Міністерство охорони здоров’я України

Одеський державний медичний університет

Іванова Надія Володимирівна

УДК [612.81:612.8.02]:615.015

Фармакодинаміка і механізми дії лігандів гальмових медіаторних систем при експериментальному моделюванні пароксизмальних станів ЦНС

14.03.05 – фармакологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Одеса – 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Одеському Національному Університеті ім. І.і. Мечникова

Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Жук Ольга Вікторівна, провідний наукових співробітник ПНДЛ-5 Одеського Національного Університету ім. І.І. Мечникова.

офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Карасьова Тамара Леонідівна, д.б.н., професор, провідний науковий співробітник відділу хімії біологічно активних речовин Фізико-хімічного інституту ім. О.В.Богатського.

доктор біологічних наук, професор Маслова Наталія Федорівна, завідувач лабораторії біохімічної фармакології Державного наукового центру лікарських засобів МОЗ та НАН України.

Провідна установа:

Інститут фармакології та токсикології АМН України, відділ нейрофармакології, м.Київ

Захист відбудеться „23„ травня 2003 року о 11 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.600.01 при Одеському державному медичному університеті МОЗ України (65026, м. Одеса, пров. Валіхівський, 2).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Одеського державного медичного університету МОЗ України (65026, Одеса, пров. Валіхівський, 3).

Автореферат розісланий „19„ квітня 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради к.мед.н, ст.н.сп. Соболєв Р.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Дослідження у галузі нейрофармaкології та нейрофізіології дозволили висунути і обгрунтувати принципові положення про провідне значення дефіциту гальмових амінокислот у розвитку ряду патологічних станів ЦНС, таких як епілепсія, афективні розлади, пресинильна деменція, хвороба Паркінсона, хорея Гетингтона (Zigmond M.J. et al, 1999, Chebib M., еt al., 2000; Макулькин Р.Ф., 1982).

Привалююче положення отримала концепція про основоположну роль ГАМКа - медіаторної системи у механізмах розвитку ряду патологій (tanaka C., et al, 1999; Шандра А.А., и соавт. 1999). В сучасній нейрофармакології вивчення кількісних закономірностей взаємодії організму і лікарських засобів, екзогенних лігандів нейрональних рецепторів, звичайно виконують як комплексне експериментальне дослідження, яке включає в себе декілька взаємопов’язаних етапів (Головенко М.Я та спів., 2001). При дії лікарських засобів на організм, процеси, що протікають у ньому, можна умовно розділити на чотири групи або підсистеми: 1.Фармакокінетичні, включно найбільш важливі для розгляду послідуючих рівнів – надходження, розподіл і елімінація з „біофази дії” ліків. 2.Рецепторно-лігадні, що відбуваються у „біофазі дії” ліків - морфофізіологічних структурах, які вміщують специфічні рецептори. 3.Пострецепторні, які є прямими наслідками утворення рецепторно-лігандних комплексів (наприклад, модуляція потоків енергії і речовин). 4.Ефекторні - мають різну фізико-хімічну природу, але є наслідками зміни параметрів попередніх процесів (електрохімічного потенціалу, вільної енергії).

Для обґрунтування принципів взаємозв’язку між динамікою фармакологічного ефекту лікарських засобів in vivo, механізмами дії на молекулярному рівні і кінетикою вмісту лігандів у організмі необхідно визначити найбільш загальні характеристики зазначених підсистем і параметри взаємозв’язку між ними.

Вивчення процесів взаємодії агоністів, інверсних агоністів, антагоністів-лігандів медіаторних систем ЦНС розкриває широкі можливості не тільки для аналізу механізмів дії і особливостей виявлення їх фармакологічної відповіді на рівні цілісного організму, але і дозволяє дослідити особливості функціонування медіаторних систем in vivo у різних режимах (нормі та експериментальній патології або, наприклад, функціонального стану, що змінються під впливом лігандів з різними механізмами дії). Вирішенню цих проблем присвячена дисертаційна робота.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Матеріали дисертації є фрагментами роботи у межах проекту 5.4./ 511 „Механізми функціонування хімічних синапсів і їх регуляція нейротропними засобами у нормі и патології”, яка виконується відповідно до умови № Ф4/1737-97 між Одеським національним університетом ім. І.І. Мечникова і Міністерством України з питань науки і технологій.

Мета дослідження. Оцінка кількісних та якісних показників фармакологічної активності лігандів тормозних медіаторних систем ЦНС при їх дії безпосередньо на нейрони (клітини Пуркін’є) (in vitro), кору головного мозку щурів (in situ) та їх внутрішньовенному введенні (in vivo) у організм експериментальних тварин.

Відповідно меті роботи були поставлені наступні задачі:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

Об’єкт дослідження: гальмівні медіторні системи ЦНС щурів і мишей нелінейних.

Предмет дослідження: процеси пароксизмальних станів ЦНС (in situ, in vivo) і її елементів – нейронів Пуркін’є (in vitro) в умовах дії екзогенних лігандів ГАМКа- і гліцинової рецепторно-медіаторних систем ЦНС.

Методи дослідження: електрофізіологічні, фармакологічні, статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. На основі проведених експериментальних досліджень вперше виконана порівняльна оцінка взаємозв’язку фармакологічних ефектів лігандів гальмових систем ЦНС, при їх реєстрації на моделях різного рівня організації біологічних систем (in vitro, in situ, in vivo). Показано, що параметри процесів функціонування епілептичних комплексів, сформованих конвульсантами, що діють на різні субодиниці ГАМКа – рк, вірогідно відмінні. Проведен порівняльний аналіз динаміки протисудомних ефектів прямих агоністів ГАМКА – рк – феназепаму, барбітал натрію і етанолу. Вперше показано, що для динаміки дії етанолу на епілептичний комплекс, викликаний аплікацією бензпеніціліну, характерна наявність двох фаз – антисудомної і просудомної.

Вперше експериментально підтверджена і математично обґрунтована гіпотеза про необоротність процесів масопереносу лікарських засобів безпосередньо аплікованих на біофазу їх дії. Запропонована математична модель для інтерпретації фармакокінетики аплікованних лігандів ГАМКа – рк, параметри якої визначаються двома необоротними процесами - надходження до „біофази дії” та елімінації з неї.

Отриманні результати дослідження особливостей змін МЕД стрихніну, коразолу і бемегріду на фоні введення феназепаму, барбіталу натрію і етанолу свідчать про незалежність процесів модифікації конфірмаційних станів ГАМК - рк феназепамом від функціональних станів, викликаних взаємодією гальмових систем цНС з різними судомними агентами. Ефекти барбіталу натрію і етанолу спряженні з дією інверсних агоністів гальмових систем ЦНС.

Вперше показана висока фармакологічна активність нового типу лігандів ГАМКА-рк - 2-аміно-5-бром-2’-хлорбензофенону на нейронах - клітинах Пуркін’є (in vitro).

Вперше досліджена порівняльна динаміка змін іонного струму нейронів (клітин Пуркін’є), індукованого прикладанням медіатору і інверсних агоністів ГАМКА – рк, включно раніш невідомого ліганду нового типу–похідного БФ. Обґрунтовані механізми і характеристика процесів, кінетики взаємодії лігандів з ГАМКа – рк з використанням для їх інтерпретації марковських кінетичних схем.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані дослідні результати роботи і структурно – функціональне моделювання процесів розширили існуючі уявлення про процеси функціонування гальмових систем ЦНС при дії на них екзогенних лігандів – лікарських препаратів, що використовуються в практичній медицині.

Прикладний аспект роботи полягає у розробці і обґрунтуванні експериментальних моделей in vitro, in situ, in vivo пароксизмальних станів головного мозку придатних для оцінки, з урахуванням показників фармакокінетики, дії лікарських засобів, що корегують дану патологію.

Вперше виявлені особливості динаміки дії етанолу на епілептичній комплекс, викликаний аплікацією бензпеніциліну, дозволяють запропонувати цей метод як експрес – модель гострого алкогольного абстинентного синдрому для дослідження ефективності нових антиалкогольних препаратів у фазах гострого алкогольного отруєння і абстинентного стану тварин.

Запропонована експериментальна модель дослідження динаміки пароксизмальних станів при дії лікарських засобів безпосередньо введених у біофазу їх дії і математичний апарат її інтерпретації можуть бути успішно застосовані у біофармацевтичних, нейрофармакологічних і електрофізіологічних дослідженнях.

Вперше відмічена фармакологічна активність 5-бром-2‘-хлор-2 – амінобензофенону при безпосередній дії на нейрони (клітини Пуркін’є), дозволяє запропонувати дану сполуку як інструмент (реактив) для дослідження ГАМК – медіаторної системи у електрофізіологічних експериментах.

Власний внесок пошукача. Автором було виконано інформаційний пошук, відпрацовани експериментальні моделі, на основі яких були досліджені процеси функціонування гальмових систем ЦНС при дії їх лігандів. Виконана основна частина експериментальної роботи, здійснено статистичне обрахування отриманих результатів, проведені оформлення таблиць і графіків, сформульовані висновки роботи, опрацьовані та надруковані основні результати.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідались на XV з’їзду українського фізіологічного товариства (Донецьк, 12-15 травня 1998 р), X?ЙЙ ?іжнародному фармакологічному конгресі (Munchen, Germany,1998), Симпозіумах міжнародного товариства нейрохімії і Європейського товариства нейрохімії (Berlin, Germany, 1998, 1999), Другому Європейському конгресі з фармакології (Budapest, Hungary,1999).

Публікації. По темі дисертації опубліковано 9 праць (4 з них – статті у наукових журналах, затверджених ВАК України, 5 – тези доповідей – у збірниках наукових праць).

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 128 сторінках машинопису, вона складається зі вступу. огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, 4 розділів власних досліджень, обговорення дослідних результатів, висновків та списку використаних джерел. Робота проілюстрована 20 рисунками та 9 таблицями. Бібліографія включає 182 джерел (58 вітчизняних та 132 зарубіжних).

Основний зміст дослідження.

Матеріали і методи дослідження. У ході роботи використовувались феназепам, 5- бром-2’- хлор-2 – амінобензофенон (БФ), барбітал натрію, етанол і судомні агенти – коразол, бікукулін, пікротоксин, стрихнін і бензпеніцилін. Досліди були проведені на щурах Вістар і мишах білих нелінійних, обох статей. Досліджувані речовини вводилися внутрішньоочеревинно в 0.9 % розчині NaCL, або в емульсії Twin-80.

Електрофізіологічні експерименти проводили в умовах гострого досліду, утворюючи детермінантні і залежні осередки шляхом аплікацій пеніциліну (10% і 1%), стрихніну (1% і 0,1%), бікукуліну (1% і 0,1%), пікротоксину (1% і 0,1%) на поверхню неокортексу, феназепам (14 мг/кг), барбітал натрію (40 мг/кг) і етанол (5 г/кг) вводили дослідним тваринам внутрішньоочеревинно. Для оцінки епілептичної активності у комплексах осередків вивчили динаміку амплітуди (мВ) пікових потенціалів і їх частоти (кількість потенціалів за 30 сек.), а також інтегрального показника - потужності епілептичного комплексу (добутки амплітуди на частоту, виражені в умовних одиницях (УО)). Оцінку епілептичної активності проводили при аплікації на кору головного мозку розчинів судомних агентів: 0,1 і 0,15 % розчини стрихніну, 1 і 0,1 % - пікротоксину і 25 і 50 % - коразолу. За одиницю оцінки електричної активності мозку приймали величину сумарного відхилення інтегрального середнього значення потенціалу за одиницю часу. Для визначення мінімальних ефективних доз (МЕД), що викликають показники судомного нападу, які реєструються у досліді: клоніко - тонічні судоми (ДКТС) та тонічну екстензію (ДТЕ), - тваринам внутрішньосудинно в хвостову вену вводили з швидкістю 0,01 мл за секунду розчини: бемегріду (0,01 %), коразолу (1 %), стрихніну (0,02 %) на фоні попереднього (за 30 хв) введення різних доз феназепаму, барбітал натрію і етанолу.

Електрофізіологічна реєстрація макроскопічних струмів мембран нейронів Пуркін’є. Струми викликані прикладанням 500 мкМ ГАМК, реєструвались методом „patch-clamp” у конфігурації „цілої клітини”. Фіксацію мембранного потенціалу виконували подачею заданої напруги на два хлор- срібляних електроди, один з яких був опущеним у міжклітинний розчин, другий у внутрішньоклітинний. Розчини, що вміщали ліганди подавались відповідно до методики поданої у (Kopanitsa M.V., et al, 2001). Функціонування каналів, реєстрація струмів, частота і амплітуда контролювались за допомогою комп’ютера. Первинне опрацювання даних (вимірювання амплітуди, нормалізація і т.п.) проводили за допомогою програми „AnDatRa”. Електрофізіологічними показниками були швидкість зміни струму при асоціації речовини з відкритими каналами (фon) і при дисоціації її з блокованих каналів (фoff).

Статистичне і математичне опрацювання результатів досліджень проводилось з використанням програмних пакетів „Statistics 5.0”, ”Mathcad”, „Excel 5.0”.

Дослідження динаміки пароксизмальної активності ЦНС, викликаної інверсними агоністами ГАМК – медіаторної системи і оцінка дії модуляторів. Вивчення показників епілептичної активності при дії інверсних агоністів і антиконвульсивних сполук лігандів ГАМК і гліцінової медіаторних систем продемонструвало (рис.1) вірогідні відмінності у параметрах функціонування епілептичних комплексів – найбільша тривалість (Тмах) існування осередків спостерігалось при дії пеніциліну: середній час існування складав 440± 10,8 хв. Найменша при дії стрихніну - 45±5,5 хв. Бікукуліновий комплекс існував в середньому 200±5,8 хв., а пікротоксиновий - 280±6,8 хв. (рис.1). Максимум потужності у випадку аплікації пеніциліну спостерігався у середньому через 98±5 хв., бікукуліну і стрихніну – 20 ± 5,0 хв., пікротоксину 20 хв. і при цьому на протязі ? 35- 120 хв. знаходився на стаціонарнім рівні, близьким до максимуму потужності.

Рис 1. Динаміка потужності (УО) епілептичного комплексу, викликаного аплікацією на кору головного мозку щурів судомних агентів: пеніциліну (10% і 1%), стрихніну (1% і 0,1%), бікукуліну (1% і 0,1%), пікротоксину (1% і 0,1%)

Порівняння площ (AUK) під кривими, що характеризують динаміку потужності судомних осередків, показало, що дані величини складають наступний ряд: AUK пеніциліну > AUK бікукуліну > AUK пікротоксину > AUK стрихніну.

По такому показнику, як співвідношення площ під контрольними кривими до площі під кривою при введені феназепаму (AUKк/AUKекс.) найбільше зменшення під дією феназепаму спостерігалось для осередків викликаних пеніциліном (у 5,13 рази), при дії стрихніну і бікукуліну – було приблизно однаковим ? 3 рази. Барбітал натрію зменшував час існування комплексу при аплікації бікукуліну до 95 хв. і не змінював даний показник дії стрихніну, аналогічно феназепаму, але такий показник як потужність змінював менше, ніж феназепам, для обох типів осередків. Підтвердженням цьому є і вірогідно (Р ? 0,01) більш високі величини площ під фармакодинамічними кривими. При аплікації пеніциліна час існування осередків під дією барбіталу натрію скорочувався і складав 120 ± 2 хв., потужність при Тмах дорівнювала 74, 3 ± 36умовн. од., AUC епілептичного комплексу зменшилась у 4,18 рази. Вплив етанолу на створення судомними агентами епілептичних осередків був істотно відмінним від дії феназепаму і барбітурату. Так, найбільша антиконвульсивна активність етанолу спостерігалась по відношенню до осередків викликаних аплікацією стрихніну, при цьому істотно (майже у 2 рази) зменшувався час існування комплексу і потужність комплексу. На відміну від дії попередніх модуляторів вже на протязі перших 15 хв. експерименту етанол (5 разів) істотно гальмував потужність, утворених осередків на протязі 3 годин експерименту, але у подальшому інтервалі досліду (3-7,5 год.) спостерігався протилежний процес – зростання епілептичної активності, а з 6 години і до кінця часового інтервалу дослідження – переважаюче по потужності контрольні показники. Аналогічні дані були отримані раніш (Копаниця М.В., et al, 2001; Zhuk O.V., et al, 2001) при дослідженні динаміки антиконвульсивної дії етанолу при внутрішньовенній інфузії інверсних агоністів гальмових медіаторних систем (коразолу, стрихніну). У даній роботі, як і раніш, було показано, що для динаміки ефектів етанолу характерна наявність двох фаз – антисудомної (5-180 хв.) і просудомної (3-6 год.).

Для порівняльного аналізу дії антиконвульсантів нами були розглянуті відносні величини [(Мс–Мі)/Мс] їх протиепілептичної дії (рис.2). Результати досліджень показали (рис.2), що феназепам і барбітал натрію при дії на епілептичні осередки утворенні внаслідок аплікації інверсних агоністів ГАМКа-рк мають приблизно рівну відносну ефективність процесу, етанол виявляє менш виражену дію і меншу відносну швидкість процесу зміни потужності епілептичної активності.

Рис.2. Динаміка антиконвульсивної дії лігандів ГАМКА-рк (відносні величини потужності ((Мс-Мi)/Mc) епілептичних осередків, сформованих аплікацією бікукуліну, стрихніну і пеніциліну.

При дії на епілептичні осередки, утворенні внаслідок блокади стрихніном гліцинової медіаторної системи, відносна швидкість процесів для всіх досліджених лігандів була приблизно однакова, але найбільш виражену антиконвульсівну дію виявляв етанол, найменьшу – барбітал натрію. По відношенню до дії блокатора хлорного каналу – пеніциліну, відносна ефективність процесу зміни активності комплексу на протязі досліджуваного часового інтервалу вища у феназепама, ніж у барбіталу натрію. При введенні етанолу, даний вид аналізу чітко показав параболічне зниження величин відносної ефективності його дії у часі (до 4 год.) і появлення просудомної фази після зазначеного часового інтервалу. Тобто, при одноразовому надходженні до організму високих доз етанолу; можна спостерігати у експерименті зміну функціонального стану ГАМКа – рецепторно-медіаторної системи, що характеризується динамікою відповідною до описаної при алкогольному абстинентному синдромі. Наведені дані про існування 2-х фаз у дослідженій фармакологічній дії етанолу, стабільність і можливість коректної кількісної оцінки кожної з них, дозволяє запропонувати цей метод для визначення параметрів фармакодинамики алкоголю, і як експрес-модель гострого алкогольного абстинентного синдрому.

Моделювання динаміки пароксизмальної активності і фармакокінетики лігандів ГАМКа – рецепторної системи при їх введенні у біофазу дії. Розроблені математичні моделі, що дозволяють визначати параметри фармакокінетики екзогенних лігандів на основі аналізу даних їх фармакодинамики при безпосередній аплікації ксенобіотиків на біофазу їх дії. Кінетична схема масопереносу лігандів за цих умов, ґрунтується на виключенні з аналізу процесів що протікають у зворотних напрямках, так як вважається, що вони відбуваються із зневажливо малою швидкістю. Проведено дослідження динаміки розвитку пароксизмальної активності при аплікації на кору головного мозку щурів різних доз стрихніну, коразолу, пікротоксину. Після аплікації тваринам досліджуємих розчинів у різних концентраціях, реєстрували час початку (t1) реєстрації пароксизмальної активності кори головного мозку і час її припинення (t2), які слугували для подальшого аналізу кінетики масопереносу екзогенних лігандів через біофазу їх дії (комплекс епілептоморфної активності кори) у внутрішнє середовище (системний кровообіг) організму. Розрахункові значення величин констант швидкостей процесів масопереносу і часу досягнення максимального значення (Тmaх) порогових концентрацій наведені в таблиці. Як видно з дослідних даних (табл.1) максимальна пароксизмальна активність спостерігається у інтервалі 1-2 хв. після аплікації коразолу. Розрахункові значення Тmaх концентраційної кривої коразолу визначені як: 1,4 хв., що цілком адекватно описує реальний процес.

Таблиця 1

Використані у експериментах концентрації (%) досліджуваних речовин, апліковані дози (мкг), час початку (t1), припинення (t2) пароксизмальної активності і параметри (розрахункові значення величин) фармакокінетики і фармакодинаміки

Речовина | Р-н (%) | Апл доза мкг | t1 (хв) | t2 (хв) | k1 | k2 | Стер1 | Стер2 | m | Tmaх

Стрихнін | 0,1 | 50 | 11 | 75 | 0,033 | 0,033 | 0,0252 | 0,0208 | 3 | 30,1

Стрихнін | 0,15 | 75 | 5 | 92 | 0,033 | 0,033 | 0,0210 | 0,0219 | 3 | 30,1

Пікротоксин | 0,1 | 50 | 3 | 95 | 0,018 | 0,086 | 0,0046 | 0,0048 | 1 | 23,0

Пікротоксин | 1 | 500 | 0,26 | 220 | 0,018 | 0,086 | 0,0046 | 0,0050 | 1 | 23,0

Коразол | 25 | 12500 | 0,1 | 12 | 0,138 | 2,27 | 0,3064 | 0,3089 | 3 | 1,4

Коразол | 50 | 25000 | 0,047 | 17 | 0,138 | 2,27 | 0,3066 | 0,3099 | 3 | 1,4

Де: k1 и k2 – константы швидкості масопереносу лігандів у біофазу дії;

С1 и С2 – розрахункові значення порогових концентрацій досліджуваних сполук і час досягнення максимального значення (Tmax);

m – кооперативність ефектів.

Для пікротоксину і стрихніну характерні низькі значення величин констант швидкостей масопереносу у біофазі дії: розрахункова величина Тmaх концентраційної кривої пікротоксину склала 23 хв., стрихніну – 30,1 хв., що на порядок перевищує аналогічний параметр фармакокінетики коразолу і відповідає динаміці що спостерігається у дослідах: Максимальна пароксизмальна активність спостерігалась у інтервалі 30-35 хв. після аплікацій стрихніну. Аналіз дослідних даних виконаний у відповідності до алгоритмів розроблених моделей, продемонстрував можливість їх ефективного використання для визначення параметрів фармакокінетики фізіологічно активних речовин, аплікованих безпосередньо на біофазу їх дії. Для фармакодинаміки пікротоксину характерним є некооперативний процес (m=1). Ступень кооперативності фармакологічної дії коразолу і стрихніну визначена як: m 3.

Продемонстровано, що при аплікації сполук безпосередньо на біофазу їх дії, фармакокінетична схема може бути інтерпретована ланцюговою камерною моделлю, параметри якої визначаються двома необоротними процесами першого порядку – находження і елімінації. Експериментально підтверджена гіпотеза про необоротність кінетичної схемі масопереносу ліків, аплікованих безпосередньо на біофазу їх дії.

Оцінка швидкооборотних ефектів лігандів гальмових систем ЦНС. Перспективним напрямком моделювання швидкооборотних ефектів in vivo є внутрішньовенна інфузія інверсних агоністів гальмових медіаторних систем ЦНС, так як ці підходи можуть слугувати підґрунтям досліджень механізмів взаємодії рецепторно-ефекторних систем і їх лігандів у ціліснім організмі. Дослідження дії блокатора хлорних каналів – бензпеніциліну при його внутрішньовенному введенні мишам в дозах від 100 до 1500 мг/кг показали, що при низьких концентраціях (до 1000 мг/кг) у тварин не спостерігалося вираженого нейрофармакологічного ефекту. Високі дози, що наближаються до токсичних, (вище 1000 мг/кг) викликали міоклонічні посмикування, але не спостерігалось клоніко-тонічних судом і тонічної екстензії, характерних для дії інших блокаторів хлорного каналу - коразолу чи пікротоксину. Відсутність чіткого конвульсивного ефекту пеніциліну in vivo найбільш вірогідно пояснюється кінетикою його надходження до біофази дії крізь гематоенцефалічний бар’єр. При внутрішньовенній інфузії стрихніну мишам, на фоні попереднього введення антисудомних препаратів, відмічена однотипна картина для всіх сполук, що мають різні місця зв’язування і структуру – гіперболічне зростання МЕД, в залежності від доз введених агоністів. Характерною особливістю процесів є обмежене і незначне зростання показників судомного нападу, яке характеризується низькими величинами ЕДmaх. Визначення МЕД коразолу бемегріду і стрихніну на фоні введення феназепаму, барбіталу і етанолу у мишей, продемонструвало різні типи залежностей “доза - ефект”. Введення феназепаму у зростаючих дозах, при інфузії коразолу, бемегріду і стрихніну викликає гіперболічне зростання МЕД до деякого значення ЕДмакс. Характерною особливістю дії феназепаму є те, що, незалежно від структури і місця рецепції судомного агента, форма залежності однакова і відповідна до гіперболи першого порядку. Для антиконвульсивної активності барбіталу при внутрішньовенній інфузії коразолу характерне лінійне зростання порогових показників, в залежності від введених доз барбітурату. Кількісні відмінності ефектів феназепаму і барбітал натрію полягають у істотно більш високому значенні ЕДмах., у останнього, що узгоджується з більше вираженою модифікацією провідності хлорного каналу, виявленою раніш (Akaike N.1985), і полягає у збільшенні часу перебування іонофору у відкритому стані. Зміна МЕД бемегріду на фоні введення мишам барбітал натрію має більш складний характер - форма залежності “доза - ефект” має S - образний характер, що передбачає більш складні взаємовідносини конформерів рецепторно - іонофорного комплексу, що потребують більш детальних досліджень. Внутрішньоочеревинне введення мишам етанолу змінює МЕД коразолу і бемегріду параболічно, тобто при високих його дозах спостерігається необмежене зростання показників, найбільш виражене для тонічної екстензії. На підставі отриманих результатів можна зробити припущення, що утворений комплекс ГАМКА – рецепторного ансамблю з етанолом, коразолом або бемегрідом має переважну конформацію з високою провідністю іонофору, що проявляється у необмеженому (параболічному) зростанні (і зниженні ймовірності проявлення) реєстрованих показників судомного нападу на фоні введення високих доз спирту.

Аплікації на кору головного мозку щурів і внутрішньовенна інфузія у різних дозах (100-500 мг/кг) БФ не виявила фармакологічної дії препарату.

Дослідження і моделювання процесів модуляції in vitro ГАМК – ергічних нейронів інверсними агоністами. Дослідження провідністю переживаючих нейронів, які демонструють кінетику наслідків прикладання медіатору і екзогенних лігандів даної рецепторної системи до функціональних клітин, лежать у основі інтерпретації первинних фармакологічних ефектів. Теоретичною основою інтерпретації результатів дослідів є кінетична схема взаємодії ГАМК – рецепторно – іонофорних ансамблів (R) з ?-аміномасляною кислотою (G) і екзогенними лігандами (М), з утворенням рецепторно – медіаторних, рецепторно- лігандних і рецепторно – медіаторно – лігандних комплексів (RG, RM і RGM) у високо – і низько – провідних конформаційних станах (х і +) (Рис.3).

Визначені основні фази динаміки змін іонного струму нейронів, що індукується прикладенням різних лігандів ГАМК – рецепторно – іонофорних ансамблів, і проведено порівняння з теоретичною кінетичною схемою рецепторно - лігандної взаємодії. Для експериментального дослідження дії лігандів використали два підходи, діючи на різні фази динаміки ГАМК – індукованого струму нейронів Пуркін’є. Показано, що бензпеніцилін і бемегрід виявляють високу швидкість взаємодії з ГАМК – рк. Для процесів їх взаємодії характерні високі значення константи швидкості дисоціації комплексу (ГАМК – рецептор – ліганд) і низькі рівноважні константи цих процесів.

Рис. 3. Кінетична схема взаємодії ГАМК-рецепторно-їонофорних ансамблів (R) с ГАМК (G) и екзогенними лігандами (М).

Де: k1, k-1, q1, q-1 – константи швидкості процесів асоціації, дисоціації R i G та R і M; 1, -1 – конверсії R у форми та

При аплікації лігандів на фоні попереднього прикладання ГАМК для дії всіх інверсних агоністів характерно зниження величин ГАМК – залежних іонних струмів у всіх дослідних серіях. Вартим уваги є те, що зниження іонного струму після аплікації пеніциліну і бемегріду настає практично миттєво (характеристичний час процесу менше 20 мс). Ефект прикладання ліганду є максимальним вже при першому прикладанні ГАМК. Тоді як прикладання пікротоксину і БФ демонструють повільний процес. Час напівзниження чутливості нейрональної мембрани до дії ГАМК, в умовах прикладання пікротоксину складає 5 хв., після прикладання БФ – більш ніж 6 хв. Зниження ГАМК – індукованого струму обумовлено процесом взаємодії М з R, з утворенням комплексу (), що не трансформується в наслідок взаємодії з G у високопровідну конформацію (). Дослідження впливу інверсних агоністів на провідність нейрональної мембрани у фазі стаціонарної дії медіатора (рівноваги конформерів (()) (рис.4) дозволило на підставі характеристичного часу процесів, що протікають у цій фазі і формального апарату кінетичної схеми визначити їх особливості механізмів дії. Бензпеніцилін і бемегрід, як і в попередній серії, виявили більш високу швидкість взаємодії з ГАМК – рк. Для цих процесів характерні високі значення константи швидкості розпаду (‘ q-1) комплексу , що визначає швидке досягнення стану рівноваги (фon) і повернення нейрону у вихідний стан (?off). Рівноважні константи цих процесів низькі (табл.2).

Рис.4. Модуляція інверсними агоністами макроскопічних ГАМК-активованих струмів ізольованих нейронів Пуркін’є у стаціонарній фазі дії медіатору

Таблиця 2

Кінетичні показники процесів взаємодії агоністів і ГАМК-рк нейронів Пуркін’є

Ліганд | on

(ms) | off

(ms) | Km=‘q-1/‘q1 | (‘q1[Mi]+‘

q-1) сек‘ | q-1, сек-1‘ | q1[Mi]‘ | q1

Бензпен-іцилін (1mM) | 5,50,7 | 25,64,4 | 275,411,5 | 134,89,2 | 39,14,7 | 1425,8 | 0,140,02

Пікроток-син (30М) | 45,43,2 | 596,6205,6 | 2,50,9 | 22,02,4 | 1,20,13 | 20,33,4 | 0,210,01

Бемегрід

(1 mM) | 5,50,8 | 38,111,7 | 121,614,7 | 1378,0 | 26,22,2 | 1567,8 | 0,160,05

БФ (10М) | 75,45,2 | 162,449,3 | 8,20,8 | 13,31,2 | 6,71,4 | 7,11,1 | 0,710,04

Це дозволяє охарактеризувати пеніцилін і бемегрід як ліганди з низькою спорідненістю до рецепторного комплексу і його комплексу з ГАМК, що неселективно взаємодіють як з рецептором так і з його комплексом з ГАМК. Пікротоксин і БФ виявляють інші властивості - низьку швидкість взаємодії з ГАМК- рк у відсутності ГАМК. У присутності ГАМК у середовищі, що визначає утворення комплексів ГАМК-рецептор-ГАМК (RG), ці сполуки виявляють високу спорідненість (табл.2) до рецепторного комплексу. Для їх комплексів: „ліганд - рецептор - ГАМК„ (RGM) характерна низька швидкість дисоціації тому у основі механізму їх фармакологічної активності ми повинні припустити процес утворення стійкої частиці () з низькою провідністю іонофору.

Висновки

У дисертації наведене експериментальне та теоретичне вирішення важливої наукової задачі сучасної фармакології – комплексного дослідження фармакологічної активності, механізмів дії та фармакодинаміки агоністів і інверсних агоністів гальмових рецепторно-медіаторних систем ЦНС.

1. Показано, що параметри процесів функціонування епілептичних комплексів, сформованих конвульсантами- сполуками, що діють на різні субодиниці ГАМКа – рк, вірогідно відмінні: часовий інтервал від початку аплікації до формування домінантного і залежного осередків при аплікації пеніциліну складав 5±0,8 хв., стрихніну 10±3,75 хв., бікукуліну 15±2,04 хв., пікротоксину 20±6,98 хв.; найбільша тривалість існування осередків спостерігалась при дії пеніциліну (440 10,8 хв), найменша - при дії стрихніну (48 5,5хв); на максимумі активності найбільша інтегральна потужність була осередків, викликаних дією бікукуліна (269,122,2 УО), найменша - дією пікротоксина (50,9 6,8 УО). Порівняння узагальнюючих показників – площ (AUC) під кривими що характеризують динаміку функціонування судомних осередків, показало, що ці величини складають слідуючий ряд: AUC пеніциліну > AUC бікукуліну >AUC пікротоксину > AUC стрихніну.

2. Порівняльний аналіз антиконвульсивної дії прямих агоністів ГАМКа – рк. показав, що феназепам і барбітал натрію мають приблизно рівну відносну ефективність процесу, етанол виявив меншу відносну швидкість процесу зміни потужності епілептичної активності. При впливі на епілептичні осередки, утворені в наслідок дії стрихніну на гліцинову медіаторну систему, найбільш виражену дію виявляв етанол, найменшу – барбітал натрію.

3. Експериментально підтверджена і математично доведена гіпотеза про необоротність процесів масопереносу лікарських засобів, безпосередньо аплікованих на біофазу. Їх фармакокінетична схема може бути описана ланцюговою камерною моделлю, з двома необоротними процесами – находження і елімінації лікарських препаратів.

4. Показано, що характерною особливістю змін МЕД стрихніну на фоні введення мишам феназепаму, барбіталу натрію і етанолу є обмежене зростання показників судомного нападу, що характеризується низькими величинами максимальних ефектів (ЕДмах). Особливістю протисудомної дії феназепаму є те, що незалежні від структури і механізмів дії інверсних агоністів параметри залежностей „доза – ефект” ідентичні, що припускає однотипну модифікацію конфірмаційних станів комплексів (рецептора, ГАМК і бенздіазепіну). Введення етанолу збільшує МЕД коразолу і бемегріду параболічно, що припускає утворення комплексу ГАМК – рк з етанолом і судомними агентами, який має переважно конформацію з високою провідністю іонофору.

5. Дослідженні особливості прояви фармакологічної дії нового типу лігандів ГАМКА-рк - 2-аміно-5-бром-2’-хлор-бензофенона виявили його високу активність при безпосередньому прикладанні до нейронів (in vitro), при введенні (in vivo) і аплікації (in situ) сполуки її дія не виявлена.

6. Дослідження динамики змін іонного струму нейронів (клітин Пуркін’є), індукованих прикладанням медіатору і різних лігандів ГАМКа – рк, дозволяє охарактеризувати пеніцилін і бемегрід як ліганди із низькою спорідненністью, що неселективно взаємодіють як з рецептором, та і з його комплексом з ГАМК. У основі механізму фармакологічної активності пікротоксину і бензофенону припускається процес утворення стійкої частиці “ліганд – рецептор - ГАМК” з низькою провідністю іонофору.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Федорова Е.А., Пыхтеев Д.М., Иванова Н.В., Токарь Г.А. Влияние противосудорожных агентов и этанола на комплексы эпилептических очагов, создаваемые бикукуллином, стрихнином и пенициллином в коре головного мозга крыс.// Нейрофизиология.-1997.-т.29.-№6.-с.387-393. (Проведені експериментальні дослідження, та оформлення статті.).

2. 3іньковський В.Г., Токар Г.О, Сіваченко Г.В., Казакова Н.А., Іванова Н.В. Динаміка судомних станів, зумовлених дією лігандів ГАМК-медіаторної системи, як наслідок еволюції функціонування стохастичних нейронних популяцій // Нейрофізіология.-1999.-т.31.-№3.-с.263-265. (Проведені експериментальні дослідження, статистична та математична обробка результатів та їхня часткова інтерпретація, оформлення статті.).

3. Іванова Н.В., Жук О.В. Моделювання динаміки пароксизмальної активності та фармакокінетики лігандів ГАМКА-рецепторної системи при їх введенні в біофазу дії// Нейрофізіология, - 2001-т.33.-№4, - с.243-251. (Проведені експериментальні дослідження, статистична та математична обробка результатів, їхня часткова інтерпретація та оформлення статті).

4. Силантьєв С.О., Жук М.С., Токар Г.А., Сіваченко Г.В., Слизький А.В., Іванова Н.В., Зіньковський В.Г. Моделювання кінетики і механізмів рецепторно-лігандної взаємодії in vivo //В кн. фармакологічний аналіз рецепторно-лігандної взаємодії. Академперіодика. Київ, 2001.- с.64 - 137. (Проведені експериментальні дослідження та їхня часткова інтерпретація.).

5. Федорова О.А., Сіваченко Г.В., Іванова Н.В. Модифікація епілептичної активності прямими агоністами ГАМК і гліцинового рецепторних комплексів та аліфатичними спиртами.// Фізіологічний журнал. 1998.- т.44. - № 3. - с. 66. (Проведені експериментальні дослідження, статистична та математична обробка результатів та оформлення тез).

6. Fedorova Е.A., Zhuk О.V., Sivachenko A.V., Ivanova N.V. Investigated of interaction of alcohols and tranquillizers with exogenic ligands of the GABA and glycine mediator systems in experimental animals // Archives of Pharmacology, Suppl. 1. v. 358. No 1. 1998. XIII International Congress of Pharmacology. (Munchen, Germany, Abstracts) 1998. P. 182. (Проведені експериментальні дослідження, аналіз та інтерпретація результатів. ).

7. .Fedorova E.A., Zhuk O.V., Sivachenko A.V., Ivanova N.V. Interaction of aliphatic alcohols and tranquilizers with the exogenic ligands of GABA - and glycine mediator systems. // European J. of Neuroscience, vol. 10., Suppl. 10. 1998. June 27 - July 1. Berlin. P. R. 51 60 (Проведені експериментальні дослідження, аналіз та інтерпретація результатів, переклад англійською.).

8. Zhuk M.S., Silantiev S.A., Schukin S.I., Slyskiy A.V., Sivachenko A.V., Ivanova N.V. Interactions between exogenous ligands of the GABA neuromediator system at various levels of the endogenous neuromediator in vivo// Joint Meeting of International Society for Neurochemistry and the European Society for Neurochemistry Berlin, Germany August 8 - 14, 1999 (Проведені експериментальні дослідження, аналіз та та їхня часткова інтерпретація).

9. Ivanova N.V.. Tokar G.A.,. Sivachenko A.V,. Silantiev S.A, Zhuk M.S., Sliskiy A.V. A comparative study of the anticonvulsant action of ethanol// 2ND European congress of pharmacology. Budapest, Hungary, July 4-9, 1999. (Проведені експериментальні дослідження, аналіз та їхня часткова інтерпретація ).

АНОТАЦІЇ

Іванова Н.В. Фармакодинаміка і механізми дії лігандів гальмових медіаторних систем при експериментальному моделюванні пароксизмальних станів ЦНС - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук із спеціальності 14.03.05 – фармакологія. – Одеській національний університет ім. І.І. Мечникова, Одеса, 2003.

Дисертація присвячена дослідному вивченню пароксизмальної активності ЦНС при дії лігандів гальмових медіаторних систем, на моделях різного рівня організації біосистем (in vitro, in situ, in vivo). Визначені параметри і характерні відмінності динаміки епілептичних комплексів, сформованих інверсними агоністами, що діють на різні субодиниці ГАМКА- і гліцинового рецепторних комплексів. Проведено порівняльний аналіз антиконвульсивної дії прямих агоністів – феназепаму, барбиталу натрия і етанолу. Виявлена наявність двох фаз (антисудомної та просудомної) у дії етанолу, може бути запропонована як експрес – метод дослідження гострого алкогольного абстинентного синдрому. Обґрунтована і дослідно підтверджена гіпотеза про необоротність процесів масопереносу лікарських засобів безпосередньо аплікованих на біофазу їх дії. Досліджена динаміка зміни величин МЕД коразолу, пікротоксину, бемегріду і стрихніну на фоні введення феназепаму, барбіталу і етанолу, припускає незалежний від впливу інверсних агоністів механізм дії першого і виявляє необмежене зростання МЕД в умовах введення високих доз останніх. В умовах дослідження ГАМК-залежних струмів нейронів (клітин Пуркіньє), показано, що пеніцилін і бемегрід можуть бути охарактеризовані як ліганди з низькою спорідненістю, що неселективна взаємодіють як з рецептором, так і з його комплексом з ГАК, а пікротоксин і 5-орто-2’-хлор-2-амінобензофенон, як ліганди, що утворюють стійку частицю ”рецептор-ГАМК-ліганд” з низькою провідністю іонофору.

Ключові слова: ГАМКА- і гліцин-медіаторні системи, пароксизмальна активність головного мозку, ліганди гальмових медіаторних систем, фармакодинаміка, фармакокінетика, математичне моделювання.

Иванова Н.В. Фармакодинамика и механизмы действия лигандов тормозных медиаторных систем при экспериментальном моделировании пароксизмальных состояний ЦНС - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 14.03.05 – фармакология. – Одесский национальный университет им. И.И. Мечникова, Одесса, 2003.

Диссертация посвящена экспериментальному изучению пароксизмальной активности Цнс при действии лигандов тормозных медиаторных систем, на моделях различного уровня организации биологических систем (in vitro, in situ, in vivo). Определены параметры процессов функционирования эпилептических комплексов, сформированных судорожными соединениями действующими на различные субъединицы ГАМКА и глицин-рк. Показано, что наибольшая продолжительность существования очага наблюдалась при действии пенициллина, наименьшая – стрихнина. Проведен сравнительный анализ динамики противосудорожных эффектов прямых агонистов ГамкА –рк – феназепама, барбитала натрия и этанола, первые из которых обнаружили приблизительно равную относительную эффективность действия, этанол обладает меньшей относительной скоростью процесса изменения мощности эпилептической активности. При воздействии на эпилептические очаги, образованные вследствие неконкурентной блокады глициновой медиаторной системы стрихнином, наиболее выраженным действием обладал этанол,