НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

Гальченко Катерина Сергіївна

УДК: 57.043.086.132:591.146

Вплив заморожування і сублімаційного висушування на збереження молозива корів

03.00.19- кріобіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків-2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

Науковий керівник

доктор медичних наук, професор Сандомирський Борис Петрович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини, завідувач відділу експериментальної кріомедицини, м. Харків.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Розанов Леонід Федорович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, провідний науковий співробітник відділу низькотемпературного кріоконсервування, м. Харків.

доктор біологічних наук, професор Перський Євген Єфроїмович, Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, професор кафедри фізіології людини та тварин, м. Харків.

Провідна установа Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького, відділ експериментальних клітинних систем, м. Київ.

Захист відбудеться 20.05.2003 р. о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23)

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23)

Автореферат розісланий 19.04. 2003 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

доктор медичних наук, професор Гольцев А.М.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Погіршення екологічної ситуації, високий рівень забруднення продуктів радіонуклідами, пестицидами, важкими металами та іншими токсичними речовинами викликають необхідність детоксикації і оздоровлення населення. Однією з причин погіршення здоров’я людей є також незбалансоване харчування. При цьому спостерігаються порушення імунного статусу, розвиваються захворювання органів травлення і т.д. Крім того, на Україні важливим фактором, що впливає на здоров’я населення, є наслідки аварії на ЧАЕС. За останні роки значно виросла інвалідність і смертність серед учасників ліквідації аварії. Люди, що проживають на забрудненій радіонуклідами території, мають цілий ряд порушень в організмі таких, як імунологічні, цитогенетичні та ін. (О.Ф. Возіанов, 1996). Поліпшити здоров’я населення можливо за рахунок широкого використання так званих харчових добавок, що містять біологічно активні речовини, які здатні мінімізувати негативний вплив несприятливих факторів оточуючого середовища та стимулювати адаптаційні процеси в організмі людини.

Однією з таких високоефективних харчових добавок може бути молозиво корів. До складу молозива входять імунні фактори, ростові гормони, вітаміни, мінерали, амінокислоти, ферменти та ін. (Г.А. Саидов, 1980; F. Klobasa et al. 1998; R.J. Playford et al., 1999, 2000). Молозиво має антиоксидантні властивості, які пов’язані з тим, що в ньому містяться антиоксиданти та лактоферин (ЛФ) – хелатор заліза (С. Белизи и др., 1999, 2001; B. Lonnerdal et al., 1994, 1995; S.Shimmura et al., 1996, 1998). Зв’язуючи залізо, ЛФ перешкоджає розвитку ланцюгових реакцій перекисного окислення ліпідів (ПОЛ). Активація процесів перекисного окислення є специфічною відповіддю на радіаційне опромінювання організму, а також неспецифічною – при багатьох інших патологічних процесах, включаючи запальні захворювання, цукровий діабет (ЦД), фотопошкодження шкіри (В.И. Грищенко и др., 2002, Б.П. Сандомирский и др., 2002). Молозиво корів може бути ефективним при використанні як в плані загального оздоровлення населення, так і в плані оздоровлення людей, які зазнають вплив хронічного радіоактивного опромінювання. Це можуть бути як люди, що проживають на території, забрудненій радіонуклідами, так і співробітники АЕС та інших промислових об’єктів, пов’язаних з переробкою та зберіганням радіоактивних речовин. Молозиво може також знайти застосування з профілактичною метою у робітників різних хімічних підприємств та для стимуляції адаптаційних процесів в організмі і т.д. Найбільш зручно його використовувати в вигляді сублімаційно висушеного (ліофілізованого) продукту (F. Klobasa et al. 1998; R.J. Playford et al., 1999, 2000).

Основними фізичними факторами крім процесу сублімаційного висушування, що можуть впливати на якість молозива, є температура та час зберігання. При цьому пошкоджуючій дії найбільш підпадають два класи біологічних молекул – жирні кислоти (особливо поліненасичені), як вільні, так і ті, що входять до складу ліпідів, а також білки. Пошкодження білків може відбуватися як безпосередньо, так і при взаємодії з вільними радикалами або продуктами ПОЛ (А.М. Белоус, 1991).

В зв’язку з цим, є доцільним вивчити вплив факторів заморожування, сублімаційного висушування і умов зберігання молозива на характер перекисних процесів в ліпідах молозива та на збереження білків. В молозиві міститься велика кількість різноманітних білків, але ми зупинили свій вибір на ЛФ. Такий вибір пов’язаний з тим, що цей білок крім того, що він має антиоксидантні та хелаторні властивості, також приймає участь в регулюванні проліферації клітин, має протипухлинну дію, стимулює імунітет і т.д. (С. Белизи и др., 1999, 2001; B. Adamik et al., 1996, 1998; C. Griffiths et al., 2001). Такий широкий спектр його дії привертає до нього увагу великої кількості дослідників. Збереження властивостей ЛФ в ліофілізованому молозиві є необхідним для збереження біологічной дії готового продукту.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась в рамках науково-дослідних тем Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України: “Розробка технології кріоконсервування фрагментів деяких ксеноорганів для клінічного застосування” (шифр-2.2.6.75, № держреєстрації 0100U004240) та “Дослідження впливу та механізму дії кріоконсервованих тканинних препаратів з ксеногенних органів на перебіг ряду патологічних процесів в організмі” (шифр-2.2.6.5, № держреєстрації 0102U002027), де автор виконував самостійний розділ.

Мета і задачі дослідження.

Мета дослідження. Визначити вплив заморожування, сублімаційного висушування та умов зберігання молозива корів на його якість.

Задачі дослідження.

1. Встановити вплив заморожування, сублімаційного висушування та умов зберігання нативного та ліофілізованого молозива корів на його рН, кислотність та характер перекисних процесів в ліпідах молозива.

2. Вивчити в порівняльному плані антиоксидантні властивості ЛФ з нативного та ліофілізованого молозива корів на модельних системах та при гіпотермічному зберіганні фрагментів печінки.

3. Дослідити ефективність ліофілізованого молозива корів при експериментальному ЦД.

4. Вивчити вплив ЛФ на життєздатність культури клітин меланомної лінії Arn8 і репаративні процеси в їх ДНК в нормі та після ультрафіолетового (УФ) опромінювання.

Об’єкт дослідження. Вплив заморожування, сублімаційного висушування та умов зберігання на якість молозива корів, перекисні процеси в ліпідах та на антиоксидантні, цитотоксичні і регуляторні властивості лактоферину.

Предмет дослідження. Молозиво корів, ліпіди та лактоферин, що входять до його складу.

Методи дослідження. При оцінці якості молозива корів використовували такі методи: рH-метрію, метод титрування для визначення кислотності, визначення щільності за допомогою ареометрів; вміст сухої речовини та зольність визначали шляхом висушування та спалювання відповідно. Методики вимірювання проводили згідно відповідних державних стандартів.

Інтенсивність ПОЛ та антиоксидантні властивості ЛФ досліджували за допомогою хемілюмінесцентного (ХЛ) методу і шляхом визначення рівня ТБК-активних продуктів (ТБКАП) спектрофотометричним методом. Рівень глюкози в крові визначали хромооксигеназним методом.

В роботі також використовували методи культивування клітин Arn8 і метод підрахунку загальної кількості клітин і клітин з пошкодженою ДНК під світловим мікроскопом. Для виявлення клітин з пошкодженою ДНК використовували метод визначення активності -галактозидази в клітинах, що продукують р53. Життєздатність клітин визначали спектрофотометричним методом.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше було проведено комплексне дослідження впливу заморожування, сублімаційного висушування та умов зберігання на якість молозива корів, інтенсивність перекисних процесів в ліпідах молозива та на біологічні властивості ЛФ. Досліджено антиоксидантні властивості ЛФ на модельних системах і при гіпотермічному зберіганні фрагментів печінки.

Встановлено, що ліофілізоване молозиво сприяє нормалізації рівня глюкози в крові та зменшенню інтенсивності ПОЛ при експериментальному ЦД. Вперше було досліджено вплив ЛФ на життєздатність культури клітин меланомної лінії Arn8 та репаративні процеси в їх ДНК.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані дані з впливу заморожування, сублімаційного висушування та умов зберігання на якість молозива корів можуть бути покладені в основу розробки технології отримання харчової добавки з молозива корів. Показано, що ліофілізоване молозиво ефективне при ЦД і може знайти своє місце в комплексній терапії цього захворювання. ЛФ з молозива корів можна використовувати при гіпотермічному зберіганні біологічних об’єктів. Показано, що ЛФ є цитотоксичним для меланомних клітин лінії Arn8 і при цьому не сприяє просуванню клітин з пошкодженою ДНК в цикл проліферації, і, таким чином, цей білок може бути використаний при розробці препаратів для захисту шкіри від несприятливого впливу УФ променів.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертаційної роботи самостійно проведений аналіз літературних даних по темі дослідження, отримані результати експериментальних досліджень, проведений первинний аналіз даних та їх статистична обробка. Автором безпосередньо оброблені експериментальні дані, інтерпретовані результати та зроблені попередні висновки. Автором разом з науковим керівником були визначені мета та завдання роботи, зроблені остаточні висновки. В статтях, опублікованих сумісно з Сандомирським Б.П. та іншими співавторами, були використані результати, самостійно отримані здобувачем. В експериментах, пов’язаних з вивченням впливу ЛФ та УФ опромінювання на клітини Arn8, була отримана методична та консультативна допомога доктора Neil K. Gibbs (Hope Hospital, Манчестер, Велика Британія).

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи доповідались та обговорювались на міжнародній науково-практичній конференції “Лекарства-человеку” (Харьков, 2000, 2001); конференції молодих вчених ХДМУ “Медицина третього тисячоліття” (Харків, 2001); конференції молодих вчених ІПКіК НАН України сумісно з кафедрою ЮНЕСКО (Харків, 2000, 2001, 2002); науковій конференції, присвяченій 100-річчю з дня народження академіка І.М. Буланкіна (Харків, 2001); конференції Cryo-2001 (Edinburgh, 2001); конференції студентів, аспірантів та молодих вчених з молекулярної біології та генетики (Київ, 2001); Всеукраїнській конференції “Успехи и перспективы развития криобиологии и криомедицины” (Харків, 2001), міжнародній науково-практичній конференції “Новые технологии получения и применения биологически активних веществ” (Алушта, 2002); науково-практичній конференції “Сучасні напрямки розвитку ендокринології” (Харків, 2003).

Публікації. Основні положення дисертації викладені в 14 роботах: п’яти наукових статтях, опублікованих в провідних фахових журналах, і дев’яти тезах доповідей.

Обсяг і структура дисертації. Робота викладена на 110 сторінках. Вона має вступ, основну частину, яка складається з трьох розділів (огляд літератури, матеріали і методи дослідження, отримані результати та їх обговорення), заключення, висновки. Список використаної літератури складає 201 джерело і викладений на 20 сторінках. Дисертація містить 14 рисунків та 21 таблицю.

Основний зміст роботи

Матеріали і методи дослідження. Дослідження проводились в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, а також в лабораторії фотобіології, Hope Hospital при Манчестерському університеті, Велика Британія.

Об’єктами дослідження були молозиво корів 2-3-ї доби лактації, яке отримували від корів Симентальської породи віком 4-5 років колективного сільськогосподарського підприємства “Східне” Харківського району, а також ліпіди та ЛФ, що входять до його складу.

Визначення показників якості молозива корів (рН, кислотність, щільність, вміст жиру, білка, сухої речовини та ін.) проводили за відповідними стандартами на молокопродукти. Характер перекисних процесів в молозиві корів вивчали ХЛ методом. Заморожування проводили, приміщуючи пластикові контейнери об’ємом 1 л з молозивом в морозильну камеру холодильника (-12С) або занурюючи в рідкий азот (-196С). Молозиво зберігали в побутовому холодильнику (4С) і в кімнатних умовах (20С), відігрівали на водяній бані при 37-40С.

Сублімацію здійснювали на установці УЗВ-9 або УЗВ-10 (виробництва СКТБ з ДВ ІПКіК НАН України, м. Харків). Молозиво, яке зберігалось в рідкому азоті, перед сублімаційним висушуванням розморожували на водяній бані з температурою 37-40С, наливали на лотки шаром товщиною 10 мм та заморожували до -30С зі швидкістю 2С/хв. Сушіння здійснювали при залишковому тиску в камері (1,3-1,8)10-2 Па і кінцевій температурі 33-35С. Зразки висушували до залишкової вологості 1,5-2,0%. Ліофілізоване молозиво розфасовували по 300 мг в желатинові капсули №0, упаковували в пластикові контейнери ТУ У 23455985-001-97 по 50 штук і зберігали в побутовому холодильнику при температурі 4С. Регідратацію ліофілізованого молозива проводили дистильованою водою.

ЛФ отримували за методом (Р.И. Якубовская и др., 1986). Хелаторні властивості ЛФ на модельних системах визначали ХЛ методом.

Гіпотермічне зберігання фрагментів печінки щурів проводили в середовищі 199. В дослідних пробах середовище додатково містило 5 мг/мл ЛФ. Інтенсивність перекисних процесів в фрагментах печінки визначали за рівнем спонтанного, Fe2+ - і аскорбат-індукованого ПОЛ за швидкістю накопичення ТБКАП на 30 хв (контроль), 24, 48 і 72 год зберігання при температурі 4С в тому ж середовищі. ХЛ аналіз проводили на хемілюмінометрі 1420-2, що працює в режимі рахування фотонів. ХЛ індукувалась додаванням розчину солі Мора або перекису водню. Світлосуму ХЛ виражали в умовних одиницях.

Для моделювання ЦД в роботі були використані статевозрілі щури-самці лінії Вістар масою 180-230 г. Алоксан-тригідрат виробництва фірми “Lachema” (Чехія) вводили в черевну порожнину одноразово в дозі 130 мг/кг ваги тварини після попереднього 24-годинного голодування при вільному доступі до води. Тварини були поділені на три групи. 1 група: контрольні тварини; 2 група: щури з ЦД, які не отримували молозива; 3 група: щури, які до введення алоксану на протязі місяця щоденно за допомогою зонда отримували регідратоване молозиво корів (по 100 мг сухої речовини кожний). Ця ж група щурів продовжувала отримувати молозиво на протязі всього експерименту.

Ступінь вираження глікемії і інтенсивності ПОЛ в плазмі крові і гомогенаті печінки щурів вивчали на 7, 15 і 30 добу. Рівень глюкози визначали хромооксигеназним методом в сироватці крові натще та через 3 год після глюкозного навантаження (400 мг глюкози/кг маси). Інтенсивність ПОЛ визначали ХЛ методом, а також за початковим, спонтанним, Fe2+- і аскорбат-індукованим рівнем ТБКАП в плазмі крові та тканині печінки. Щурів декапітували під легким ефірним наркозом.

Для дослідження впливу УФ опромінювання та ЛФ на клітини in vitro була використана лінія клітин A375RGCneo (Arn8). Це клітини меланомної лінії А375, трансформовані шляхом вбудови в ДНК р53-відповідаючого елементу, зчепленого з -галактозидазним геном (S.E.Kern et al., 1991; T. Frebourg et al., 1992; J.P. Blaydes et al., 1997). Концентрація ЛФ в середовищі інкубації складала 0,1 мг/мл, 0,5 мг/мл і 1 мг/мл. Перед експериментом клітини висівали в чашках Петрі діаметром 35 мм в кількості 5х104 клітин на чашку Петрі в 2 мл середовища та інкубували на протязі 24 год.

Життєздатність клітин визначали за методикою (P.R. Twentyman, M.A. Luscombe, 1987). Цей тест включає реакцію тетразольної солі МТТ з дегідрогеназою мітохондрій живих клітин. Розчинна жовта сіль МТТ розщеплюється в мітохондріях з функціонуючою дегідрогеназою, що дає нерозчинний фіолетовий продукт формазан, концентрація якого може бути визначена спектрофотометричним методом.

Для опромінювання клітин використовували флуоресцентну лампу Philips TL 100W/12. Клітини опромінювались УФ опромінюванням діапазону А (довжина хвилі 315-400 нм) та діапазону В (довжина хвилі 280-315 нм). Кількість клітин з пошкодженою ДНК визначалась за р53-залежним синтезом ферменту ?-галактозидази, який при взаємодії з субстратом X-Gal дає синій продукт, що залишається в клітинах (A. Deck et al., 1998).

Підрахунок клітин в чашках Петрі проводили “сліпим” методом під світловим мікроскопом і вичисляли відсоток загальної кількості клітин від контролю та відсоток “синіх клітин” від загальної кількості клітин.

В роботі використовувались реактиви марки не нижче ХЧ.

Статистичну обробку отриманих результатів здійснювали за методом Стьюдента-Фішера. В якості критерію статистичної достовірності різниці приймали рівень 95% (р 0,05).

Отримані результати та їх обговорення.

Вплив температури та строку зберігання на якість молозива корів. Молозиво корів може використовуватись як в рідкому вигляді, так і в вигляді сублімаційно висушеного порошку (F. Klobasa et al. 1998; R.J. Playford et al., 2000). Для ефективного використання молозива корів необхідно створення його запасів, що пов'язано з проблемою його зберігання. Час зберігання молозива в рідкому стані або замороженим при помірно низьких температурах обмежений. Але в доступній літературі ми не знайшли даних з впливу умов зберігання молозива на його якість. В зв’язку з цим ми вивчили вплив температури та строку зберігання на такі показники якості молозива як рН, кислотність та інтенсивність ПОЛ.

Було встановлено, що зберігання молозива при –12С та –196С на протязі 35 діб не приводить до достовірної зміни рН та кислотності. При позитивних температурах збереження рН та кислотність молозива достовірно відрізняються від контролю через 7 та 14 діб при температурі зберігання 20С та 4С відповідно.

Нами також була досліджена інтенсивність ХЛ молозива, індукованої двовалентним залізом та перекисом водню. Встановлено, що показники ПОЛ під час зберігання молозива при негативних температурах залишаються на рівні контролю терміном до 28 діб. На 7 добу зберігання молозива при 20С показники ХЛ, також як рН та кислотність, достовірно відрізняються від відповідних показників контролю. Під час зберігання молозива при 4С інтенсивність ХЛ, індукованої двовалентним залізом, достовірно відрізняється від контролю вже на 7 добу зберігання, що свідчить про розвиток процесу перекисного окислення в ліпідах. Можна відзначити, що до цього моменту рН та кислотність залишаються на рівні контролю. У випадку, коли молозиво зберігалось при -12С, такі зміни в інтенсивності ХЛ спостерігались на 35 добу. Таким чином, з отриманих результатів можна зробити висновок, що зберігання молозива корів при -12С більше 35 діб не раціонально. При зберіганні молозива в рідкому азоті (-196С) показники якості залишались не змінними. Тривалість зберігання при позитивних температурах (20С і 4С) обмежена 7 та 14 добами відповідно. При цьому ХЛ методом несприятливі зміни в ліпідах продукту виявляються в більш ранні строки, ніж при використанні традиційних методів оцінки якості молокопродуктів. Отже, ХЛ метод може бути використаний як експрес-метод оцінки якості молозива в процесі його зберігання або переробки.

Вплив температури та строку зберігання на показники якості сублімаційно висушеного молозива корів. Тривале зберігання молозива корів можливе або в замороженому, або в ліофілізованому стані. Молозиво відноситься до того ряду природних продуктів, які містять термолабільні речовини. В зв’язку з цим методи висушування при підвищених температурах для його зневоднення не придатні. Тому для висушування молозива корів використовувалось сублімаційне сушіння. Але в науковій літературі не було знайдено даних з впливу на молозиво фізико-хімічних факторів, що виникають під час заморожування та сублімаційного висушування. В зв’язку з цим в роботі вивчався вплив сублімаційного висушування та терміну зберігання при 4С на якість сухого молозива корів, розфасованого в желатинові капсули. Було показано, що рН, кислотність та показники ПОЛ в молозиві достовірно не відрізняються від контролю при зберіганні у вказаних умовах протягом 12 міс.

Антиоксидантні властивості лактоферину з молозива корів. ЛФ - це природний залізозв’язуючий білок, один із найважливіших компонентів молозива корів. ЛФ приймає участь в обміні речовин, регуляції клітинної проліферації і т.д. (T. Hagiwara et al., 1995; В. Adamik et al., 1996, 1998). Заслуговує на інтерес здатність ЛФ зв’язувати (хелатувати) іони заліза (С. Белизи и др., 1999, 2002). Іони заліза є ефективними каталізаторами генерації активних форм кисню та ініціюють реакцію розгалуження ланцюгів ПОЛ. Молозиво корів, завдяки високому вмісту ЛФ, може бути ефективним регулятором кількості заліза в організмі людини, а отже, справляти позитивний вплив під час патологічних станів, які характеризуються активацією ПОЛ. Однак роль ЛФ в механізмі дії систем антиоксидантного захисту вивчена не достатньо. Не було досліджено також впливу сублімаційного висушування на його антиоксидантні властивості. Тому в своїй роботі ми провели вивчення антиоксидантних властивостей ЛФ на модельних системах і вплив на цю властивість заморожування та сублімаційного висушування молозива корів.

На різноманітних модельних системах, до складу яких входили Fe2+, H2O2, манітол, ліпопротеїди яєчного жовтка, гомогенат печінки щурів, ХЛ методом було досліджено антиоксидантну активність ЛФ з нативного, замороженого та ліофілізованого молозива. На основі отриманих результатів можна зробити висновок, що ЛФ із молозива корів є ефективним хелатором заліза, знижує концентрацію гідроксильних радикалів і в значній мірі зменшує інтенсивність перекисних процесів в модельних системах. Під час заморожування, ліофілізації і зберігання ліофілізованого молозива протягом 12 міс при вказаних умовах не відмічалось зменшення антиоксидантних властивостей ЛФ.

Адекватною моделлю вивчення впливу ЛФ з молозива корів на біологічні об’єкти може бути модель гіпотермічного зберігання фрагментів печінки щурів. При гіпотермічному зберіганні біологічних об’єктів спостерігається активація процесів вільнорадикального окислення ліпідів (Л.П. Кравченко и др., 1999, 2001). Тому в своїй роботі ми вивчили вплив ЛФ з нативного і ліофілізованого молозива корів на інтенсивність перекисних процесів у фрагментах печінки в умовах гіпотермічного зберігання.

Швидкість вільнорадикального окислення в біологічному матеріалі підтримується на певному рівні складною системою регуляції. Порушення стаціонарного стану цього процесу розглядається як універсальний механізм розвитку різних патологічних процесів.

В табл.1 представлені дані з інтенсивності ХЛ модельної системи, індукованої Fe2+, в залежності від терміну гіпотермічного зберігання фрагментів печінки щурів, а також наявності або відсутності ЛФ з нативного і ліофілізованого молозива корів в середовищі зберігання. При зберіганні фрагментів в середовищі без ЛФ інтенсивність ХЛ, індукованої Fe2+, а отже, і кількість вільних радикалів достовірно вище контролю вже через 24 год зберігання. При наявності в середовищі зберігання ЛФ як з нативного, так і з ліофілізованого молозива достовірна різниця в порівнянні з контролем спостерігається тільки на 72 год зберігання. При цьому різниця в інтенсивності ХЛ фрагментів, що зберігались в середовищі з ЛФ, в порівнянні зі зберіганням без ЛФ стає достовірною вже через 24 год зберігання.

Таблиця 1

Світлосума ХЛ (умов.од.), індукованої Fe2+, в залежності від джерела ЛФ і строку гіпотермічного зберігання фрагментів печінки щурів

Час

зберігання,год | Без ЛФ | Джерело ЛФ

Нативне молозиво | Ліофілізоване молозиво

Контроль | 1887185 | 1731163 | 1899171

24 | 26722281 | 17951612 | 18841852

48 | 48814391 | 20311922 | 19901682

72 | 87138011 | 56816911,2 | 55397091,2

Примітки: 1. Відмінності статистично достовірні в порівнянні з контролем, р<0,05;

2. Відмінності статистично достовірні в порівнянні з тим же строком зберігання без ЛФ, р<0,05.

Таким чином, представлені дані свідчать про те, що ЛФ, введений в середовище зберігання, перешкоджає утворенню вільних радикалів в фрагментах печінки при всіх вивчених термінах зберігання в порівнянні зі зберіганням їх в середовищі без ЛФ. При цьому ЛФ знижує інтенсивність ХЛ в 2,4 и 1,6 рази на 48 и 72 год зберігання відповідно. Було показано також, що інтенсивність ХЛ, індукованої H2O2, а отже, і стійкість фрагментів печінки до перекисного окислення, навіть при зберіганні без ЛФ, відрізняється від контролю через 48 год зберігання, в той час як інтенсивність ХЛ, індукованої Fe2+, достовірно відрізняється від контролю вже на 24 год зберігання. Тобто, можна припустити, що антиоксидантні системи, що знешкоджують вільні радикали і перекиси, зберігають свою активність протягом 24 год зберігання, а потім спостерігається їх виснаження, що й приводить до різкого росту ХЛ на 48, і особливо на 72 год зберігання. Якщо в середовищі міститься ЛФ, цей показник достовірно відрізняється від контролю тільки на 72 год зберігання, але в цьому випадку він нижче ХЛ гомогенату фрагментів, що зберігались без ЛФ. При цьому, якщо інтенсивність ХЛ біоматеріалу, що зберігався без ЛФ, збільшується в 6,4 рази, то при зберіганні з ЛФ – в 3,3 рази.

Отримані дані свідчать про те, що завдяки своїм залізозв’язуючим властивостям, ЛФ є ефективним антиоксидантом, який перешкоджає ініціації процесів ПОЛ, і при цьому стійкість біологічних об’єктів до перекисного окислення залишається незмінною більш тривалий час, що може бути пов’язано з меншим навантаженням на ендогенні антиоксидантні системи.

При вивченні впливу ЛФ із нативного та ліофілізованого молозива корів на рівень утворення ТБКАП у фрагментах печінки щурів в залежності від терміну гіпотермічного зберігання було встановлено, що на другу добу гіпотермічного зберігання фрагментів без ЛФ відмічається значне (більш, ніж в два рази) збільшення кількості ТБКАП, що свідчить про інтенсифікацію перекисних процесів в мембранах клітин. Наявність в середовищі ЛФ із нативного молозива сприяє пригніченню накопичення кінцевого продукту ПОЛ на 48 год зберігання. Схожий ефект інгібування утворення ТБКАП отриманий і при використанні ЛФ із ліофілізованого молозива. Для підтвердження протиокисного механізму дії ЛФ було вивчено утворення ТБКАП в наступних експериментальних умовах (табл. 2).

Таблиця 2

Вплив ЛФ на спонтанне, Fe2+- і аскорбат-індуковане утворення ТБКАП (нмоль/г тканини) в фрагментах печінки при їх гіпотермічному зберіганні |

Строк зберігання, год

Гіпотермічне зберігання | Утворення ТБКАП | Контроль |

24 |

48

Без ЛФ | спонтанне | 4,90,2 | 8,80,61 | 15,11,11

Fe2+-індуковане | 5,90,3 | 10,10,71 | 21,71,91

аскорбат-індуковане |

10,20,6 |

14,40,91 |

32,02,51

В присутності ЛФ | спонтанне | 5,20,3 | 5,80,32 | 9,40,71,2

Fe2+-індуковане | 5,60,4 | 6,20,42 | 13,31,21,2

аскорбат-індуковане |

9,90,4 |

8,20,61,2 |

18,91,51,2

Примітки: 1. Відмінності статистично достовірні в порівнянні з контролем, р<0,05;

2. Відмінності статистично достовірні в порівнянні з тим же строком зберігання без ЛФ, р<0,05.

Отримані дані свідчать про те, що ЛФ знижує рівень як Fe2+-, так і аскорбат-індукованого утворення кінцевих продуктів ПОЛ. Це може бути пояснено тим, що ЛФ знижує ефективну концентрацію двовалентного заліза, а отже, зменшує активацію процесів ПОЛ на етапі утворення вільних радикалів і розгалуження ланцюгів пероксидації. Менший рівень аскорбат-індукованої пероксидації в присутності ЛФ також підтверджує, що в цьому випадку менша кількість заліза доступна для відновлення аскорбатом. Отже, отримані дані підтверджують наявність у ЛФ антиокисних властивостей, що пов’язано, певне, з його хелаторними властивостями по відношенню до двовалентного заліза. Проведені дослідження показують, що ЛФ із ліофілізованого молозива корів в рівній мірі має антиоксидантні властивості, як і ЛФ із нативного молозива.

Вплив ліофілізованого молозива корів на динаміку метаболічних порушень при експериментальному цукровому діабеті. В усьому світі проблема захворювання населення ЦД набуває все більшого значення. Це пов’язано з тим, що кількість хворих на ЦД щорічно збільшується на 6-10% . Проблема запобігання ЦД та зниження його проявлень потребує пошуку нових засобів лікування, а також засобів, що змогли б мати профілактичну та протекторну дію, так як вже існуючі підходи до корекції метаболічних порушень при даному захворюванні не завжди дають очікуваний ефект (В.И. Грищенко и др., 2002).

Ліофілізоване молозиво корів може знайти своє місце серед препаратів, що направлені на профілактику ЦД, на компенсацію його проявлень і нормалізацію метаболізму клітин, тканин і всього організму. Тому в нашій роботі ми провели вивчення ефективності ліофілізованого молозива корів при експериментальному ЦД.

При моделюванні ЦД з 40 щурів, що не отримували молозиво (2 група), вижила 21 тварина (52,5%), з них діабет розвився у 9 тварин (41% від тварин, що вижили), а з 40 тварин, які отримували молозиво (3 група), вижило 34 тварини (85,5%), а діабет розвився у 8 тварин (23,5% від тварин, що вижили). Було встановлено, що рівень глюкози в крові тварин 2 групи на 7-му добу перевищував норму (1 група) в 2,3 рази, а на 15-ту добу в 3,5 рази. На 30-ту добу рівень глюкози в крові дещо знижувався, однак залишався значно вищим норми. У тварин 3 групи рівень глікемії був нижче, ніж у тварин 2 групи, і на 7-му добу перевищував норму в 1,7 рази. В крові щурів 3 групи концентрація глюкози збільшувалась на 15-ту добу, як у щурів 2 групи, однак на 30-ту добу відзначалось зниження концентрації (перевищення складало 1,9 рази в порівнянні з перевищенням норми в 2,8 рази у щурів 2 групи). При дослідженні динаміки глюкози в крові тих же груп тварин при глюкозному навантаженні отримані аналогічні результати.

Відомо, що ЦД супроводжується активацією перекисних процесів і накопиченням в тканинах і крові кінцевих продуктів ПОЛ. Максимальна концентрація ТБКАП спостерігається в крові щурів 2 групи на 15-ту добу з деяким зниженням на 30-ту добу, однак вона залишається достовірно вище (р<0,05) контрольного значення. При попередньому застосуванні молозива рівень ТБКАП на 7-му добу хоча і перевищує контрольне значення, але достовірно нижче (р<0,05) рівня, характерного для щурів, які не отримували молозива. На 15-ту добу цей показник збільшується, але на 30-ту добу повертається до значення, характерного для контрольних тварин.

Підвищений рівень ПОЛ при ЦД характерний не тільки для плазми крові, але й для інших тканин, зокрема для печінки (табл.3). Введення тваринам молозива має протекторний ефект, зменшуючи активацію ПОЛ в печінці, і в цьому випадку рівень ТБКАП складає 0,8-0,9 від величини відповідних показників тварин, що не отримували молозива. При цьому початковий рівень ТБКАП не відрізняється від контролю (р<0,05) як на 7-му, так і на 30-ту добу спостереження.

Таблиця 3

Початковий, спонтанний, Fe2+- і аскорбат-індукований рівень ТБКАП

(нмоль/г тканини) в печінці щурів

Рівень ТБКАП | Строк спостереження, доба | Умови експерименту

Контроль | ЦД | ЦД+молозиво

Початковий | 7 | 3,90,3 | 5,40,4 | 4,20,31

30 | 3,80,2 | 5,20,3 | 4,20,31

Спонтанний | 7 | 4,70,3 | 6,70,5 | 5,90,3

30 | 4,40,2 | 6,50,4 | 5,30,42

Fe2+-індукований | 7 | 5,40,4 | 8,70,7 | 7,30,52

30 | 5,80,5 | 8,10,4 | 6,90,52

Аскорбат-індукований | 7 | 9,20,6 | 20,11,8 | 15,11,32

30 | 9,40,7 | 18,41,1 | 12,21,02

Примітки: 1. Відмінності статистично недостовірні в порівнянні з контролем, р > 0,05;

2. Відмінності статистично достовірні в порівнянні з тим же строком ЦД, р < 0,05.

Характер різноманітних моментів процесів ПОЛ в печінці щурів, вивчених ХЛ методом, вказує на те, що при ЦД активується радикалоутворення в тканині органа (Fe2+-індукована ХЛ), знижується стійкість до перекисного окислення (Н2О2-індукована ХЛ), а наявність активних форм кисню приводить до збільшення кількості радикалів, що утворюються, в 2,8 рази (Fe2+-індукована ХЛ після впливу перекису водню на гомогенат тканини). Отже, при даній патології страждають всі вивчені ланки антиоксидантного захисту і механізмів регуляції рівня ПОЛ в тканині печінки. При вивченні ХЛ методом перекисних процесів в печінці встановлено, що у щурів 3 групи інтенсивність ХЛ тканини печінки при різних умовах дослідження на 30-ту добу значно нижче, ніж у щурів 2 групи, і деякі показники наближуються до показників контролю.

Таким чином, отримані дані дозволяють зробити висновки, що при експериментальному ЦД у щурів спостерігаються виразні порушення метаболізму, що проявляються в гіперглікемії, підвищенні рівня глюкози в крові при глюкозному навантаженні і активації процесів ПОЛ. Ліофілізоване молозиво корів має захисну дію при експериментальному ЦД і знижує рівень метаболічних порушень в динаміці розвитку і протікання даної патології.

Вплив лактоферину на життєздатність культури клітин Arn8. Велика кількість літературних даних підтверджує той факт, що ЛФ здатний впливати на проліферацію клітин як in vitro, так і in vivo. Крім регуляторної функції, відзначалась також і цитотоксична дія ЛФ на ракові клітини (E. Damiens et al., 1999; A. Yanaihara et al., 2000). В зв’язку з цим в нашій роботі ми провели порівняльне вивчення дії рекомбінантного ЛФ людини (лЛФ) та ЛФ з молозива корів (кЛФ) на меланомні клітини лінії Arn8. Було встановлено, що присутність в середовищі інкубації як лЛФ, так і кЛФ в концентраціях 0,1 мг/мл і 1 мг/мл приводить до зменшення життєздатності клітин, причому спостерігався невеликий дозозалежний ефект. Інкубація клітин в середовищі, що містило кЛФ, приводило до значно більшої втрати життєздатності (80%), ніж у клітин, що інкубувались з лЛФ (10-20%). Це вказує на те, що кЛФ був більш цитотоксичний по відношенню до меланомних клітин.

Вплив лактоферину на культуру клітин Arn8 при ультрафіолетовому опромінюванні. Однією з особливостей ЛФ є його здатність безпосередньо зв’язуватись з нуклеїновими кислотами, а отже впливати на процеси, пов’язані з пошкодженням і репарацією ДНК, транкрипцією генів і т. д., що підтверджується великою кількістю досліджень (E. Damiens et al., 1999; E. Ellas et al., 2002).

Відомо, що відновлення ДНК або апоптоз клітин є наслідками пошкодження ДНК УФ опромінюванням і обидва ці механізми залежать від функціонування інтактного гену р53 (D.P. Lane, 1992; D.E. Fisher, 1994). Крім того відомо, що УФ опромінювання біомембран та інших ліпідних структур індукує пероксидацію ненасичених жирних кислот, що приводить до збільшення продуктів цього процесу в період після опромінювання. ПОЛ опромінених мембран може блокуватись антиоксидантами, які діють на різних етапах пероксидації (S. Shimmura et al., 1996, 1998). ЛФ є одним з антиоксидантів завдяки його хелаторним властивостям по відношенню до двовалентного заліза, тому він може зменшувати негативний вплив УФ опромінювання.

В зв’язку з цим представлялось цікавим вивчити дію ЛФ на клітини з непошкодженою ДНК в нормальних умовах, а також на процеси відновлення ДНК після пошкоджуючої дії УФ опромінювання.

Було показано, що інкубація клітин Arn8 в середовищі, яке містило лЛФ в концентрації 1 мг/мл, протягом 24 год не мала помітної дії на кількість клітин. Опромінювання клітин дозою 10 мкДж/см2 ультрафіолету діапазону В (довжина хвилі 280-315 нм) викликало зменшення кількості клітин на 70%. Кількість опромінених клітин, які інкубувались з ЛФ в концентраціях 0,5 мг/мл та 1 мг/мл, не відрізнялась від кількості опромінених клітин, що інкубувались без ЛФ.

Кількість клітин Arn8 з активованим р53, а отже пошкодженою ДНК (“сині клітини”) в контрольній групі та після інкубації з ЛФ в концентрації 1 мг/мл не перевищувала 1-2%. При опромінюванні клітин УФВ в дозі 10 мкДж/см2 кількість “синіх клітин” складала 20% через 24 год після опромінювання. Інкубація клітин з ЛФ в концентраціях 0,5 мг/мл і 1 мг/мл не приводило до збільшення або зменшення кількості “синіх клітин” в групах, що були опромінені. Це показує, що ЛФ не змінює кількість клітин, зупинених в фазі G1, а отже, не сприяє переходу клітин з пошкодженим геномом із фази G1 до S-фази та подальшій дуплікації пошкодженої ДНК.

Було також встановлено, що при опромінюванні клітин Arn8 УФ випромінюванням діапазону А (довжина хвилі 315-400 нм) спостерігається залежність загальної кількості клітин в культурі і кількості клітин з пошкодженою ДНК від дози опромінювання. Введення ЛФ в середовище інкубації не впливає на ці показники.

Отже, можна зробити висновок, що не було відмічено прямого захисного ефекту ЛФ на життєздатність клітин Arn8 та збереження їх геномного матеріалу при пошкоджуючій дії УФ опромінювання. В той же час кількість “синіх клітин” після УФ опромінювання та інкубації клітин з ЛФ в концентраціях 0,5 мг/мл та 1 мг/мл не відрізнялась від кількості “синіх клітин” після опромінювання та інкубації без ЛФ. Таким чином, ЛФ не ініціює просування клітин з пошкодженою ДНК до S-фази. Рівень пошкодження клітин Arn8 при опромінюванні УФА є дозозалежним і не залежить від присутності чи відсутності ЛФ в середовищі інкубації.

ВИСНОВКИ

1. Широке впровадження ліофілізованого молозива як харчової добавки можливе тільки після комплексного дослідження впливу заморожування, сублімаційного висушування та умов зберігання на його якість. Але невелика кількість літературних даних з цього питання носить розрізнений, здебільшого чисто практичний характер. В зв’язку з цим в даній роботі досліджено вплив заморожування, сублімаційного висушування, температури та строку зберігання на якість молозива корів, а також на ліпіди молозива і біологічні властивості ЛФ.

2. Строк зберігання молозива при позитивних температурах (20?С і 4?С) обмежений 7 та 14 добами відповідно. При зберіганні молозива в замороженому вигляді при -196?С негативні зміни в ньому не були виявлені, а при -12?С виявлялися на 35 добу. ХЛ метод, використаний для дослідження інтенсивності перекисних процесів в молозиві корів, може бути застосований при експрес-оцінці якості молозива (а також можливо і інших молокопродуктів) в процесі їх зберігання або переробки.

3. Якість ліофілізованого молозива, оцінена за його рН, кислотністю та показниками ПОЛ, при його зберіганні при 4?С розфасованим у желатинові капсули статистично достовірно не змінюється протягом 12 міс.

4. ЛФ з молозива корів проявляє хелаторні властивості по відношенню до заліза і в значній мірі зменшує інтенсивність перекисних процесів в модельних системах. Заморожування, сублімаційне висушування та зберігання сухого молозива при 4?С не впливають на ці властивості ЛФ.

5. Введення ЛФ як з нативного, так і з ліофілізованого молозива в середовище для гіпотермічного зберігання (4?С) фрагментів печінки щурів приводить до уповільнення розвитку процесів ПОЛ. А саме, достовірні відмінності різних показників інтенсивності ПОЛ у фрагментах в порівнянні з контролем спостерігаються через 72 год при наявності ЛФ, і