МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

КИЇВСЬКА МЕДИЧНА АКАДЕМІЯ

ПІСЛЯДИПЛОМНОЇ ОСВІТИ ІМ. П. Л. ШУПИКА

Кривда Григорій Федорович

УДК 340.64:577.213.32:572.2

ПЛР-аналіз

молекулярно-генетичного

поліморфізму людини

в судовій медицині

14.01.25 — судова медицина

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Київ — 2003

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано на кафедрі судової медицини з післядипломною підготовкою Одеського державного медичного університету і в Центрі судово-медичної молекулярно-генетичної експертизи Одеського обласного бюро судово-медичної експертизи Управління охорони здоров’я Одеської обласної державної адміністрації

Науковий консультант: доктор біологічних наук,

професор, академік УААН

Сиволап Юрій Михайлович,

Південний біотехнологічний центр

УААН і МОН України, директор.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Дідковська Софія Петрівна,

Київський Національний університет ім. Тараса Шевченка,

професор кафедри криміналістики

доктор медичних наук, професор Мішалов Володимир Дем`янович

Дніпропетровська Державна медична академія,

завідувач кафедри судової медицини

доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент НАН України

Малюта Станіслав Станіславович, Інститут молекулярної біології

і генетики НАНУ, заступник директора

Провідна установа:

Донецький державний медичний університет ім. М. Горького

МОЗ України, кафедра судової медицини, м. Донецьк.

Захист дисертації відбудеться “26_” вересня 2003 р. о 12_ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.613.03 при Київській медичній академії післядипломної освіти ім. П. Л. Шупіка за адресою: 04112, м. Київ, вул. Оранжерейна, буд. 9.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київської медичної академії післядипломної освіти ім. П. Л. Шупика (04112, м. Київ-112, вул. Дорогожицька, буд. 9).

Автореферат розісланий “19_”серпня 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат медичних наук, доцент Бурчинський В. Г.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Останнім часом створені ефективні підходи дослідження специфічності ДНК, що характеризують сучасний рівень розвитку методології судової медицини. Піонером використання аналізу поліморфізму ДНК у судовій медицині вважається англійський учений Алекс Джеффріс, який перший у світі розв’язав проблему визначення спірного батьківства за допомогою аналізу “сателітної” ДНК. Завдяки його роботам у практику судової медицини введене поняття “геномної дактилоскопії”, або “геномного фінгенпринтингу”. З 1985 року типування ДНК стає одним із найефективніших засобів ідентифікації особи. На початку 90-х років минулого століття розроблено метод типування ДНК за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), який є основою сучасних технологій визначення специфічності ДНК.

Розробка теоретичних аспектів і технології використання ДНК-ового аналізу методом полімеразної ланцюгової реакції в умовах популяції, що мешкає на Україні, є актуальною проблемою судової медицини.

Дослідження специфічності ДНК у визначені спірного батьківства, а потім і при впізнанні особи людини в кримінальних справах роозпочалися нами в 1992 році в Одеському обласному бюро судової експертизи і відділі молекулярної генетики Південного біотехнологічного центру УААН і МОН України. На цей час тільки розпочиналися роботи з вдосконалення методів виділення ДНК із біологічних об’єктів і проводилась розробка технології ПЛР-аналізу відповідно до завдань судової медицини. Тому значну частину експериментального розділу дисертаційної роботи займають дані з вдосконалення методів виділення ДНК із різних об’єктів біологічного походження, добору локусів, визначення частоти зустрічальності алелів у популяції та ін.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Це дослідження є складовою частиною наукової теми Одеського державного медичного університету “Розробка методів діагностики та оцінки ефективності фармакотерапії специфічних та неспецифічних інфекційно-запальних захворювань на основі молекулярно-генетичних і біофізичних технологій” (№ держреєстрації 0199U000262), що входить до Науково-технічної програми 01.01. “Охорона генофонду населення України”. Дисертант є співвиконавцем цієї теми.

Метою дослідження є розробка теоретичних і практичних аспектів ПЛР-аналізу при ідентифікації особи і встановленні спірного батьківства та впровадження в практику судово- медичної експертизи України технології аналізу поліморфізму ДНК.

Завданням роботи є визначення умов добору і збереження біологічного матеріалу для ДНК-аналізу, визначення гіперваріабельних локусів людини, що дозволяють проводити диференціацію й ідентифікацію осіб, добір праймерів, що визначають алельний стан аналізованих локусів, оптимізація ПЛР згідно зі складом праймерів, встановлення алельного розподілу локусів геному людини в українській популяції, впровадження сучасних методів візуалізації профілів ДНК.

Об’єктом дослідження є біологічні зразки людини — кров, м’язи, епітелій, сперма, епітелій, що знаходиться в слині, волосся, кістки.

Предмет дослідження — ДНК, виділена з біологічних об’єктів.

Методи дослідження. Молекулярно-біологічний і молекулярно-генетичний аналіз, які містять виділення ДНК, полімеразна ланцюгова реакція, електрофорез в поліакриламідних і агарозних гелях, синтез праймерів, комп’ютерний, популяційно-генетичний аналіз.

Наукова новизна одержаних результатів полягає в такому: —

науковому обгрунтуванні використання продуктів полімеразної ланцюгової реакції у практиці судової медицини; —

науковому обгрунтуванні і визначенні умов відбору й збереження речових доказів біологічного походження, придатних для виділення ДНК такої полімерності, що дозволяє типування за варіабельними локусами;—

доборі праймерів високоваріабельних локусів геному людини й оптимізації ПЛР;—

визначенні частоти алельного розподілу ряду гіперваріабельних локусів у популяції, що мешкає в Україні;—

розробці системи ідентифікації особи в кримінальних справах при виділенні ДНК із крові, слини, м’язів, кісток, волосся, сперми, епітелію, зі змивів та зскрибків, з використаної жувальної гумки (Деклараційний патент на винахід № 51559 А від 15.11.2002 р., Деклараційний патент на винахід № 53564 А від 15.01.2003 р., Деклараційний патент на винахід № 53565 А від 215.01. 2003р.);—

застосуванні систем візуалізації й документації профілів ДНК у судовій медицині;—

розробці й застосуванні технології аналізу поліморфізму ДНК для визначення спірного батьківства у цивільних і кримінальних справах.

Практичне значення одержаних результатів. Проведена оцінка і добір міні- і мікросателітних варіабельних локусів, які можливо використати для ідентифікації особи за полімеразною ланцюговою реакцією. Рекомендована тест-система мікросателітних маркерів. Проведено аналіз частоти зустрічальності алелів у змішаній популяції України і порівняння з даними з інших джерел, що дозволяє використання результатів для кавказоїдів у популяції, яка мешкає в Україні. Результати наукових розробок, описаних в дисертації, використані при проведенні більш ніж 250 судово-медичних експертних досліджень в Одеському обласному бюро судово-медичної експертизи з типування ДНК при визначенні особи на підставі постанов, ухвал, направлень органів МВС, прокуратур і судів Донецької, Дніпропетровської, Закарпатської, Кіровоградської, Луганської, Миколаївської, Одеської, Херсонської, Харківської, Черкаської, Чернігівської областей України, Придністров’я та АР Крим. Видано науково-практичне керівництво “Використання аналізу ДНК у судово-медичних експертизах”.

Матеріали, що викладені в дисертації, використані в курсі лекцій на кафедрі судової медицини з післядипломною підготовкою для студентів та курсантів Одеського державного медичного університету.

Особистий внесок здобувача. Здобувач брав безпосередню участь у виконанні експериментальної частини роботи, проводив експертні дослідження з типування ДНК. У виконанні окремих експериментів брали участь співробітники Центру судово-медичних молекулярно-генетичних експертиз Одеського облбюро СМЕ. Одержані в співробітництві з колегами результати опубліковано в спільних наукових працях, які наведені в переліку праць за темою дисертації. Обговорення та аналіз результатів проведено спільно з науковим консультантом.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були заслухані на науковій конференції, присвяченій пам’яті Ю. С. Сапожнікова, Київ, 1997; науковій конференції “Актуальні питання теорії і практики судової експертизи”, Харків, 2000 р.; XVIII Міжнародному конгресі International Society for Forensic Genetics, 2000, USA, San Francisco; XIX Міжнародному конгресі International Society for Forensic Genetics, 2001, Germany, Muenster; семінарі-нараді начальників обласних бюро СМЕ України, Херсон, 2001; на засіданнях Одеського відділення Українського товариства судово-медичних експертів, Одеса, 1999, 2000, 2001; семінарі-нараді начальників обласних бюро СМЕ України, Чернівці, 2002; науково-практичній конференції “Історія та перспективи розвитку післядипломної освіти лікарів”, Одеса, 2002; семінарі-нараді “Впровадження ДНК-аналізу в судово-медичну практику”, Одеса, 2002; засіданні вченої ради медичного факультету № 2 Одеського державного медичного університету; Всеукраїнському науково-практичному семінарі “Інформаційне забезпечення у боротьбі з організованою злочинністю”, Одеса, 2002.

Публікації. Основний зміст дисертації викладений у 33 статтях і тезах доповідей, в тому числі в 20 працях, що надруковані у виданнях, рекомендованих ВАК України.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 295 сторінках машинописного тексту, складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, дев’яти розділів, результатів досліджень та їх обговорення, висновків, практичних рекомендацій.

Дисертація містить 41 таблицю та 47 рисунків. Список використаних літературних джерел містить 203 найменування, з яких 46 вітчизняних та 157 закордонних джерел, в тому числі 154 англійською, 2 — німецькою і 1 — французькою мовами.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

В першому розділі здійснено огляд літератури з проблеми ідентифікації особи людини за допомогою біохімічних і молекулярних маркерів. Проведено детальну оцінку біохімічних систем визначення особи, показано їхні недоліки і перевагу молекулярних маркерів. Серед систем визначення специфічності ДНК істотну перевагу для судово-медичних експертних досліджень має аналіз продуктів ампліфікації ДНК полімеразною ланцюговою реакцією.

У другому розділі наведено відомості про матеріали і методи досліджень.

Використаний матеріал. У роботі використано більше 1100 об’єктів біологічного походження: рідку кров, плями крові на різних носіях, слину і плями слини, плями сперми на різних носіях, змішані зразки вмісту піхви при згвалтуванні, змиви з різних поверхонь, кісткові залишки, хрящі, волосся та ін. У відділенні судово-медичної імунології Одеського обласного бюро судово-медичної експертизи проведені дослідження з визначення природи і видової належності об’єктів біологічного походження.

Виділення ДНК із цільної крові і плям крові здійснювали згідно з Singer-Sam J., Tanguay R., Riggs A.,1989. Диференційне виділення ДНК з вмісту піхви, анального отвору, ротової порожнини проводили за Jeffreys A., Werret D., 1985. Вдосконалені нами методи виділення ДНК з біологічних об’єктів речових доказів викладені в експериментальному розділі.

Ампліфікація ДНК. Ампліфікацію ДНК за допомогою ПЛР здійснювали на термоциклерах MJ Research PTC–200 (США) або “Терцик” (“ДНК-технологія”, Росія). Для ампліфікації ДНК використовували: 1 — тест-системи "Promega" (США), що містять 10 ґ буфер, до складу якого входить: розчин dNTPs, 10 ґ розчин праймерів, ДНК-полімераза Taq, деіонізована вода, розчин контрольної ДНК; 2 — тест-системи “ТАПОТИЛИ” (Росія), що містять 10 ґ буфер, 10 ґ розчин праймерів, 10 ґ розчин dNTPs, ДНК-полімеразу Taq, деіонізовану воду, розчин контрольної ДНК; 3 — тест-системи, зроблені в Центрі судово-медичних молекулярно-генетичних експертиз (Україна), які містили: 10 ґ буфер, до складу якого входили 670 m трис-HCl pH 8,8; 166 m (NH4)2SO4; 0,1%-й твін 20; 1–4 mM MgCl2 і 5mM розчин dNTPs, 10 ґ розчин праймерів, ДНК-полімераза Taq, стерильна деіонізована вода. Реакційна суміш обсягом 20–50 мкл містила: 1 ґ буфер; по 0,2 mkM прямого й зворотного праймерів; 0,2 mM кожного dNTP; 20–100 нг ДНК; 2 одиниці ДНК-полімерази Taq.

Гель-електрофорез ДНК. Продукти ампліфікації ДНК (5–20 мкл реакційної суміші) фракціонували в 2–4%-му агарозному чи 6–12%-поліакриламідному гелі залежно від розмірів отриманих фрагментів у 1 ґ ТВЕ-буфері. Тривалість електрофорезу становила 2–4 год при 100–120 V і при 4 °С у горизонтальному “підводному” агарозному гелі чи 1,5–2 г при 500 V у вертикальному поліакриламідному гелі (довжина 16 см, товщина 0,75 мм) при 60 °С. Електрофорез здійснювали в горизонтальних і вертикальних електрофорезних камерах "Hoefer Scientific Instruments" (США).

При проведенні кожного електрофорезу обов’язково використовували електрофоретичний стандарт — ДНК-маркери молекулярної ваги, розміри фрагментів яких відомі, чи ледери, які містять повний спектр алелів відповідного локусу.

Візуалізація ДНК. Фрагменти ДНК, розподілені в агарозних гелях, забарвлювали бро-мис-тим етидієм (0,1–0,5 мкг/мл) і фотографували в УФ-променях на фотоплівку “Мікрат 300”.

Фрагменти ДНК в поліакриламідних гелях, забарвлювали сріблом у такий спосіб. Гель протягом 5 хв інкубували в 10%-му розчині етанолу, потім протягом 3 хв — у 1%-му розчині HNO3. Кілька разів промивали гель дистильованою водою, вміщували його на 20 хв у 0,012 М розчин AgNO3 у темряві. Потім гель кілька разів промивали дистильованою водою і “проявляли” у розчині, що містить 0,28 М Na2CO3 і 0,019%-й формалін, змінюючи його при потемнінні, до появи фрагментів ДНК. Потім гель знову промивали кілька разів дистильованою водою і вміщували на 2 хв у 10%-ий розчин крижаної оцтової кислоти. Інкубували не менше 2 хв у дистильованій воді. Потім гель висушували на папері Ватман 3ММ за допомогою вакуумного драйера при 80 °С протягом 30 хв або запаювали в поліетиленові пакети.

Документування даних електрофоретичного розподілу. Відеозображення й розміри ампліфікованих фрагментів одержували, використовуючи одну із систем документації й аналізу електрофорезних гелів: "image master VDS" чи "Kodak Digital Science EDAS 120".

Статистична обробка даних. При розрахунках ймовірності випадкового збігу генотипів і ймовірності підтвердження батьківства/материнства використовували дані частот алелів для європеоїдів, застосовуючи при цьому методи популяційної генетики.

Розрахунок ймовірності випадкового збігу генотипів (Р) за кожним дослідженим локусом проводили згідно з формулою: Р = рa(2-pa) у випадку, якщо профіль ДНК містив алелі а й а, і за формулою: Р = pa(2-pa) + pb(2-pb) – 2papb у випадку, якщо профіль ДНК містив алелі а і b. Кумулятивну ймовірність випадкового збігу генотипів (Ркум.) розраховували як добуток імовірностей за окремими локусами. Розрахунок ймовірності підтвердження батьківства/материнства (n) проводили за формулою:

n = (1 – Ркум.) ґ100 % .

Очікувану гетерозиготність Hobs, гетерозиготність, що спостерігається (фактичну) Hexp, ймовірність випадкового збігу генотипів двох неспоріднених індивідуумів рМ (probability of random match), ймовірність розрізнення генотипів двох неспоріднених індивідуумів PD (power of discrimination), теоретичну мінімальну частоту зустрічальності алеля min хobs, мінімальну частоту зустрічальності алеля, що спостерігається, min хexp, розраховували за такими формулами:

Hexp = (1 – xi2) x n/(n-1);

Hobs = Nhe/N;

pM = Pi2;

PD = 1 – рМ;

min хexp = 5/2N;

де xi — частота зустрічальності i-того алеля; n — кількість алелів; N — розмір вибірки (кількість індивідуумів); Nhe — кількість гетерозиготних генотипів; Pi — частота зустрічальності i-того генотипу.

У третьому розділі наведено дані про збір і збереження зразків. Умови одержання, добору й збереження біологічного матеріалу мають суттєве значення для проведення успішного ДНК-типування. Для використання ПЛР-аналізу в судово-медичних експертизах необхідно відібрати і зберегти біологічний матеріал, що містить ДНК необхідної полімерності. Протягом 10 років нами розроблялись умови вилучення й збереження матеріалу — біологічних зразків, придатних для ПЛР-аналізу. Це найшло відображення у науково-практичному виданні “Використання аналізу ДНК у судово-медичних експертизах” (Одеса: Одеський медуніверститет, 2001. 91 с.) При виявленні об’єктів біологічного походження на місці події їх необхідно вилучити з дотриманням нативності, упакувати й направити в судово-імунологічне відділення для досліджень.

Добір рідкої крові. За наявності людини, ДНК якої необхідно типувати, зразок рідкої крові в кількості не менше 0,5 мл відбирали з ліктьової вени в одноразову пробірку, що містить антикоагулянт 2,1 М розчин цитрату натрію. Зберігали при температурі –4 °С.

За відсутності антикоагулянту свіжу кров кількістю не менше 0,5 мл поміщали на стерильну марлю, складену в чотири шари, чи фільтрувальний папір. Носій із плямою крові висушували на чашці Петрі при кімнатній температурі без дії прямих сонячних променів і упаковували в поліетиленовий пакет. Зберігали при кімнатній температурі. Висушену на марлі чи фільтрувальному папері кров використовували для одержання препарату ДНК.

Добір трупної крові. Зразок трупної крові брали з порожнини серця чи великих судин, поміщали на стерильну марлю, складену в чотири шари. Марлю висушували на чашці Петрі при кімнатній температурі без дії прямих сонячних променів і упаковували в поліетиленовий пакет. Зберігали при кімнатній температурі.

Добір слини. Зразок слини кількістю 2—3 мл збирали в центрифужну пробірку і центрифугували. Надосадову рідину виливали на стерильну марлю, складену в чотири шари, висушували на чашці Петрі при кімнатній температурі без дії прямих сонячних променів і упаковували в поліетиленовий пакет. Зберігали при кімнатній температурі.

Збір слідів сперми і піхвових виділень. Залежно від обставин згвалтування плями сперми виявляли: а) на одязі потерпілого; б) на тілі потерпілого, у порожнинах, у т. ч. у піхві, у задньому проході, у ротовій порожнині; в) на місці події; г) на одязі підозрюваних. Плями з передбачуваною наявністю сперми на речах потерпілого вирізали й поміщали між двома предметними стеклами, фіксували липкою стрічкою і упаковували в поліетиленовий пакет. Тампони зі стерильної марлі з вмістом піхви, ротової порожнини чи заднього проходу висушували при кімнатній температурі, поміщали між двома стерильними предметними скельцями й упаковували в поліетиленовий пакет. Мазки-відбитки з головки статевого члена чи піхви не фіксували і не забарвлювали, щоб мінімізувати деградацію ДНК. Зразки зберігали при +4 °С.

Добір органів і тканин. Дослідження кісток проводили у випадках, коли не уявлялося можливим аналізувати інші тканини. Використовували так звані “свіжі” кістки або добре висушені губчастої структури. Добір м’язової тканини робили методом “відбитка”. Для цього з глибини розрізу м’яза шляхом промокування робили “відбиток” крові і тканинного вмісту на стерильну марлю, складену в чотири шари. Марлю висушували на чашці Петрі при кімнатній температурі, упаковували в поліетиленовий пакет і зберігали при +4 °C. Препарат упаковували в поліетиленовий пакет і зберігали при –20 °С.

Добір волосся. Волосся для ДНК-типування використовували у випадку наявності в ньому цибулини і піхвових оболонок. Волосини, що містять перераховані вище утворення, як правило, були вирваними. Їх висушували на чашці Петрі при кімнатній температурі, упаковували в паперовий конверт, потім у поліетиленовий пакет. Зберігали при кімнатній температурі.

Четвертий розділ дисертації присвячено розробці й удосконаленню методів виділення ДНК з біологічних зразків.

Фактори, що впливають на придатність ДНК для ПЛР-аналізу. На препарат ДНК, що аналізують методом ПЛР, можуть впливати такі фактори: недостатня кількість ДНК у зразку; деградація макромолекул ДНК під впливом клітинних ферментів і зовнішнього середовища (температура, вологість, продукти життєдіяльності мікроорганізмів); “забруднення” ДНК аналізованого об’єкту клітинною ДНК мікроорганізмів; вплив предмета-носія на процес виділення ДНК із висушених плям біологічного матеріалу; контамінація розчину ДНК елементами предмета-носія.

Проблема інгібування ПЛР. Іншим фактором, що впливає на можливість типування ДНК з біологічних зразків, є присутність інгібіторів, що виділяються одночасно з ДНК, таких як хемін, органічні компоненти, розчинні екстракти мікроорганізмів. На результати ампліфікації може негативно впливати використання ДНК із плям крові на різних носіях, гемолізована кров, гнильні зміни тканин.

Проблема контамінації. Висока чутливість методу ПЛР має й негативну сторону, що полягає в контамінації навіть малими кількостями нематричної ДНК. Контамінація — залучення із зовнішнього середовища в реакційну суміш специфічних молекул ДНК, здатних слугувати мішенню (матрицею) у реакції ампліфікації і давати хибнопозитивні результати. Такими мішенями можуть бути продукти реакції, що потрапляють у зовнішнє середовище на етапі електрофорезу або на етапі виділення ДНК із проб.

Багато шансів для забруднення сторонньою ДНК виникає під час приготування зразка. Чужорідна ДНК може бути отримана через крос-контамінацію між зразками чи через контамінацію зразка продуктами ПЛР із попередніх реакцій.

Якщо дотримуватися основних заходів обережності, можна мінімізувати й уникнути випадкової контамінації. Ці заходи такі:

— Просторовий поділ етапів. Повинні існувати фізично розділені приміщення для виділення ДНК із зразків, для постановки ПЛР і для аналізу продуктів ПЛР. —

Необхідно мати роздільні набори реактивів і піпеток для готування ПЛР-зразків і для постановки реакції. —

Автоклавування розчинів. —

Використання одноразових рукавичок.—

Уникання сплесків. —

Попереднє змішування реагентів і поділ їх на аліквоти. —

Додавання ДНК. Такі компоненти як мінеральна олія, пре-суміш і фермент можуть бути додані в ампліфікаційні пробірки перед додаванням ДНК. —

Ретельний вибір позитивного і негативного контролів. —

Ультрафіолетове опромінення для депуринізації залишкової ДНК.

Крайнім заходом захисту від контамінації є повне припинення роботи лабораторії протягом двох-трьох місяців.

Виділення ДНК. Традиційним для молекулярної біології підходом до виділення ДНК є клітинний лізис із використанням протеїнази К з наступним очищенням фенолом-хлороформом. Цей метод має ряд недоліків при використанні для судово-медичних досліджень: застосування реактивів, небезпечних для здоров’я людини, повторювані переноси зразків ДНК під час процедури виділення збільшують ризик контамінації ДНК і можливість втрати частини матеріалу при його вихідній малій кількості; тривалість процедури (2–3 доби). Тому цей метод для виділення ДНК з експертних зразків нами був модифікований.

Виділення ДНК із використанням Chelex 100 із різних експертних зразків складалося з таких етапів: інкубація зразка в 1 мл бідистильованої води при кімнатній температурі протягом 15–30 хв; центрифугування протягом 2–3 хв при 10,000–15,000 хg; додавання до 20 мкл осаду 5%-го розчину Chelex 100 до кінцевого обсягу 200 мкл; інкубація зразка при 56 °С протягом 15–30 хв; інкубація зразка на киплячій водяній бані протягом 8 хв; центрифугування протягом 2–3 хв при 10,000–15,000 хg. Обробка зразка до стандартної процедури виділення і введення додаткових етапів очищення залежали від виду і вихідного стану біологічного зразка.

Виділення і характеристика ДНК із плям крові на різних матеріалах. На вибір методу виділення ДНК зі слідів крові на різних матеріалах впливає стан плями і предмета-носія. У випадках з невеликими і слабо насиченими плямами чи у випадках із змивами з твердих предметів позитивний результат можна одержати шляхом прямої ампліфікації ДНК без її виділення. Пряма ампліфікація без виділення ДНК полягала у такому: квадрат розміром 2ґ2 мм, вирізаний із плями крові, обробляли метанолом протягом 15 хв, зливали метанол, а зразок висушували. У пробірку зі зразком додавали компоненти ампліфікаційної суміші, крім Taq-полімерази; пробірку прогрівали на киплячій водяній бані протягом 15 хв, охолоджували до кімнатної температури; конденсат осаджували короткочасним центрифугуванням; додавали 2,5 одиниці Taq-полімерази, нашаровували 20 мкл мінеральної олії. Ампліфікацію приводили в умовах, оптимізованих для використовуваної пари праймерів.

Виділення ДНК із плям крові з використанням Chelex 100. У 1,5-мл епендорф, що містить 1 мл бідистильованої води, вміщували подрібнену частину плями розміром 9–25 мм2. Наступні етапи виділення здійснювали за розробленою методикою: предмет-носій зі зразками залишали в епендорфі, якщо він був індиферентним, незабарвленим матеріалом, наприклад, марля, папір, поліетилен, скло; якщо пляма була слабовиражена або якщо пляма піддавалася обробці, наприклад, пранню. При виділенні ДНК із плям на пофарбованих матеріалах, наприклад, джинсовому чи шкіряному одязі, предметоносій видаляли з епендорфа.

Виділення і характеристика ДНК із слини. У судово-медичній експертній практиці досліджують сліди слини, виявлені на недопалках, поштових конвертах, різному посуді, на одязі гвалтівника і потерпілої у випадку боротьби, на шматках тканини при підозрі на використання їх як кляпа. У 1,5-мл епендорф, що містить 1 мл бідистильованої води, вміщували подрібнену частину плями розміром 9–25 мм2. Наступні етапи виділення здійснювали за стандартною методикою.

Виділення й характеристика ДНК із волосся. Волосся часто є речовим доказом у кримінальних справах при розслідуванні убивств, крадіжок, дорожньо-транспортних випадків, статевих злочинах. Волосся можна знайти в руках трупа, знаряддях злочину, одязі і тілі потерпілого та підозрюваного.

Для виділення ДНК із волосся необхідно мати його кореневу частину, тому що саме циліндричні клітини кутикули нижньої частини кореня й клітини серцевини кореня мають ядра. Перед тим як почати виділення ДНК, волосся обробляли ксилолом, абсолютним етиловим спиртом і деіонізованою водою для очищення від поверхневих забруднень і контамінантів, потім висушували на повітрі. Стерильним скальпелем відрізали частину волосся довжиною 1 мм з кореневого кінця разом з цибулиною. Суміжна частина волосини служила контролем, тому що волосся могло містити на поверхні клітинний матеріал, що має походження від донора даного волосся або з іншого джерела.

Методика виділення ДНК із волосся складалася з таких етапів: відрізану порцію волосся поміщали в 1,5-мл епендорф, що містить 200 мкл 5%-го Chelex 100; інкубували при 56 °С не менше 6–8 год чи протягом ночі; перемішували на вортексі при високій швидкості 5–10 с; центрифугували 2–3 хв при 10,000–15,000 xg; супернатант використовували для ПЛР-аналізу. Зберігали зразок при 2–8 °С чи замороженим.

Виділення ДНК із кісткових залишків. Дослідження кісток проводили у випадку неможливості аналізу інших тканин, наприклад, при ексгумації трупа, спалюванні трупа, обробці черепа киплячою водою тощо. Вихід ДНК при виділенні з 100 мг стегнової кістки складав: через 76 год після смерті — 6 мкг, через 123 год — 0,1–1,5 мкг.

Виділення ДНК із відбитків і змивів з статевих органів. Якщо змиви представлені в рідкому вигляді, то виділення ДНК розпочинали з центрифугування протягом 2–3 хв при 10,000–15,000 хg. Потім до 20 мкл осаду додавали 5%-й розчин Chelex 100 до кінцевого об’єму 100 мкл, далі процедуру продовжували згідно зі стандартним протоколом. Якщо змиви були адсорбовані шматочком стерильної марлі, змоченої ізотонічним розчином хлориду натрію, і потім висушені, то марлю поміщали в пробірку і заливали невеликою кількістю бідистильованої води. Термін екстрагування становив 1 добу. Потім марлю віджимали й видаляли з пробірки. Виділення ДНК проводили за стандартною методикою.

Виділення ДНК із використаної жувальної гумки. Знайдену на місці події використану жувальну гумку переносили у 2 мл пластикову пробірку, заливали 1,5 мл бідистильованої води й інкубували протягом 1 доби при температурі 4 °С, постійно погойдуючи пробірку. Жувальну гумку обережно видаляли з пробірки; розчин, що залишився в пробірці, центрифугували при 10 000–16 000 об/хв і до одержаного осаду додавали 150 мкл 5%-го Chelex 100 ("BioRad", США), потім інкубували при температурі 56 °С протягом 1 год. Після цього пробу піддавали кип’ятінню на водяній бані протягом 8 хв. Пробірку струшували, центрифугували при вказаних вище умовах. Для ПЛР-аналізу використовували 5–10 мкл аліквоту.

У п’ятому розділі наведено відомості про підбір і характеристику гіперваріабельних локусів для типування людини.

Гіперваріабельні мультиалельні генетичні локуси в геномі людини представлені, головним чином, так званими, “тандемними повторами” з варіабельною кількістю копій (VNTRs). Клас тандемних поліморфних локусів умовно розбитий на два підкласи: мінісателітів — з довжиною повтору 7 і більше п. н. (саме їх мають на увазі під найменуванням VNTRs) і мікросателітів — з довжиною повтору від 2 до 7 п. н. (відомих також як “короткі тандемні повтори” (STRs) .

При виборі міні- і мікросателітних локусів для наших ідентифікаційних досліджень керувалися такими критеріями: незчепленість локусів між собою; висока інформативність і гетерозиготність; низька ймовірність випадкового збігу генотипів двох неспоріднених індивідів; можливість аналізу деградованих препаратів ДНК; можливість аналізу мікрокількостей ДНК; простота й дешевизна візуалізації алелів, тобто відсутність необхідності в дорогій апаратурі, такій як автоматичний ДНК–аналізатор, прилад для капілярного електрофорезу; можливість проведення мультиплексних ПЛР; відсутність артефактів, пов’язаних з роботою Taq ДНК полімерази, таких як прослизання повтору й додавання кінцевого нуклеотиду; відсутність мікроваріантних алелів.

Характеристика вибраних мінісателітних локусів. Локус D1S80. Тандемний повтор даного локусу розташований на дистальному кінці короткого плеча хромосоми 1. Поруч не розташовані відомі в даний час гени.

Маркер має аутосомно-кодомінантний тип спадкування. Передбачувана кількість алелів 29, що визначає більше 400 можливих генотипів. Дискримінаційний потенціал дорівнює 95–98 %. Довжина повторюваної одиниці — 16 п. н. Довжина ампліфікованих фрагментів варіює від 398 до 718 п. н.

Локус гена аполіпопротеїну В. Локус розташований у 3’-фланкуючому районі гена аполіпопротеїну В на хромосомі 2 (2р23-р24). Маркер має аутосомно-кодомінантний тип спадкування. Передбачувана кількість алелів 12–16, що визначає наявність близько 90 можливих генотипів. Потенціал дискримінації — 80–85 %. Довжина повторюваної одиниці становить 15 п. н., однак довжина алелів даного локусу відрізняється одна від одної на 30, 60, 90 п. н. і т. ін., тобто на дві, чотири, шість повторюваних одиниць і т. д. Довжина ампліфікованих фрагментів варіює від 540 до 1020 п. н.

Локус D17S5. Тандемний повтор рYNZ22 даного локусу розташований на короткому плечі хромосоми 17 (17р13). Поруч не розташовані відомі в даний час гени. Маркер має аутосомно-кодомінантний тип спадкування. Передбачувана кількість алелів у популяції 12–14, що визначає близько 80 можливих генотипів. Потенціал дискримінації — 80–85 %. Довжина повторюваної одиниці — 70 п. н. Довжина ампліфікованих фрагментів варіює від 170 до 1010 п. н.

Локус D1S111. Тандемний повтор р33.6 даного локусу розташований на хромосомі 1 (1cen-q24) у гені міоглобіну. Довжина повторюваної одиниці — 37 п. н. Виявлено 8–14 алелів у діапазоні довжин 381–1000 п. н. Для даного локусу характерний високий рівень поліморфізму: вісім алелів було виявлено при гібридизаційному аналізі зразків ДНК 14 неспоріднених осіб. Довжина повторюваної одиниці становить 37 п. н.

Локус RB1. Локус розташований усередині інтрона 16 гена ретинобластоми (RB1), що є геном-супресором, який бере участь у процесі утворення злоякісних пухлин зі схильністю до ретинобластом, розташований на хромосомі 13 (13q14) і має довжину близько 200 т. п. н. (160). Довжина повторюваної одиниці становить 50 п. н. Виявлено дев’ять алелів. Довжина ампліфікованих фрагментів варіює від 1200 до 1650 п. н.

Локус IgH. Локус розташований на хромосомі 14 (14q32). Мінісателітна послідовність знаходиться в 5’-кінцевому сегменті J гена важкого ланцюга імуноглобуліну. Довжина повтору — 50 п. н. Довжина ампліфікованих фрагментів варіює від 370 до 920 п. н.

Характеристика вибраних мікросателітних локусів. Локус HUMCYAR04. Мікросателіт CYP19 даного локусу розташований у гені ароматази цитохрому Р450 на хромосомі 15 (15q21.1). Виявлено 8 алелів розміром від 181 до 209 п. н., що включають від п’яти до 12 повторів АААТ.

Локус D19S253. Локус має структуру (СА)n і містить до десяти алелів довжиною від 204 до 240 п. н., що включають від трьох до 21 повторюваних одиниць. Повторювана ланка цих алелів має розмір 4 п. н. і складається з двох динуклеотиідних мотивів. Серед європеоїдів знайдено 8 алелів даного локусу розміром 212–240 п. н.

Локуси HUMvWFII і HUMvWFA31. Мікросателіти даних локусів розташовані в гені фактора фон Виллебранда (von Willebrand factor gene — vWF) на хромосомі 12 (12р13.3-р13.2). В інтроні 40 гена vWF виявлено 3 дистанційованих один від одного поліморфних мікросателіти мотиву (АТСТ)n/(AGAT)n. Для мікросателіта HUMvWFI, розташованого в 5’-кінцевій частині інтрона 40, у європейських популяціях виявлено 11 алелів. Для мікросателіта HUMvWFII, що знаходиться в 3’-кінцевій частині поліморфної ділянки (позиції 2215–2380 п. н. в інтроні 40), показано існування 7 алелів довжиною від 154 до 178 п. н. Для мікросателіта HUMvWFIII, що також позначається як HUMvWFA31/A (позиції 1640–1794 п. н. в інтроні 40), показане існування 7–12 алелів при аналізі різних расових груп.

Локус D6S366. Мікросателіт D6S366 (позначення за Genome Database) розташований на хромосомі 6 (6q21-qter). Відомо десять алелів розміром від 138 до 174 п. н. Повторюваний мотив (А3Т).

Локус HUMCD4. Ген поверхневого антигену CD4 знаходиться на хромосомі 12 (12pter-p12). Для різних рас виявлено до 11 алелів розміром від 125 до 175 п. н. Однак при використанні інших пар праймерів у ряді західноєвропейських популяцій виявлено максимум 8 алелів даного локусу розміром від 88 до 128 п. н.

Локус HUMF13AO1. Ген субодиниці А фактора XIII людини розташований на хромосомі 6 (6р243-р251). Описано 6 алельних варіантів даного гена, 5 з яких виникли через точкові мутації, що торкаються ділянки гена, який кодує, і приводять до амінокислотних замін.

Локус HUMBFXIII. Мікросателіт F13B даного локусу розташований на хромосомі 1 (1q31-q32.1) у гені субодиниці фактора XIII. Містить повторювану одиницю АААТ. Виявлено 7 алелів розміром від 169 до 193 п. н.

Локус SE33. Для кавказоїдів Німеччини виявлено 26 алелів у вибірці з 180 неспоріднених індивідуумів, а для кавказоїдів США у вибірці з 39 індивідуумів — 21 алель.

Локус HUMTH01. Мікросателіт даного локусу (ТС11) розташований у гені тирозингідроксилази на хромосомі 11 (11р15.5). Повторюваний елемент ААТ. Для кавказоїдів Німеччини у вибірці з 110 індивідуумів і США у вибірці з 40 індивідуумів виявлено шість алелів, у вибірці з російської популяції виявлено 7 алелів довжиною від 197 до 199 п. н.

Локус HUMCSF1PO. Мікросателіт CSF1PO даного локусу розташований у гені рецептора c-fms фото-онкогена на хромосомі 5 (5q33.3-34). Відомо 10 алелів розміром 291–327 п. н.

Локус HUMFESFPS. Мікросателіт даного локусу FESFPS розташований на хромосомі 15 (15q25-qter) у c-fes/fps фото-онкогені. Повторюваний елемент АААТ. Виявлено 8 алелів розміром 222-250 п. н.

Локус HUMHPRTB. Мікросателіт HPRTB даного локусу розташований у гені гіпоксантин-фосфорибозилтрансферази (Xq26). Виявлено 12 алелів розміром 259–303 п. н.

Локус HUMLIPOL. Мікросателіт LPL даного локусу розташований на хромосомі 8 (8р22) у гені ліпопротеїнліпази. Повторювана одиниця — АААТ. Виявлено 7 алелів розміром від 105 до 133 п. н.

Локус HUMTPOX. Мікросателіт TPOX даного локусу розташований на хромосомі 2 (2р23-2рter) у гені тироїдпероксидази. Виявлено 8 алелів розміром 224–252 п. н. Локус PАН. Даний локус розташований на хромосомі 12 (12q 22–q 22.4). Кількість алелів, виявлених у вибірці з 187 неспоріднених людей міських популяцій Москви і Західного Сибіру (Томськ, Новосибірськ), становить 8. Діапазон довжин алелів від 228 до 256 п. н.

Для визначення статевої належності біологічних зразків проводили ампліфікацію частини Х–Y-гомологічного гена амелогеніну з єдиною парою праймерів, унаслідок чого одержували продукти різної довжини з Х- і Y-хромосом. Використовували пари праймерів, що фланкують 6-п. н. делецію в інтроні 1 Х-гомолога, в результаті чого ампліфікувались 106-п. н. і 112-п. н. ПЛР-продукти Х- і Y-хромосоми відповідно. Якщо судово-медичний зразок належав жінці, на електрофореграмі був присутній один фрагмент довжиною 106 п. н.; якщо чоловіку — два фрагменти довжиною 106 і 112 п. н.

Обмеження в застосуванні мінісателітів і переваги мікросателітів для ідентифікації особистості. Cуттєві обмеження накладаються на ПЛР-аналіз мінісателітних локусів при дослідженні деградованих препаратів ДНК (наприклад, виділених із плям крові, сперми, слини, а також частин волосяного покриву і трупного матеріалу, що перебував у стані розкладання від дії руйнуючих біологічних чи фізико-хімічних факторів). При аналізі подібних препаратів часто спостерігається повна відсутність електрофоретичних смуг в алельному діапазоні, що, як правило, свідчить про повну деградацію в зразку алелів аналізованого локусу, отже, про неможливість проведення генотипування. Якщо ж при аналізі деградованого зразка ДНК виявляється тільки один низькомолекулярний алель, то в цьому випадку існує небезпека помилкової гомозиготності: можливо, аналізований зразок насправді є гетерозиготним, але наявний високомолекулярний алель не виявляється в ході дослідження, оскільки ступінь його деградації у “поганих” зразках істотно вищий ступеня деградації низькомолекулярного.

З цього погляду ПЛР-типування мікросателітних локусів виявляється переважнішим. Завдяки більш коротким, порівняно з мінісателітами, розмірами алелів, по-перше, вище ймовірність збереження їх у деградованої ДНК, а по-друге, не настільки велика ймовірність втрати високомолекулярного алеля внаслідок його переважної деградації. На практиці це означає відчутний виграш у чутливості аналізу. Крім того, ймовірність помилкової гомозиготності, обумовленої кращою ампліфікацією низькомолекулярних алелів, украй низька для мікросателітних локусів через вузькість спектра алельних довжин.

Таким чином, обмеження, зв’язані із застосуванням мінісателітних маркерів у судово-медичних дослідженнях, зумовлені такими факторами: низька частота і асиметричність розподілу мінісателітних повторів у геномі людини; ймовірність “помилкової гомозиготності”, обумовленою “кращою ампліфікацією” чи втратою (деградацією) високомолекулярного алеля; деградація мінісателітних локусів у препаратах ДНК, виділеної зі зразків, що перебували у стані розкладу від впливу руйнуючих біологічних чи фізико-хімічних факторів; неможливість використання при виділенні ДНК хелатуючої смоли Chelex 100.

У шостому розділі охарактеризовано розподіл алелів і генотипів у змішаній популяції України.

Оцінка ймовірності ідентифікації вимагає знання того, як часто ті чи інші генотипи зустрічаються в тій частині населення, до якої приблизно належить ідентифікований об’єкт. Чим частіше зустрічається генотип, тим нижче ймовірність ідентифікації. Тому в країнах, де в судово-медичних експертизах використовують ДНК-типування, створюють бази даних по ДНК-дослідженнях, що охоплюють різні верстви населення з урахуванням раси, походження й ін.

Даних щодо частот зустрічальності генетичних ознак у конкретній популяції (ця конкретна популяція повинна відповідати тестованій особі), як правило, недостатньо, тому що накопичення таких даних — справа часу. Практичний експерт користується рекомендованими формулами підрахунку ймовірностей, що знижують кінцеву цифру ймовірнісно-стверджувальної відповіді. Це не означає, що виправдується винний, тому що більшою мірою захищаються права невинної у здійсненні даного злочину особи. Таким чином, експерт змушений включати в дослідження більшу кількість систем генетичного аналізу для того, щоб підвищити вірогідність доказової відповіді, що одночасно багаторазово збільшує імовірність виключення випадкового збігу генотипів.

Популяційна вибірка. Популяція України є гетерогенною, тому що на її території проживають національності колишнього СРСР, що відрізняються неоднаковою частотою прояву алелів. Ступінь гетерогенності популяції Одеси, що посідає певне місце в наших дослідженнях, висока також у зв’язку з історичним минулим міста, у формуванні населення якого брали участь греки, італійці, французи, швейцарці, болгари, євреї, турки, вихідці з внутрішніх губерній Російської імперії.

Дані щодо вибірки з неспоріднених представників змішаної популяції України наведені у табл. 1.

Частота зустрічальності алелів і генотипів у змішаній популяції України. Для локусу D17S5 нами показана