МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

КОВАЛЬ ГАЛИНА ДАНИЛІВНА

УДК 616.233-002-097+616.245-008.87]-07-08.

КОМПЛЕКСНЕ ОБСТЕЖЕННЯ І ЛІКУВАННЯ ХВОРИХ НА ХРОНІЧНИЙ ОБСТРУКТИВНИЙ БРОНХІТ З УРАХУВАННЯМ СТАНУ ПОКАЗНИКІВ ІМУННОГО СТАТУСУ ТА МІКРОБІОЦЕНОЗУ ПОРОЖНИНИ ТОВСТОЇ КИШКИ

14.03.08 – імунологія та алергологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

КИЇВ – 2003

Дисертацією є рукопис.

Дисертація виконана в Буковинській державній медичній академії МОЗ України

НАУКОВИЙ КЕРІВНИК:

доктор медичних наук, професор

СИДОРЧУК ІГОР ЙОСИПОВИЧ

Буковинська державна медична академія МОЗ України,

завідувач кафедри клінічної імунології, алергології та ендокринології.

ОФІЦІЙНІ ОПОНЕНТИ:

доктор медичних наук, професор

БЕРЕЖНА НІНЕЛЬ МИХАЙЛІВНА;

Інститут експериментальної патології, онкології

та радіобіології ім. Р.Е. Кавецького

НАН України, завідувач лабораторією імунології та алергології;

доктор медичних наук, професор, член-кориспондент АМН України

ЧЕРНУШЕНКО КАТЕРИНА ФЕДОРІВНА

Інститут фтизіатрії і пульмонології ім.Ф.Г. Яновського

АМН України, завідувач лабораторією імунології

Провідна установа: Інститут геронтології АМН України, м. Київ.

Захист дисертації відбудеться 04.12.2003 року о 16 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.003.02 при Національному медичному університеті імені О.О.Богомольця за адресою: 01023, м. Київ, вул. Шовковична, 39/1, Центральна міська клінічна лікарня, корпус 2, аудиторія кафедри шкірних та венеричних хвороб.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Національного медичного університету імені О.О.Богомольця за адресою: 03057, м. Київ-57, вул. Зоологічна, 3.

Автореферат розісланий 31.10.2003 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, Д.26.003.02.

доктор медичних наук, професор ____________________________Свирид С.Г.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Хронічний обструктивний бронхіт (ХОБ) займає одне з провідних місць серед захворювань органів дихання, характеризується зростанням захворюваності в усьому світі (Reynolds H.J., 2000), резистентністю до існуючих методів лікування, що призводить до зниження якості життя (Гусейнов Х.Ю., 2000), частої і тривалої втрати працездатності, інвалідизації та смертності хворих (Чучалин А.Г., 1997; Кокосов А.Н., 2000).

На всіх етапах розвитку бронхообструктивної патології мають місце порушення імунної реактивності (Земсков А.М., 1998; Чернушенко Е.Ф., 1998), які поряд з проведенням хворим на ХОБ частої антибактеріальної терапії призводять до змін нормальної мікрофлори, зокрема, зростає частота виявлення при ХОБ дисбактеріозу кишечнику (Кшемінська М.В., 2002), а порівняльний аналіз даних клінічного, функціонального і бактеріологічного дослідження хворих на ХОБ показав, що наявність фонового дисбактеріозу кишечнику асоціюється з більш тяжким клінічним перебігом захворювання (Белоглазов В.А., 1999; Каспрук Н.М., 2001). Порушення імунної реактивності патогенетично пов’язані зі змінами регуляції фібринолітичних та протеолітичних властивостей крові та внутрішньолегеневої мікроциркуляції (Каминская Г.О., 1991), що призводить до формування імуно-гемокоагуляційного дисбалансу, причиною якого при ХОБ (Белоглазов В.А., 1999) є зміни ендотоксинового спектру крові внаслідок дисбактеріозу кишечнику. Автором вдосконалена діагностика ендотоксинемії, з’ясовані механізми взаємодії ендотоксину кишкової палички з імунними клітинами і гуморальними чинниками у хворих на ХОБ, розроблені методи обмеження його патогенетичного впливу на організм і визначені шляхи корекції порушень імунного статусу.

Водночас нез’ясованими залишаються зв’язок клінічного перебігу ХОБ зі ступенем кишкового дисбактеріозу та вплив останнього на клініко-імунологічні показники. Не визначені можливості застосування у комплексному лікуванні хворих на ХОБ пробіотиків та їх вплив на ефективність терапії бронхообструктивного синдрому, мікрофлору порожнини товстої кишки та основні ланки патогенезу імуно-гемостатичних порушень.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація є фрагментом завершеної планової НДР кафедри клінічної імунології, алергології та ендокринології Буковинської державної медичної академії “Мікробіоценоз товстої кишки у хворих різного віку на цукровий діабет та хронічні неспецифічні захворювання легень” (номер держреєстрації 0198U005598) та завершеної планової НДР центральної науково-дослідної лабораторії Буковинської державної медичної академії „Вивчити вікові особливості взаємодії центральних та периферичних механізмів регуляції імунологічної реактивності та гемокоагуляційного потенціалу в нормі та при ендо-та екзогенних інтоксикаціях” (номер держреєстрації 0199U004595).

Мета дослідження. Вивчити стан імунної системи, неспецифічної резистентності, гемокоагуляції, фібринолізу та протеолізу у хворих на хронічний обструктивний бронхіт залежно від ступеня дисбактеріозу кишечнику та розробити метод їх комплексної корекції.

Задачі дослідження:

1.Вивчити особливості стану клітинної, гуморальної ланок системного імунітету, цитокінів (ІЛ-1, ФНП, ТФР1), неспецифічної резистентності у хворих на ХОБ з різними ступенями дисбактеріозу кишечнику.

2.Визначити активність каспаз (каспази-3, каспази-8 та каспази-1) в лізаті лімфоцитів хворих на ХОБ залежно від ступеня дисбактеріозу кишечнику

3.Визначити частоту, характер і ступінь порушень видового складу та популяційного рівня мікрофлори порожнини товстої кишки у хворих на хронічний обструктивний бронхіт.

4.З’ясувати залежність змін гемостазу, фібринолізу і протеолізу у хворих на ХОБ від ступеня кишкового дисбактеріозу.

5.Розробити комплексний метод терапії хворих на ХОБ шляхом використання біфі-форму та біоспорину на підставі встановлення їх протимікробної активності, впливу на мікробіоценоз кишечнику, стан імунної реактивності, апоптоз Т-лімфоцитів, гемокоагуляцію, фібринолітичну та протеолітичну активність плазми крові.

Об'єкт дослідження. Залежність імунологічної реактивності та гемокоагуляції у хворих на ХОБ від ступеню дисбактеріозу кишечнику.

Предмет дослідження. Стан системного імунітету, неспецифічної резистентності, гемокоагуляції, фібринолізу та протеолізу у хворих на ХОБ з різним ступенем порушень мікрофлори порожнини товстої кишки та розробка патогенетично обгрунтованого комплексного лікування виявлених порушень.

Методи дослідження. В роботі використані загально клінічні, імунологічні, мікробіологічні, біохімічні методи.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведений аналіз залежності стану клітинної, гуморальної ланок системи імунітету, рівня цитокінів (ІЛ-1, ФНП, ТФР1), активності каспаз, неспецифічного резистентності, гемокоагуляції, фібринолізу і протеолізу у хворих на ХОБ від ступеня кишкового дисбактеріозу.

Вперше показано, що у хворих на ХОБ з ІІІ-ІV ступенями кишкового дисбактеріозу має місце значне підвищення вмісту в крові ТФР1, зниження фагоцитарної активності нейтрофілів, підвищення активності каспази-8, каспази-3 і каспази-1 в лізаті лімфоцитів. Ці зміни поєднуються з активацією гемостазу, фібринолізу і колагенолізу на фоні підсилення лізису низько- і високомолекулярних білків.

Вперше показано, що загострення ХОБ відбувається на фоні порушення видового складу та популяційного рівня мікрофлори порожнини товстої кишки за рахунок дефіциту автохтонних облігатних бактерій (біфідобактерій, лактобактерій та ентерококів), зростання популяційного рівня факультативних умовно патогенних мікроорганізмів (бактероїдів, превотел, пептокока, клостридій, ентеробактерій, стафілококів та дріжджоподібних грибів роду Candida), а також контамінації порожнини товстої кишки патогенними гемолітичними, ентеропатогенними ешерихіями та умовно патогенними ентеробактеріями (цитробактером, ентеробактером, гафніями та серраціями).

Показано, що біфі-форм та біоспорин підвищують популяційний рівень в порожнині товстої кишки автохтонних облігатних бактерій, викликають деконтамінацію превотел, пептострептококів, окремих видів ентеробактерій, гемолітичних та ентеропатогенних ешерихій. Відмінністю впливу біоспорину є зниження популяційного рівня дріжджоподібних грибів роду Candida.

Біфі-форм і, особливо, біоспорин сприяє корекції порушень стану імуннологічної реактивності у хворих на ХОБ з дисбактеріозом, що характеризується зниженням вмісту в крові ТФР1, ІЛ-1, ФНП; зменшенням активності каспази-8 і каспази-3, при підвищенні функціональної активності нейтрофілів, зменшенні інтенсивності згортання крові та фібринолізу на фоні нормалізації плазмового протеолізу.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено і впроваджено в практичну медицину рекомендації стосовно диференційованого підходу до комплексного лікування хворих на ХОБ із дисбактеріозом кишечнику.

Оцінка ефективності комплексного лікування хворих на ХОБ з використанням пробіотиків свідчить про суттєве покращання клінічного перебігу захворювання і позитивну динаміку показників функції зовнішнього дихання, що призвело до скорочення перебування хворих у стаціонарі в середньому на 2,60,3 ліжко-дні і зменшило частоту загострень ХОБ з 3,70,5 на рік до 1,50,2 на рік.

Результати роботи впроваджені в навчальний процес на кафедрах клінічної імунології, алергології та ендокринології Буковинської державної медичної академії; в клінічну практику Чернівецької обласної клінічної лікарні та лікарні служби охорони здоров’я управління міністерства внутрішніх справ в Чернівецькій області.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто здійснено розробку основних теоретичних і практичних положень роботи, проведено аналіз літературних джерел, клінічні і лабораторні дослідження. Самостійно провела набір і обробку фактичного матеріалу, написала всі розділи дисертації, сформулювала висновки і практичні рекомендації. У наукових працях, опублікованих зі співавторами, самостійно зібрано матеріал, здійснено огляд літератури за темою, проведено статистичну обробку даних, проведено аналіз та узагальнення одержаних результатів та сформульовані висновки.

Апробація матеріалів дисертації. Основні наукові положення та висновки дисертації доповідалися та обговорювалися на: IV науково-практичній конференції з актуальних питань клінічної імунології та алергології (Київ, 1999); VІІI конгресі СФУЛТ (Львів, Трускавець, 2000); VІ зїзді ВУЛТ (Чернівці, 2001); I зїзді алергологів України (Київ, 2002); VI науково-практичній конференції з актуальних питань клінічної імунології та алергології (Київ, 2002); на науковій конференції “Розвиток санітарної мікробіології в Україні” (Чернівці, 2002); Міжнародній науково–практичній конференції “Актуальні питання стратегії, тактики застосування і дослідження антисептиків, антибіотиків” (Вінниця, 2002); Міжнародному симпозіумі “Актуальні питання астми” (Сінгапур, 2002); підсумкових наукових конференціях співробітників БДМА (Чернівці, 1999-2002). Основні наукові положення та висновки дисертації доповідалися та обговорювалися на засіданнях кафедри клінічної імунології. алергології та ендокринології Буковинської державної медичної академії.

Публікаціі. За темою дисертації опубліковано 12 наукових праць, з них 5 - у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, отримано 1 деклараційний патент на винахід.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалу і методів дослідження, 4 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення одержаних результатів, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних літературних джерел. Загальний обсяг дисертаційної роботи складає 225 сторінок машинописного тексту, включаючи 58 таблиць. Список використаних джерел містить 363 джерела, зокрема – 212 кирилицею та 151 – латиницею.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Матеріали і методи дослідження: Обстежено 112 хворих на хронічний обструктивний бронхіт, в період загострення (68 чоловіків та 44 жінки, віком від 20 до 72 років, середній вік хворих становив 47,932,85років). Контрольну групу склали 15 практично здорових осіб (9 чоловіків та 6 жінок) віком від 22 до 65 років (середній вік 44,563,11 років).

При аналізі клінічних даних хворих на ХОБ використовували Міжнародну класифікацію хвороб десятого перегляду (МКХ-10), матеріали міжнародного консенсусу з проблем БА І ХОБ, II з’їзду фтизіатрів і пульмонологів України, Наказ міністерства охорони здоров’я України від 30.12.99.за № 311 “Інструкція по діагностиці, клінічній класифікації і лікуванню хронічного обструктивного бронхіту”. Згідно МКХ-10 у всіх пацієнтів захворювання верифіковано за параграфом “Хронічний обструктивний бронхіт” (J 44.8). У всіх хворих на хронічний обструктивний бронхіт до початку лікування були клінічні, функціональні та лабораторні ознаки загострення захворювання.

На підставі ретельного аналізу анамнестичних, клініко-імунологічних, мікробіологічних досліджень та інструментальних обстежень була виключена можливість вираженої маніфестації патології серцево-судинної системи, органів травлення, різноманітних уражень печінки і нирок, що могло б суттєво вплинути на результати досліджень. У результаті комплексного клініко-інструментального обстеження всі хворі були розподілені на 8 клінічних груп. Першу групу склали 12 хворих на ХОБ без супутнього дисбактеріозу кишечнику та без симптомів ураження шлунково-кишкового тракту (пацієнти з нормоценозом). До 2 групи увійшли хворі на ХОБ із супутнім дисбактеріозом I ступеня (11 хворих). У хворих цієї групи також не було симптомів ураження шлунково-кишкового тракту. До третьої групи (15 чоловік) увійшли хворі на ХОБ із супутнім дисбактеріозом II ступеня без явних ознак ураження шлунково-кишкового тракту. Четверту групу склали пацієнти із супутнім дисбактеріозом III ступеня (23 хворих). У хворих цієї групи виявлялися ознаки дисфункції органів шлунково-кишкового тракту. До 5 групи (37 чоловік) були віднесені пацієнти із супутнім дисбактеріозом IV ступеня і симптомами ураження шлунково-кишкового тракту (діарея, часті закрепи, відчуття дискомфорту в області живота). До 6 групи увійшли 23 пацієнти із супутнім дисбактеріозом III та IV ступенів, які були обстежені після стандартного лікування (холінолітики, 2-агоністи короткої дії, метилксантини, інгаляційні форми глюкокортикостероїдів, муколітики, мукорегулятори, антибактеріальні засоби (антибіотики та сульфаніламіди), фізіотерапевтичні методи лікування). Сьому групу склали 17 пацієнтів із супутнім дисбактеріозом III та IV ступеня, які, окрім стандартної терапії, приймали для корекції порушень мікробіоценозу кишечнику пробіотик біфі-форм по1 капсулі 3 рази на добу протяном 14 діб. До 8 групи увійшли 20 пацієнтів із супутнім дисбактеріозом III та IV ступеня, які одночасно із стандартною терапією приймали пробіотик біоспорин по 2 дози 3 рази на добу протягом 14 діб.

За допомогою бактеріологічного та мікологічного методів вивчали видовий склад та популяційний рівень мікрофлори порожнини товстої кишки.

Для оцінки стану клітинного імунітету проводили: визначення субпопуляцій лімфоцитів за кластерами детермінації CD3+, CD4,+ CD8+ з використанням панелі моноклональних антитіл до лейкоцитарних диференційованих антигенів серії LT НПО “Сорбент” (Росія). Препарати досліджували на люмінесцентному мікроскопі “МЛ-2” (Росія); реакцію бластної трансформації лімфоцитів (РБТЛ) проводили з використанням в якості Т-клітинного мітогену фітогемаглютиніну (ФГА).

Механізми послаблення клітинного імунітету оцінювали за активністю каспази-3, каспази-8 та каспази-1 в лізаті лімфоцитів (105/мл), який отримували методом заморожування-розморожування після виділення лімфоцитів з периферичної крові за допомогою центрифугування на градієнті щільності фікол-верографін. У роботі використовували реактиви фірми BioVision (США) з рєестрацією показників на мультіскані “Уніплан-М” (Росія).

Для оцінки гуморальної ланки імунного статусу визначали рівень імуноглобулінів класів М, G, А у сироватці крові за Mancini G. Дослідження вмісту цитокінів у сироватці крові проводили на імуноферментному аналізаторі “Униплан-М” (Росія) за допомогою наборів реагентів “РгоСоn IL-1” для визначення ІЛ-1 (Росія) та “РгоСоn ТNF” (OOO “Протеиновый контур”, Росія) для визначення ФНП. Рівень у плазмі крові трансформувального фактора росту 1 визначали методом імуноферментного аналізу реактивами фірми “R&D Systems. Quantikine TM - TGF1” (США).

Для виділення нейтрофілів і макрофагів використовували пробірки “Vacutainer CPTTM” фірми “BECTON DICKINSON” (США). Фагоцитарну активність нейтрофілів периферичної крові і фагоцитарне число визначали за Чернушенко Е.Ф. і Когосовою Л.С. Тест відновлення нітросинього тетразолію (НСТ-тест) - на основі реакції відновлення поглинутого фагоцитом розчинного нитросинього тетразолію в нерозчинний диформазан (Караулов А.В., 2002). Для визначення опсоно-фагоцитарного механізму визначали концентрацію фібронектину у плазмі крові методом імуноферментного аналізу. Рівень цикрулюючих імунних комплексів визначали за Гриневичем Ю.А., Алферовим А.М.

Стан тромбоцитарно-судинного гемостазу оцінювали за відсотком адгезивних тромбоцитів (МищенкоВ.П.,1980), а також за індексом спонтанної агрегації тромбоцитів (Taccola A. et. al., 1080). Загальний коагуляційний потенціал (час рекальцифікації плазми крові, протромбіновий і тромбіновий час, активований парціальний тромбо-пластиновий час), фібринолітичну активність плазми, потенційну активність плазміногену, антиплазміни (швидко- та повільнодіючі), рівень фібриногену в плазмі крові, активність антитромбіну III, концентрацію розчинних комплексів фібрин-мономера та продуктів деградації фібрин/фібриногену у крові визначали за допомогою наборів реактивів фірми “Simko Ltd.” (Україна).

Дослідження протеолітичної активності плазми крові проводили за лізисом азоальбуміну, азоказеїну та азоколу (“Simko Ltd.”, Україна). Визначення інтенсивності ферментативного і неферментативного фібринолізу у біологічних рідинах проводили за допомогою азофібрину (“Simko Ltd.”, Україна) [Кухарчук О.Л., 1996]: Дослідження функції зовнішнього дихання проводили на апараті “Поліаналізатор-М” (Україна).

Результати досліджень опрацьовували методами варіаційного статистичного аналізу з визначенням критерію Ст’юдента за програмою “Bio-stat” на PC PENTIUM II (Гланс С., 1999; Тюрин Ю.Н., Макаров А.А., 1998).

АНАЛІЗ ТА УЗАГАЛЬНЕННЯ ОДЕРЖАНИХ РЕЗУЛЬТАТІВ

При загостренні хронічного обструктивного бронхіту формуються порушення видового складу та популяційного рівня мікрофлори вмісту порожнини товстої кишки, які характеризуються дефіцитом автохтонних облігатних бактерій (біфідобактерій, лактобактерій та ентерококів), зростанням популяційного рівня автохтонних факультативних умовно патогенних мікроорганізмів (бактероїдів, превотел, пептокока, клостридій, протеїв, стафілококів та дріжджоподібних грибів роду Candida), а також контамінацією порожнини товстої кишки патогенними гемолітичними і ентеропатогенними ешерихіями та умовно патогенними ентеробактеріями (цитробактером, ентеробактером, гафніями та серраціями). Варто зазначити, що із 98 хворих лише у 12 встановлено нормобіоценоз, тоді як у решти 86 хворих визначався кишковий дисбактеріоз різного ступеня. Зокрема, у 49% хворих виявлено дисбактеріоз, у 44% - дисбіоз.

Таблиця 1.

Ступені кишкового дисбактеріозу ( дисбіозу ) у хворих на хронічний обструктивний бронхіт |

Всього | Нормофлора | I ступінь | II

ступінь | III ступінь | IV ступінь

Кількість хворих | 98 | 12 | 11 | 15 | 23 | 37

Відсоток % | 100 | 12,24 | 11,22 | 15,31 | 23,47 | 37,76

В тому числі дисбіоз | 47 | - | 3 | 7 | 13 | 25

Відсоток виявлення

дисбіозу % | 48,92 | - | 27,27 | 46,67 | 56,52 | 67,57

Переважна більшість хворих (61%) страждає на дисбактеріоз III-IV ступеня. Водночас зі збільшенням ступеня дисбактеріозу зростає питома вага хворих, у яких відбувається контамінація порожнини товстої кишки дріжджоподібними грибами роду Candida, тобто розвивається дисбіоз (табл.1).

У хворих на ХОБ, по мірі збільшення ступеня дисбактеріозу поступово знижується вміст фібронектину, 2-мікроглобуліну крові, фагоцитарна активність, фагоцитарне число нейтрофілів, а НСТ-тест та вміст лейкотрієну В4 зростає відповідно до ступеня порушення мікробіоценозу кишечнику. Зазначені зміни супроводжувалися підвищенням вмісту в крові циркулюючих імунних комплексів. У хворих на ХОБ з нормоценозом рівень ЦІК збільшувався на 16%, у пацієнтів з дисбактеріозом І ступеня - на 26%, ІІ ступеня - на 35%, ІІІ ступеня - на 57%, IV ступеня - на 74%.

У хворих на ХОБ з нормоценозом, а також при дисбактеріозі І-ІІ ступеня змін вмісту в крові CD3+-клітин, CD4+- i CD8+-лімфоцитів не виявляється, при дисбактеріозі ІІІ ступеня спостерігається зниження кількості CD3+- i CD8+-клітин, а при дисбактеріозі IV ступеня в периферичній крові зменшується рівень лімфоцитів усіх трьох фенотипів - CD3+, CD4+, CD8+.

Функціональна активність лімфоцитів відповідає контрольним величинам у хворих на ХОБ всіх досліджуваних груп, окрім пацієнтів з дисбактеріозом IV ступеня, у яких він суттєво знижується. Серед досліджуваних параметрів гуморального імунітету достовірні зміни виявлені тільки для вмісту в крові імуноглобуліну А, зменшення якого у хворих на ХОБ розпочинається при дисбактеріозі ІІ ступеня і досягає максимуму при дисбактеріозі IV ступеня.

Аналіз дослідження рівня цитокінів свідчить, що концентрація у плазмі крові ІЛ-1 у пацієнтів з нормоценозом не відрізняється від контрольних показників, тоді як у хворих на ХОБ з порушенням мікробіоценозу кишечнику достовірно перевищує контрольні величини: при дисбактеріозі І ступеня - на 30%, ІІ ступеня - на 37%, ІІІ ступеня - на 92%, IV ступеня - на 75%. Плазмовий вміст ФНП у хворих на ХОБ з нормоценозом перевищує контроль на 47%, а у пацієнтів з дисбактеріозом І ступеня - на 45%, ІІ ступеня - на 54%, ІІІ ступеня - на 88%, IV ступеня - на 85%. Вміст ТФР-1 у крові хворих на ХОБ з дисбактеріозом зростає при дисбактеріозі ІІ ступеня, досягає максмальних величин при дисбактеріозі ІІІ і IV ступенів, але не виявляється чіткої прямої залежності від глибини порушення мікробіоценозу кишечнику. Це характерно й для вмісту в крові прозапальних цитокінів ІЛ-1 та ФНП (табл.2).

Таблиця 2.

Вміст інтерлейкіну-1 (ІЛ-1), фактора некрозу пухлин (ФНП) і трансформувального фактора-1 (ТФР-1) у крові хворих на хронічний обструктивний бронхіт з різним ступенем дисбактеріозу (xSx)

Групи хворих | ІЛ-1

пг/мл | ФНП

пг/мл | ТФР-1

нг/мл

Контроль (практично здорові люди), n=17 | 50,733,62 | 46,254,25 | 53,123,64

Хворі на ХОБ з нормоценозом, n=12 1 група52,987,03 |

68,007,55

p<0,02 | 60,205,36

Хворі на ХОБ з дисбактеріозом І ступеня, n=11 2 група66,174,97

p<0,02 | 67,106,62

p=0,01 | 63,725,25

Хворі на ХОБ з дисбактеріозом ІІ ступеня, n=15 3 група69,434,83

p<0,01 | 70,993,81

p<0,001 | 83,086,27

p<0,001

p1<0,02

p2<0,05

Хворі на ХОБ з дисбактеріозом ІІІ ступеня, n=23

4 група97,335,34

p<0,001

p1<0,001

p2<0,001

p3<0,001 | 86,713,32

p<0,001

p1<0,02

p2<0,01

p3<0,01 | 131,607,98

p<0,001

p1<0,001

p2<0,001

p3<0,001

Хворі на ХОБ з дисбактеріозом IV ступеня, n=37

5 група88,793,16

p<0,001

p1<0,001

p2<0,001

p3<0,01 | 85,772,90

p<0,001

p1=0,01

p2<0,01

p3<0,01 | 145,806,42

p<0,001

p1<0,001

p2<0,001

p3<0,001

Примітки: р - ступінь вірогідності різниць показників відносно контролю; р1 - ступінь вірогідності різниць показників відносно таких у пацієнтів 1 групи; р2 - ступінь вірогідності різниць показників відносно таких у пацієнтів 2 групи; р3 - ступінь вірогідності різниць показників відносно таких у пацієнтів 3 групи; р4 - ступінь вірогідності різниць показників відносно таких у пацієнтів 4 групи; n - число спостережень.

Для визначення механізмів послаблення клітинного імунітету у хворих на ХОБ з дисбактеріозом були проведені дослідження апоптозу лімфоцитів, ефекторами якого є каспази, зокрема каспаза-8 і каспаза-3. Каспаза-1 передає стимулючий сигнал на продукцію цитокінів, що підвищують функціональну активність фагоцитуючих клітин крові. (табл.3). Активність каспази-8 у хворих на ХОБ з нормоценозом, а також у пацієнтів з дисбактеріозом І і ІІ ступенів не відрізняється від контрольних показників. У хворих на ХОБ з дисбактеріозом ІІІ ступеня активність каспази-8 збільшується на 42%, у пацієнтів з дисбактеріозом IV ступеня - на 96%. Активність каспази-3 також відповідає контролю як у хворих на ХОБ з нормоценозом, так й у пацієнтів з дисбактеріозом І і ІІ ступенів. При дисбактеріозі ІІІ ступеня активність цього ферменту зростала на 55%, а при дисбактеріозі IV ступеня активність каспази-3 досягала найвищих показників. Активність каспази-1 у хворих на ХОБ з дисбактеріозом суттєво перевищує контрольні величини: при дисбактеріозі І ступеня - на 58%, ІІ ступеня - на 77%, ІІІ ступеня - в 2,2 рази, IV ступеня - в 3,3 рази. Таким чином, активність каспази-8, каспази-3 і каспази-1 в лізаті лімфоцитів хворих на ХОБ набуває високих величин саме при дисбактеріозі ІІІ і IV ступенів.

Таблиця 3

Активність каспаз в лізаті лімфоцитів хворих на хронічний обструктивний бронхіт з різним ступенем дисбактеріозу (xSx)

Групи хворих | Каспаза-8

UE/ml | Каспаза-3

UE/ml | Каспаза-1

UE/ml

Контроль (практично здорові люди), n=17 | 1,0050,092 | 0,8120,078 | 0,5020,054

Хворі на ХОБ з нормоценозом, n=12

1 група1,0360,151 | 0,9870,132 | 0,7220,109

Хворі на ХОБ з дисбактеріозом І ступеня, n=11 2 група1,0900,129 | 0,9020,120 | 0,7930,119

p<0,02

Хворі на ХОБ з дисбактеріозом ІІ ступеня, n=15 3 група1,2130,115 |

1,0470,109 |

0,8860,103

p<0,01

Хворі на ХОБ з дисбактеріозом ІІІ ступеня, n=23

4 група1,4220,094

p<0,01

p1<0,05

p2=0,05 | 1,2600,091

p<0,001

p2<0,05 | 1,1120,086

p<0,001

p1=0,01

p2<0,05

Хворі на ХОБ з дисбактеріозом IV ступеня, n=37

5 група1,9670,097

p<0,001

p1<0,001

p2<0,001

p3<0,001

p4<0,001 | 1,9030,088

p<0,001

p1<0,001

p2<0,001

p3<0,001

p4<0,001 | 1,6800,080

p<0,001

p1<0,001

p2<0,001

p3<0,001

p4<0,001

Примітки:

р - ступінь вірогідності різниць показників відносно контролю; р1 - ступінь вірогідності різниць показників відносно таких у пацієнтів 1 групи; р2 - ступінь вірогідності різниць показників відносно таких у пацієнтів 2 групи; р3 - ступінь вірогідності різниць показників відносно таких у пацієнтів 3 групи; р4 - ступінь вірогідності різниць показників відносно таких у пацієнтів 4 групи; n - число спостережень.

Ще одним важливим аспектом патогенезу багатьох захворювань, в тому числі і бронхо-легеневої патології, є зміни в системі регуляції агрегатного стану крові.

У хворих на ХОБ з нормобіоценозом порушень процесів утворення протромбіназного комплексу і фібриногенезу не виявляється. У пацієнтів з дисбактеріозом І ступеня спостерігається прискорення процесів утворення тромбіну і фібрину, з дисбактеріозом ІІ-III ступеня спостерігається прискорення процесів згортання крові відразу в трьох ланках: відбувається скорочення періодів генерації активного тромбіну за внутрішнім і за зовнішнім механізмами тромбіногенезу при одночасній інтенсифікації процесів фібриногенезу. Водночас у хворих з порушенням мікробіоценозу кишечнику IV ступеня жоден з часових параметрів згортання крові достовірно від контрольних величин не відрізнявся. Звертає на себе увагу висока функціональна активність тромбоцитів: індекс спонтанної агрегації тромбоцитів у хворих на ХОБ з нормоценозом перевищує контрольні величини на 68%, у пацієнтів з дисбактеріозом І ступеня - на 70%, а у хворих з дисбактеріозом ІІ, ІІІ і IV ступенів цей показник виявляється більшим за контроль у 2-3 рази. Відсоток адгезивних тромбоцитів зростає при дисбактеріозі ІІ, ІІІ і IV ступенів на 13, 19 і 21%, відповідно. Концентрація фібриногену в плазмі крові у хворих на ХОБ зазнає різноспрямованих змін: у пацієнтів з нормоценозом й у хворих з дисбактеріозом ІІ і ІІІ ступенів цей показник не відрізняється від контролю, тоді як при дисбактеріозі І ступеня спостерігається збільшення вмісту в крові фібриногену, а у хворих з дисбактеріозом IV ступеня рівень фібриногену знижується.

Проведений нами аналіз змін плазмового фібринолізу свідчить, що показники сумарної фібринолітичної активності плазми крові та інтенсивності ферментативного фібринолізу у хворих на ХОБ з нормоценозом достовірних змін не зазнають, однак неферментативна фібринолітична активність зростає на 38%. У хворих на ХОБ з дисбактеріозом І ступеня сумарна інтенсивність плазмового фібринолізу підвищується, неферментативна фібринолітична активність також збільшується, проте інтенсивність ферментативного фібринолізу залишається сталою. У хворих з порушенням мікробіоценозу кишечнику ІІ, ІІІ і IV ступенів виявляються різноспрямовані зміни неферментативної і ферментативної фібринолітичної активності плазми крові. Перша зазнає перманентного збільшення відповідно ступеня дисбактеріозу, а друга, навпаки, зменшується і досягає найнижчих величин у пацієнтів з дисбактеріозом IV ступеня. Ообливістю змін плазмового фібринолізу у хворих на ХОБ з порушенням мікробіоценозу кишечнику є перебудова структури сумарної фібринолітичної активності, яка полягає у значному збільшенні частки неферментативного лізису фібрину при суттєвому зменшенні інтенсивності ферментативного фібринолізу.

Не виключено, що зміни коагуляційного, фібринолітичного потенціалів і протизгортаючої здатності крові у хворих на ХОБ з кишковим дисбактеріозом пов’язані зі змінами вмісту у крові прозапальних цитокінів, адже відомо, що інтерлейкін-1 і ФНП стимулюють утворення у печінці білків гострої фази, серед яких фібриноген, 1-антитрипсин та 2-макроглобулін мають безпосереднє відношення до процесів згортання крові і фібринолізу. Більш того, прозапальні цитокіни впливають на ендотеліальні клітини і макрофаги та сприяють збільшенню утворення та секреції прокоагулянтів, зокрема тканинного фактора, а також зменшують генерацію антикоагулянтів - тромбомодуліну і протеїну С, що супроводжується гіперкоагуляційними зсувами.

У хворих на ХОБ з дисбактеріозом ІІІ і IV ступенів характерним є збільшення у плазмі крові протеолітичної деструкції низько- і високомолекулярних білків при зменшенні інтенсивності плазмового колагенолізу.

Корекцію порушень мікрофлори слід проводити відповідно до видового складу та популяційного рівня мікрофлори порожнини товстої кишки, тому до стандартної схеми лікування були включені пробіотики, які містять автохтонні облігатні мікроорганізми з метою деконтамінації патогенних і заміщення дефіциту фізіологічно корисних біфідобактерій, лактобактерій та інших автохтонних облігатних мікроорганізмів.

З метою підбору пробіотика попередньо було проведено вивчення антимікробної активності полікомпонентного бактерійного преперата біфі-форм та самоелімінуючого вітчизняного пробіотика біоспорина (бактисубтила). Показано, що біфі-форм є ефективним препаратом для пригнічення росту та розмноження грампозитивних умовно патогенних стафілококів, в т.ч. антибіотикорезистентних клінічних варіантів, та ентеробактерій: патогенних та умовно патогенних ешерихій, цитробактера, клебсієл та ін.. Однак він практично не гальмує ріст та розмноження як музейних, так і клінічних штамів дріжджоподібних грибів роду Candida. Антагоністична активність біоспорину проявляється стосовно патогенних та умовно патогенних ентеробактерів та стафілококів вже через 24 години, поступово зростаючи до 7 діб. Біоспорин через 3 доби проявляє антагоністичну активність стосовно дріжджоподібних грибів роду Candida, яка постійно зростає.

Біфі-форм, що використовується у комплексній терапії хворих на ХОБ з дисбактеріозом (дисбіозом) кишечнику III - IV ступенів призводить до деконтамінації із порожнини товстої кишки патогенних (гемолітичних та ентеропатогенних) ешерихій, умовно патогенних превотел, пептострептококів, ентеробактерів. Він менш ефективний стосовно окремих умовно патогенних бактерій родів Enterobacter, Klebsiella, Serratia та взагалі не впливає на дріжджоподібні гриби роду Candida. Важливо, що препарат проявляє виражену мікробокоригуючу дію стосовно автохтонних облігатних бактерій – біфідобактерій, лактобактерій та ентерококів, значно підвищуючи їх популяційний рівень у порожнині товстої кишки.

Вітчизняний пробіотик біоспорин при використанні у комплексній терапії хворих на ХОБ з дисбактеріозом (дисбіозом) кишечнику III - IV ступенів призводить до деконтамінації із порожнини товстої кишки патогенних (гемолітичних та ентеропатогенних) ешерихій, умовно патогенних превотел, пептострептококів, ентеробактерій (цитробактера, гафній, серрацій). Менш ефективним був його вплив на стафілококи, бактерії родів Enterobacter, Klebsiella. Проте, на відміну від біфі-форму, біоспорин ефективніше знижує популяційний рівень дріжджоподібних грибів роду Candida. Як і біфі-форм, він значно підвищуює популяційний рівень у порожнині товстої кишки біфідобактерій, лактобактерій та ентерококів.

Включення до комплексу лікувальних засобів біоспорину призводить до нормалізації параметрів функціональної активності нейтрофілів та концентрації у плазмі крові фібронектину і лейкотрієну В4, що відбувається на фоні підвищення НСТ-тесту і плазмового рівня 2-мікроглобуліну. Нормалізації рівня ЦІК у крові хворих на ХОБ з дисбактеріозом ІІІ-IV ступеня не спостерігається в жодній з досліджуваних груп, проте найбільшій ефект щодо зниження вмісту ЦІК у плазмі крові виявляє комплексне лікування з використанням біоспорину.

Після проведеного курсу стандартної терапії у хворих на ХОБ вміст у крові CD3+ і CD4+-клітин залишається меншим за контроль. Під впливом біоспорину підвищується кількість CD8+-лімфоцитів, але теж не нормалізується. Застосування в комплексному лікуванні хворих на ХОБ з дисбактеріозом ІІІ-IV ступенів біфі-форму призводить до нормалізації кількості у крові CD3+-, CD4+- i CD8+-клітин і співвідношення CD4+/CD8+-лімфоцитів. Отже, у хворих на ХОБ з порушеннями мікробіоценозу кишечнику ІІІ-IV ступенів нормалізація клітинної ланки системи імунітету спостерігається тільки в разі використання в комплексі лікувальних засобів біфі-форму. РБТЛ з ФГА у пацієнтів з дисбактеріозом, яким призначали стандартне лікування, залишається зниженою. Водночас при використанні біфі-форму або біоспорину РБТЛ з ФГА не відрізняється від контролю.

Після застосування комплексу стандартних лікувальних засобів активність каспаз практично не змінюється і значно перевищує контроль. Під впливом лікування з використанням біфі-форму відбувається зменшення активності каспази-8 і каспази-3, однак активність каспази-1 залишається високою. При використанні біоспорину активність каспази-8 і каспази-3 нормалізується, але активність каспази-1 залишається суттєво більшою за контроль.

Після проведення стандартного лікування плазмова концентрація імуноглобуліну А не змінюється, тоді як застосування в комплексному лікуванні біфі-форму і біоспорину нормалізує плазмову концентрацію цього імуноглобуліну. Таким чином, на відміну від стандартного лікування, використання в комплексі лікувальних засобів біфі-форму або біоспорину підвищує концентрацію у крові Ig А до контрольних величин.

Cтандартне лікування знижує вміст в крові ІЛ-1 і ФНП, але рівень їх залишається суттєво більшим за контроль. Концентрація в плазмі крові ТФР1 достовірних змін не зазнає і значно перевищує контрольні величини. При застосуванні біфі-форму вміст у крові ІЛ-1 і ТФР1 дещо зменшується, але плазмовий рівень ФНП залишається сталим і значно вищим, ніж в осіб контрольної групи. Включення до лікувального комплексу біоспорину знижує плазмову концентрацію ІЛ-1 і нормалізує вміст у плазмі крові ТФР1. Отже, стандартна терапія хворих на ХОБ з дисбактеріозом ІІІ-IV ступенів дещо зменшує концентрації у плазмі крові ІЛ-1 і ФНП, але не впливає на рівень ТФР1. Включення до комплексного лікування біфі-форму сприяє зменшенню вмісту в крові ІЛ-1 і ТФР1, однак не змінює концентрацію ФНП. Призначення біоспорину також знижує плазмовий рівень ІЛ-1, нормалізує концентрацію ТФР1, але не викликає достовірних змін вмісту в крові ФНП.

У хворих на ХОБ з дисбактеріозом кишечнику ІІІ ступеня стандартна терапія і лікування з використанням біфі-форму зменшує інтенсивність тромбіногенезу за внутрішнім механізмом згортання крові, однак не впливає на прискорений фібриногенез і утворення протромбіназного комплексу за зовнішнім механізмом гемокоагуляції. Застосування в комплексному лікуванні біоспорину призводить до нормалізації швидкості утворення тромбіну та інтенсивності фібриногенезу. Комплексне лікування хворих на ХОБ з дисбактеріозом IV ступеня з використанням біоспорину не викликає достовірних змін часових параметрів гемокоагуляції. Біфі-форм не має помітного впливу на протизгортаючу здатність крові і функціональну активність тромбоцитів у хворих на ХОБ з дисбактеріозом ІІІ ступеня, тоді як комплексне лікування з використанням біоспорину нормалізує активність антитромбіну ІІІ та адгезивно-агрегаційні властивості тромбоцитів. Включення до комплексного лікування хворих на ХОБ з дисбактеріозом кишечнику IV ступеня біфі-форму або біоспорину, на відміну від стандартної терапії, сприяє нормалізації протизгортаючого потенціалу крові, зменшує функціональну активність тромбоцитів і відновлює концентрацію фібриногену в плазмі крові до контрольного рівня. Отримані результати свідчать, що у хворих на ХОБ з дисбактеріозом кишечнику ІІІ ступеня тільки комплексне лікування з використанням біоспорину нормалізує інтенсивність і структуру плазмового фібринолізу. Включення до комплексного лікування біфі-форму підвищує до контрольного рівня лише ферментативний фібриноліз, тоді як інтенсивність неензиматичного лізису фібрину залишається суттєво більшою за контроль.

Після комплексного лікування з використанням біфі-форму зберігається помірне підвищення активності швидко- і повільнодіючої фракцій антиплазмінів, тоді як включення біоспорину до комплексу лікувальних засобів призводить до повної нормалізації антифібринолітичного потенціалу крові. Стандартна терапія характеризується відсутністю змін загальної активності антиплазмінів та активності швидкодіючих антиплазмінів. Призначення хворим біфі-форму зменшує активність загальних антиплазмінів, однак не впливає на активність швидкодіючої фракції антиплазмінів, яка залишається більшою, ніж в осіб контрольної групи. Комплексне лікування з використанням біоспорину нормалізує активність загальних, швидко- і повільнодіючих антиплазмінів. Тобто, незалежно від ступеня дисбактеріозу, застосування в комплексному лікуванні біоспорину виявляється найбільш ефективним щодо корекції зсувів в антиплазміновій системі крові.

У хворих на ХОБ з дисбактеріозом кишечнику ІІІ і IV ступенів включення до комплексної терапії біоспорину або біфі-форму нормалізує показники потенційної активності плазміногену і Хагеман-залежного фібринолізу та знижує (особливо при використанні біоспорину) вміст у крові розчинних комплексів фібрин-мономеру. Застосування біфі-форму в комплексному лікуванні хворих на ХОБ з дисбактеріозом кишечнику ІІІ-IV ступенів нормалізує інтенсивнсть плазмового колагенолізу, тоді як інтенсивність лізису низько- і високомолекулярних білків залишається підвищеною. Позитивний ефект від включення біоспорину в комплексне лікування характеризується нормалізацією колагенолітичної активності крові і лізису високомолекулярних білків, що поєднується з суттєвим зменшенням надмірно високого розпаду азоальбуміну. Зазначені вище зміни плазмової протеолітичної активності супроводжуються зниженням вмісту в крові молекул середньої маси. Отже, застосування в комплексному лікуванні хворих на ХОБ з порушенням мікробіоценозу кишечнику ІІІ-IV ступенів біфі-форму або біоспорину виявляє високу ефективність щодо корекції вмісту в крові молекул середньої маси.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведене наукове узагальнення результатів вивчення впливу біфі-форму і біоспорину на динаміку імунологічних, мікробіологічних і біохімічних змін у хворих на ХОБ з порушенням видового складу та популяційного рівня мікрофлори порожнини товстої кишки та нове вирішення наукової задачі, що полягає в патогенетичному обгрунтуванні доцільності і визначенні ефективності використання пробіотиків для покращення імунного статусу і клінічного перебігу хронічного обструктивного бронхіту.

1.У хворих на ХОБ з дисбактеріозом кишечнику відмічається зниження фагоцитарної активності і фагоцитарного числа нейтрофілів, що поєднується зі зростанням НСТ-тесту, рівня лейкотрієну В4 і ЦІК; зменшенням вмісту в крові 2-мікроглобуліну, гіпофібронектинемією. При дисбактеріозі ІІІ ступеня спостерігається зниження кількості ТCD3+- i ТCD8+-клітин, а при порушенні мікробіоценозу IV ступеня зменшується рівень лімфоцитів фенотипів ТCD3+, ТCD4+, ТCD8+ та супроводжується пригніченням реакції бласттрансформації у відповідь на ФГА. Зниження вмісту в крові IgА досягає максимуму при дисбактеріозі IV ступеня.

2.Вміст ІЛ-1, ФНП та ТФР-1 досягає максимальних величин при дисбактеріозі ІІІ і IV ступенів. Активність каспази-8, каспази-3 і каспази-1 в лізаті лімфоцитів хворих на ХОБ зростає при дисбактеріозі ІІІ і IV ступенів, але не виявляє чіткої прямопропорційної залежності від ступеня порушень видового складу та популяційного рівня мікрофлори порожнини товстої кишки.

3.Загострення ХОБ відбувається на фоні порушення видового складу та популяційного рівня мікрофлори порожнини товстої кишки за рахунок дефіциту автохтонних облігатних бактерій (біфідобактерій, лактобактерій та ентерококів), зростання популяційного рівня автохтонних факультативних умовно патогенних (бактероїдів, превотел, пептокока, клостридій, протеїв, стафілококів та дріжджоподібних грибів роду Candida) мікроорганізмів, а також контамінації порожнини товстої кишки патогенними (гемолітичними і ентеропатогенними) ешерихіями та умовно патогенними ентеробактеріями (цитробактером, ентеробактером, гафніями та серраціями).

4.Особливістю змін гемостазу у хворих на ХОБ з порушенням видового складу та популяційного рівня мікрофлори порожнини товстої кишки є скорочення періодів тромбіно- і фібриногенезу у пацієнтів з дисбактеріозом ІІ і ІІІ ступенів при нормальних параметрах хронометричної гемокоагуляції у пацієнтів з дисбактеріозом IV ступеня. При дисбактеріозі ІІІ-IV ступеня зниження протизгортаючої активності крові супроводжується зменшенням вмісту в крові фібриногену. У всіх хворих на ХОБ встановлена висока агрегаційна здатність тромбоцитів, яка у пацієнтів з дисбактеріозом ІІ, ІІІ і IV ступенів поєднується з підвищенням адгезивних властивостей тромбоцитів.

5.У хворих на ХОБ з дисбактеріозом кишечнику настають зміни фібринолітичної системи плазми крові за рахунок підвищення неферментативної фібринолітичної активності при зниженні інтенсивності ферментативного фібринолізу, що супроводжується накопиченням у крові розчинних комплексів фібрин-мономеру. При дисбактеріозі ІІІ-IV ступенів до цих змін приєднується збільшення активності антиплазмінів, зменшення потенційної активності плазміногену та інтенсивності Хагеман-залежного фібринолізу, зростання протеолітичної деструкції у плазмі крові низько- і високомолекулярних білків при зменшенні інтенсивності плазмового колагенолізу, що поєднується з підвищенням вмісту в крові молекул середньої маси.

6.Застосування біфі-форму в комплексному лікуванні хворих на ХОБ нормалізує фагоцитарний індекс нейтрофілів і вміст у крові фібронектину, відносну кількість Т-лімфоцитів (ТCD3) та їх субпопуляцій (TCD4 і TCD8); нормалізує реакцію бластної трансформації лімфоцитів у відповідь на ФГА і підвищує концентрацію у крові IgА до контрольних величин; сприяє зменшенню вмісту в крові ІЛ-1 і ТФР1, активності каспази-8 і каспази-3. Включення до комплексу лікувальних засобів біоспорину призводить до нормалізації параметрів функціональної активності нейтрофілів та вмісту в крові фібронектину і лейкотрієну В4, що відбувається на фоні підвищення НСТ-тесту і плазмового рівня 2-мікроглобуліну; виявляє ефективність щодо зниження вмісту ЦІК у плазмі крові; зменшує плазмовий рівень ІЛ-1, нормалізує концентрацію ТФР1, активність каспази-8 і каспази-3 та