих. (остання, як популяція нульового циклу добору позначається Со). Про ефективність маркерної тестової системи, на цьому етапі, свідчить достовірна різниця між вказаними вибірками;

5. Отримання сімей покоління F4 шляхом розмноження групи рослин, відібраних за маркерами (F3доб.), тобто популяції першого циклу добору С1.

6. Визначення результату добору (зсуву за добором – R): R = хС1 – хСо; Отримання

достовірної різниці цих показників свідчить, що відповідь на добір задовільна;

7. Визначення генетичного ефекту добору за формулою: ?G = R / х х 100 % . Цей показник дозволяє оцінити ступінь поліпшення популяції за певною ознакою.

За наведеною схемою було проведено експериментальне моделювання маркерного добору рослин кукурудзи на підвищення рівня розвитку деяких кількісних ознак.

Маркерний добір проводили для трьох ознак, на які у F3 залишалося більше одного маркера, що задовольняли б наведеним вище інформаційним критеріям: 1. “Висота рослини” – два гомозиготних SSR-маркери – nc030_108 (назва праймера з молекулярною масою поліморфного продукту в п.н., що характерний для генотипів з більшим рівнем розвитку ознаки), phi061_88; 2. “Глибина зерна” – три гомозиготних ISSR-маркери – isp5_950, isp5_378 i isp13_525. Маркерні локуси незчеплені; 3. “Індивідуальна продуктивність” – два гомозиготних SSR-маркери – nc030_108, phi061_88 і один ISSR-маркер – isp5_950. Локуси nc030_108 та isp5_950 зчеплені.

У таблиці 2 подано результати добору за першим варіантом поєднання маркерів у тестову систему (ТС) (модель 1). Для ознаки “ВР” цей варіант єдиний – два SSR-маркери, для “ГЗ” – три ISSR-маркери одночасно, для “ІП” – залучено два SSR-маркери, щоб вирівняти умови моделювання з ознакою “ВР”.

Таблиця 2

Статистична характеристика вихідної популяції (F3вих.) порівняно з групою рослин (F3доб.), відібраних за маркерними тестовими системами (модель 1)

Статистичні показники | F3вих. | F 3доб. | Селекційний диференціал, Sd

висота рослини (см). ТС: nc030, phi061

х ± Sх | 142,7 ± 1,65 | 149,9 ±1,17 | 7,2**

s | 16,2 | 15,2

Ліміти | 135 – 151 | 144 – 159

глибина зерна (см). ТС: isp5_950, isp5_378, isp13_525

х ± Sх | 1,34 ± 0,03 | 1,48 ± 0,03 | 0,14**

s | 0,27 | 0,23

Ліміти | 1,2 – 1,5 | 1,4 – 1,6

індивідуальна подуктивність (г). ТС: nc030, phi061

х ± Sх | 40,1 ± 3,36 | 56,9 ± 2,80 | 16,8***

s | 31,7 | 29,6

Ліміти | 30,2 – 59,0 | 44,0 – 76,1

**Достовірно при Р<0,01; *** при Р<0,001

Треба зазначити, що тестову систему ознаки “ІП” складали ті ж самі маркери, що були інформативними для ознаки “ВР”. Групи рослин, відібраних за маркерами (F3доб.), достовірно різняться з вихідною популяцією, де проводили добір, за середніми значенням (наприклад для “ІП” – 56,9 г проти 40,1 г), тобто інтенсивність добору (Sd) суттєва для всіх ознак. Різнилися також кращі генотипи (наприклад для “ВР” – 159 см проти 151 см). Порівняння стандартного відхилення двох вибірок свідчить про звуження дисперсії ознаки в групах рослин, відібраних за маркерами. Для перевірки ефективності добору на кожну ознаку, матеріал був висіяний у двох варіантах: група рослин відібрана за маркерами F3доб. та вихідна популяція, з якої проводили добір F3вих.

Значення ознак “ВР” та “ІП” в популяціях С1 свідчать про задовільну відповідь на добір, для ознаки “ГЗ” такої відповіді не отримано (табл. 3). Порівняння середніх та лімітів підтверджує значне поліпшення селекційних показників популяцій С1 за ознаками “ВР” і “ІП”. Зсув за маркерним добором (R) для ознаки “ВР” складає 12,1 см, при цьому генетичний ефект добору наближається до 10 %. Отже, можна вважати, що для ознаки “висота рослини” марковано досить впливові QTLs. Ці ж самі маркери обумовили значно кращий генетичний ефект добору для ознаки “ІП” – 16,1 %.

Треба зазначити, що за традиційним методом селекції (качанорядковий добір) внурішньопопуляційне поліпшення можливе лише на 2,6% за рік.

Для ознаки “ГЗ” зсув за добором (R) не набув достовірного значення, кращий генотип з С1 мав однакове значення з таким у популяції Со (1,5 см). Генетичний ефект добору складає лише 3,9 %. Ці показники свідчать про низьку ефективність даної моделі для підвищення значень ознаки “ГЗ”.

Таблиця 3

Ефективність маркерного добору в популяціях першого циклу С1 порівняно з вихідною Со (модель 1)

Статистичні

показники | Со | С1 | Зсув за добором, R | Генетичний ефект добору, ?G, %

висота рослини (см). ТС: nc030,