ІНСТИТУТ біології тварин УААН

ГОЛУБЕЦЬ РУСЛАН АНАТОЛІЙОВИЧ

УДК: 619:616-006.446:636.22/28

Зміни метаболічного профілю крові і окремих
ділянок ДНК лімфоцитів великої рогатої худоби
при лейкозі

03.00.04 - біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

Львів – 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті ветеринарної медицини УААН.

Науковий керівник – | кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник

Клестова Зинаїда Сергіївна,

Інститут ветеринарної медицини УААН,

вчений секретар, завідувач відділу координації

науково-дослідних робіт | Офіційні опоненти: | доктор біолоігчних наук, професор

Янович Вадим Георгійович,

Інститут біології тварин УААН,

завідувач лабораторії росту і розвитку; |

доктор ветеринарних наук, член-кор УААН

Мандигра Микола Станіславович

Інститут епізоотології УААН, директор | | Провідна установа: | Державний науково-дослідний контрольний інститут

ветеринарних препаратів та кормових добавок

Міністерства аграрної політикик України,

відділ фармакології і імунології, м.Львів |

Захист відбудеться 11.11.2003 р. о 12 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01 при Інституті біології тварин УААН за

адресою: 79034. м.Львів, вул. В.Стуса, 38.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці інституту біології тварин

УААН за адресою: 79034. м.Львів, вул. В.Стуса, 38.

Автореферат розісланий 10.10.2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Віщур О.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Успішне виконання завдань з виробництва продукції тваринництва можливе лише за умов реалізації науково обґрунтованих заходів, що забезпечують удосконалення племінної роботи та зміцнення кормової бази, впро-вадження досягнень ветеринарної медицини (Карасик Ю.М., Буркат В.П., Зу-
бець М.В., 1995). На даному етапі однією з головних проблем ветеринарної медицини України є профілактика та ліквідація вірусних захворювань, зокрема лейкозу великої рогатої худоби (Мандигра М.С., 2000). Проблема ліквідації лейкозу великої рогатої худоби та використання позитивних в реакції імунодифузії (РІД) на лейкоз корів (інфікованих вірусом лейкозу) для відтворення залишається однією з найбільш ак-туальних. Проте, патогенез лейкозу великої рогатої худоби на біохімічному і генетичному рівнях з’ясований недостатньо. Тому подальше вивчення властивостей вірусу лейкозу великої рогатої худоби, особливостей його впливу на біохімічні та генетичні процеси в організмі є необхідною умовою для більш глибокого розуміння патогенезу цього небезпечного захворювання, вдосконалення способів його діагностики та ліквідації. Це ілюструють наступні дані: інфікованість тварин вірусом лейкозу в Україні на початку впровадження серологічної діагностики (1986 рік) становила 18,6%, у господарствах Тернопільської області – 20%. У 1991 році, порівняно з 1986 роком, ураження тварин вірусом зменшилося в 1,7 рази, в 1995 році – в 2,6, в 1998 році – в 2,9 рази (Мандигра М.С., 1996 ).. Встановлено, що вірус – збудник лейкозу здатний викликати незворотні біохімічні зміни в організмі тварин. Ступінь прояву останніх може змінюватись в залежності від ендогенних (генетичних) та екзогенних, зокрема аліментарних, факторів (Мозгас В.Я., Приеднискас О.К., Чернобаева Л.Г.,1990; Амироков М.А., Смирнова В.В., Ерова Л.М., 1997; Смирнов Ю.П., 1998). Крім того, вірус лейкозу належить до мутагенних агентів: частка клітин із структурними хромосомними абераціями та відносна кількість анеуплоїдних клітин у інфікованої вірусом лейкозу великої рогатої худоби значно вищі, ніж у здорових тварин (Мандигра М.С., 2000). Застосування сучасних методів біохімічних і молекулярно-генетичних досліджень, зокрема методу ПЛР з довільними праймерами (RAPD-PCR), дасть можливість підвищити ефективність діагностики лейкозу у корів, а також прогнозувати їх подальше використання.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась згідно державного завдання в Інституті ветеринарної медицини УААН "Вивчення впливу патогенів на генетичний апарат тваринних клітин та розробка методів їх корекції при дії інфекційних, технологічних та екологічних факторів" (період виконання – 1996-1998 рр.), № держреєстрації – 0197 U O12751, в якій автор досліджував дію вірусу лейкозу на ділянки геному великої рогатої худоби.

Мета і завдання дослідження. Метою дисертаційної роботи було дослідження впливу вірусу лейкозу великої рогатої худоби на біохімічний профіль крові і геном лімфоцитів.

Для досягнення мети необхідно було вирішити наступні завдання:–

дослідити ряд біохімічних показників (вміст загального білку і окремих
білкових фракцій, вітаміну А в сироватці крові, глюкози, мікроелементів (міді, цинку, заліза, марганцю, кобальту) у крові інфікованої вірусом лейкозу великої рогатої худоби та неінфікованих тварин, а також мікроелементний склад кормів;–

розробити метод виявлення впливу вірусу лейкозу великої рогатої худоби на геном лімфоцитів;–

дослідити мутації в окремих ділянках геному лімфоцитів в інфікованої вірусом лейкозу великої рогатої худоби;–

провести порівняльне дослідження в інфікованої вірусом лейкозу великої рогатої худоби окремих локусів ДНК за RAPD-спектром.

Об’єкт дослідження – біохімічні показники крові і окремі ділянки ДНК хромосом № 4 і 5 лімфоцитів великої рогатої худоби.

Предмет дослідження – показники рівня загального білку, білкових фракцій, глюкози, вітаміну А, мікроелементів, ДНК лімфоцитів, хромосоми № 4 і № 5.

Методи досліджень – за допомогою біохімічних методів проводили: визначення в сироватці крові вмісту загального білку, білкових фракцій, вітаміну А, в цільній крові – глюкози. Методом атомно-абсорбційної спектрофотометрії визначали вміст міді, цинку, марганцю, заліза та кобальту в крові і кормах. Визначення наявності антитіл до вірусу лейкозу проводили за допомогою серологічної реакції – РІД, до-слідження ділянок дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) лімфоцитів проводили методами полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) і полімеразної ланцюгової реакції з довільними праймерами (polymerase chain reaction with random primers, RAPD–PCR). Клінічні дослідження полягали у вимірюванні температури тіла у великої рогатої худоби, кількості дихальних рухів, частоти пульсу, стану лімфатичних вузлів. Одержані дані обраховано математично та статистично за допомогою комп’ютерної програми Microsoft Excel–2000.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше в Україні проведено комп-лексне дослідження біохімічного профілю крові та окремих ділянок ДНК лімфоцитів крові інфікованої вірусом лейкозу великої рогатої худоби на різних стадіях захворювання. Виявлено значні різниці у вмісті рівня загального білка і гама-глобулінів у сироватці крові інфікованої вірусом лейкозу великої рогатої худоби. Так, у інфікованих тварин, рівень гама-глобулінів був значно більший, а вміст альбумінів – менший порівняно до їх вмісту у сироватці крові здорових тварин. Відношення альбуміни/глобуліни в сироватці крові великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозом, на початку і в кінці періоду досліджень було меншим, ніж у сироватці крові неінфікованих тварин. Вміст вітаміну А в сироватці крові, глюкози і мікроелементів (міді, заліза, кобальту, цинку) у крові великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозу, значно менший, ніж у неінфікованих корів. Вперше методами RAPD-PCR та ПЛР виявлено зміни в окремих ділянках ДНК у локусах MAF-50 і ВМ-315, хромосомах № 4 і 5 лімфоцитів великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозу, які характеризуються змінами у спектрі RAPD-фрагментів.

Практичне значення отриманих результатів. Одержані результати розширюють і поглиблюють наявні в літературі дані про біохімічні і генетичні зміни в організмі великої рогатої худоби при лейкозі, їх зв’язок з мікроелементним живленням тварин. Результати досліджень використані при розробці "Методичних вказівок по оцінці дії вірусу лейкозу великої рогатої худоби на геном соматичних клітин тварин методом полімеразної ланцюгової реакції з довільними праймерами (RAPD-PCR)", затверджених Державним департаментом ветеринарної медицини України від 10.07.2001 р.; № 15-14/204.

Особистий внесок здобувача. Полягає в безпосередньому виконанні всього обсягу науково-експериментальних досліджень, статистичної обробки та аналізу одержаних даних, формулюванні наукових положень і висновків, що підтверджуються відповідною документацією.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідалися та були схвалені на: –

засіданнях вченої ради Інституту ветеринарної медицини УААН в період
1997-2000 рр.;–

нараді-навчанні для лікарів ветеринарної медицини на тему: "Основні принципи застосування методу полімеразної ланцюгової реакції в вірусологічних дослідженнях", що була проведена на базі Центральної державної лабораторії ветеринарної медицини (22 лютого 2001 р., м. Київ).–

науково-методичному семінарі "Лабораторна ветеринарна медицина: фізико-хімічні методи досліджень" (5-6 лютого 1998 р., м. Рівне); –

міжнародній науково-практичній конференції: "Проблеми патології, санітарії та безпліддя в тваринництві" (10-11 грудня 1998 р., м. Мінськ). –

європейській міжнародній генетичній конференції: "European Human Genetics Conference 2002" (25-28 травня 2002 р., м. Страсбург, Франція).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 6 наукових праць,
у тому числі у 4-х наукових фахових виданнях, з яких одна одноосібна. Розроблено 2 методичні рекомендації.

Структура дисертації. Дисертація викладена на 135 сторінках і складається із вступу, огляду літератури, методів досліджень, результатів досліджень, висновків, пропозицій виробництву, додатків, списку використаних джерел літератури (всього 274 найменування). Робота проілюстрована 16 таблицями та 26 рисунками, 1 формулою. Ілюстрації, таблиці, список використаних джерел викладені на 67 сторінках.

Основний зміст роботи

Огляд літератури і вибір напрямків дослідження. Складається з 6 підрозділів, в яких наведено аналіз наукової літератури, що стосується ролі спадковості у сприйнятливості до лейкозу великої рогатої худоби, впливу аліментарних факторів на природну резистентність організму великої рогатої худоби, впливу вірусу лейкозу на генетичний апарат, застосування методу полімеразної ланцюгової реакції для діагностичних досліджень та виявлення змін у генетичному апараті. Аналіз даних літератури свідчить про те, що зміни, які відбуваються в генетичному апараті під впливом вірусу лейкозу на різних стадіях інфекційного процесу, з’ясовані недостатньо. Майже не вивчена роль точкових мутацій у геномі інфікованого вірусом лейкозу поголів’я великої рогатої худоби, можливі наслідки цих мутацій. Комплексне дослідження біохімічних та генетичних змін в організмі великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозу, необхідне для подальшого вивчення патогенезу цього захворювання.

Матеріали і методи дослідження. Дослідження проведені на великій рогатій худобі чорно-рябої породи віком 2-2,5 роки, в ТЗОВ "Україна" Тернопільського району, Тернопільської області в період 1997-2000 рр. Господарство спеціалізується на вирощуванні великої рогатої худоби м’ясо-молочного напрямку. У зимовий період утримання тварин прив’язне, а в літній – стійлове з використанням пасовищ. Господарство неблагополучне на лейкоз великої рогатої худоби протягом трьох років.

Досліди були проведенні в два етапи: на початку та в кінці стійлового періоду. З метою формування контрольної і дослідної груп кров від великої рогатої худоби досліджували в РІД для виявлення інфікованих вірусом лейкозу тварин. На основі результатів дослідження було сформовано контрольну і дослідну групи тварин по 10 голів у кожній. Тварини обох груп утримувалися в окремих приміщеннях і отримували однаковий раціон. У піддослідних тварин досліджували клінічний стан: вимірювали температуру тіла, частоту пульсу, дихання, розмір лімфатичних вузлів (надвименних, предлопаткових, шийних, колінної складки).

Для біохімічних досліджень використовували зразки крові, одержаної з яремної вени тварин. У крові та кормах визначали вміст мікроелементів (мідь, цинк, марганець, кобальт, залізо) методом атомно-абсорбційної спектрофотометрії на приладі AAS-30 (Carl Zeiss Jena, Німеччина). У сироватці крові визначали загальний вміст білків рефрактометричним методом та співвідношення окремих білкових фракцій, вміст вітаміну А – колориметричним методом, у цільній крові – вміст глюкози за методом Сомоджі (Методичні вказівки щодо методів біохімічних досліджень біологічного матеріалу, які застосовуються в державних лабораторіях ветеринарної медицини при діагностиці захворювань. № 15-14/29, 2000 р.).

Молекулярно-генетичні дослідження (ПЛР та RAPD-PCR) проводилися на базі лабораторії генетики Інституту свинарства УААН (м. Полтава). Для дослідження окремих ділянок геному досліджуваних тварин застосовували метод RAPD-PCR із специфічним праймером ILO 1127, який охоплює декілька локусів геному великої рогатої худоби. Методом ПЛР використовували специфічні праймери на локуси MAF-50 і ВМ-315. Праймери для RAPD – PCR та локусів MAF-50 і ВМ-315 синтезували в НВП "Біоаналітичні технології", м. Харків.

Результати досліджень

Вміст загального білка і окремих білкових фракцій у сироватці крові ве-ликої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозу. З наявних у літературі даних відомо, що у корів, хворих на лейкоз, змінюється вміст загального білка і співвід-ношення окремих білкових фракцій у сироватці крові. Ступінь цих змін залежить від ряду факторів: стадії захворювання, годівлі і утримання. При аналізі отриманих результатів ми не виявили зв’язку між змінами вмісту окремих мікроелементів і змінами білкового складу сироватки крові великої рогатої худоби, а також даних про вплив стадії захворювання тварин на вказані зміни. Тому окремий етап дисер-таційної роботи становило порівняльне дослі-дження загального вмісту білків і вмісту окремих фракцій у сироватці крові здорових і хворих на лейкоз тварин.

Наведені у таблиці 1 дані свідчать про те, що вміст загального білку у сироватці крові великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозу, на початку і наприкінці стійлового періоду був відповідно у 1,14 і 1,22 рази більший (Р<0,001), ніж у тварин контрольної групи.

У сироватці крові тварин дослідної групи на початку стійлового періоду разом з більшим загальним вмістом білків виявлено менший вміст альбумінів і альфа-глобулінів (Р < 0,01) та вищий вміст гама-глобулінів (Р < 0,001), ніж у сироватці крові тварин контрольної групи (рис.1). Загалом альбуміново – глобулінове відношення у сироватці крові тварин дослідної групи було в 1,40 рази менше, ніж у сироватці крові корів контрольної групи (Р < 0,001).

Таблиця 1

Вміст загального білка в сироватці крові великої рогатої худоби,

інфікованої вірусом лейкозу (M±m, г/л, n=10)

Групи тварин |

Загальний білок

Початок стійлового періоду | Кінець стійлового періоду

Дослідна | 86,5±0,14*** | 88,3±0,64***

Контрольна | 76,0±0,19 | 72,7±0,26

Примітка. Тут і надалі *– Р < 0,05; ** – Р < 0,01; *** – Р < 0,001.

Наприкінці стійлового періоду різниці у співвідношенні білкових фракцій у сироватці крові корів дослідної групи порівняно до корів контрольної групи, подібні до різниць, виявлених на початку стійлового періоду, що свідчить про зв’язок між стадією захворювання і синтезом сироваткових білків у великої рогатої худоби. Так, вміст загального білка в сироватці крові великої рогової худоби дослідної групи наприкінці стійлового періоду був більший, ніж у сироватці крові корів контрольної групи в 1,22 рази (Р < 0,01).

Рис. 1. Вміст окремих білкових фракцій у сироватці крові досліджуваних тварин на початку стійлового періоду | Рис. 2. Вміст окремих білкових фракцій у сироватці крові досліджуваних тварин наприкінці стійлового періоду

Вміст альбумінів у сироватці крові корів дослідної групи наприкінці стійлового періоду був у 1,31 рази менший (Р < 0,01), а вміст гама-глобулінів в 1,42 рази більший (Р < 0,01) (рис. 2), ніж у тварин контрольної групи. З цих даних випливає, що інфікування великої рогатої худоби вірусом лейкозу приводить до підвищення синтезу імун-них білків у клітинах білої крові. Різниці у вмісті альфа- і бета-глобулінів у сироватці крові корів дослідної групи, порівняно до корів контрольної групи, при цьому виражені незначною мірою (Р< 0,5). Коефіцієнт А/Г у сироватці крові тварин дослідної групи на початку стійлового періоду був менший в 1,4 рази (Р < 0,001), а наприкінці – в 1,6 рази (Р < 0,01), ніж у тварин контрольної групи.
З цих даних випливає, що на ступінь зміни складу вмісту окремих фракцій сироваткових білків у корів протягом стійлового періоду впливає або стадія захворювання, або зниження поживної і біологічної цінності кормів.

Рівень глюкози в крові піддослідних тварин. Проведені дослідження показали, що інфікування великої рогатої худоби вірусом лейкозу приводить до значного порушення обміну вуглеводів у її організмі. Так, вміст глюкози в крові тварин дослідної групи на початку стійлового періоду був в 1,75 рази менший (Р< 0,01), ніж у крові тварин контрольної групи (рис.3). Ці данні заслуговують на увагу у зв’язку з важливим значенням глюкози у субстратному забезпеченні енергетичних процесів у клітинах крові, центральної нервової системи, серцевого і скелетних м’язів (Яно-вич В.Г., Сологуб Л.І., 2000).

Аналогічної різниці у вмісті глюкози в крові корів дослідної групи, порівняно до корів контрольної групи, виявлені також у кінці стійлового періоду. Отже, в організмі великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозу, порушуються біохімічні механізми регуляції гомеостазу глюкози, в основі якого лежить, з одного боку, її синтез у печінці, а з іншого використання моносахаридів у тканинному метаболізмі.

Рис. 3. Концентрація глюкози
в крові досліджуваних тварин | Рис. 4. Концентрація вітаміну А в
сироватці крові досліджуваних тварин

Вміст вітаміну А в сироватці крові піддослідних тварин. Для виявлення змін в обміні вітаміну А в організмі інфікованої вірусом лейкозу великої рогатої худоби визначали його вміст у сироватці крові.

Проведенні дослідження показали (рис. 4), що рівень вітаміну А в сироватці крові тварин дослідної групи на початку стійлового періоду був в 1,12 рази менший, ніж у сироватці крові тварин контрольної групи (Р < 0,5 ). Наприкінці стійлового періоду вміст вітаміну А в сироватці крові тварин дослідної групи був в 1,76 рази менший, ніж у сироватці крові тварин контрольної групи (Р < 0,01), що свідчить про різке зменшення запасів вітаміну А в печінці інфікованих тварин, внаслідок чого його рівень у сироватці крові знижується. Причиною цього може бути посилення вільнорадикальних процесів в організмі тварин при прогресуванні захворювання. Ці дані заслуговують на увагу у зв’язку з тим, що при зменшенні рівня вітаміну А в організмі великої рогатої худоби, порушується білковий обмін (Вальдман А.Р. и др., 1993). У регуляції обміну білків в організмі тварин важливу роль відіграє ретинол-транспортуючий білок, який відноситься до альфа-глобулінової фракції.

Вміст мікроелементів у крові піддослідних тварин. Проведені дослідження показали, що вміст більшості досліджуваних мікроелементів у крові інфікованої великої рогатої худоби був значно менший, ніж у не інфікованої. Зокрема, на початку стійлового періоду вміст заліза в крові тварин дослідної групи був менший в 1,62 рази (Р<0,01), міді – в 1,77 рази (Р<0,01), кобальту – в 2,38 рази (Р<0,01), ніж у крові тварин контрольної групи (табл.2). Різниці у вмісті цинку і марганцю в крові тварин дослідної групи порівняно до тварин контрольної групи при цьому були невірогідні (Р < 0,5).

Аналогічні різниці у вмісті заліза, міді та кобальту в крові великої рогатої худоби дослідної групи порівняно з контрольними тваринами виявлені і наприкінці стійлового періоду (табл. 2). Так, наприкінці стійлового періоду вміст заліза у крові великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозу, був менший в 1,92 рази (Р < 0,01), міді – в 1,75 рази (Р < 0,01), кобальту – в 2,05 рази (Р < 0,001), ніж у тварин контрольної групи (Р < 0,001). Вміст цинку в крові тварин дослідної групи був менший, ніж у крові тварин контрольної групи в 1,5 рази (Р < 0,01). Різниці у вмісті марганцю в крові тварин дослідної групи порівняно до тварин контрольної групи не вірогідні (Р < 0,5).

Таблиця 2

Вміст мікроелементів у цільній крові великої рогатої худоби,
інфікованої вірусом лейкозу (M±m, n=10)

Мікроелемент | Групи тварин

Початок стійлового періоду | Кінець стійлового періоду

Контрольна група | Дослідна група | Контрольна

група | Дослідна група

Мідь, мкмоль/л | 11,24±0,47 | 6,36±0,78** | 10,71±0,08 | 6,12±0,28**

Цинк, мкмоль/л | 29,16±2,65 | 24,17±2,85* | 27,83±1,16 | 20,56±0,85**

Залізо, ммоль/л | 7,14±0,31 | 4,42±0,35** | 6,81±0,25 | 3,55±0,16**

Марганець, мкмоль/л | 1,86±0,25 | 1,51±0,23 | 1,52±0,07 | 1,37±0,08

Кобальт, мкмоль/л | 0,50±0,08 | 0,21±0,03** | 0,37±0,08 | 0,18±0,009***

З аналізу наведених у таблиці 2 даних видно, що вміст більшості досліджуваних мікроелементів в крові великої рогатої худоби дослідної групи протягом стійлового періоду зменшується: заліза – в 1,25 рази (Р < 0,05), кобальту – в 1,16 рази (Р < 0,05), цинку – в 1,17 рази (Р < 0,5). Вміст міді і марганцю в крові великої рогатої худоби протягом стійлового періоду зменшується значно менше (Р < 0,5 ).

З одержаних результатів випливає, що вміст майже всіх досліджуваних мікроелементів в крові великої рогатої худоби протягом стійлового періоду зменшується, а ступінь цього зменшення у тварин дослідної групи виражений більшою мірою, ніж у тварин контрольної групи. Ці зміни, як показали проведені нами дослідження, обумовлені зменшенням вмісту мікроелементів у раціоні тварин. Так, на початку стійлового періоду забезпеченість великої рогатої худоби досліджуваними мікроелементами становила: залізом – 88,90%, кобальтом – 56,69%, марганцем – 46,25%, міддю – 90,10%, цинком – 91,14%. Наприкінці стійлового періоду забезпеченість великої рогатої худоби становила залізом – 68,32%, кобальтом – 18,98%, марганцем – 33,46%, міддю – 73,80%, цинком – 51,23%. Загалом, як випливає з наведених результатів, забезпеченість досліджуваного поголів’я мікроелементами протягом стійлового періоду зменшилася: залізом – в 1,3 рази, міддю – в 1,22, кобальтом – в 3, цинком – в 1,78, марганцем – в 1,38 рази.

Аналіз локусів МАF-50 та ВМ-315 лейкоцитів піддослідних тварин методом ПЛР. Вірусні інфекції, зокрема вірус лейкозу великої рогатої худоби, відіграють ключову роль у процесах мутагенезу, в тому числі у пухлинній трансформації клітини. Включення онкогенного вірусу в геном клітини-господаря викликає його зміни і пошкодження. Зміни генетичного апарату лімфоцитів відіграють певну роль у подальшому розвитку патологічної трансформації цих клітин у процесі розвитку захворювання при лейкозі великої рогатої худоби. Вже на початковій фазі дії вірусу лейкозу на велику рогату худобу відбувається взаємодія вірусу з ДНК лімфоцитів, що приводить до її змін і пошкоджень.

З метою подальшого вивчення ролі цих змін у патогенезі захворювання, використовуючи дані банку генів, ми підібрали специфічні праймери (GENBANK Seguences M7737 і GENBANK Seguences G18514) з нуклеотидною послідовністю окремих ділянок геному соматичних клітин великої рогатої худоби, а саме ділянки високополіморфних локусів MAF-50 і ВМ-315. При цьому ми визначили місце локалізації локусу MAF-50 в геномі соматичних клітин великої рогатої худоби на хромосомі № 4. Було встановлено, що цей локус знаходиться між локусами ВМ-1260 та RM-067 (рис. 5). Кількість алелей в локусі MAF-50 – 8, розмір алелей від 152 до 166 пар нуклеотидів (п.н.). Синоніми локусу MAF-50 – MAF-050, DU-13S3, OARMAF-50.

При проведенні ПЛР (полімеразної ланцюгової реакції) у 20 зразках лейкоцитів, одержаних від великої рогатої худоби контрольної і дослідної груп, встановлено, що спектри локусів MAF-50 і BM-315 у зразках лейкоцитів на обох етапах дослідження не відрізняються між собою. Виключення становить одна тварина, в якої у зразках лейкоцитів при повторному дослідженні виявлені зміни в алельному спектрі в порівнянні з першим дослідженням в обох локусах – MAF-50 і BM-315. Зокрема, в локусі MAF-50 встановлено появу нових алельних варіантів розміром 166 пар нуклеотидів (при встановленому розмірі алелей від 152 до 166 п.н.), у локусі BM-315 – зникнення алеля розміром 152 п.н. та появу нових алельних варіантів розміром 158 і 162 п.н.

Рис. 5. Схема розташування локусу MAF-50

Локус ВМ-315 (рис. 6) знаходиться на хромосомі № 5, між локусами ВМ-43 і ВМ-287, кількість алелей –17, розміри алелей – від 107 до 163 п.н., синонім локусу – D5S22.

Рис. 6. Схема розташування локусу ВМ 315

Поява нових алельних варіантів у локусах MAF-50 і BM-315 та зникнення виявлених раніше алельних варіантів свідчить про мутаційні зміни в геномі клітин-попередників лейкоцитів. Можна припустити, що під час другого дослідження крові у великої рогатої худоби дослідної групи існувало дві популяції лейкоцитів, що відрізнялися за нуклеотидним складом вказаних локусів.

В результаті досліджень встановлено, що оцінка геному інфікованої вірусом лейкозу великої рогатої худоби за двома високополіморфними локусами, чутливими до дії мутагенних факторів, проведена на такій кількості тварин, не дозволяє повною мірою оцінити кількісну сторону мутаційного процесу в геномі соматичних клітин. Більш об’єктивна оцінка може бути проведена при аналізі декількох локусів геному соматичних клітин великої рогатої худоби, що досягається RAPD-PCR аналізом, який був застосований нами у подальших дослідженнях.

Аналіз поліморфних локусів за допомогою RAPD-PCR методу. Новий метод молекулярно-генетичних досліджень – ПЛР з довільними праймерами ( RAPD-PCR) при аналізі окремих ділянок геному соматичних клітин великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозу, застосований нами вперше. RAPD-PCR метод широко застосовується в генетичних дослідженнях при клонуванні генів, встановленні спадковості, визначенні філогенетичного зв’язку між видами, у селекційних програмах. Цей метод не вимагає попереднього знання нуклеотидної послідовності в геномі і дозволяє дослідити велику кількість високополіморфних локусів.

При проведенні RAPD-PCR аналізу з метою стандартизації результатів досліджень геному тварин дослідної і контрольної груп був застосований маркер довжини нуклеотидних пар л/psti (120–2556 п.н.).

У результаті проведених досліджень (початок стійлового періоду – кінець стійлового періоду) виявлені індивідуальні зміни у спектрі RAPD-фрагментів, які свідчать про зміни геному соматичних клітин великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозу. У тварин дослідної групи, інфікованої вірусом лейкозу, в порівнянні з тваринами контрольної групи кількість таких змін у RAPD-спектрі в середньому була більша (табл. ).

Зміни в окремих ділянках геному свідчать про мутаційний процес у соматич-них клітинах великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозу. До таких змін можуть належати точкові мутації, а також інерції, до яких можна віднести вклю-чення геному провірусу лейкозу в геном соматичних клітин інфікованих тварин. Нами вирахувана частка смуг, що не співпадає, у сумі всіх смуг та розташування смуг у RAPD-спектрах, визначених протягом періоду досліджень крові. Різниця між дослідною і контрольною групами тварин у частці смуг RAPD-спектрів при першому і другому дослідженні крові тварин дослідної і контрольної груп віро-гід-на (Р < 0,05).

Таблиця 3

Результати RAPD-PCR-аналізу досліджуваної великої рогатої худоби

Показники | № дослідних тварин

Контрольна група | Дослідна група

1 | 2 | 3 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6

Кількість смуг у RAPD спектрі при 1-му
дослідженні лейкоцитів | 12 | 13 | 10 | 14 | 21 | 5 | 15 | 7 | 13

Кількість смуг у RAPD спектрі при 2-му
дослідженні лейкоцитів | 16 | 13 | 14 | 16 | 16 | 12 | 10 | 8 | 12

Кількість смуг, що
не співпадають | 4 | 2 | 4 | 5 | 7 | 7 | 5 | 5 | 11

Сума смуг спектру при
1-му і 2-му дослідженнях | 28 | 26 | 24 | 30 | 37 | 17 | 25 | 15 | 25

Частка смуг, що не співпа-дають, порівняно до суми | 0,14* | 0,08* | 0,17* | 0,17* | 0,19* | 0,41* | 0,20* | 0,33* | 0,44*

Використаний нами підхід до аналізу змін в окремих ділянках геному соматичних клітин великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозу, дозволяє статис-тично обґрунтувати вплив певних факторів (у даному випадку лейкозної інфекції ) на геном соматичних клітин при дослідженні невеликих по кількості груп цих тварин.

Висновки

1. Проведено дослідження метаболічного профілю крові і структури окремих ділянок ДНК у локусах MAF-50 і BM-315 хромосом № 4 і № 5 у лейкоцитах великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозу, на різних стадіях захворювання.

2. Вміст вітаміну А в сироватці крові, глюкози і мікроелементів (міді, заліза, кобальту, цинку) у крові великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозу, значно менший (Р < 0,05 – 0,001), ніж у неінфікованих корів.

3. Вміст загального білка і гамма-глобулінів у сироватці крові інфікованої вірусом лейкозу великої рогатої худоби значно більший (Р<0,001), а вміст альбумінів – менший (Р<0,01), порівняно до їх вмісту у сироватці крові здорових тварин.

4. Відношення альбуміни/глобуліни в сироватці крові великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозом, на початку стійлового періоду було меншим в 1,40 рази (Р<0,001), а в кінці стійлового періоду – в 1,60 рази (Р<0,001), ніж у сироватці крові неінфікованих тварин.

5. У результаті застосування методу полімеразної ланцюгової реакції виявлені зміни окремих ділянок ДНК у локусах MAF-50 (хромосома № 4) та ВМ-315 (хромосома № 5) лейкоцитів великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозу.

6. RAPD-PCR аналіз у нашій модифікації більш інформативний при малих вибірках тварин у порівнянні з існуючими методами оцінки впливу мутагенних факторів.

7. У інфікованої вірусом лейкозу великої рогатої худоби частота індивідуальних змін в геномі лейкоцитів за спектрами досліджуваних RAPD-фрагментів значно вища (Р < 0,05), ніж у неінфікованих тварин.

Пропозиції виробництву

Під час виконання дисертаційної роботи розроблені:

1. Рекомендації для практичних лабораторій ветеринарної медицини України, науково-дослідних інститутів та інших ветеринарних закладів, які використовують в своїй роботі метод молекулярно-генетичних досліджень ПЛР: "Методичні рекомендації по організації та проведенню робіт у лабораторіях, які використовують метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)" Розробники А.М. Голов-ко, О.М. Дерябін, З.Р. Троценко, Р.А. Голубець, В.О. Гарматюк, В.В. Кацімон, Т.Р. Левицький. Затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини України від 9.01.2002 р. № 15-14/1. – К.: – 2002. – 18 с.

2. Для науково-дослідних інститутів ветеринарної медицини і науково-дослідних інститутів тваринництва України "Методичні вказівки по оцінці дії вірусу лейкозу великої рогатої худоби на геном соматичних клітин тварин методом полімеразної ланцюгової реакції з довільними праймерами (RAPD-PCR)" Розробники: Р.А. Голубець; В.М. Балацький. Затверджених Державним департаментом ветеринарної медицини України від 10.07.2001 р. № 15-14/204. – К.: – 2001. – 10 с.

СПИСОК ОСНОВНИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Голубець Р.А. Вивчення біохімічних показників крові у РІД-позитивної ве-ликої рогатої худоби // Вет. медицина: Міжвід. тематич. наук. зб. – Харків, 2000. – Вип. . – С. .

2. Клестова З.С., Балацький В.М., Голубець Р.А. Виявлення мутацій у великої рогатої худоби позитивно реагуючих у РІД на лейкоз // Науковий вісник Національного аграрного університету: Зб.наук.праць. – К.: НАУ. – 2001. – № 36. – С. 143-146. (Дисертант провів експериментальні дослідження, відбір контрольної та дослідної груп тварин, постановку молекулярно-генетичних реакцій ПЛР та RAPD-PCR, статистичну обробку, аналіз і узагальнення отриманих даних).

3. Голубець Р.А., Балацький В.М. Вивчення змін у генетичному апараті великої рогатої худоби, яка позитивна у РІД на лейкоз, методом полімеразної ланцюгової реакції // Ветеринарна медицина України. – 2000. – № 4. – С. . (Дисертант провів вивчення змін в геномі великої рогатої худоби, виконав експериментальні дослідження, статистичну обробку, аналіз і узагальнення отриманих даних).

4. Клестова З.С., Голубець Р.А. Молекулярні механізми дії вірусу лейкозу ве-ликої рогатої худоби // Науковий вісник Львівської державної академії ветеринар-ної медицини: Зб. наук. праць. – Львів. – 2003. – С. 90-94. (Дисертант провів узагальнення наукових даних про дію вірусу лейкозу на геном великої рогатої худоби, а також представив свої данні, що свідчать про зміни в алельному cпектрі в локусах MAF-50 та BM-315 в великої рогатої худоби інфікованої вірусом лейкозу).

5. Методичні вказівки по оцінці дії вірусу лейкозу великої рогатої худоби на геном соматичних клітин тварин, методом полімеразної ланцюгової реакції з довільними праймерами (RAPD-PCR). // Р.А. Голубець., В.М. Балацький. (Затвердженні Головою Державного департаменту ветеринарної медицини Мінагрополітики України від 10.07.2001 р. № 15-14/204). – К.: – 2001 р. – 10 с. (Дисертант розробив основні положення, проводив експериментальні дослідження та узагальнив отримані результати).

6. Методичні рекомендації по організації та проведенню робіт у лабораторіях, які використовують метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)./Розробники: А.М.Головко, О.М.Дерябін, З.Р.Троценко, Р.А. Голубець, В.О. Гарматюк, В.В.Каци-мон, Т.Р.Левицький. (Затверджено науково-технічною радою Державного депар-таменту ветеринарної медицини Мінагрополітики України, протокол № 1 від
25 грудня 2001р.). – К.: – 2001 р. – 13 с. (Дисертант приймав участь у формулюван-ні основних положень, що випливають з результатів проведених досліджень).

Анотація

Голубець Р.А. Зміни метаболічного профілю крові і окремих ділянок ДНК лімфоцитів великої рогатої худоби при лейкозі. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Інститут біології тварин УААН, Львів, 2003.

Дисертація присвячена дослідженню ряду біохімічних показників у сироватці крові та структури деяких ділянок геному 4- і 5-ї хромосом лейкоцитів крові великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозу, на різних стадіях захворювання. Встановлено вірогідно більший вміст загального білка і гама-глобулінів та менший вміст альбумінів, вітаміну А в сироватці крові, ряду мікроелементів (міді, цинку, кобальту, заліза) і глюкози в крові великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозу, ніж у здорових тварин.

Частота індивідуальних змін у геномі клітин лейкоцитів інфікованої вірусом лейкозу великої рогатої худоби за спектрами досліджуваних RAPD-фрагментів більша, ніж у неінфікованих тварин.

Ключові слова: лейкоз, мутації, полімеразна ланцюгова реакція, лімфоцити, мікроелементи, глюкоза, білкові фракції, вітамін А.

Аннотация

Голубец Р.А. Изменения метаболического профиля крови и отдельных участков ДНК лимфоцитов крупного рогатого скота при лейкозе. – Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата ветеринарных наук по специальности 03.00.04 – биохимия. – Институт биологии животных УААН, Львов, 2003.

Проблема ликвидации лейкоза крупного рогатого скота в Украине остаётся одной из наиболее актуальных. Этим объясняется продолжение углубления ис-следований, направленных на изучение биохимических и генетических аспектов патогенеза заболевания. Исследования возбудителя вируса лейкоза крупного рогатого скота и особенностей его влияния на геном животных и обмен веществ в их организме имеет значение для изучения патогенеза заболевания, разработки новых, более эффективных способов его диагностики и ликвидации. В связи с этим проведено сравнительное исследования содержания общего белка и отдельных его фракций в сыворотке крови, глюкозы, витамина А и ряда микроэлементов в крови, а также структуры отдельных локусов генома хромосом № 4 и № 5 лимфоцитов крови крупного рогатого скота, инфицированного вирусом лейкоза.

Проведённые исследования показали, что содержания общего белка и гамма-глобулинов в сыворотке крови крупного рогатого скота, инфицированного вирусом лейкоза, в начале и в конце стойлового периода было достоверно выше, а содержание альбуминов – ниже, чем в сыворотке крови неинфицированных животных. Альбуминово-глобулиновое соотношение в сыворотке крови инфицированных животных в начале стойлового периода было больше в 1,40 раза
(Р < 0,001), а в конце его – в 1,60 раза (Р < 0,01), чем у неинфицированных живот-ных. Уровень глюкозы в крови инфицированных вирусом лейкоза животных в начале стойлового периода был ниже в 1,75 раза (Р < 0,01). Такая же тенденция сохранялась у животных опытной группы в конце стойлового периода – содержа-ние глюкозы было в 1,78 раза выше (Р < 0,01), чем у здоровых животных. Содер-жание железа в крови крупного рогатого скота, инфицированного вирусом лейкоза, в начале стойлового периода было меньше в 1,61 раза (P < 0,01), меди – 1,77 раза (Р < 0,01), кобальта – в 2,38 раза (Р < 0,01), чем в крови здоровых животных. В конце стойлового периода содержание указанных микроэлементов в крови инфицированных животных было меньше соответственно в 1,92, 1,75, 2,05 раза (Р,0,01 – 0,001) по сравнению с их содержанием в крови неинфицированных животных. При анализе уровня микроэлементов в крови, установлено снижение содержания железа, цинка, кобальта в течение стойлового периода в крови крупного рогатого скота контрольной и опытной групп. Так, содержание железа в крови крупного рогатого скота, инфицированного вирусом лейкоза, уменьшилось в 1,25 раза (Р < 0,05), кобальта – в 1,16 раза (Р < 0,5), цинка – в 1,17 раза (Р < 0,5), марганца – в 1,10 раза (Р < 0,5), а в крови неинфицированных животных – соответственно в 1,03 (Р < 0,5), 1,35 (Р < 0,05), 1,04 (Р < 0,5) и 1,20 (Р<0,01) раза.

В результате проведённых исследований выявлено индивидуальные изменения спектра RAPD – фрагментов, которые свидетельствуют об изменениях генома соматических клеток крупного рогатого скота, инфицированных вирусом лейкоза. У животных опытной группы, инфицированных вирусом лейкоза по сравнению с животными контрольной группы количество таких изменений в RAPD – спектре в среднем было значительно больше.

Сравнительное исследование методом ПЛР локусов MAF-50 и ВМ-315 в хромосомах № 4 и № 5 лимфоцитов крови инфицированного и неинфицированного поголовья показало, что в течении исследуемого периода в локусе MAF-50 хромосомы № 4 лимфоцитов инфицированных животных появился новый аллельный вариант размером 166 п.н. В локусе ВМ-315 выявлено исчезновение аллеля размером 152 п.н и появление новых аллелей размером 158 п.н. и 162 п.н.

Использованный нами подход при анализе изменений в отдельных участках генома соматических клеток крупного рогатого скота инфицированного вирусом лей коза позволяет статистически обосновать влияние разных факторов (в данном случае лейкозной инфекции) на геном соматических клеток при исследовании небольших групп этих животных.

Ключевые слова: лейкоз, мутации, полимеразная цепная реакция, лимфоциты, микроэлементы, глюкоза, белковые фракции, витамин А./

annotation

Golubets R.A The changes of metabolic profile of blood and separate fragments of DNA in lymphocytes of cattle by leucosis. – Manuscript.

The thesis for a candidate’s degree of veterinary sciences in speciality 03.00.04 – biochemistry. – Institution of animal’s biology, Lviv,