НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут клітинної біології та генетичної інженерії

ГОЛОВКО Андрій Ерастович

УДК 633.416 : 581.143.6 : 577.21

ЦУКРОВИЙ БУРЯК (Beta vulgaris L.) В КУЛЬТУРІ IN VITRO: РЕГЕНЕРАЦІЯ, МОРФОГЕНЕЗ І ГЕНЕТИЧНА ТРАНСФОРМАЦІЯ

03.00.20 – біотехнологія

Авторефератдисертації на здобуття вченого ступеня
кандидата біологічних наук

Київ – 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана
в Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України (м. Київ).

Науковий керівник: доктор біологічних наук
професор, академік НАН України
Глеба Юрій Юрійович,
Інститут клітинної біології
та генетичної інженерії НАН України,
директор

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук
професор, чл.-кор. НАН України
Кунах Віктор Анатолійович,
Інститут молекулярної біології
та генетики НАН України,
завідувач відділу генетики
клітинних популяцій

доктор біологічних наук
Ларченко Катерина Андріївна,
Інститут фізіології рослин
і генетики НАН України,
провідний науковий співробітник
відділу експериментального мутагенезу

Провідна установа: Київський національний університет
імені Тараса Шевченка

Захист відбудеться “  25     вересня         2003 року о   12    годині
на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.202.01
при Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
за адресою 03143 Київ-143, вул. Акад. Заболотного, 148

З дисертацією можна ознайомитися
в бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
за адресою: 03143 Київ-143, вул. Акад. Заболотного, 148

Автореферат розісланий “15 cерпня 2003 року

Вчений секретар
Спеціалізованої вченої ради, к.б.н. О.А.Кравець

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Цукровий буряк (Beta vulgaris L.), дворічна рослина, є однією з найбільш важливих технічних культур. Близько 35-40% всесвітнього цу-крового виробництва здійснюється з цукрового буряка (Winner, 1993). Площа по-сівів цукрового буряка в Україні складає приблизно 1 млн га з середньою уро-жайністю коренеплодів 3 т/га. Незважаючи на величезну промислову цін-ність ро-слини, особливо в північній півкулі, і досить тривалий період її дослі-джень, все ще дуже важко створювати рослини цукрового буряка, що мають нові, важливі в сільськогосподарському відношенні властивості, та-кі як: стійкість до гербіцидів, пестицидів і хвороб, підвищений вміст цукру в коренеплодах, цитоплазматична чоловіча стерильність тощо. Створення нових сортів цукрового буряка з цінними властивостями є трудомістким процесом з величезними витратами часу, здійсню-ваним методами традиційної селекції і класичної генетики. Оскільки цукровий буряк – перехреснозапильна, гетеро-зиготна і дворічна рослина, то використову-ючи методи класичної генетики, необхідно здійснити до 8 зворотних схрещувань, щоб одержати рослини з поліпшеними властивостями. У такий спосіб розробка діючих схем мікро-клонування рослин у культурі in vitro та регенерації, які для цукрового буряка вивчалися протягом майже 30 років, разом з ефективними ме-тодами трансформації дозволили б одержати сорти з новими властивостями.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисерта-ційна робота виконувалася в рамках бюджетних тем відділу цитофізіології і клі-тинної інженерії Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАНУ “Дослі-дження молекулярно-генетичних процесів у реконструйованих клітинних систе-мах і трансгенних рослинах” і “Вивчення молекулярно-біологічних процесів у трансгенних і трансгеномних клітинних лініях і рослинах”. Дослідження також проводилися в рамках наукових проектів пріоритетного напрям-ку 01.11.00 “Біо-технологія”, у рамках Державної науково-технічної програми 02.12 “Перспективи біотехнології” Міністерства України в справах науки і технологій, проекту Про-грами підтримки наукових досліджень у країнах колиш-нього СРСР Міжнарод-ного наукового фонду (ISF) і відповідно до тематичних планів відділу.

Мета і завдання роботи. Метою роботи була розробка ефективної системи регенерації і методів трансформації цукрового буряка за допомогою агробактерії і бомбардування мікрочастинками золота з нанесеною на них ДНК, одержання клітинних ліній і трансгенних рослин та їх молекулярно-біологічний аналіз.

Поставлена мета досягалася при послідовному вирішенні таких завдань:

1.

2.

3.

4.

5.

Об’єкт дослідження – індукція калюсогенезу, регенерація і генетична трансформація цукрового буряка (Beta vulgaris L.).

Предмет дослідження – отримання та молекулярно-біологічний аналіз трансгенних клітинних ліній цукрового буряка.

Методи дослідження – методи генетичної трансформації за допомогою Agrobacterium tumefaciens, методи соматичного ембріогенезу та бомбардування мікрочастинками золота; методика гістологічного аналізу процесів регенерації, методи аналізу трансгенності отриманих трансформантів (виділення сумарної ро-слинної ДНК, полімеразно-ланцюгова реакція, саузерн-блотинг гібридизація, тест на активність в-глюкуронідази /GUS/, імуноферментне визначення активності гена NPTII).

Основні положення, які виносяться на захист:

1.

2.

3.

4.

5.

Наукова новизна отриманих результатів.

· У процесі визначення підходів до трансформації цукрового буряка вивчено реге-нераційну здатність різних тканин Beta vulgaris. Вперше уніфіковано сис-теми індукції калюсу і регенерації цукрового буряка з різних експлантів і ка-люсу, підібрано оптимальний склад середовищ для одержання великої кілько-сті регенерантів, проведено гістологічний аналіз регенерації.

· Вперше отримано і вивчено регенерацію з калюсу шляхом соматичного ембріо-генезу. При цьому отримані вторинні ембріоїди буряка й оптимізовані умови підтримки їх в культурі in vitro без втрати регенераційної активності і здатності до коренеутворення у рослин, отриманих в результаті регенерації.

· Проведено підбір умов трансформації й отримано транзієнтну експресію гена GUS у клітинах калюсу в результаті трансформації за допомогою гармати і стабі-льну експресію GUS у листках при використанні Agrobacterium tumefaciens.

· Вперше отримані трансгенні калюсні лінії буряка зі зміненим біосинтезом вугле-водів. Вперше отримані трансгенні калюсні лінії буряка, протрансфор-мо-вані генами, що відповідають за зміну біосинтезу вуглеводів. Вперше отримані рослини цукрового буряка, стійкі до PURSUIT. Відібрано три лінії цукрового буряка (Beta vulgaris L.), що показали позитивний сигнал при аналізі PCR і гібридизації за Саузерном.

Практичне значення отриманих результатів. Розроблені методи генетичної трансформації з використанням Agrobacterium tumefaciens і бомбардування мікрочастинками золота дозволяють одержувати трансгенні рослини цукрового буряка з цінними сільськогосподарськими ознаками.

Розроблені методи соматичного ембріогенезу й органогенезу цукрового буряка in vitro можуть бути використані для масового розмноження рослин буряка цінних генотипів. Використання методу соматичного ембріогенезу є особливо цінним у тих випадках, коли важко одержати насіння важливих генотипів. Методи мікроклонального розмноження дозволяють, незважаючи на кліматичні умови, розмножити унікальний селекційний матеріал, підвищити коефіцієнт розмноження та збагатити генофонд цукрового буряка.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто проведені експерименти по генетичній трансформації буряка з використанням Agrobacterium tumefaciens і бомбардування мікрочастинками золота, оптимізації умов одержання і культивування соматичних ембріоїдів і регенерації рослин, а також молекулярно-біологічний аналіз рослин, цитологічний аналіз і деякі експерименти з генетичної трансформації проведені разом із співавторами публікацій. Аналіз трансгенності трансформантів був проведений в компанії “Америкен Ціанамід” (м. Принстон, США).

Апробація роботи. Результати роботи було представлено на II Російському симпозіумі "Новые методы биотехнологии растений" (1993, Пущино, Росія), на IV Європейському конгресі з клітинної біології (26 червня – 1 липня 1994, Прага, Чехія), на ІХ Міжнародному конгресі з культури рослинних клітин та тканин, біотехнології рослин і біології in vitro в 21 сторіччі (червень 1998 р., Ізраїль, Єрусалим), Міжнародній конференції Американського агрономічного товариства (листопад 2000 р., Мінесота, США), а також на численних семінарах Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, та відділу біотехнології компанії “Америкен Ціанамід”, США.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 8 наукових праць, із них 4 статті у провідних фахових виданнях та отримано 1 патент на винахід.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, чотирьох розділів (огляд літератури, матеріали та методи досліджень, 2_х експери-ментальних розділів), висновків і списку використаних джерел. Текст дисертації викладено на 191 сторінці комп’ютерного друку, ілюстровано 22таблицями і 18рисунками. Список використаних джерел включає 355найменувань.

Матеріали ТА методи досліджень

Рослинний матеріал. У роботі використовувалося насіння цукрового буряка 14 сортів вітчизняної і закордонної селекції, люб'язно надані Інститутом цукрових буряків УААН (Україна) – Льговський однонасінний-52, Уладовський ЧС-5, Міжотненський гібрид-18, Рамонський однонасінний-47 і Рамонський ЧС-54; Institut fur Genbiologische Forschung (Німеччина) – KWS, VRB і 3915 та Crystal & Maribo Beet Seeds, Inc. (США) – ACH199, ACH31 і ACH203.

Бактерії і вектори. Найчастіше здійснювали трансформацію, використо-вуючи плазмідні конструкції, створені на базі широко використовуваного вектора pBin19: 1) pCB004, котра несе кодуючу послідовність арабідопсисного гена синтази ацетогідроксикислоти (AHAS) з мутацією в положенні 653 (Ser653Asn) під нативним промотором і термінується нативним поліаденілуючим сигналом; 2) pCB001, похідну від комерційного вектора pBI101 (Jefferson, 1987) з кодуючою послідовністю гена в-глюкуронідази (GUS) під промотором CaMV35S з вбудованим інтроном рослини (з метою виключити бактеріальну GUS активність), що термінується поліаденілуючим сигналом нопалинсинтази (NOS), а також химерним NPTII геном. Також використовували конструкції з генами для зміни біосинтезу вуглеводів, контрольовані тканиноспецифічним промотором, що експресується в коренях і коренеплодах, люб’язно надані Лотаром Вилмитцером, Німеччина.

Використовуючи метод прямої бактеріальної трансформації, агро-бактеріальні вектори були протрансформовані в Agrobacterium tumefaciens, штами LBA 4404 чи EHA101, що несуть інактивовану Ti-плазміду pMP90.

Середовища. Як базове середовище для культивування рослин і експлантів цукрового буряка використовували середовище Мурашиге-Скуга (Murashige, Scoog, 1962), скорочено MS. Для різних цілей були підібрані модифікації цього середовища. Базове середовище для швидкого розмноження вторинних ембріоїдів складалося з мінеральних солей (MS) з додаванням наступних складових: міоінозитол 100 мг/л, нікотинова кислота ,5 мг/л, піроксидин-HCl ,5 мг/л, тіамін-HCl 1 мг/л. Базове середовище для проростання ембріоїдів складалося з мінеральних солей (MS) плюс наступні компоненти: сахароза 3%, міоінозитол 100 мг/л, нікотинова кислота 0,5 мг/л, піроксидин-HCl 0,5 мг/л, тіамін-HCl 1 мг/л і агар Difco 0,8 % (в/о).

Стерилізація, проростання насіння і умови культивування рослин. Оп-тимізація процесу стерилізації насіння була проведена за відомою схемою (Банникова, 1995). Пророщення здійснювалося в чашках Петрі на агаризованому середовищі MS20. По досягненні рослинами розмірів близько 5 см обрізали корені, гіпокотиль і сім’ядолі, пагони пересаджували на середовище MSsh. Субкультивування здійснювали відсадженням одиничних бруньок (як правило, листків, що утворювалися в пазухах чи на базальній тканині), чи пагонів на свіже середовище. Частина рослин підтримувалася в укоріненому вигляді на середовищі MS, щоб постійно мати достатню кількість рослинного матеріалу. Рослини культивували при температурі 24?C і 16 годинному світловому періоді.

Методи культури тканин

Щільний калюс індукували з різних експлантів (як правило, сім’ядоль і черешків) після їх 2-3-тижневого культивування при розсіяному освітленні на середовищі MSCF. Утворення пухкого калюсу відбувалося в результаті переносу як цілих пагонів, так і окремих черешків листкових пластинок із середовищ MSRP і MSsh на середовище MS.

При культивуванні пухкого калюсу на регенераційному середовищі (MSRP) в умовах інтенсивного освітлення відбувалася його диференціація (утворення твердої зеленої тканини, іноді окремих пагонів) у 2-3-тижневий термін; в основному ж для регенерації з калюсу використовувалося середовище MSCR.

Регенерацію з різних експлантів здійснювали на середовищі MSRP відповідно до описаної методики (Банникова, 1995).

Укорінення пагонів здійснювали на середовищі MSRI. Формування коренів також спостерігалося при переносі пагонів зі збагачених гормонами середовищ (MSsh, MSRP) на безгормональне MS.

Трансформація цукрового буряка
за допомогою Agrobacterium tumefaciens

Базову методику трансформації рослин, застосовану у роботі, описано раніше (Головко, 2002), проте в подальшій роботі вона зазнавала різноманітних змін.

Трансформація рослин методом бомбардування
мікрочастинками золота з преципітованою ДНК

Біолістичний метод використовували для ядерної трансформації калюсу цукрового буряка, що регенерує. Принцип роботи пристрою PDS-1000/HE Biolistic ® Particle Delivery System, так само як і базова методика трансформації рослин цим пристроєм, описані в літературі (Castillo, 1994; Hartman, 1994). У процесі роботи параметри варіювали.

Гістологічний аналіз

Для гістологічних досліджень матеріал фіксували хpомацетофоpмолом (10:4:1) за С.Г.Навашиним (1951), подальшу обробку проводили за відомою цитологічною методикою (Паушева, 1970). Препарати фарбували реактивом Шиффа за Фельгеном з дофарбуванням світлим зеленим.

Методи аналізу ДНК

ДНК цукрового буряка була ізольована за допомогою набору “Dneasy” для одержання рослинної ДНК (Qiagen, Hilden, Нiмеччина). Виділена в такий спосіб ДНК використовувалася для PCR і гібридизації за Саузерном.

PCR (ланцюгова реакція полімеризації) була виконана з використанням апарата HYBAID PCR Тhermocycler з підігрівом кришки (Hybaid Ltd., Ashford, Великобританія), реактивів набору для PCR з Taq ДНК полімеразою (Qiagen, Hilden, Нiмеччина) і умов реакції рекомендованих фірмою-виробником реактивів.

Гібридизація за Саузерном здійснювалася відповідно до методики, описаної Sambrook (1989). Плазміда pCB004, що несе мутантний ген AHAS, використовувалася як матриця для одержання б 2 P-dCTP-???????? зонда за допомогою PCR, використовуючи праймери 4F і 4R. Для фрагментації рослинної ДНК використовувався фермент рестрикції BamHI. Оскільки цей фермент розрізає кодуючу послідовність мутантного гена AHAS у двох сайтах, а зонд обраний таким чином, що він гібридизується з внутрішнім фрагментом такої рестрикції, трансгенна ДНК повинна показувати сигнал, що відповідає приблизно 800 п.о.

Визначення активності GUS гена

Постановка реакції здійснювалася відповідно до запропонованої методики (Jefferson, 1987). Для гістохімічного аналізу експресії гена GUS також засто-совувався метод, що дозволяє пригнічувати дію фенолоксидаз (Krens, 1996).

Визначення активності NPTII гена

Імуноферментне визначення активності гена NPTII проводили відповідно до методу, запропонованого Нейджелом та ін. (Nagel et al, 1992). Для аналізу використовували стандартний набір для детектування і кількісного визначення NPTII фірми 5 Prime – 3 Prime, Inc.

Результати досліджень та їх обговорення

Вивчення процесів калюсоутворення і ембріогенезу
з експлантів цукрового буряка

Численні літературні дані вказують на здатність цукрового буряка до калюсоутворення з різних експлантів: гіпокотиля (Jacq, 1992), сім’ядоль /котиледонів/ (Catlin, 1990), черешків (Jacq, 1992), листків (Ritchie, 1989). У своїх експериментах ми спробували використовувати запропоновані в літературі методи, адаптуючи їх у міру необхідності до використовуваних сортів. Культивування різних експлантів на середовищі MSCF, що містить 2,4_Д, як і вказувалося в літературі, приводило до утворення щільного калюсу жовтого чи світло-зеленого кольорів. Однак цей калюс виявився нездатним до регенерації рослин.

Крім процесу спонтанного органогенезу з калюсу, відзначеного у деяких лініях Міжотненського гібрида-18 (сорту Рамонський однонасінний-47 – в одиничних випадках), був також підібраний гормональний склад, що дозволяє цілеспрямовано індукувати цей процес для калюсів Міжотненського гібрида-18, сорту Рамонський однонасінний-47 і одержати регенерацію з калюсних ліній сорту Уладовський ЧС-5.

Особлива увага була приділена одержанню калюсу, здатного до ембріо-генезу. Як виявилося, це явище ще більш сортоспецифічне, оскільки тільки для одного сорту, ACH199, у результаті використання відзначеної вище субкультива-ційної зміни середовищ, нам удалося одержати калюс, що спонтанно утворює білу диференційовану тканину, і показати її ембріоїдний характер (рис. 1, А).

Рис. 1. Вторинні ембріоїди цукрового буряка і регенерація з них:

А - білий ембріоїд, що росте в пухкому калюсі;

Б - білі ембріогенні тканини, що з'являються як включення в меристеми ембріоїда, що проростає;

В - суспензійна культура вторинних ембріоїдів;

Г - регенерація з ембріоїда.

Частота ембріогенезу була невисокою: сім окремих ембріоїдів були знайдені в двох з 40 незалежних ліній калюсу. Через 1-2 тижні після переносу ембріоїдів на свіже середовище, можна було спостерігати утворення пагонів з цих тканин. Деякі з цих пагонів зберегли білі ембріогенні тканини, що проявилися як вклю-чення в меристему (рис. 1, Б). Ці білі включення були відділені вручну і помі-щені в рідке середовище, що містило невеликі кількості БАП. Білі ембріогенні тканини продовжували рости і через два тижні нові білосніжні конгломерати сформувалися на поверхні старих тканин (рис. 1, В). Була проведена оптимізація умов культивування цих тканин, в результаті якої середовище MS6B, що склада-ється з базового середовища MS для підтримки ембріоїдів (”Матеріали та методи досліджень”), сахарози 6%, БАП 0,1 мг/л і гліцину 2 мг/л, виявилося найбільш відповідним для підтримки вторинних ембріоїдів у суспензії. Підтримуючи культуру ембріогенного калюсу, можна одержати постійну високоефективну (з частотою 15-20%) регенерацію.

Щоб підібрати найбільш оптимальне середовище для проростання ембріоїдів, були перевірені середовища з декількома концентраціями БАП і ТДЗ. Останній в концентрації 0,1 мг/л був найбільш ефективний для формування адвентивних пагонів (рис. 1, Г).

Таким чином, розроблена нами система калюсоутворення і регенерації рослин у цукрового буряка дає можливість застосовувати сучасні методи генетичної інженерії з метою одержання нових високоврожайних і стійких до стресових умов сортів цукрового буряка.

Вивчення процесів органогенезу з експлантів цукрового буряка

Відомо, що певні лінії (генотипи) цукрового буряка мають здатність регене-рувати рослини з окремих черешків з дуже високою частотою (Freytag, 1988). На прояв регенераційної здатності експлантів цукрового буряка крім генотипу істо-тно впливає склад поживних середовищ, концентрація в них регуляторів росту. Узагальнивши літературні дані і врахувавши специфіку сортів, що досліджува-лися, ми зупинилися на наступній схемі регенерації, універсальної для всіх сор-тів, що використовувалися. Експланти (черешки, базальну тканину, гіпокотиль, листкові пластинки) поміщали на середовище MSRP і культивували при інтенси-вному освітленні. Через 2-4 тижні спостерігали утворення пагонів. Основним ти-пом регенерації було утворення бруньок на поверхні експлантів (рис. , А).

Рис. 2. Органогенез з експлантів цукрового буряка:

А - регенерація пагона - pегенеpанта з черешка;

Б - зони меристематичних клітин і горбики.

Процес регенерації спостерігався: 1) з центральної жилки листка, черешка при культивуванні як цілих пагонів, так і окремих експлантів на середовищах, що містять БАП (на середовищах, що містять БАП, донорна рослина повинна пере-нести 2-3 пасажі); 2) з меристематично активних зон основи пагона і базальної тканини при додаванні в культуральні середовища зеатину 2 мг/л і БАП 1-2 мг/л (після культивування пагонів-донорів на безгормональних середовищах); 3) з ко-тиледонів в області примикання листкової пластинки до гіпокотиля на середо-вищі з БАП будь-якої концентрації.

Результати гістологічного аналізу регенерантів показали, що для черешків листків цукрового буряка, культивованих in vitro, характерний органогенез, що веде до утворення бруньок з наступним їх розвитком і утворенням листків.

Гістологічний аналіз регенерації з черешків показав, що органогенез відбува-ється із клітин верхніх епідермальних шарів (рис. , Б), що не зовсім відповідає існуючій в літературі думці, що регенерація відбувається із глибоко розташова-ної, так званої “меристеми, що мовчить” (D'Hаlluіn, 1992). Таким чином, імовірна можливість одержання трансформованих пагонів шляхом прямої регенерації з че-решків у випадку використання різних методів введення ДНК у клітини рослин, за винятком агробактеріальної.

Агробактеріальна трансформація калюсу цукрового буряка

Хоча цукровий буряк досить чутливий до інфекції Agrobacterium (Wang, 1985; Paul, 1987; Krens, 1988), одержання трансформованих регенерантів має зна-чні труднощі. Врахувавши помилки і використовуючи досягнення інших авторів, у своїй роботі ми спробували здійснити трансформацію цукрового буряка. Було випробувано кілька підходів до визначення концентрацій антибіотиків і гербіци-дів, які пригнічують ріст калюсу цукрового буряка. На підставі отриманих даних був зроблений висновок, що оптимальні концентрації PURSUIT для селекції як калюсу, так і рослин знаходяться в межах 0,01_,05 мкМ і залежать від генотипу цукрового буряка та умов культивування; при селекції на канаміцині можна ціл-ком пригнітити ріст нетрансгенних твердих калюсних колоній використовуючи середовища з концентрацією 200 мг/л протягом 2-2,5 місяців; селекція pослин-pегенеpантів на середовищах з канаміцином можлива при концентраціях 200_ мг/л.

Використовуючи описані вище методи одержання пухких і твердих калюсів, було проведено понад 100 дослідів з одержання трансгенних клітинних ліній за допомогою Agrobacterium tumefaciens і регенерації з них. В одному з експеримен-тів, в результаті обробки експлантів Agrobacterium tumefaciens, що несе pCB001, удалося одержати одну трансгенну лінію пухкого калюсу Міжотненського гіб-рида-18, стійку до 150 мг/л канаміцину з позитивною активністю гена GUS.

У дослідах з одержання трансгенних твердих калюсів використовувалися штами агробактерій, що несуть конструкції з геном GUS (pCB001), а також з ге-нами для зміни біосинтезу вуглеводів (рSPS, рINV, рS21 і рPPA) і експланти цук-рового буряка сортів Уладовський ЧС-5 (№5), Рамонський однонасінний-47 (№47) та Міжотненського гібрида-18 (№18). Результати досліду наведено в таблиці 1.

Підсумки роботи з одержання трансгенного твердого калюсу можна підвести в такий спосіб:

1) Частота трансформації склала 4-7%. Позитивний контроль трансфор-мації – колонії, отримані після трансформації агробактерією з pCB001– мають як GUS, так і NPTII позитивні активності. Лінії з іншими конструкціями мали тільки NPTII активність (таблиця 1). GUS активність вони не виявляли, скоріше за все через тканиноспецифічність промотору В33.

2) Більше всього отримано колоній - трансформантів, що несуть ген SPS. Фенотипічно вони виглядають як великі щільні утворення оранжевого, жовто-червоного, темно-зеленого і світло-зеленого кольорів.

3) Колонії, трансформовані pCB001 і рSPS, виявили здатність до коренеутво-рення на середовищах з ауксинами в присутності канаміцину (до 250 мг/л), при цьому корені калюсу, що несе ген SPS, мали жовтий колір і виділяли жовту суб-станцію в середовище; корені pCB001 мали позитивні як GUS, так і NPTII актив-ності, тоді як калюси, що несуть ген SPS, мали тільки NPTII активність.

4) В результаті регенерації з експлантів, що трансформувалися геном SPS, отримано найбільшу кількість життєздатних пагонів на середовищі з Km 100 мг/л, але нетрансформованих, як показав аналіз NPTII.

Таблиця 1

Результати аналізу колекції трансформованих калюсів.

Конструкції | № сорту | Загальна кількість ліній | GUS+лінії | Утворили

корені | GUS + корені | NPTII,

нг/мг білка

pCB001
| 5
47
18 | 49
12
3 | 47
12
– | 3
––3
––24

рSPS * | 5 | 51– | 12– | 7 (калюс)
5 (корені) | рPPA * | 5
18 | 22
7–– | 1
–––4,8 | рS21* | 5 | 5––– | не визначалось | рINV * | 5
18 | 32
1–––––– | не визначалось | * – конструкції несуть GUS ген під тканиноспецифічним B33 промотором.

Агробактеріальна трансформація експлантів цукрового буряка з наступною регенерацією рослин шляхом органогенезу

Беручи до уваги, що принциповою проблемою здійснення трансформації є виділення клітин, здатних як до трансформації, так і до регенерації, нами був проведений власний скринінг здатних до трансформації експлантів різного гене-зису для вітчизняних сортів. В подальшому як основний матеріал були викорис-тані калюсоутворююча диференційована тканина сорту VRB і експланти базаль-ної тканини і черешків сортів №5 і №52, що відповідало наявним методичним вказівкам (D'Hаlluіn, 1992; Lindsey, 1991).

Внаслідок застосування базової методики трансформації цукрового буряка, була проведена велика кількість дослідів з використанням штаму Agrobacterium tumefaciens, що несе pCB001, однак тільки в одному випадку виявлена позитивна активність гена GUS всередині експланту листка одного з численних регенеран-тів. Оптимізація процесу трансформації з використанням цього ж штаму агробак-терії дозволила одержати 18 синіх секторів на трьох рослинах через 4-5 тижнів після співкультивування. Листок однієї з рослин був цілком синій, у той час як у двох інших рослин листки були частково сині. На рис.  видно інтенсивно пофа-рбовані темні сектори листка однієї з таких химерних рослин, що експресують ген GUS. Варто також відзначити, що опуклість сектора, розташованого на пове-рхні експланта, дає можливість припустити, що в цьому місці почала формува-тися брунька.

Рис. . Результати гістохімічного аналізу активності в-глюкуронідази після 4 тижнів культивування регенеруючих тканин сорту VRB, оброблених агробактеріальним штамом, що несе плазміду pCB001, і селекції на середовищі MSRP, що містить неоміцин (100 мг/л).

Загальним підсумком роботи з трансформації буряка за допомогою штаму агробактерії, що несе плазміду з модельним геном GUS з наступною регенера-цією шляхом органогенезу, стало одержання декількох химерних за експресією GUS гена канаміцинстійких ліній для сортів №5 і VRB. Величина частоти селек-ції (0,03-0,1%) виявилася на два порядки нижче від вказаних у літературних дже-релах (D'Hаlluіn, 1992).

Досліди з трансформації цукрового буряка мутантним геном AHAS проводи-лися одночасно з дослідами з трансформації модельним вектором, що містить ген GUS. Таким чином, у ранніх дослідах використовувалася базова методика транс-формації, яка описана в розділі ”Матеріали та методи досліджень”. В по-даль-шому було проведено кілька експериментів з трансформації цукрового буряка агpобактеpією, що несе плазміду pCB004, відібрано велику кількість стійких до гербіциду PURSUIT рослин, однак усі вони виявилися не транс-генними.

У процесі оптимізації методики трансформації застосовувався цілий арсенал методів для підвищення ефективності трансформації і регенерації: вакуумне про-никнення Agrobacterium tumefaciens, мацерація експлантів, збільшення ранової поверхні за допомогою маленьких скляних намистин, використання фідерного шару, використання ацетосирингону; середовища з різною концентрацією гормо-нів, а також різні схеми селекції після співкультивування. В результаті після спі-вкультивування експлантів цукрового буряка сортів VRB і ACH-199 із супервіру-лентним штамом Agrobacterium tumefaciens EHA101, що несе pCB004, були отри-мані 15 регенерантів, що ростуть на середовищі з 50 нМ PURSUIT. Рослини були проаналізовані за допомогою PCR і три рослини (сорт VRB, лінії №5 і №6; сорт ACH-199, лінія №22) дали позитивний сигнал у вигляді смуги 300 п.о. (рис. ). ДНК цих ліній також була проаналізована гібридизацією за Саузерном (рис. ) і одна з ліній (№5) показала позитивний результат.

Рис. 4. PCR аналіз імовірно трансгенних рослин цукрового буряка на предмет інтеграції в їх геном мутантного гена АНАs:
К – контрольна (нетрансгенна) рослина;
+/- – позитивний контроль реакції (використовували плазміду pCB004).

Рис. 5. Аналіз за Саузерном ДНК імовірно трансгенних рослин цукрового буряка на предмет інтеграції в їх геном мутантного гена АНАS:
К – контрольна (нетрансгенна) рослина;
+/- – позитивний контроль реакції (використовували плазміду pCB004).

Всі три лінії, що показали позитивні за PCR і Саузерном результати, були розміщені в середовищі для коренеутворення MSRI і ті, котрі сформували корені, були пересаджені в ґрунт для наступних досліджень і одержання насіння. Щоб одержати насіння, коренеплоди всіх PURSUIT-стійких рослин, що ростуть у ґру-нті, були піддані верналізації при +4°C . Отримане насіння використовувалося в дослідах по обприскуванню PURSUIT (15, 30 і 60 г/га, що відповідає 0,3; 0,5 та 1_кратній дозі, що рекомендується для польових обробок, відповідно), однак па-ростки виявилися не стійкими. Повторний аналіз за Саузерном ДНК рослин лінії №5, отриманих з насіння, не дав позитивного сигналу. Можливо, трансгенні лінії виявилися мозаїчними з низьким відсотком трансгена, що призвело до втрати трансгенних тканин або під час субкультивування рослин, або під час утворення гамет (тобто була відсутня трансмісія трансгена в першому поколінні). Химерні-стю отриманих рослин також можна пояснити і низьку їхню стійкість до гербіци-дів.

Трансформація експлантів цукрового буряка
методом бомбардування мікрочастинками золота

Відомо, що гармата моделі PDS-1000 була успішно застосована для одер-жання транзієнтної експресії при обстрілі клітинної суспензії (Ingersoll, 1996), а також клітин продихів (Hall, 1997) цукрового буряка. В нашій роботі ми викорис-товували інші експланти – сегменти листків і калюс. Після обстрілу експланти поміщали на середовища для регенерації. Через три дні експланти були проаналі-зовані. Для аналізу використовували модифікований метод гістохімічного аналізу GUS активності, що дозволяє пригнічувати дію фенолоксидаз. Модифікований метод дозволив провести аналіз експлантів цукрового буряка. В результаті в двох калюсних колоніях було виявлено зафарбовані зони. На рис.  представлено одну з них (сорт ACH-199). Колом позначений сектор, що зафарбувався в блакитний колір. Фарбування групи клітин характерне для транзієнтної експресії після бом-бардування експлантів мікрочастинками золота.

Рис. 6. Результати гістохімічного аналізу активності глюкуронідази через три дні після бомбардування пухкого калюсу сорту ACH-199 плазмідою pCB002.

Обстрілювання тканин частками з нанесеною плазмідою, що містить ген глюкуронідази, з наступним гістохімічним аналізом проводилося з метою оптимі-зації параметрів трансформації для подальшого використання їх з метою одер-жання стабільних трансформантів. Позитивні результати цих експеримент-тів є практичною базою для використання регенеруючого ембріогеного калюсу для прямої трансформації. Відпрацьовані параметри і методи трансформації з вико-ристанням гармати можуть бути застосовані для практичних цілей одержання ро-слин цукрового буряка зі зміненим метаболізмом – стійких до гербіцидів чи не-сприятливих умов навколишнього середовища.

Висновки

1. Відпрацьовано системи індукції калюсоутворення і регенерації у рослин цукрового буряка (Beta vulgaris L.) з різних експлантів і калюсу, підібрано оптимальний склад середовищ для масового одержання регенерантів.

2. Гістологічним аналізом встановлено, що регенераційні процеси в черешках листків цукрового буряка в культурі in vitro проходять по типу органогенезу.

3. Запропоновано ефективний метод регенерації рослин з калюсу шляхом соматичного ембріогенезу. Вперше отримано вторинні ембріоїди цукрового буряка та оптимізовано умови підтримки їх у культурі in vitro без втрати регенераційної активності і здатності коренеутворення з регенерантів.

4. Розроблено умови і підібрано методи генетичної трансформації буряка за допомогою Agrobacterium tumefaciens і бомбардування мікрочастинками золота з преципітованою ДНК.

5. Вперше отримані трансгенні калюсні лінії буряка зі зміненим біосинтезом вуглеводів.

6. Виявлено стабільну експресію гена GUS у калюсі і листках буряка при використанні A., а також транзієнтну експресію цього гена, внесеного у клітини калюсу шляхом бомбардування експлантів мікрочастинками золота.

7. За допомогою A. в рослини цукрового буряка перенесено ген стійкості до гербіциду PURSUIT. Експресію цього гена виявлено у трьох ліній цукрового буряка на основі позитивного сигналу при аналізі PCR і гібридизації за Саузерном.

Список робіт, опублікованих ЗА темОЮ дисертації

1. Гирич А.М., Череп Н.Н., Скаржинская М.В., Головко А.Э., Глеба Ю.Ю. Генетическая трансформация рапса Brassica napus с помощью Agrobacterium tumefaciens // Цитология и генетика.– 1995.– №2.– С. 20-25.

2. Банникова М.А., Головко А.Э., Хведыныч О. А., Кучук Н.В. Регенерация растений сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) в культуре in vitro. Гистологическое изучение процессов регенерации // Цитология и генетика. – 1995.– №6.– С. 14-22.

3. Golovko A. Genetic variability of somatic embryogenesis in tissue cultures of sugar beet breeding lines // Цитология и генетика.– 2001.– №6.– С. 10-17.

4. Головко А.Э., Погребняк Н.Я., Банникова М.А. Особенности культивирования in vitro и трансформации сахарной свеклы // Физиология и биохимия культурных растений.– 2002.– 34, №5.– С. 394-405.

5. Golovko Andrei. Methods for somatic embryo formation and plant regeneration of Beta vulgaris. Patent US 6,555,375 B1. Int. Cl. C12N 5/00, C12N 5/02. Filled 14.06.2000 (Issued to American Cyanamid by United States Patent and Trademark Office on 29.04.2003).

6. Банникова М.А., Головко А.Э., Кучук Н.В., Глеба Ю.Ю. Разработка методов генетической трансформации у коммерческих сортов сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) // Сборник тезисов II Российского симпозиума "Новые методы биотехнологии растений", 1993.– Пущино, 1993.– С. 11(245).

7. Bannikova M.A., Golovko A.E., Khvedynich O.A., Kuchuk N.V., GlebaIn vitro organogenesis and protoplast cultivation of sugar beet (Beta vulgaris L.) //of IVth European Cell Biology Congress Prague, June 26th – July 1st 1994. – Prague, 1994. – P. 546.

8. Merkulov S.M., Pasternak T.P., Golovko A.E., Gleba Y.Y. Agrobacterium - mediated transformation of pear cultivars (Pyrus communis L.) // Abstracts of IVth European Cell Biology Congress Prague, June 26th – July 1st 1994.– Prague, 1994. – P. .

АнотацІя

Головко А.Е. Цукровий буряк (Beta vulgaris l.) в культурі in vitro: регенерація, морфогенез і генетична трансформація.– Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 – біотехнологія.– Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України. Київ, 2003.

За темою дисертації захищається 8 наукових робіт.

Вивчалися процеси морфогенезу в культурі тканин цукрового буряка (Beta vulgaris L.) in vitro з використанням 14 сортів вітчизняної і закордонної селекції. Відпрацьовано системи індукції калюсу і регенерації цукрового буряка з різних експлантів і калюсу, підібраний оптимальний склад середовищ для одержання ве-ликої кількості регенерантів. Гістологічний аналіз показав що регенераційні про-цеси в черешках листків цукрового буряка в культурі in vitro, проходять за типом органогенезу. Запропоновано ефективний метод регенерації рослин з калюсу шляхом соматичного ембріогенезу. Вперше отримано вторинні ембріоїди буряка і оптимізовано умови підтримки їх у культурі in vitro без втрати регенераційної ак-тивності і здатності коренеутворення у регенерантів. Розроблені методи регене-рації рослин було використано для трансформації цукрового буряка за допомо-гою Agrobacterium tumefaciens і бомбардування мікрочастинками золота. Вперше отримані трансгенні калюсні лінії буряка зі зміненим біосинтезом вуглеводів. Ви-явлено стабільну експресію гена GUS у калюсі і листках при використанні A., а також транзієнтну експресію цього гена, внесеного у клітини ка-люсу в результаті бомбардування мікрочастинками золота. Отримані трансгенні рослини цукрового буряка зі стійкістю до PURSUIT при використанні A.. Відібрано три лінії цукрового буряка (Beta.), що пока-зали позитивний сигнал при аналізі PCR і гібридизації за Саузерном.

Ключові слова: цукровий буряк (Beta vulgaris L.), органогенез, ембріогенез, регенерація, трансформація, Agrobacterium tumefaciens, стійкість до гербіцидів, ген АНАS.

Аннотация

Головко А.Э. Сахарная свекла (Beta vulgaris L.) в культуре in vitro: регенерация, морфогенез и генетическая трансформация.– Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.20 – биотехнология.– Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины. Киев, 2003.

По теме диссертации защищается 8 научных работ.

Диссертация посвящена изучению индукции каллюсогенеза, регенерации и генетической трансформации сахарной свеклы (Beta vulgaris L.). Целью работы была разработка эффективной системы регенерации и методов трансформации сахарной свеклы при помощи агробактерии Agrobacterium tumefaciens и бомбар-дировки микрочастицами золота с преципитированной ДНК, получение клеточ-ных линий и трансгенных растений, а также их молекулярно-биологический ана-лиз.

Изучались процессы морфогенеза в культуре тканей сахарной свеклы in vitro с использованием 14 сортов отечественной и зарубежной селекции. Отработаны системы индукции каллюса, изучены процессы спонтанного и индуцируемого органогенеза сахарной свеклы из различных эксплантов и каллюса, подобран оптимальный состав сред для получения большого количества регенерантов. Гис-тологический анализ показал что регенерационные процессы в черешках листьев сахарной свеклы в культуре in vitro проходят по типу органогенеза, приводящего к образованию почек с последующим их развитием и образованием листьев. По-лучена и изучена регенерация из каллюса путём соматического эмбриогенеза. Впервые получены вторичные эмбриоиды свеклы и оптимизированы условия поддержания их в культуре in vitro без потери регенерационной активности и способности корнеобразования у регенерантов. Поддерживая культуру эмбрио-генного каллюса, оказалось возможным получить постоянную высокоэффектив-ную (c частотой 15-20%) регенерацию растений.

В работе также было опробовано несколько подходов к определению кон-центраций антибиотиков и гербицидов, подавляющих рост каллюса сахарной свеклы, и установлены оптимальные концентрации PURSUIT и канамицина для селекции каллюса и растений. Разработанные методы регенерации растений были использованы для трансформации сахарной свеклы при помощи A. и бомбардировки микрочастицами золота. Предварительно был проведен скри-нинг способных к трансформации эксплантов различного генезиса нескольких сортов и отобраны наиболее оптимальные сорта и ткани. В результате работ по трансформации впервые получены трансгенные каллюсные линии свеклы с изме-нённым биосинтезом углеводов, некоторые из которых обнаpужили способность к коpнеобpазованию на селективных сpедах. При использовании A. tumefaciens отобраны несколько химерных по экспрессии GUS гена канамицинустойчивых растений, и показана стабильная экспрессия трансгена в листьях.

Используя широкий арсенал методов для повышения эффективности транс-формации и регенерации получены трансгенные растения сахарной свеклы с ус-тойчивостью к PURSUIT при использовании A. tumefaciens. Отобраны три линии сахарной свеклы, которые показали положительный сигнал на наличие мутант-ного гена АНАs при анализе PCR и гибридизации по Саузерну. Бомбардирование тканей микрочастицами золота с нанесенной плазмидой, содержащей ген глюку-ронидазы, с последующим гистохимическим анализом позволило получить тран-зиентную экспрессию гена GUS в клетках каллюса. Таким образом, разработан-ные методы соматического эмбриогенеза и органогенеза сахарной свеклы в куль-туре in vitro могут быть использованы в массовом размножении ценных геноти-пов, включая растения сахарной свеклы с измененным метаболизмом, устойчи-вые к гербицидам или неблагоприятным условиям окружающей среды.

Ключевые слова: сахарная свекла (Beta vulgaris L.), органогенез, эмбриогенез, регенерация, трансформация, Agrobacterium tumefaciens, устойчивость к гербицидам, ген АНАs.

Summary

Golovko A.E. Sugar beet (Beta vulgaris L.) in vitro cultivation: regeneration, morphogenesis and genetic transformation.– Manuscript.

Thesis for a Ph D degree (Biology) by speciality 03.00.20 – biotechnology. Institute of Cell Biology and Genetic Engineering, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2003.

The results of 8 scientific publications are defended.

The processes of morphogenesis were investigated in sugar beet tissue culture in vitro using 14 Ukrainian and foreign cultivars. Methods for callus induction were developed; spontaneous and induced regeneration from various explants and callus were studied; the media composition was optimized to maximize the number of regenerants. Histology analysis showed that regeneration from petioles cultivated in vitro occurs through organogenesis which results in bud formation followed by leaf development. Regeneration through