МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я

ТЕРНОПІЛЬСЬКА ДЕРЖАВНА МЕДИЧНА АКАДЕМІЯ

ім. І.Я. ГОРБАЧЕВСЬКОГО

ГРАНКІВСЬКА СВІТЛАНА СТЕПАНІВНА

УДК: 616.36-002-02:546.173/.264]-06-092.9

РОЛЬ ПОРУШЕНЬ ДЕТОКСИКУЮЧОЇ СИСТЕМИ ТА ЕНДОГЕННОЇ ІНТОКСИКАЦІЇ В ПАТОГЕНЕЗІ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ГЕПАТИТУ, ВИКЛИКАНОГО ПОЄДНАНОЮ ДІЄЮ НАТРІЮ НІТРИТУ І ТЕТРАХЛОРМЕТАНУ, ТА ЇХ КОРЕКЦІЯ

14.03.04 – патологічна фізіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Тернопіль - 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Тернопільській державній медичній академії

ім. І.Я.Горбачевського Міністерства охорони здоров'я України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Гонський Ярослав Іванович, Тернопільська державна медична академія ім. І.Я. Горбачевського, професор кафедри медичної хімії.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Бідюк Мартин Миколайович, Львівський державний медичний університет ім. Данила Галицького, завідувач кафедри патологічної фізіології, м. Львів;

доктор медичних наук, доцент Заморський Ігор Іванович, Буковинська державна медична академія, завідувач кафедри фармакології та фармації, м. Чернівці.

Провідна установа: Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, відділ по вивченню гіпоксичних станів, м. Київ.

Захист відбудеться 27 лютого 2003 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К .601.01 у Тернопільській державній медичній академії ім. І.Я. Горбачевського (46000, м. Тернопіль, майдан Волі, 1)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Тернопільської державної медичної академії ім. І.Я. Горбачевського МОЗ України (м. Тернопіль, вул. Руська, 12)

Автореферат розісланий 24 січня 2003 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук, професор Боднар Я.Я.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В умовах прогресування техногенного забруднення довкілля одним із пріоритетних напрямків токсикології та медицини залишається вивчення особливостей та механізмів комбінованої дії ксенобіотиків – факторів ризику багатьох екологічно залежних хвороб (Сердюк А.М., 1998; Трахтенберг И.М., 1998). Серед найпоширеніших ксенобіотиків, як свідчать дані епідеміологічних досліджень, - пестициди, нітрити та нітрати, солі важких металів, галогенопохідні, гідразин та інші (Коршун М.М., Колесова Н.А., Веремій М.І. та інші, 2001). В сучасній літературі достатньо широко висвітлені особливості, характер та механізм дії подвійних та потрійних комбінацій зазначених вище речовин на рівні смертельних доз (Mitcheva M., Astroug H., Drenska D. et al., 1993; M. Boll, L.W. Weber, E. Becker, Stampfl A., 2002). Однак накопиченої інформації недостатньо для прогнозування наслідків дії їх складних багатокомпонентних комбінацій на рівні порогових та підпорогових доз, під впливом яких знаходиться населення. Труднощі такого прогнозування пов’язані з рядом причин, у тому числі з особливостями біотрансформації екзогенних хімічних речовин в організмі та неоднозначною роллю в цих процесах мікросомальних оксигеназ, навіть коли відомі молекулярні механізми токсичності окремих хімічних речовин (Голиков С.Н., Саноцкий И.В., Тиунов Л.А., 1986; Sanz N., Dґiez-Fernґandez C., Alvarez A.M. et al., 1999).

Надлишкове використання азотних добрив і викиди азоту промисловими підприємствами призводять до забруднення навколишнього середовища нітратами, які легко перетворюються в нітрити. Різко зростає їх вміст у харчових продуктах, воді (Рубенчик Б.Л., Осиньковская Н.Д., Михайленко В.М. и др., 1990). Цьому сприяє і широке використання нітратів у харчовій промисловості та побуті. Натрію нітрит - класичний метгемоглобіноутворювач, за його дії на організм розвивається гемічна гіпоксія. Згідно з деякими даними (Шугалей И.В., Львов С.Н., Целинский И.В., Баев В.И., 1992), натрію нітрит у контакті з оксигемоглобіном призводить до утворення активних радикалів, що пошкоджують біологічні системи, проявляють виражену цитотоксичну дію та ініціюють процеси пероксидного окиснення.

Значне місце в арсеналі засобів, що обумовлюють гострі отруєння з ураженням печінки, займають галогенопохідні, в основному хлоровані вуглеводні. За частотою отруєнь ксенобіотики цієї групи посідають друге місце серед отруєнь хімічними речовинами і викликають розвиток тяжких некрозо-дистрофічних змін у печінці (Лужников Е.А., 1982; Slater T.F., 1989). Внаслідок принципової подібності основних механізмів пошкодження гепатоцитів різними хімічними агентами, неспецифічної дії більшості отрут особливого значення набули дослідження ураження печінки тетрахлорметаном (Губський Ю.І., 1999; Edwards M.J., Keller B.J., Kauffman F.C., 1993). Ця класична модель є загальноприйнятою для вивчення механізмів пошкодження мембран гепатоцитів, пошуку нових методів лікування.

Як натрію нітрит, так і тетрахлорметан надзвичайно поширені в природі, побуті та на виробництві, тому вивчення поєднаної їх дії в експерименті представляє як науково-теоретичний, так і практичний інтерес.

Наявні дані літератури не розкривають патогенетичної суті впливу натрію нітриту та поєднаної дії цієї сполуки з тетрахлорметаном на стан ендогенної інтоксикації та детоксикуючої системи. Недостатня увага з боку науковців приділяється вивченню вікової реактивності в динаміці розвитку уражень гепатотоксинами, хоча відомо, що з віком змінюється відповідь організму на вплив сторонніх чинників. Усе ще складною і далекою до задовільного вирішення залишається проблема корекції біохімічних порушень, викликаних дією ксенобіотиків.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є складовою частиною планової наукової міжкафедральної теми “Вивчення стану окисних процесів при дії на організм ксенобіотиків” (кафедр медичної хімії та біології) Тернопільської державної медичної академії (№ держреєстрації 0101U001311), у виконанні якої автором самостійно проведено дослідження токсичного ураження організму натрію нітритом і в поєднанні з тетрахлорметаном та його корекції за допомогою антиоксидантів і ентеросорбентів, що викладено в матеріалах дисертації.

Мета і завдання дослідження. З’ясувати роль ендогенної інтоксикації і детоксикуючої системи в динаміці розвитку токсичного ураження печінки натрію нітритом та комбінацією натрію нітриту з тетрахлорметаном у щурів 3- та 18-місячного віку, а також встановити ефективність корекції порушень цих процесів за допомогою ентеросорбенту “Фібрабет” та металокомплексу гістидинату міді.

Відповідно до мети було поставлено такі основні завдання:

1. Вивчити в динаміці зміни показників ендогенної інтоксикації та детоксикуючої системи в печінці і плазмі крові щурів 3- та 18-місячного віку, уражених натрію нітритом.

2. Дослідити динаміку показників ендогенної інтоксикації та детоксикуючої системи за умов поєднаної дії натрію нітриту та тетрахлорметану з урахуванням вікових змін і порівняти із змінами цих показників при нітритній інтоксикації.

3. Дослідити вплив металокомплексу гістидинату міді на стан детоксикуючої системи та ендогенної інтоксикації за різних стадій розвитку токсичного ураження печінки, викликаного натрію нітритом і при його поєднанні з тетрахлорметаном, у щурів різного віку.

4. Дослідити ефективність дії на показники ендогенної інтоксикації та детоксикуючої системи ентеросорбенту “Фібрабет” і його поєднання з гістидинатом міді в досліджуваних тварин з нітритною інтоксикацією та нітритно-тетрахлорметановим токсикозом.

Об’єкт дослідження – нітритний та нітритно-тетрахлорметановий токсикоз у білих лабораторних щурів 3- та 18-місячного віку.

Предмет дослідження – показники ендогенної інтоксикації та детоксикуючої системи у тварин різного віку, уражених натрію нітритом та тетрахлорметаном на тлі нітритної інтоксикації.

Методи дослідження – біохімічні: вміст середніх молекул, еритроцитарний індекс інтоксикації, активність аланін- і аспартат-амінотрансфераз, активність кислої та лужної фосфатаз, вміст малонового діальдегіду та окиснювально модифікованих білків як показники ендогенної інтоксикації; деметилазна і гідроксилазна активність мікросом, вміст SH-груп для оцінки стану детоксикуючої системи.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше комплексно досліджено взаємозв’язок і взаємозалежність стану ендогенної інтоксикації і детоксикуючої системи за дії натрію нітриту у віковому аспекті. Встановлено, що ураження тетрахлорметаном на тлі нітритної інтоксикації викликає суттєве порушення процесів детоксикації, а також зміни показників ендогенної інтоксикації в крові і печінці тварин обох вікових груп (статевого дозрівання і старіння). Доведено ефективність корекції нітритної та нітритно-тетрахлорметанової інтоксикації за допомогою ентеросорбенту “Фібрабет”. Виявлено, що введення гістидинату міді викликає позитивні зміни показників детоксикуючої системи та ендогенної інтоксикації у тварин досліджених вікових груп, як у крові, так і в печінці. Доведено виразний нормалізуючий вплив поєднаної дії гістидинату міді та “Фібрабету”, застосованих з метою корекції детоксикуючої системи та ендогенної інтоксикації.

Практичне значення одержаних результатів. Результати проведених досліджень розширюють і поглиблюють існуючі знання про механізм впливу натрію нітриту та його комбінації з тетрахлорметаном на стан детоксикуючої системи і показники ендогенної інтоксикації, відкривають шляхи для вдосконалення способів детоксикації організму за допомогою антиоксидантів та ентеросорбентів.

Виражена антиоксидантна дія гістидинату міді вказує на доцільність його подальшого вивчення для можливого використання з метою корекції біохімічних порушень за патології, що супроводжується активацією вільнорадикальних процесів.

Результати дослідження впроваджені на кафедрах патофізіології, медичної хімії, фармакології та загальної гігієни і екології Тернопільської державної медичної академії ім. І.Я. Горбачевського у навчальний процес, що підтверджено відповідними актами впровадження (від 25 вересня 2002 р.).

Особистий внесок здобувача. Самостійно проведені експерименти, біохімічні дослідження, статистична обробка одержаних результатів, написання та оформлення дисертації. З науковим керівником інтерпретовані результати досліджень та підібрані засоби для корекції біохімічних порушень.

У трьох наукових працях, опублікованих у співавторстві, автору належать аналіз літератури, дані експериментальних досліджень, їх статистична обробка та підготовка матеріалу до друку.

В актах впровадження в тій частині, що стосується наукової новизни, використано власний матеріал автора.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що внесені до дисертації, оприлюднені на V та VІ Міжнародних медичних конгресах студентів та молодих вчених (Тернопіль, 2001, 2002), на ІІ Львівсько-Люблінській конференції з експериментальної та клінічної біохімії (Люблін, Польща, 2002).

Публікації. Опубліковано 5 наукових праць, з яких 3 – у фахових наукових виданнях, рекомендованих ВАК України, 2 – у матеріалах і збірниках конференцій та конгресів.

Структура дисертації. Дисертація викладена на 176 сторінках і складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методик дослідження, 4 розділів власних досліджень, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків, рекомендацій щодо наукового і практичного використання здобутих результатів, списку використаних літературних джерел (всього 275 найменувань). Робота проілюстрована 34 таблицями та 11 рисунками і містить 6 додатків. Загальний обсяг ілюстрацій, таблиць, списку використаних джерел і додатків становить 51 сторінку.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Досліди проведені на білих нелінійних щурах-самцях, які утримувалися на стандартному раціоні віварію. Для дослідження використовували щурів двох вікових періодів: статевого дозрівання (3-місячні) та старіння (18-місячні). В експерименті було використано 424 тварини.

Iнтоксикацiю тварин натрію нітритом викликали шляхом дворазового внутрішньошлункового введення натрію нітриту в дозі 70 мг/кг маси тіла (?ЛД50) (Фіра Л.С., Гонський Я.І., Гранківська С.С., Фіра Д.Б., 2000) з інтервалом в одну добу. Токсичне ураження печінки моделювали шляхом одноразового внутрішньошлункового введення 50 % олійного розчину тетрахлорметану з розрахунку 0,25 мл на 100 г маси тіла тварини, на 4-у добу після першого введення натрію нітриту.

Усі піддослідні тварини були поділені на такі групи: 1 – інтактні; 2 – уражені натрію нітритом, 3 - уражені тетрахлорметаном на тлі нітритної інтоксикації; 4, 5, 6 – групи уражених тварин, в яких для корекції біохімічних порушень використовували, відповідно, ентеросорбент “Фібрабет”, гістидинат міді та поєднання “Фібрабету” з гістидинатом міді. Евтаназію проводили під легким ефірним наркозом на 1-, 4- та 7-у доби після останнього введення ксенобіотика.

Ентеросорбент “Фібрабет” - біологічно активний додаток (отриманий на кафедрі медичної хімії Тернопільської державної медичної академії і затверджений МОЗ України) - вводили із розрахунку 1 г/кг маси тіла за допомогою зонда щоденно протягом усього експерименту. Металокомплекс гістидинат міді синтезовано на кафедрі медичної хімії Тернопільської державної медичної академії з гістидину та гідроксиду міді. Гістидинат міді вводили внутрішньошлунково, починаючи від дня першого введення натрію нітриту, в дозі 0,94 мг/кг (біотична доза міді в крові) (Кубант Р.М., 2001).

Матеріалами дослідження були плазма крові, сироватка крові, цільна кров та гомогенат печінки.

Показники ендогенної інтоксикації визначали такими методами: вміст середніх молекул (СМ) за методом Оськина В.В., Чекалина К.И. (1987) в модифікації Ромашова Ф.Н., Джогендра Мандала (1988) - досліджували СМ1 при ?=256 нм (визначаються ланцюгові амінокислоти) та СМ2 при ?=280 нм (визначаються ароматичні амінокислоти); еритроцитарний індекс інтоксикації (ЕІІ) – за кількістю поглинутого барвника еритроцитарними мембранами (Тогабаєв А.А., 1988); активність аланінамінотрансферази (АлАТ) (КФ 2.6.1.2.) та аспартатаміно-трансферази (АсАТ) (КФ 2.6.1.1.) – за методом Райтмана і Френкеля (Горячковський А.М., 1994), який базується на здатності 2,4-динітрофенілгідразину в лужному середовищі утворювати забарвлений гідразон піровиноградної кислоти, за інтенсивністю якого оцінюють активність амінотрансфераз; активність кислої фосфатази (КФ) (КФ 3.1.3.2.) - за методом Богданського, який базується на здатності бета-гліцерофосфату в кислому середовищі взаємодіяти з молібдатом амонію і аскорбіновою кислотою, в результаті чого утворюється неорганічний фосфат; активність лужної фосфатази (ЛФ) (КФ 3.1.3.1) - принцип методу полягає в здатності лужної фосфатази розщепляти фенілфосфат з утворенням фенолу і фосфату. (Фенол реагує з 4-амінофеназоном у присутності окиснювача - перйодату натрію з утвореннями забарвленого хіноніміму; інтенсивність забарвлення реакційного розчину прямо пропорційна активності ферменту (Горячковський А.М., 1994)); вміст малонового діальдегіду (МДА) - фотоколометричним методом за інтенсивністю забарвленого комплексу, який утворюється при взаємодії малонового діальдегіду з тіобарбітуровою кислотою в кислому середовищі (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972); ступінь окиснювальної модифікації білків (ОМБ) плазми крові оцінювали за вмістом альдегідо- і кетонопохідних нейтрального та основного характеру, які утворюються при взаємодії альдегідних і кетонних груп окиснено-модифікованих білків з 2,4-динітрофінілгідразином, та утворенням 2,4-динітрофенілгідрозонів, що мають характерний спектр (Дубинина А.А., 1993, в модифікації Мещишен І.Ф., 1998).

Показники детоксикуючої системи оцінювали за станом мікросомального окиснення: N-деметилазна активність – за кількістю утвореного формальдегіду в реакції деметилювання диметиланіліну, р-гідроксилазна активність – за кількістю утвореного р-амінофенолу, який разом з фенолом у присутності карбонату натрію утворює індофенольний комплекс синього кольору в реакції гідроксилювання аніліну (Карузина И.И., Арчаков А.И., 1977); вміст вільних SH-груп визначали за методом Дж. Елмана (1959).

Результати досліджень піддавали статистичному аналізу (Гублер Е.В., 1978). Достовірність отриманих результатів визначали, використовуючи критерій Ст'юдента. Зміни вважали достовірними при р<0,05. Для розрахунків використовували комп’ютерну програму Exel (Microsoft, США).

Основні результати досліджень. Результати проведених нами досліджень свідчать про значні зміни перебігу ендогенної інтоксикації та детоксикуючої системи у тварин обох вікових груп під впливом використаних ксенобіотиків. У нормі з віком вміст достовірних маркерів токсичного синдрому (Бурмистров С.О., Габелова К.А., Андреева А.А., 2001) - СМ1 та СМ2 в плазмі крові зростає (табл. 1), що підтверджує думку про те, що при переході організму від молодого до старого віку відбувається посилення катаболічних процесів. Максимальні значення СМ1 та СМ2 відмічено у старих (18-міс.) щурів. У тварин, яким вводили натрію нітрит, вміст молекул середньої маси достовірно збільшувався протягом усього експерименту і максимальних показників досягав у молодих щурів на 4-у добу, а у старих - на 7-у добу досліджень. Поєднане введення натрію нітриту і тетрахлорметану супроводжувалось значно інтенсивнішим зростанням даного показника ендогенної інтоксикації (ЕІ), причому в 3-місячних тварин максимальні зміни спостерігались вже на 1-у добу експерименту, а у старих на 7-у добу. Це свідчить про потенціювання токсичної дії обох токсичних агентів, що може супроводжуватись як посиленням в організмі катаболічних процесів, так і пригніченням функціональної активності системи детоксикації.

Така ж тенденція спостерігалася і стосовно іншого показника ендогенної інтоксикації – еритроцитарного індексу інтоксикації (ЕІІ). Максимальні значення останнього в інтактних тварин спостерігалися у віці 18-місяців. При отруєнні щурів натрію нітритом найбільших значень ЕІІ досягав на 4-у добу експерименту в молодих і на 7-у добу в старих тварин. Щодо комбінованого ураження, то зміни були більш виражені, ніж при нітритному токсикозі, що, ймовірно, свідчить про посилення порушень цілісності мембран еритроцитів. Враховуючи, що еритроцитарні мембрани розглядаються як прототип плазматичних мембран всіх клітин організму, то підвищення їх проникності (зростання ЕІІ) можна вважати загальним проявом для мембран клітин організму, в тому числі печінки і нирок, що проявляється їх цитолізом та виходом з цитоплазми органо- та органелоспецифічних ферментів, наприклад трансаміназ, кислої та лужної фосфатаз тощо.

Таблиця 1

Динаміка вмісту СМ (ум. од.) у крові щурів при нітритній інтоксикації та за комбінованої дії натрію нітриту та тетрахлорметану (Мm; n=6)

Вік | Показ-ник | Група тварин

Інтактні

щури | Уражені щури, доба експерименту

1 | 4 | 7

3-міс. | СМ1 | 0,2170,004 | Нітритне | 0,2860,002* | 0,2980,002* | 0,2740,005*

3-міс. | СМ2 | 0,0270,003 | 0,0650,003* | 0,0850,004* | 0,0730,004*

18-міс. | СМ1 | 0,2860,006 | 0,2990,004* | 0,3490,005* | 0,3660,007*

18-міс. | СМ2 | 0,0510,003 | 0,0630,005* | 0,080 0,005* | 0,0920,006*

3-міс. | СМ1 | 0,2170,004 | Комбіноване | 0,3330,005* | 0,3030,004* | 0,2860,005*

3-міс. | СМ2 | 0,0270,003 | 0,0960,005* | 0,0820,007* | 0,0750,005*

18-міс. | СМ1 | 0,2860,006 | 0,3570,004* | 0,3900,006* | 0,4030,006*

18-міс. | СМ2 | 0,0510,003 | 0,0820,008* | 0,1000,008* | 0,1150,002*

Примітка: * - зміни достовірні відносно інтактних тварин (р0,05)

З метою дослідження функціонального стану мембранних структур ми вивчали деякі ферменти, активність яких відзеркалює функціонування плазматичних (АлАТ та АсАТ, ЛФ) та лізосомальних (КФ) мембран. З віком в інтактних тварин відмічено підвищення ферментативної активності трансаміназ. Отримані результати свідчать, що ізольоване введення натрію нітриту в щурів 3- та 18-місячного віку викликало однотипні, спрямовані в сторону зростання зміни, які істотно залежать від кількості днів з часу потрапляння в організм отрути. Найбільше зростання активності АсАТ та АлАТ в сироватці крові та гомогенаті печінки тварин обох вікових груп відмічено на 7-й день експерименту. Поєднання ж натрію нітриту та тетрахлорметану призвело до істотного підвищення ферментативної активності як АлАТ, так і АсАТ у молодих щурів уже на 1-й день досліджень в обох досліджуваних тканинах, що підтверджує дані багатьох досліджень про те, що організм, який розвивається, є чутливішим до дії ксенобіотиків (Тимофеев В.П., Семенова В.В., 1993). У 18-місячних тварин ми спостерігали лінійне в часі зростання даних показників як у сироватці крові, так і в гомогенаті печінки, з максимальними значеннями на 7-й день експерименту. Причому абсолютні числові значення при комбінованому ураженні істотно відрізнялись від таких при нітритному токсикозі, що свідчить про адитивну дію обох ксенобіотиків на плазматичні мембрани (Khoo C., Hallquist N.A., Samuelson D.A., Cousins R.J., 1996; Dudka J., Szczepaniak S., Tomaszewska B., 1995). Такі ж за спрямованістю зміни спостерігались і при дослідженні активності лужної і кислої фосфатаз.

При нітритному та нітритно - тетрахлорметановому токсикозах спостерігається значне підвищення вмісту малонового діальдегіду та альдегідо- і кетонопохідних нейтрального (ОМБ370 нм) й основного (ОМБ430 нм) характеру. Під впливом натрію нітриту максимального вільнорадикального окиснення зазнають ліпіди і білки у тварин 3-місячного віку на 4-у добу експерименту, тоді як за сумісної дії натрію нітриту та тетрахлорметану - на 1-у добу. У тварин 18-місячного віку максимальні достовірні зміни спостерігались на 7-й день ураження, однак за комбінованого ураження вони були найбільш виражені. Це, очевидно, свідчить про те, що введення тетрахлорметану на тлі нітритної інтоксикації сприяло інтенсивнішому утворенню активних форм кисню (АФК) в процесі метаболізму даних ксенобіотиків. Аналогічна закономірність змін, що простежується між МДА та ОМБ, опосередковано підтверджує думку про те, що як пероксидне окиснення ліпідів, так і окиснювальна модифікація білків визначаються утворенням активних форм кисню (Гонський Я.І., Кубант Р.М., Кліщ І.М., 2001).

Ксенобіотики в печінці піддаються процесові метаболічного розпаду під дією мікросомальних ферментів (Туряница И.М., Пащенко А.Е., Фабри З.Й. и др., 1996). Встановлено, що в інтактних тварин з віком відбувається зниження як гідроксилазної, так і деметилазної активності мікросом. Це є підтвердженням думки про те, що з віком знменшується активність ферментів, які каталізують реакції І фази біотрансформації ксенобіотиків, зокрема мікросомальної монооксигеназної системи (Китани К., 1993; Lee D.W., Yu B-P., 1990). У щурів, отруєних натрію нітритом (табл. 2), швидкість деметилювання диметиланіліну мікросомами печінки достовірно знижувалась вже на 1-у добу досліджень. Однак в молодих тварин максимальні зміни спостерігались на 4-у, а в старих - на 7-у доби експерименту. Аналогічні зміни були отримані і при дослідженні гідроксилювання аніліну.

Таблиця 2

Зміна активності мікросомального окиснення (мкмоль/(кгхв)) у печінці тварин, уражених натрію нітритом та комбінацією натрію нітриту з тетрахлорметаном (Мm; n=6)

Вік |

Показник | Група тварин

Інтактні

щури | Уражені, доба експерименту

NaNO2 | NaNO2+

CCL4 | NaNO2 | NaNO2+

CCL4 | NaNO2 | NaNO2+

CCL4

1 | 4 | 7

3-міс. | N-демети-

лазна | 16,22

0,45 | 11,01

0,64* | 4,99

0,44* | 7,46

0,63* | 9,10

0, 63* | 10,94

0,70* | 10,67

0,61*

p-гідрок-силазна | 1,61

0,06 | 1,16

0,05* | 0,56

0,05 * | 0,71

0,05* | 0,89

0,05 * | 1,02

0,05* | 1,08

0,07*

18-міс. | N-демети-

лазна | 8,07

0,35 | 6,64

0,63 | 5,75

0,51* | 4,99

0,49* | 4,38

0,43* | 4,31

0,43* | 2,94

0,23*

p-гідрок-силазна | 0,75

0,04 | 0,62

0,06* | 0,59

0,04* | 0,44

0,04* | 0,40

0,04* | 0,39

0,03* | 0,31

0,02*

Примітка: * - зміни достовірні відносно інтактних тварин (р0,05)

Поєднане застосування натрію нітриту і тетрахлорметану мало значно інтенсивніший пригнічувальний вплив на стан окиснювальних процесів у мікросомах гепатоцитів, аніж ізольоване введення нітриту.

Наслідком пригнічення окиснювальних процесів є нагромадження недоокиснених продуктів, які можуть активувати чи бути субстратами реакцій вільнорадикального окиснення. SH-групи, у складі білків, пептидів чи амінокислот, здатні взаємодіяти з вільними радикалами, тим самим знижуючи їх токсичну дію. Впродовж експерименту вміст вільних SH-груп в досліджуваних тканинах знаходився на дуже низькому рівні. Причому, як при нітритному, так і при комбінованому токсикозах більш виражені зміни спостерігались в молодих тварин (Губський Ю.И., 1998).

Для корекції порушень детоксикуючої системи та ендогенної інтоксикації, викликаних введенням натрію нітриту та тетрахлорметану, ми використали речовини з антиоксидантною та сорбційною дією.

Одним із сучасних методів лікування токсичних уражень печінки є ентеросорбція, принцип якої ґрунтується на пригніченні ендогенної інтоксикації внаслідок фіксації на поверхні сорбенту токсинів, що знаходяться в просвіті шлунково-кишкового тракту. Нами було використано препарат “Фібрабет”, який створений на кафедрі медичної хімії Тернопільської державної медичної академії проф. Я.І. Гонським та рекомендований МОЗ України як біологічно-активний додаток (свідоцтво № 7.09.2951 від 25 листопада 1997 р.).

Застосування “Фібрабету” мало позитивний вплив на зниження вмісту СМ в обох групах тварин у всі періоди експерименту. Найменші відхилення значення цього показника в крові молодих лікованих щурів відмічали при нітритному ураженні.

Зниження ферментативної активності АлАТ в крові та печінці молодих тварин на 4-у та 7-у доби експерименту спостерігалося при нітритному ураженні та в усі доби в крові, а також на 4-у і 7-у доби в печінці при комбінованому токсикозі. Щодо старих тварин, то цей показник мав лише тенденцію до зменшення, однак зміни не були достовірні відносно уражених тварин. Знижувалась також і активність АсАТ, проте суттєво лише у 3-місячних тварин на 1-у добу при нітритному ураженні. Більшу мембраностабілізувальну дію має ентеросорбент відносно до ЛФ. Нами зафіксовані достовірні зміни активності цього ферменту в молодих тварин в усі дні досліджень при корекції обох токсикозів. Менш помітними вони були у 18-місячних щурів. Також відмічено зниження активності КФ, особливо у тварин 3-місячного віку. Отже, можна констатувати виражену мембраностабілізуючу дію застосованого сорбенту, механізм якої, ймовірно, пов’язаний з позитивним впливом на процеси ліпопереокиснення та зниження токсичного навантаження на клітини печінки. Введення “Фібрабету” сприяло нормалізації вмісту вторинного продукту пероксидного окиснення ліпідів (МДА). У крові і печінці молодих тварин відмічалось зниження вмісту МДА протягом усього експерименту як при нітритному, так і при нітритно-тетрахлорметановому токсикозах. Про ефективну дію “Фібрабету” свідчить також зниження утворення ОМБ у плазмі крові, причому ці зміни були практично однаковими як у 3-, так і у 18-місячних щурів. Застосування “Фібрабету” мало позитивний вплив і на функціональну здатність мікросом та вміст вільних SH-груп, що може бути пов’язано з властивістю ентеросорбенту знижувати функціональне навантаження на печінку і нормалізувати активність ферментів мікросомального окиснення.

Аналізуючи отримані результати, можна констатувати, що ентеросорбент “Фібрабет” знижує вираженість токсичного синдрому, пригнічує активність ліпопероксидації, стабілізує проникність плазматичних та лізосомальних мембран печінки, активує окиснювальні детоксикаційні процеси у мікросомах гепатоцитів за умов інтоксикації натрію нітритом і в комбінації з тетрахлорметаном.

Перспективним і сучасним методом терапії, у тому числі і токсичних уражень печінки, є застосування амінокислот та їх металокомплексів (Гонський Я.І., Михалків М.М., 2000; Кубант Р.М., 2001). Нами було використано для корекції порушень, викликаних ксенобіотиками, синтезований на кафедрі медичної хімії Тернопільської державної медичної академії проф. Я.І. Гонським металокомплекс гістидину з міддю.

Результати досліджень показали, що введення гістидинату міді нормалізувало вміст СМ у крові тварин обох вікових груп. Максимальне зниження цього показника спостерігали при нітритному ураженні в молодих та старих тварин на 7-у добу досліджень, за комбінованого токсикозу – в 3-місячних щурів на 4-у, у 18-місячних - на 7-у доби. Застосування даного середника також позитивно впливало на ЕІІ. Таким чином, введення гістидинату міді зменшувало вираженість токсичного синдрому. Дослідження показників, які характеризують стан мембранних структур, також показало позитивний вплив металокомплексу гістидинату міді. Знижувалася ферментативна активність як ферментів, що характеризують плазматичні мембрани (АлАТ, АсАТ, ЛФ), так і лізосомальних (КФ) у досліджуваних тканинах тварин обох вікових груп. Як і при дослідженні маркерів ендогенної інтоксикації, кращому лікувальному впливу піддавались тварини з нітритним ураженням, а з-поміж вікових груп – молоді 3-місячні щури.

Застосування гістидинату міді дало позитивні результати і при дослідженні функціонального стану мікросом. Нами зафіксовано підвищення активності деметилювання диметиланіліну та гідроксилювання аніліну в досліджуваних тварин як при нітритному, так і при нітритно-тетрахлорметановому токсикозах. Максимальне наближення даних показників до рівня інтактних тварин спостерігалось у молодих щурів на 7-у добу досліджень за нітритного ураження. Щодо 18-місячних тварин, то кращий коригувальний ефект гістидинату міді також спостерігався при ураженні нітритом натрію, однак відновлення активності окиснювальних процесів у мікросомах печінки в них було менш виражене, аніж у 3-місячних щурів.

Як видно з наведених результатів досліджень (табл. 3), застосування гістидинату міді в значній мірі пригнічувало активність вільнорадикальних процесів, про що можна судити за зниженням вмісту МДА та ОМБ у досліджуваних тканинах, що дозволяє припустити наявність у використаному середнику антиоксидантних властивостей. Найбільше зниження вмісту МДА в крові і печінці молодих тварин відмічено при нітритному та комбінованому ураженні з 4-ї доби експерименту, а в старих тварин на - 7-й день. Подібна тенденція спостерігалась і щодо вмісту альдегідо- та кетонопохідних ОМБ нейтрального (ОМБ370 нм) і основного (ОМБ430 нм) характеру.

Достовірних змін у сторону норми зазнавав і компонент глутатіонової системи- вільні SH-групи. У крові і печінці тварин 3-місячного віку спостерігався значно кращий ефект від введення тваринам гістидинату міді порівняно із старими щурами.

Таблиця 3

Зміна окиснено-модифікованих білків (ОМБ) (моль/кг) у крові тварин, уражених натрію нітритом та тетрахлорметаном на тлі нітритної інтоксикаіцї, в процесі корекції гістидинатом міді (Мm; n=6)

Вік |

Показник |

Група тварин

Інтактні щури | Уражені, доба експерименту

NaNO2 | NaNO2+

CCL4 | NaNO2 | NaNO2+

CCL4 | NaNO2 | NaNO2+

CCL4

1 | 4 | 7

3-міс. | ОМБ 370 | уражені |

0,79

0,01 | 0,85

0,01* | 1,17

0,03* | 0,95

0,01* | 0,96

0,02* | 0,86

0,01* | 0,88

0,01*

кореговані | 0,87

0,01 | 1,04

0,03# | 0,85

0,01# | 0,88

0,02# | 0,82

0,01# | 0,85

0,01#

ОМБ 430 | уражені |

0,50

0,01 | 0,55

0,01* | 0,66

0,01* | 0,58

0,01* | 0,61

0,01* | 0,54

0,01* | 0,57

0,01*

кореговані | 0,55

0,01 | 0,63

0,01# | 0,54

0,01# | 0,57

0,02# | 0,53

0,01 | 0,54

0,01#

18-міс. | ОМБ 370 | уражені |

0,95

0,01 | 1,02

0,02* | 1,26

0,07* | 1,18

0,02* | 1,28

0,01* | 1,25

0,01* | 1,35

0,01*

кореговані | 1,09

0,02# | 1,22

0,02 | 1,19

0,02 | 1,30

0,02 | 1,08

0,04# | 1,20

0,01#

ОМБ 430 | уражені |

0,61

0,01 | 0,68

0,01* | 0,73

0,01* | 0,73

0,02* | 0,79

0,01 * | 0,76

0,01* | 0,85

0,01*

кореговані | 0,64

0,01# | 0,70

0,02 | 0,74

0,02 | 0,81

0,02 | 0,67

0,02# | 0,79

0,02#

Примітка: * - зміни достовірні відносно інтактних тварин (р0,05)

# - зміни достовірні відносно уражених тварин (р0,05)

Таким чином, використання гістидинату міді у тварин з експериментальним гепатитом, викликаним натрію нітритом та в поєднанні з тетрахлорметаном, відновлювало стан детоксикуючої системи та сприяло зменшенню вираженості токсичного синдрому, послабленню вільнорадикального окиснення ліпідів та білків і нормалізації антиоксидантної здатності печінки.

Роздільне введення ентеросорбенту “Фібрабет” і металокомплексу гістидинату міді хоч і мало позитивний вплив на досліджувані показники стану ендогенної інтоксикації та детоксикуючої системи, проте не досягало нормалізації всіх параметрів. Зважаючи на це, ми вирішили дослідити ефективність поєднаного застосування цих середників.

Отримані результати свідчать про значно більшу ефективність поєднаного застосування досліджуваних засобів порівняно з роздільним їх введенням. Так, при дослідженні СМ максимально наближені до норми значення отримані на 7-у добу експерименту. Однак, як і при корекції гістидинатом міді, найкращий лікувальний вплив використані чинники мали на молодих тварин з нітритною інтоксикацією. Проте використання даних середників менше вплинуло на ЕІІ. На 1-у добу дослідження значення цього показника було на рівні уражених, однак до 7-ї доби достовірно знизилось, що, очевидно, свідчить про позитивний вплив “Фібрабету” та гістидинату міді на клітинні мембрани.

Поєднане застосування ентеросорбенту і металокомплексу проявило позитивний вплив на активність АлАТ та АсАТ, ЛФ та КФ і на функціональну здатність мікросом.

Заслуговує також на увагу здатність середників корекції інгібувати активовані за дії натрію нітриту та тетрахлорметану процеси пероксидації білків та ліпідів, доказом чого є нормалізація в уражених щурів рівня ОМБ та МДА. Кращий і більш пролонгований ефект від поєднання “Фібрабету” та гістидинату міді можна пов’язати, ймовірно, із здатністю гістидину та іонів міді включатися у фізіологічні метаболічні шляхи і тим самим тривалий час знаходитися в організмі, тоді як еньеросорбент знижує токсичне навантаження на клітини печінки за коротший час.

Помітніший вплив комбінація середників, порівняно з їх роздільним введенням, мала і на антиоксидантну систему. Враховуючи, що основний внесок у сумарну величину вільних SH-груп робить відновлений глутатіон, то зростання вмісту SH-груп під впливом чинників корекції в крові і печінці досліджуваних уражених тварин треба вважати активацією антиоксидантної функції глутатіонової системи.

Таким чином, поєднане застосування ентеросорбенту “Фібрабет” та гістидинату міді, який володіє антиоксидантними властивостями, мало більш виражений нормалізуючий вплив на показники ліпопереокиснення, системи антиоксидантного захисту, функціональної активності мікросом, стан плазматичних та субклітинних мембран гепатоцитів у тварин дослідженого віку, ніж роздільне їх введення.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукового завдання, що знайшло своє відображення у встановленні вікових особливостей детоксикуючої системи та ендогенної інтоксикації в інтактних, а також уражених натрію нітритом та тетрахлорметаном на тлі нітритної інтоксикації тварин. Запропоновано нові підходи до корекції порушень, викликаних застосованими ксенобіотиками, за допомогою металокомплексу гістидинату міді та ентеросорбенту “Фібрабет”.

Призначення наукового завдання – з’ясувати у віковому аспекті вплив натрію нітриту та комбінації його з тетрахлорметаном на стан показників ендогенної інтоксикації та детоксикуючої системи організму.

У результаті вирішення наукового завдання зроблено такі наукові та прикладні висновки:

1. Комбіноване ураження тварин натрію нітритом та тетрахлорметаном викликає інтенсивніше пригнічення детоксикуючої системи організму та розвиток синдрому ендогенної інтоксикації щурів обох вікових груп, ніж нітритна інтоксикація. Найбільш виражені зміни спостерігаються у 3-місячних тварин.

2. У крові тварин обох вікових груп за комбінованого впливу натрію нітриту та тетрахлорметану в усі терміни дослідження збільшується вміст молекул середньої маси: при довжині хвилі 254 нм в молодих щурів у 1,5; 1,4; 1,3 разів, в старих - у 1,2; 1,3; 1,4 разів (відповідно на 1-, 4- та 7-у добу експерименту), при довжині хвилі 280 нм – в 3-місчяних тварин у 3,6; 3,0; 2,8 разів; 18-місячних - у 1,6; 2,0; 2,3. Максимальне зростання молекул середньої маси спостерігали у тварин 3-місячного віку на 1-у добу експерименту. Аналогічні особливості виявлені щодо еритроцитарного індексу інтоксикації.

3. Ураження тварин натрію нітритом та комбінацією натрію нітриту з тетрахлорметаном призводить до активації вільнорадикального окиснення як ліпідів, так і білків плазми крові та печінки, ступінь якої залежить від віку. Максимальні зміни спостерігалися у молодих щурів за комбінованого токсикозу на 1-у добу досліджень та становили: малоновий діальдегід у крові (18,02±0,72) (мкмоль/л), у печінці (42,15±0,61) (мкмоль/кг); ступінь окиснювальної модифікації білків плазми крові за рівнем альдегідо- та кетонопохідні нейтрального й основного характеру відповідно (1,17±0,03) та (0,66±0,01) (моль/кг) (р<0,05).

4. За комбінованого впливу застосованих ксенобіотиків значно порушуються процеси детоксикації, про що свідчать пригнічення деметилазної та гідроксилазної активності мікросом (у 3-місячних щурів максимальні зміни складали відповідно 30,8 та 34,8 %; у 18-місячних – 36,4 та 41,3 % від рівня інтактних), зниження вмісту вільних SH-груп у крові і печінці тварин усіх вікових груп.

5. Ентеросорбент “Фібрабет” знижує вираженість синдрому ендогенної інтоксикації (зменшуються вміст молекул середньої маси, еритроцитарний індекс інтоксикації, активність аланінамінотрансферази, аспартатаміно-трансферази, лужної фосфатази, кислої фосфатази у всіх вікових групах), сприяє частковій нормалізації процесів вільнорадикального окиснення (знижується вміст малонового діальдегіду, окиснено-модифікованих білків), активує окиснювальні процеси у мікросомах гепатоцитів (збільшується деметилазна та гідроксилазна активність).

6. Застосування гістидинату міді виявилося ефективнішим засобом корекції інтоксикації, ніж призначення “Фібрабету”, що проявилося нормалізацією більшості показників детоксикуючої системи та ендогенної інтоксикації. Найбільше наближення до показників контрольної групи після введення металокомплексу, відмічено у 3-місячних тварин з нітритною інтоксикацією на 4-у добу експериментів.

7. Комбінація гістидинату міді з ентеросорбентом “Фібрабет” проявляє виражений нормалізуючий вплив на стан мембранних структур та процеси детоксикації, ефективно пригнічує активовані процеси вільнорадикального окиснення ліпідів та білків. Дієвішою ця терапія є у молодих тварин, уражених натрію нітритом на 4-у добу досліджень.

РЕКОМЕНДАЦІЇ ЩОДО НАУКОВОГО ТА ПРАКТИЧНОГО ВИКОРИСТАННЯ ЗДОБУТИХ РЕЗУЛЬТАТІВ

1. Рекомендується для обґрунтування патогенезу проявів токсичного ураження організму нітритами та галогенопохідними, а також іншими ксенобіотиками, або за вільнорадикальних патологій, які супроводжуються підвищенням показників ендогенної інтоксикації та пригніченням детоксикуючої системи, з метою їх нормалізації використовувати гістидинат міді.

2. При виборі адекватних методів корекції за токсичних уражень печінки натрію нітритом та тетрахлорметаном на тлі нітритної інтоксикації враховувати вікові особливості перебігу патологічного процесу.

3. Основні положення дисертації доцільно використовувати у навчальному процесі під час викладання лекційного курсу і на практичних заняттях на кафедрах патофізіології, медичної хімії, фармакології, загальної гігієни і екології.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.

2.

3.

4.

5.

АНОТАЦІЯ

Гранківська С.С. Роль порушень детоксикуючої системи та ендогенної інтоксикації в патогенезі експериментального гепатиту, викликаного поєднаною дією натрію нітриту і тетрахлорметану, та їх корекція. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.04 – патологічна фізіологія. Тернопільська державна медична академія ім. І.Я. Горбачевського МОЗ України. – Тернопіль, 2003.

Робота присвячена вивченню в динаміці змін детоксикуючої системи та ендогенної інтоксикації в печінці та плазмі крові щурів різного віку за дії натрію нітриту і тетрахлорметану на тлі інтоксикації натрію нітритом та корекції їх за допомогою ентеросорбенту та металокомплексу.

Використання ентеросорбенту “Фібрабет”, металокомплексу гістидинату міді та поєднана їх дія з метою корекції біохімічних порушень сприяють певній нормалізації виявлених змін в організмі уражених тварин 3- та 18-місячного віку. Отримані нами результати є експериментальною основою для подальшого вивчення і можливого застосування металокомплексів і природних сорбентів за умов токсичного впливу на організм