НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

ДЬОМІН ЮРІЙ АЛЬБЕРТОВИЧ

УДК 576.31:615.361.013.014.41:617.723-08

МОРФОФУНКЦІОНАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА

КРІОКОНСЕРВОВАНИХ ЕМБРІОНАЛЬНИХ КЛІТИН

ТА ЇХНЄ ВИКОРИСТАННЯ ДЛЯ ЛІКУВАННЯ ХВОРИХ

ІЗ СУДИННОЮ ПАТОЛОГІЄЮ ОРГАНА ЗОРУ

(експериментально-клінічне дослідження)

14.01.35. – Кріомедицина

14.01.18. – Очні хвороби

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук

Харків

2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини Національної Академії наук України.

Науковий консультант:

академік НАН України, доктор медичних наук, професор Грищенко Валентин Іванович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини Національної Академії наук України, директор

Офіційні опоненти:

Провідна установа: доктор медичних наук, професор Хворостов Євген Дмитрович, Харківський національний університет ім.В.М.Каразіна, завідувач кафедри хірургічних захворювань;

доктор медичних наук Караченцев Юрій Іванович, Інститут проблем ендокринних патологій ім. В.Я.Данилевського АМН України, директор;

член-кореспондент НАН України, доктор медичних наук, професор Сергієнко Микола Маркович, Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л.Щупика МОЗ України, завідувач кафедри офтальмології

Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця. Науково-дослідний лабораторний центр.

Захист відбудеться 15.04.2003 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої Вченої ради Д 64.242.01 при Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків, 15, вул. Переяславська, 23)

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту проблем кріобіології и кріомедицини НАН України (61015, м. Харків, 15, вул. Переяславська, 23)

Автореферат розіслано 14.03.2003 р.

Вчений секретар спеціалізованої Вченої ради

доктор медичних наук, професор Гольцев А.М

ВСТУП

Актуальність теми. Інтенсифікація досліджень щодо вивчення анабіозу і впливу холоду на біологічні об'єкти, досягнуті на сьогодні успіхи в низькотемпературному консервуванні різних клітин і тканин, розвиток спеціальної кріогенної техніки, яка забезпечує програму заморожування, а також використання захисних середовищ показали, що низькі температури зберігають цілість клітин, тканин у життєздатному стані (Высеканцев И.П. и др., 2001; Ивченко Н.Ф. и др., 2001; Петренко А.Ю. и др., 2001; Цуцаева А.А., 2001; Юрченко Т.Н. и др., 2001).

Отримані теоретичні й експериментальні дані лягли в основу розробки методів кріоконсервування ембріональних і фетальних тканин, що особливо актуально в останнє десятиліття, оскільки активний розвиток трансплантації ембріональних і фетальних клітин людини і тварин, численні наукові дослідження і підбадьорюючі, часом винятково високі клінічні результати, отримані лікарями багатьох медичних спеціальностей, перетворили клітинну трансплантацію в один з найперспективніших медичних напрямків (Сухих Г.Т., 1998, Грищенко В.И., 2001; Лобынцева Г.С., Вотякова И.А., Климова Е.М., 2001; ).

Однак, слід відзначити, що практичні успіхи у використанні ембріофетальних і плацентарних тканин значною мірою випереджають фундаментальні дослідження з виявлення механізму дії таких трансплантатів.

Успіхи трансплантології багато в чому визначаються досягненнями сучасної кріобіології, що розробляє методи низькотемпературного консервування клітин і тканин. Ступінь ушкодження біологічних об'єктів при їхній підготовці до консервування (виділення, зберігання, транспортування) у значній мірі впливає на результати трансплантації. Для клінічного застосування може бути використаний тільки життєздатний, функціонально повноцінний донорський матеріал. Оцінка життєздатності консервованої тканини дозволяє прогнозувати подальшу долю трансплантата.

Питання про короткострокове гіпотермічне зберігання і тривале низькотемпературне консервування для подальшої трансплантації становить загальнобіологічний інтерес і вимагає різнобічних досліджень.

Вивчення життєздатності деконсервованих клітин на етапах гіпотермічного зберігання важливе з практичних позицій, оскільки дозволяє встановити ті безпечні терміни використання трансплантаційного матеріалу, при яких зберігається достатня життєздатність клітин, необхідна для їхнього повноцінного функціонування.

Наявні дані літератури про вплив низьких температур є суперечливими, а в ряді випадків і прямо протилежними, що можна пояснити тим, що експерименти проводилися на різних біологічних об'єктах – суспензійних клітинах, ізольованих фракціях внутрішньоклітинних органел, виділених зі складу клітин, тканин. Окрім того, істотна варіація швидкостей охолодження, застосування різних добавок до середовища заморожування, а також швидкість відігрівання, що змінюється, неоднаково впливають на аналіз експериментальних даних і зіставлення отриманих результатів.

Застосування ембріональних препаратів і препаратів фетоплацентарного комплексу впливає на рівень глюкози крові, холестерину, ліпідну формулу крові, процеси перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) і стабілізує перебіг патологічного процесу, викликаючи регресію різних патоморфологічних і функціональних змін (Репін В.С., 1997; Новицька А.В., 2001; Смикодуб О.І., 2001).

Таким чином, трансплантація ембріональних клітин може позитивно впливати на клінічний синдром судинних захворювань і стабілізацію основних показників гомеостазу.

Унікальним органом для візуалізації різних системних судинних уражень є очне яблуко. Судинні зміни органа зору об'єктивно характеризують ступінь виразності судинних змін різних органів і організму в цілому.

У сучасній офтальмології провідне місце серед патологій сітківки займають захворювання, обумовлені загальними і місцевими порушеннями кровообігу. До причин, що призводять до гострих і хронічних судинних порушень очного дна, слід віднести артеріальну гіпертензію, атеросклероз і цукровий діабет.

В останні 20 років відбулися істотні зрушення у вивченні і лікуванні атеросклерозу й діабету. Найбільш значною подією стала профілактика атеросклерозу й діабету за допомогою корекції найважливіших факторів ризику, а також створення повного арсеналу гіполіпідемічних цукрознижувальних препаратів для профілактики вторинних ускладнень.

Незважаючи на інтенсивні наукові дослідження, зазначені захворювання мають певну тенденцію до росту. Більше 50% хворих на діабет відзначають зниження зору, обумовлене діабетичною ретинопатією, а пацієнти, які при огляді не скаржаться на погіршення зору, мають зміни на очному дні.

З кожним роком у всьому світі зростає кількість хворих із макулодистрофіями. Це виявляється у збільшенні кількості людей, які страждають на атеросклероз, гіпертонічну хворобу, цукровий діабет. Біохімічні порушення в результаті діабету призводять до ранніх анатомічних і функціональних розладів у кровоносних судинах очей.

Нестримно прогресуючий характер перебігу, тяжкість ураження і недостатня ефективність терапії обумовлюють необхідність пошуку нових методів і препаратів для лікування хворих із судинними захворюваннями очей.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота є фрагментом науково-дослідної теми ІПКіК НАН України 2.2.6.72. “Вплив охолодження на структурно-функціональні показники клітин із різною проліферативною активністю”, а також проблеми 2.28.7.4. в темі 2.2.6.02. “Структурно-метаболічний і функціональний стан клітин фетоплацентарного комплексу після кріоконсервування та гіпотермічного зберігання”.

Обраний напрямок дослідження тісно пов'язаний з планами кафедри офтальмології Харківської медичної академії післядипломної освіти, міської клінічної лікарні № 14 ім. проф. Л.Л.Гіршмана.

Мета і задачі досліджень. Вивчити вплив низьких температур на структурно-функціональні властивості і життєздатність ембріональних клітин, механізми дії кріоконсервованих ембріональних клітинних трансплантатів; динаміку основних метаболічних показників гомеостазу реципієнта після трансплантації кріоконсервованих ембріональних клітин в експерименті, а також при їхньому клінічному використанні для підвищення ефективності лікування судинної патології ока; створити комплексний препарат гемонейрональних ембріональних клітин та охарактеризувати його морфофункціональні властивості.

Задачі дослідження:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

Об’єкт дослідження. Ембріональні клітини, які зберігаються при низьких температурах, для подальшої трансплантації в експерименті та клініці, а також хворі з судинною патологією органа зору.

Предмет дослідження. Механізми дії кріоконсервованих ембріональних клітин, що лежать в основі терапевтичних ефектів, які використовуються для лікування хворих з судинною патологією органа зору.

Методи дослідження. При проведенні досліджень у роботі використовувалися цитологічні, цитохімічні, біохімічні, імунологічні, радіоізотопні, морфологічні, офтальмологічні методи та методи математичного аналізу. Дослідження проводилися в трьох основних напрямках:

-

-

-

Наукова новизна одержаних результатів. На підставі всебічного аналізу дії кріоконсервування та гіпотермічного зберігання на морфофункціональний стан ембріональних клітин різного походження, уперше запропоновано комплексний препарат гемонейрональних ембріональних клітин. Показана його висока стійкість до дії низьких позитивних температур зі зберіганням співвідношення гемопоетичних і нейрональних клітин. Установлено, що після низькотемпературного консервування препарат має високу метаболічну й функціональну активність, а клітини, які його формують, зберігають унікальні властивості ембріональних нейрональних і гемопоетичних одиниць. Показано, що деконсервовані ембріональні клітини зберігають властивості нативних і мають той же комплекс характерних ознак. Після проведеного кріоконсервування і відтавання фенотипічна характеристика клітини не змінюється.

Виконані дослідження з гіпотермічного зберігання ембріональних клітин мозку й печінки ембріона в середовищах різного складу дозволяють віддати перевагу сахарозо-сольовому розчину (ССР), який краще зберігає морфологічну цілісність ембріональних клітин.

Отримано нові дані про зміну метаболічних розладів під дією кріоконсервованих ембріональних клітин. Показано коригуючий вплив ембріональних клітин на вуглеводний, проантиоксидантний і ліпідний статус організму.

Уперше показано вплив ККЕП на стан коагуляційної й фібринолітичної ланок гемостазу, активність лізосомальних ферментів при експериментальному гемофтальмі.

Простежено шляхи міграції кріоконсервованих ембріональних клітин після трансплантації при наявності модельної патології. Уперше науково обґрунтовано патогенетично орієнтоване застосування ККЕП і “Гемонейронала” у лікуванні судинної патології органа зору (проста діабетична ретинопатія, гемофтальм, центральна хоріоретинальна дистрофія), а також уперше застосовано ембріональні клітини в клінічній офтальмологічній практиці й узагальнено результати клінічного застосування.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати поповнюють дані про вплив факторів кріоконсервування і гіпотермічного зберігання на морфофункціональний стан клітинно-тканинних субстратів ембріонального походженння, розширюють і поглиблюють наші пізнання про механізми коригуючої дії створених із них кріоконсервованих біопрепаратів.

Проведені дослідження щодо гіпотермічного зберігання ембріональних клітин печінки й мозку дають підстави рекомендувати сахарозо-сольовий розчин (ССР) для використання у трансплантології й інших галузях медицини як середовище короткострокового (транспортування) і довгострокового гіпотермічного зберігання (4С) ембріональних і фетальних клітин, який до 2-х днів є достатнім для проведення вірусологічного контролю і підготовки до консервування, а також у ситуації, коли використання деконсервованих клітин неможливе безпосередньо після розморожування.

На підставі проведеного експериментального дослідження та клінічної апробації доведено, що ККЕП, а також препарат “Гемонейронал” мають високу життєздатність, зберігаючи основні фенотипічні властивості, і є повноцінним трансплантаційним матеріалом.

Трансплантація ККЕП і “Гемонейронала” дозволяє досягти позитивного результату при лікуванні судинної патології органа зору, значно покращує функціональний стан ока і сприяє поліпшенню медико-соціальної реабілітації хворих. Отже, даний метод лікування і схема його використання рекомендовані для застосування в широку клінічну офтальмологічну практику.

На основі проведених досліджень складені методичні рекомендації “Заготівля, кріоконсервування та клінічне застосування ембріональних та фетальних клітин людини в офтальмологічній практиці”, узгоджені МОЗ України, а також “Препарат Гемонейронал та його застосування для лікування хворих з судинною патологією органа зору”. Основні наукові положення роботи використовуються в курсах лекцій удосконалення лікарів при Харківській медичній академії післядипломної освіти, Київській медичній академії післядипломної освіти ім. Щупіка та Українській медичній стоматологічній академії на циклі спеціалізації лікарів “Актуальні проблеми клітинної трансплантології”.

Результати дослідження можуть бути використані в різних галузях медицини для корекції імунопатологічних станів, поліпшення результатів лікування судинних, дистрофічних, запальних захворювань, крововиливів різної локалізації.

Особистий внесок здобувача. Вибір теми дисертаційного дослідження і методологічна структура роботи належать автору.

Експериментальні дослідження проведені самостійно на базі віварію й лабораторій ІПКіК НАН України при консультаціях професора д.м.н. Т.М.Юрченко, професора д.б.н. О.Ю.Петренка, старшого наукового співробітника к.б.н. О.І.Гончарук, старшого наукового співробітника к.б.н. В.І.Строни, а також проведені в Інституті радіології АМН України ім. С.П.Григор'єва при консультаціях старшого наукового співробітника к.б.н. Н.А.Нікіфорової, старшого наукового співробітника к.б.н. В.З.Гертман.

Імунологічні дослідження проведено на базі лабораторії кафедри загальної та клінічної імунології й алергології Харківського національного університету ім. В.М.Каразіна при консультаціях професора д.м.н. М.М.Попова.

Клініко-діагностичні дослідження та лікування хворих дисертант провів самостійно, на базі Харківської міської офтальмологічної лікарні № 14 ім. професора Л.Л.Гіршмана, кафедри офтальмології Харківської медичної академії післядипломної освіти.

Дисертантом самостійно проведено патентний та інформаційний пошук з використанням Internet, аналіз отриманих результатів, написано всі розділи дисертації, сформульовано висновки.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації повідомлені й обговорені: на засіданнях секції Вченої Ради Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України; на засіданні Харківського наукового товариства офтальмологів; науковій конференції, присвяченій 90-річчю лікарні ім. проф. Л.Л.Гіршмана (Харків, 1998); IV Міжнародній конференції з офтальмології (Київ, 1998); II Українсько-Польській конференції офтальмологів (Трускавець, 1999); Word Congress of Cryobiology. Cryo’99 (Marseille, 1999), VII З'їзді офтальмологів Росії (Москва, 2000); I-й Міжнародній конференції “Сучасні аспекти судинно-ендокринних захворювань органа зору: діагностика, профілактика, засоби лікування” (Київ, 2000); науковій конференції офтальмологів, присвяченій 125-річчю з дня народження В.П.Філатова (Одеса, 2000); II Євроазіатській конференції з офтальмохірургії (Єкатеринбург, 2001); XII Міжнародному офтальмологічному симпозіумі (Одеса-Генуя, 2001); Міжнародному конгресі “Кріо 2001” (Единбург, 2001).

Публікації. Основні положення дисертації викладені в 39 публікаціях, які повною мірою відбивають зміст роботи й отримані автором результати, з яких 25 статей у журналах і збірниках, які відповідають вимогам ВАК України (12 одноособові), отримано 2 деклараційні патенти України на винахід № 32157А від 15 грудня 2000 р. і № 45693А від 15.04.02 р. Бюл. № 4.9, 9 публікацій у матеріалах і тезах конференцій; складені методичні рекомендації (3), узгоджені МОЗ України.

Основні положення дисертаційної роботи ввійшли в наукову працю “Розробка на базі фундаментальних досліджень нових біотехнологій для одержання клітинних і тканинних алотрансплантатів”, відзначену Державною премією України в галузі науки і техніки 2002 року.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 343 сторінках друкованого тексту і включає вступ, огляд літератури, 4 розділи власних досліджень та їх обговорення, аналіз та узагальнення результатів дослідження, заключення, висновки і перелік використаної літератури, який включає 418 джерел. Робота ілюстрована 45 таблицями і 33 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи експериментальних і клінічних досліджень. Гемопоетичні, нейрональні ембріональні клітини і препарат “Гемонейронал” одержували в умовах стерильного боксу при кімнатній температурі за методикою, описаною в методичних рекомендаціях (Грищенко В.І. та ін, 2000).

Для вивчення препаратів використовували цитологічні й цитохімічні методи, в яких міститься інформація про морфологічну характеристику досліджуваних клітин, їхню зрілість, життєздатність та активність. Щоб зберегти і вивчити весь клітинний склад препарату, робили мазки без відмивання клітин. Для оглядового дослідження застосовували фарбування препаратів гематоксиліном й еозином за загальноприйнятою. Для вивчення накопичення глікогену в клітинах ембріональної печінки використовували ШИК-реакцію за методом Ліллі (Лилли Л., 1969). Елементи сполучної тканини в препаратах виявляли методом алохромного фарбування сполучної тканини за методом Ліллі (Лилли Л., 1969). Препарати нервових клітин офарблювали за методом Нісля. Використовували також імпрегнацію нервових клітин за методом Грімеліуса, у результаті якої в цитоплазмі нервових клітин виявляються гранули чорного кольору (Саркисов Д.С., Серов Ю.Л., 1996). Для диференціювання клітин нейротканини використовували методики диференційованого виявлення нейронів і глії за методом Альцгеймера-Нісля в модифікації Саркісова і Петрова кольору (Саркисов Д.С., Серов Ю.Л., 1996). Кількісний вміст у кріоконсервованому й нативному препаратах клітин, які експресують CD34, CD11a, CD11b, CD18, CD62L, визначали методом мембранної імунофлюоресценції, використовуючи відповідної специфічності моноклональні антитіла (Шторх В., Эммрих И., 1987). Активність ферментів енергетичного обміну гексокінази (КФ2.7.1.1), 6-фосфофруктокінази (КФ2.7.1.11), піруваткінази (КФ2.7.1.40), лактатдегідрогенази (КФ1.1.1.27), глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (КФ1.1.1.49), НАДФ-залежної ізоцитратдегідрогенази (КФ1.1.1.42) визначали за допомогою спектрофотометричних методів, в основі яких лежить використання сполучних систем окислювання або відновлення нікотинамідних коферментів (Асатиани В.С., 1969). Зміну активності цитохром С-оксидази визначали за швидкістю окислювання ферментів відновленого цитохрому С в розрахунку на 1 мг білка.

Інтенсивність аеробного та анаеробного гліколізу в клітинах оцінювали за накопиченням у зразках молочної кислоти при культивуванні 107 кл/мл протягом 1 год при 37оС (Асатиани В.С., 1969).

Колонієтвірну здатність клітин ембріонального препарату оцінювали у двошаровій агаровій системі (Бабенко Н.Н., Вотякова И.А., Лобінцева Г.С., 1998). Альфафетапротеіїн визначали методом імуноферментного аналізу з використанням набору фірми “Вектор-Бест”, Новосибірськ, Росія.

Для обґрунтування патогенетичної корекції метаболічних порушень трансплантацією ККЕП обрано дві експериментальні моделі:

1. Модель алоксанового діабету (Карагезян К.Г., 1989).

2. Модель антиоксидант-дефіцитного атеросклерозу (Ат-дефіцитного атеросклерозу) (Воскресенский О.Н., 1981).

Показники перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) – дієнових кон’югатів (ДК) і малонового діальдегіду (МДА) – в еритроцитах і плазмі крові визначали спектрофотометричним методом на СФ-46 (Рифан Н., Варник Г., 1997).

Активність каталази в еритроцитах визначали спектрофотометричним методом (Королюк М.А. и др., 1988).

Активність супероксиддисмутази (СОД) визначали спектрофотометричним методом (Костюк В.А. и др., 1990).

Рівень холестерину і тригліцеридів у сироватці крові визначали ферментативним методом за допомогою стандартних діагностикумів виробництва "DiaSystem Int.", (Німеччина).

Визначення глюкози в крові проводили глюкозооксидазним (уніфікованим) методом (Карпищенко А.И., 1999).

Ефективність застосування препаратів ККЕП і “Гемонейронал” для активізації репаративних процесів визначали за допомогою рогівкового тесту. Найбільш зручна модель для візуалізації розсисання кров'яного згустку - гемофтальм, який часто є проявом судинної патології органа зору (Моисеенко О.М. и др., 2001).

Патоморфологічне вивчення тканин ока після трансплантації ККЕП при експериментальному гемофтальмі на етапах посттрансплантаційного періоду проводилося на 12 кролях (24 ока).

Енуклейовані очі експериментальних тварин фіксували в 10%-ному розчині формаліну.

Для світлової мікроскопії застосовували стандартні методи гістологічної проводки. Парафінові зрізи товщиною 6 мм офарблювали гематоксилін-еозином. Дослідження серійних пофарбованих зрізів проводилося на мікроскопі МБІ-6.

Для визначення фібринолітичної активності крові існуючими методами звичайно встановлюється сумарна фібринолітична активність (СФА), яка включає ферментативний і неферментативний процеси (Кудряшов Б.А., Ляпина Л.А., 1978).

Для розрахунку параметрів коагулограми запис здійснювали на переносному коагулографі Н333 (Мельникова В.В., 1987).

Катепсин Д визначали спектрофотометричним методом (Канцалиев А.Л. и др., 1994).

Визначення активності кислої фосфатази здійснювали спектрофотометричним методом кисло-розчинних продуктів ферментативного гідролізу гемоглобіну. Принцип спектрофотометричного методу заснований на спектрофотометричному визначенні кисло-розчинних продуктів ферментативного гідролізу гемоглобіну.

Для визначення шляху і часу міграції КЕП при трансплантації на моделі експериментального травматичного гемофтальму були проведені дослідження на безпородних статевозрілих кролях-самцях. Клітини з ембріональної печінки одержували після забою вагітних самок терміном 3 тижні вагітності. Виділення і кріоконсервування клітин здійснювали за методом, розробленим в ІПКіК НАН України (Грищенко В.І. та ін., 2000).

Трансплантовані ККЕП ідентифікували в організмі реципієнта введенням у клітинну суспензію міченого попередника синтезу ДНК.

Мічені за тритієм клітини вводили кролям внутрішньовенно і парабульбарно в дозі 1,0 і 0,5 мл відповідно. Забій тварин проводили через 1, 6 і 24 год після введення, вилучали різні органи, з яких робили наважки тканини 50-70 мг. Наважки вміщували в сцинтиляційні флакони з діоксановим сцинтилятором. Радіоактивність проб підраховували на лічильнику “Бекман” в імпульсах у хвилину на 106 клітин або перераховували на 10 мг тканини (Fleock A., Manro H., 1962).

Дослідження імунного гомеостазу хворих із діабетичними ретинопатіями включало: визначення відсоткового й абсолютного вмісту в периферичній крові лімфоцитів, Т-клітин (CD3+) і їх субпопуляцій CD4+- і CD8+-клітин, В-лімфоцитів (CD19+) (Шторх В., Эммрих И., 1987); проліферативної активності Т-лімфоцитів та їхньої бласттрансформуючої здатності під впливом ФГА (Шютт Х., 1987); концентрації в сироватці імуноглобулінів класу А, M, G (Чиркин В.В. и др., 1990); циркулюючих імунних комплексів та їхніх розмірів (Фролов В.М, 1991); фагоцитарної активності клітин та їх киснево залежного метаболізму (Пастер Е.У, 1989), комплементу (Кондрашова Н.И., 1974) активності в лімфоцитах ключових ферментів основних обмінних циклів (Асатиани В.С., 1969); аеробного й анаеробного гліколізу (Мецлер Д, 1980); ступеня сенсибілізації організму антигенами ока в реакції гальмування міграції лейкоцитів (Слепова О.С., 1994) і вмісту в сльозі аутоантитіл до тканин ока (Фримель Х., 1987).

Специфічна імунна реакція на трансплантат була оцінена за показниками: змісту в сироватці крові хворих аглютинінів і цитолізинів (Gores P.A., 1958); цитотоксичної активності Т-лімфоцитів (Зарецкая Ю.М., 1983); зміни вмісту у крові активованих Т- і В-лімфоцитів (CD25+- клітин) (Шторх В., Эммрих И., 1987). Вплив трансплантації ембріональних клітин на процеси імунорегуляції оцінювали за цитокіновим статусом хворих (Серебрянная Н.Б. и др., 1998); про індукцію аутоімунних реакцій і поліклональної активації В- лімфоцитів – за появою в сироватці крові тканинноспецифічних і тканиннонеспецифічних аутоантитіл – антитіл до нативної і денатурованої ДНК, мікросомального антигену і тиреоглобуліну, гетерогемолізинів (Антипская Л.В. и др., 1983), антиглобулінових антитіл.

Під нашим спостереженням знаходилися 284 пацієнти (502 ока) основної та контрольної груп із судинною патологією органа зору, обумовленою цукровим діабетом I типу й атеросклерозом, що були розділені на 3 основні нозологічні групи:

1)

2)

3)

Основним інтегральним показником, який характеризує морфофункціональний стан ока, нами була обрана гострота зору, що перевірялася до початку лікування і через певний час після проведення лікування. У хворих на центральну хоріоретинальну дистрофію і діабет гострота зору після лікування перевірялася через 1, 3, 6 і 12 місяців.

Усім хворим було проведене повне офтальмологічне обстеження, що включало дослідження гостроти зору, поля зору, біомікроскопію, офтальмоскопію очного дна, контактну біомікроскопію, дослідження на сітці Амслера, ентоптоскопію в синьому світлі, дослідження поляризаційних властивостей жовтої плями, електроокулографію, дослідження ультразвуком.

Групи хворих з одним видом захворювання, обстежені після проведення лікування різними способами, були представлені у вигляді дисперсійних комплексів, і за допомогою двофакторного дисперсійного аналізу визначався ступінь впливу наступних факторів:

А – фактор застосування різних способів лікування;

В – фактор часу, що пройшов після проведення лікування;

АВ – фактор сполучення перерахованих факторів.

Окрім того, у хворих із діабетичними ретинопатіями визначали рівень глікемії, показники ліпідограми крові, рівень основних продуктів ПОЛ (ДК і МДА) і активність основних антиоксидантних ферментів (каталази і супероксидисмутази у крові). У хворих із ЦХРД проводили аналогічні дослідження, за винятком контролю за рівнем глікемії.

З метою визначення кореляційного зв'язку між деякими гемодинамічними, біохімічними, імунологічними показниками і гостротою зору в процесі лікування хворих контрольної й дослідної груп з інволюційною ЦХРД і діабетичною ретинопатією було проведено кореляційний аналіз, у результаті якого були визначені коефіцієнти лінійної кореляції (R), їхньої похибки репрезентативності (r) і рівень достовірності випадковості (p) за методом Стьюдента (Плохинский Н.А., 1970).

Результати досліджень та їхній аналіз.

На даний момент накопичено значний матеріал щодо дослідження кріопошкоджень при низькотемпературному впливі в біологічних системах різної складності.

У процесі гіпотермічного зберігання розвиваються компенсаторно-пристосувальні реакції, що підвищують у цілому адаптованість об'єкта до умов навколишнього середовища, які змінилися. Органи і тканини, які знаходяться в гіпотермічних умовах протягом деякого часу, зберігають основні біологічні властивості, що забезпечують їхню здатність приживлення після трансплантації.

Охолодження клітин у зоні гіпотермічних температур супроводжується різким зниженням метаболічної активності, проте дозволяє створити умови для їхньої життєдіяльності і перебігу компенсаторно-пристосувальних реакцій.

У результаті проведених нами експериментальних досліджень установлено, що початкова життєздатність КЕП складала 894% і залишалася без змін при переносі в ССР. При цьому перенос клітин у розчин Хенкса знижував життєздатність на 10-15%. Шестидобове гіпотермічне зберігання не впливало на КЕП у РСР. До 9-ї доби кількість життєздатних клітин зменшувалася і складала 723%, у той же час кількість клітин, що зберігалися в розчині Хенкса, зменшувалася на 60%.

Свіжовиділена суспензія ембріональних нейрональних клітин характеризувалася більш низькою початковою життєздатністю, що практично не знижувалася при переносі в ССР (65%) і реагувала на перенос у розчин Хенкса (41%). У динаміці спостереження відзначалося послідовне зниження показників життєздатності клітин до 433% у ССР і відповідно в розчині Хенкса – 21,2%.

Також нами було проведене тестування виживаності клітин при вивченні лактатдегідрогенази ЛДГ. При гіпотермічному зберіганні як КЕП, так і нейрональних клітин активність ферменту в середовищі збільшувалася. При цьому менш виражене збільшення було в консервуючому середовищі ССР. Окрім того, були отримані цікаві дані про те, що попереднє гіпотермічне зберігання клітин у складі органів (печінка, мозок) приводить до зниження їхньої життєздатності в порівнянні з клітинами, отриманими з органів, що не піддавалися зберіганню. Отже, при гіпотермічному зберіганні клітини у складі тканин ушкоджуються сильніше, ніж окремо взяті, ізольовані. При цьому ушкодження менш виражені в середовищі консервування, яке містить РСР.

Вивчення життєздатності деконсервованих клітин на етапах гіпотермічного зберігання важливе з практичних позицій, оскільки дозволяє встановити ті безпечні терміни використання трансплантаційного матеріалу, при яких зберігається достатня життєздатність клітин. Цікавим у порівняльному аспекті залишається питання про чутливість до позитивних низьких температур свіжовиділених і кріоконсервованих ембріональних клітин. У результаті проведених досліджень установлено, що деконсервовані зразки характеризуються досить високою життєздатністю в першу добу гіпотермічного зберігання, однак уже з 2-ї доби визначаються достовірні розходження в життєздатності в порівнянні зі свіжовиділеними зразками. До 6-ї доби гіпотермічного зберігання в деконсервованих зразках життєздатні клітини практично не визначаються, тоді як у свіжовиділених життєздатність залишається досить високою. Отже, використання деконсервованих клітин ембріональної печінки можливе у перші 2 доби після відігрівання, якщо зразки зберігаються при 4С.

Таким чином, результати вивчення життєздатності на етапах гіпотермічного зберігання (4С) щодо виключення трипанового синього й елімінації в позаклітинне середовище ЛДГ свідчать про більш високу стійкість ембріональних клітин до гіпотермічного зберігання в порівнянні з остаточно диференційованими клітинами (гепатоцитами). Слід зазначити, що нейрональні ембріональні клітини менш стійкі до гіпотермічного зберігання, ізольовані клітини поза складом органів більш стійкі, деконсервовані клітини мають достатню життєздатність у перші 2 доби при їх гіпотермічному зберіганні в ССР. Найбільш оптимальним середовищем для гіпотермічного зберігання ембріональних клітин є ССР.

Терапевтичний ефект застосування будь-якого клітинного матеріалу головним чином визначається клітинним складом і функціональною активністю складових його елементів. Особливо це стосується такого препарату, як “Гемонейронал”, що містить у своєму складі кріоконсервовані клітини печінки і нервові тканини ембріона людини. Нами були вивчені основні морфофункціональні характеристики ембріонального препарату до і після кріоконсервування.

Проведені дослідження показали, що життєздатність клітин ембріонального препарату після кріоконсервування, оцінена методом суправітального фарбування трипановим синім, складає 60,6 0,2 %. Його клітинний склад істотно не відрізнявся від нативного (некріоконсервованого) препарату. Разом з тим, наведені дані свідчать про те, що в кріоконсервованому препараті, у порівнянні з нативним, спостерігається деяке збільшення вмісту лімфоцитів і достовірне зменшення кількості гепатоцитів і чистих ядер. При цьому відсотковий вміст у препараті нейрональних клітин не змінюється.

У мазках, приготовлених із кріоконсервованого препарату і пофарбованих за Романовським – Гімзою, було виявлено 14,7 0,5 % клітин, що мали розриви зовнішньої мембрани і 13,2 0,4 % клітин – ушкодження ядра. 62,1 0,2 % клітин у пофарбованих препаратах мали характерну незмінну морфологію і властиве їм фарбування цитоплазми та ядра.

Враховуючи те, що терапевтичний ефект клітин багато в чому визначається їхніми поверхневими властивостями і, зокрема, молекулами, які забезпечують “хомінг” і контактні взаємодії з клітинами реципієнта, у спеціальних дослідженнях нами була вивчена після кріоконсервування експресія на клітинах селектинів та інтегринів CD11a, CD11b, CD18, CD62L, відповідальних за зазначені вище процеси. Було встановлено, що в нативних зразках ембріонального препарату до консервації 5,2 0,5% клітин експресують молекули CD11a, 4,8 0,5 % клітин – молекули CD11b, 5,6 0,6 % клітин – CD18 і 9,7 1,0 % клітин – СD62L (L-селектини). У кріоконсервованих зразках відсоток клітин, які експресують ці молекули, був аналогічним: кількість CD11a клітин складала 5,3 0,5 , CD11b – 4,8 0,5, CD18 – 5,1 0,5, CD62L – 9,1 1,0 %. Отримані в цих дослідженнях дані дозволяють припустити, що й інші молекули, представлені на клітинах ембріонального препарату, які відповідають за процеси регуляції метаболізму і функціональної активності, також добре зберігаються в процесі кріоконсервування, внаслідок чого клітини трансплантату залишаються здатними як впливати на інші клітини, так і відгукуватися на подібні стимули з боку клітин реципієнта.

Вивчення активності ферментів енергетичного обміну, інтенсивності аеробного й анаеробного гліколізу, які інтегрально відбивають метаболізм клітин, показало, що після кріоконсервування в клітинах відбувається зниження активності регуляторних ферментів гліколізу, дегідрогеназ пентозофосфатного шляху і циклу трикарбонових кислот, а також мітохондріальної цитохром-с-оксидази. Окрім цього, у клітинах після кріоконсервування нами було виявлено достовірне зниження інтенсивності аеробного й анаеробного гліколізу. Після інкубації клітин при 37о С в атмосфері 5%-го СО2 протягом 6 год. у культуральному середовищі спостерігається деяке підвищення активності ввсіх вивчених ферментів, а так само процесів гліколізу.

Отримані дані свідчать про те, що зниження метаболізму клітин після кріоконсервування, транзиторним; це дозволяє припустити, що після реабілітації клітин або введення в організм, де вони попадають у фізіологічні умови, можливе повне відновлення їх вихідної метаболічної активності.

Функціональна активність кріоконсервованого ембріонального препарату була оцінена in vitro, за здатністю клітин у напіврідкому агарі формувати гемопоетичні колонії і кластери. Було встановлено, що кріоконсервовані ембріональні клітини комбінованого препарату формують 47,5 5,1 кластери і 33,9 3,8 колоній на 105 клітин. Нативні клітини комбінованого ембріонального препарату формують 58,1 6,1 кластери і 44,3 4,7 колоній на 105 клітин. (Варто зазначити, що комбінований препарат складається з гемопоетичних ембріональних клітин печінки і нейрональних клітин). При цьому було виявлено, що роздільне культивування кріоконсервованих гемопоетичних клітин призводить до утворення 38,9 4,1 кластери і 27,7 3,2 колоній на 105 клітин, нативних гемопоетичних клітин – 49,4 5,2 кластерів, 36,8 3,8 колоній на 105 клітин.

Таким чином, комбінований ембріональний гемонейрональний препарат після кріоконсервування має високу метаболічну й функціональну активність, а клітини, які його формують, зберігають унікальні властивості ембріональних нейрональних і гемопоетичних одиниць.

Презентація специфічних антигенів багато в чому визначає подальшу долю гемопоетичних клітин ембріонів людини. Будучи рецепторами, локалізованими на зовнішній поверхні плазматичної мембрани, і пов'язані з нею в значній мірі слабкими електростатичними зв'язками, антигени можуть бути дуже чуттєвими до факторів кріоконсервування, якщо змінюються механічні параметри клітин, осмотичні властивості середовища і концентрація електролітів біля поверхні мембрани. Можлива втрата деяких антигенів у процесі кріоконсервування.

Проведені нами дослідження свідчать, що кріоконсервування не впливало на відсоток клітин, які презентують досліджені антигени. Це говорить про їхню кріостійкість, а також про те, що специфічні моноклональні антитіла з однаковою ефективністю зв'язуються як з нативними, так і кріоконсервованими клітинами. Наступне відмивання клітин від середовища не викликало зниження відсотку клітин, які несуть антиген. Отже, навіть клітини з ушкодженою в процесі кріоконсервування плазматичною мембраною зберігають антиген-зв’язувальні сайти.

Накопичений досвід із консервування і трансплантації свідчить про те, що трансплантат здатний виконувати свою функцію, незважаючи на ряд метаболічних зрушень, які виникають при його підготовці до трансплантації в процесі заготівлі і консервування. Останній етап перед трансплантацією також може виявитися згубним для клітин. Тому нами досліджена життєздатність КЕП в різних середовищах для подальшої трансплантації реципієнту. Загальноприйнятою схемою введення КЕП є внутрішньовенне введення у фізрозчині, однак, при перенесенні деконсервованих клітин з гіпертонічного розчину, що містить кріопротектор, у ізотонічний розчин хлориду натрію можливий осмотичний шок клітин із наступною їхньою загибеллю. З обраних нами середовищ еквілібрації (фізіологічний розчин, розчин Хенкса, сироватка крові) найоптимальнішою виявилася сироватка крові, яка дозволяє зберегти життєздатність 75% клітин.

Необоротні ушкодження клітин можуть формуватися не тільки на попередніх підготовчих етапах, але й після трансплантації. Це обумовлено новими відношеннями між тканинами донора і реципієнта. З викладеного стає ясно, що етап трансплантації є обов'язковим при оцінці ефективності методу консервації і, окрім того, він дозволяє вивчити механізми терапевтичної дії кріоконсервованих ембріональних клітин, їхню взаємодію з організмом реципієнта.

Клітини ембріональної печінки можуть бути використані для лікування цілого ряду різноманітних захворювань. Цьому сприяє гетерогенність препарату, у якому представлені попередники паренхіматозних клітин печінки і кровотворних клітин різного ступеня комітованості.

Унікальною особливістю клітин є їхня здатність продукувати різні біологічно активні речовини, які ініціюють регенерацію ушкоджених тканин. Отримані нами результати свідчать про позитивний вплив трансплантації ембріональних біопрепаратів на процеси репаративної регенерації в ушкодженій рогівці. Як видно, ембріональні клітини привносять ембріоспецифічні ростові фактори – цитокіни й інші сигнальні молекули, які активують стовбурові лімбальні епітеліальні клітини, стимулюють регенерацію у реципієнта. З іншого боку, спрямоване диференціювання стовбурових клітин донора відповідно до мікродистантного оточення реципієнта дозволяє інтенсифікувати процеси відновлення рогівкового епітелію, ініціювати регенерацію ушкоджених клітин і тканин, нормалізувати клітинний і тканинний гомеостаз.

Для обґрунтування патогенетичної корекції метаболічних порушень трансплантацією ККЕП нами обрані експериментальні моделі алоксанового діабету й антиоксидантно-дефіцитного атеросклерозу.

Використання трансплантації ККЕП щурам з алоксановим діабетом істотно знижувало виразність глікемії і нормалізувало процеси пероксидації з відновленням фізіологічної рівноваги між ступенем активності вільнорадикальних процесів та адекватною стимуляцією антиоксидантних механізмів. Очевидно, останнє пов'язане з відновленням енергозберігання клітин глюкозою і зменшенням ступеня гіпоксії. На моделі алоксанового діабету спостерігаються різкі порушення вуглеводного обміну, які супроводжуються глибокими змінами в стані прооксидантно-антиоксидантної системи й ліпідного статусу, а використання одноразової трансплантації ККЕП призводило до істотної корекції патологічних зрушень, що спостерігаються в організмі щурів.

Це виражалося, насамперед, у нормалізації прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу з відновленням активності ендогенних антиоксидантних ферментативних механізмів. Результатом ліквідації синдрому пероксидації виявилася також і нормалізація ліпідного статусу. Трансплантація ККЕП не тільки ліквідувала гіперхолестеринемію і гіпертригліцеридемію до кінця періоду спостережень, але й активувала антиатерогенний механізм захисту, тобто зворотний транспорт холестерину за рахунок підвищення рівня фракції ЛПВП, що виносить надлишки холестерину з тканин. Нормалізація ліпідного статусу тварин з експериментальним атеросклерозом та після уведення ККЕП показує, що даний метод метаболічної корекції ефективний також при розвитку “первинних” гіпер- і дизліпідемій пролонгованого характеру, викликаних аліментарними факторами.

У цілому проведені експериментальні дослідження демонструють високу ефективність впливу ККЕП на метаболічні розлади. На моделях експериментального алоксанового діабету й експериментального Ат-дефіцитного атеросклерозу було показано стимулюючий вплив трансплантації ККЕП на нормалізацію вуглеводного, про-, антиоксидантного і ліпідного статусів організму. Особливо важливою є гіполіпідемічна дія ККЕП, показана нами на експериментальних гіпер- і дисліпідеміях різного генезу, що робить застосування даного методу лікування патогенетично виправданим при різних захворюваннях, які супроводжуються мікро- і макроангіопатіями.

Також нами вперше показано виражений вплив трансплантації ККЕП на стан коагуляційної та фібринолітичної ланок гемостазу.

При лікуванні гемофтальму трансплантація ККЕП є у певному значенні “замісною” терапією, тому що містить велику кількість клітин з усім апаратом антикоагулянтних факторів різної природи як ферментативних, так і неферментативних. Превалює в даному випадку, мабуть, ферментативна ланка, як показують наші дані про більш виражену активацію ферментативної ланки фібринолітичної активності у тварин після трансплантації ККЕП. Застосування препарату ККЕП не тільки прискорювало розсисання очного крововиливу в піддослідних тварин, але й сприяло повному зникненню фібринових волокон в ураженій ділянці.

Таким чином, можна зробити висновок, що трансплантація ККЕП викликає відновлення та необхідний ступінь активації системного фібринолізу у тварин з експериментальним гемофтальмом, що сприяє активному і повному розсисанню травматичного крововиливу і може бути використане для спрямованого лікування очних крововиливів різної етіології.

Успішне розсисання крововиливу обумовлено злагодженою дією гідролітичних, у тому числі протеолітичних ферментів.

Трансплантація ККЕП викликала різке підвищення активності лізосомальних гідролітичних ферментів у тканинах травмованого ока в порівнянні з показниками тварин, яких не лікували. Системна реакція у склоподібному тілі тварин, яких лікували, носила стабільний характер. В міру розсисання крововиливу у цих тварин, активність катепсину Д у склоподібному тілі знижувалася, а в судинній оболонці – підвищувалася, що свідчило про активне видалення протеолітичних ферментів у загальне кровоносне русло з їхньою наступною елімінацією.

Безумовним, об'єктивним доказом ефективності терапії, що проводиться, є патоморфологічне дослідження органів, клітин і тканин. Гістологічне дослідження показало, що після експериментального гемофтальму у склоподібному тілі відбуваються процеси резорбції кров'яного згустку, що характеризуються однаковими морфологічними проявами як у контрольній, так і в групі тварин після трансплантації ККЕП. Однак резорбція відбувається швидше після трансплантації КЕП.

Розсисання крововиливу відбувається за рахунок захисно компенсаторних реакцій організму, проте внутрішніх резервів не вистачає для лізису крововиливу. Тому доцільним є застосування клітинної трансплантації. Можливо, з одного боку, біологічно активні речовини, які