ім. ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

Коротєєва Ганна Володимирівна

УДК. 578.85/.86

Віруси та вірусні хвороби представників родини Orchidaceae Juss. - біологічні характеристики та розповсюдження на території України

03.00.06-вірусологія

Автореферат

на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ-2003

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано на кафедрі вірусології біологічного

факультету Київського національного університету

ім. Тараса Шевченка, м. Київ.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Поліщук Валерій Петрович, Київський національний

університет ім. Тараса Шевченка, кафедра вірусології.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник Коваленко Олексій Григорович,

Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України,

провідний науковий співробітник

кандидат біологічних наук, доцент Мельничук Максим Дмитрович,

Національний аграрний університет, декан факультету захисту

рослин та біотехнології.

Провідна установа: Дніпропетровський національний університет,

м. Дніпропетровськ.

Захист дисертації відбудеться “_23_” вересня 2003 р. о 16оо годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 Київського

національного університету ім. Тараса Шевченка за адресою:

03127, Київ, проспект Глушкова, 2, корпус 12, ауд. 215

Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського

національного університету ім. Тараса Шевченка: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий 7 серпня 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Молчанець О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Культура тропічних зозулинцевих є однією з провідних економічно вигідних культур захищеного грунту. В Україні тропічні зозулинцеві вирощують, в основному, у ботанічних садах. Хоча рослини зозулинцевих досить стійкі до хвороб та шкідників, порушення правил карантину, технологій утримання культур, недотримання гідро- та терморежиму призводять до зниження їх природної стійкості. Вірусні хвороби зозулинцевих є найбільш небезпечними і викликають повне та незворотнє виродження рослин, що є причиною великих втрат в колекціях.

Колекції зозулинцевих захищеного грунту в ботанічних садах України збираються протягом багатьох років та містять нетестовані на вірусоносійство рослини, тобто не відбувається вибраковка уражених особин. В той же час, їх вегетативне розмноження, яке проводиться без вірусологічного контролю на кожному з його етапів, призводить до накопичення великої кількості уражених вірусними хворобами рослин. Крім того, багато вірусів, що викликають захворювання зозулинцевих, можуть розповсюджуватися механічним шляхом під час зрізання квіток.

Проблема збереження біологічного різноманіття рослинного світу є однією з найважливіших проблем оздоровлення довкілля. Особливості вірусних захворювань культурних зозулинцевих широко вивчаються в багатьох країнах світу, в той час як проблема вірусних інфекцій цих рослин у біогеоценозах природних ландшафтів помірної кліматичної зони майже відсутня. Як правило, дикорослі зозулинцеві України належать до рідкісних та зникаючих рослин. Невідомо, яку роль відіграють вірусні хвороби в зникненні ареалу та чисельності даних видів. Тому постає необхідність вірусологічного контролю нетропічних зозулинцевих в їх природних ценозах та розробка методів культивування того чи іншого виду у захищеному грунті для його збереження.

Використання чутливих вірусологічних методів виявлення вірусного ураження рослин на різних етапах мікроклонального розмноження і вибраковка хворих рослин повинна сприяти збереженню видового складу колекцій зозулинцевих захищеного грунту.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась згідно з науковими темами кафедри вірусології біологічного факультету Київського національного університету: тема (реєстраційний номер №01БФ036-01) “Моніторинг збудників вірусних інфекцій з метою розробки наукових основ екологічно чистих технологій вирощування сільськогосподарських культур”, міжнародна угода (реєстраційний номер №2000Д009) “Розробка технологічних прийомів боротьби проти вірусних хвороб сільськогосподарських культур СРВ (кава, чай, чорний перець, цитрусові та інші)”.

Мета та задачі дослідження. Метою нашої роботи було:

-виявлення та ідентифікація збудників вірусних хвороб зозулинцевих захищеного грунту та природних екосистем України;

-удосконалення існуючих методів отримання оздоровленого посадкового матеріалу зозулинцевих для збереження їх різноманіття.

Для досягнення зазначеної мети необхідно було вирішити такі завдання:

Провести обстеження колекцій тропічних зозулинцевих провідних ботанічних садів України на наявність вірусної інфекції.

Ідентифікувати збудників виявлених вірусних захворювань.

Вивчити морфолого-біологічні властивості збудників виявлених вірусних захворювань.

Отримати діагностичну сироватку для ідентифікації вірусів імуноферментним методом.

Удосконалити існуючу схему отримання оздоровленого посадкового матеріалу зозулинцевих.

Виявити стійкі до вірусної інфекції рослини зозулинцевих захищеного грунту.

Розробити технологію отримання in vitro рослин зозулинцевих природної флори України.

Об’єктом дослідження були рослини родини Orchidaceae Juss. природних ландшафтів та колекцій захищеного грунту провідних ботанічних садів України та В’єтнаму.

Предметом дослідження були вірусні хвороби зозулинцевих та їх збудники.

Методи дослідження. Для виявлення та ідентифікації вірусів застосовували біологічне тестування, непрямий і прямий методи імуноферментного аналізу та трансмісивну електронну мікроскопію. Структурні білки виділених вірусів досліджували за допомогою методу електрофорезу в системі ПААГ-NaДДС. Вивчення нуклеїнової кислоти вірусу кільцевої плямистості одонтоглосуму (ВКПО) проводили методом полімеразної ланцюгової реакції. Специфічність отриманої поліклональної сироватки оцінювали методами імуноелектроблотингу. За допомогою біотехнологічних методів здійснювали введення дикорослих зозулинцевих в культуру та їх культивування.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в Україні проведено обстеження колекцій зозулинцевих захищеного грунту провідних ботанічних садів на наявність вірусної інфекції. Виявлено найбільш розповсюджені віруси в колекціях ботанічних садів України – вірус мозаїки цимбідіуму (ВМЦ; Potexvirus) та вірус кільцевої плямистості одонтоглосуму (ВКПО; Tobamovirus). В результаті обстеження колекцій захищеного грунту встановлено толерантний до вірусної інфекції сорт Cymbidium hybridum hort.: Lilian Stewart ‘Sundown’. Моніторинг вірусних інефкцій (ВМЦ, ВКПО, вірусу тютюнової мозаїки (ВТМ)) орхідей В’єтнаму показав, що рослини природної флори не були уражені заначеними патогенами, в той час як рослини штучних ценозів були ними інфіковані. Вперше при тестуванні дикорослих зозулинцевих на наявність вірусних патогенів було встановлено, що вірус аспермії томатів (ВАТ; Cucumovirus), ВМЦ (Potexvirus), вірус мозаїки гусимця (ВМГ; Nepovirus) та вірус брязкотіння тютюну (ВБрТ; Tobravirus) є найпоширенішими.

Практичне значення роботи. На основі отриманої діагностичної антисироватки створено діагностичну систему ыз застосуванням лужної фосфатази, яка може бути використана для обстеження колекцій зозулинцевих. Удосконалено схему насіннєвого розмноження дикорослих орхідей в умовах in vitro шляхом відбору поживних середовищ для утворення протокормів. Модифіковано технологію оздоровлення рослин від вірусів тропічних видів за рахунок відбору здорових рослин-донорів та насіннєвого матеріалу для мікророзмноження та вірусологічного контролю на послідуючих етапах культивування.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора. Інформаційний пошук, опрацювання літературних джерел, розробка схеми експерименту, отримання експериментальних даних, їх узагальнення та інтерпретацію автором дисертації здійснено особисто. Підготовку публікацій за отриманими результатами, а також представлення результатів на наукових конференціях здійснено за участю наукового керівника. Частину досліджень проведено за сприяння співробітників лабораторії тропічних та субтропічних рослин Національного ботанічного саду ім. М. М. Гришка НАНУ, які є співавторами опублікованих робіт.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, які викладено в дисертаційній роботі, були представлені на: Міжнародній науковій конференції “Охорона і культивування орхідей”, Київ, Україна, 1999 рік; ІІІ Міжнародній конференції “Біоресурси та віруси”, Київ, Україна, 2001 рік; Міжнародній конференції “Micropropagation of ornamental plants”, Каунас, Литва, 2001 рік; Міжнародному симпозіумі “Biotechnology approaches for exploration and preservation of plant resourses”, Ялта, Україна, 2002 рік; 6-ій конференції Європейського товариства фітопатологів “Disease resistance in plant pathology”, Прага, Чеська республіка, 2002 рік, 1-му конгресі європейських мікробіологів, Любляна, Словенія, 2003 рік.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 робіт, з них 6 статей - у наукових фахових виданнях, 6 - матеріали конференцій. Права співавторів не порушено.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів, результатів та їх обговорення, підсумків, висновків та переліку використаних літературних джерел. Повний обсяг роботи складає 166 сторінок друкованого тексту, що включає 52 рисунки (з них 29 фотографій), 4 таблиці та перелік використаних джерел (204, з них 140 - іноземні).

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Огляд літератури складається з 5 підрозділів, в яких наведені сучасні відомості про віруси та вірусні хвороби рослин родини Orchidaceae Juss., висвітлені питання діагностики, профілактики інфікування та оздоровлення уражених вірусами рослин.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Для дослідження біологічних характеристик вірусів та вивчення їх різноманіття відбирали зразки дикорослих зозулинцевих природної флори України та тропічних зозулинцевих захищеного грунту. Дослідження проводили в двох основних регіонах існування дикорослих зозулинцевих: Кримському півострові та зоні Карпат. Декоративні зозулинцеві відбирали в колекціях захищеного грунту ботанічних садів України: Національного ботанічного саду ім. М.М. Гришка (Київ), ботанічного саду ім. О.В. Фоміна КНУ (Київ), ботанічного саду ХНУ ім. М.В. Каразіна (Харків), ботанічного саду ДНУ (Дніпропетровськ), Криворізьського ботанічного саду (Кривий Ріг) та Нікітського ботанічного саду (Ялта). Для препаративного виділення та накопичення вірусів відбирали зразки рослинного матеріалу з Cymbidium hуbridum hort. (листки та суцвіття) з візуальними симптомами вірусного ураження (мозаїчність та некротизація). Виділення та очищення вірусів проводили за стандартними методиками.

Електронномікроскопічні дослідження проводили на електронному мікроскопі марки JEM-1200 та ЕМ-125 за загальноприйнятою методикою.

Біологічні властивості вірусів зозулинцевих захищеного грунту та природної флори України вивчали за допомогою спектру рослин-індикаторів: Chenopodium amaranticolor Coste et Reyn., Datura stramonium L., Nicotiana tabacum cv. Samsun, N. tabacum cv Trapeson, N. glutinosa L., N. affinis Host., N. rustica L., Gomphrena globosa L., Trifolium repens L., Phaseolus vulgaris L., Pisum sativum L., Brassica campestis ssp. Rapa, B. nigra (L.) Koch, B. oleraceae L., Petunia hybrida hort, Spinaceae oleracea L.

Дослідження капсидних білків виділених вірусів ВМЦ та ВКПО проводили за допомогою методу електрофорезу у системі ПААГ-NaДДС за Лемлі (Laemmli, 1970). Імуноферментний аналіз проводили методом непрямого ІФА (indirect ELISA) та методом DAS-ELISA на полістиролових планшетах, використовуючи кролячі антисироватки до досліджуваних вірусів та антикролячу антисироватку, мічену пероксидазою хрону або лужною фосфатазою. Результати реєстрували на автоматичному ELISA-рідері “Multiscan” МСС модель 340 Р при довжині хвилі 492 нм та 405 нм. Для отримання власної антисироватки використовували кролів породи шиншила масою 3-3,5 кг, віком 10 місяців. Імунізацію проводили за стандартною методикою. Концентрацію вірусів визначали спектрофотометрично. РНК ВКПО виділяли за допомогою фенол-хлороформного методу. Якість препарату РНК оцінювали електрофоретично. Для порівняння генів капсидних білків відомих ізолятів ВКПО та отриманих нами ізолятів була проведена ампліфікація ділянки РНК методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).

Насіння таких зозулинцевих природної флори Криму, як Orchis purpurea L., Comperia comperana (Stev.) Aschers., Limodorum abortivum (L.) Sw. та Neottia nidus-avis (L.) Rich. культивували в умовах in vitro, як описано (Черевченко Т.М., 1982), для вивчення можливості передачі вірусів за допомогою насіння.

Метод розмноження тропічних зозулинцевих в культурі тканин складався з декількох етапів: 1 - відбір експланта; 2 - стерилізація рослинного матеріалу; 3 - виділення меристем та бруньок; 4- отримання протокормоподібних тіл; 5 - отримання рослин; 6- висадка у субстрат. Як експлант рослин Cymbidium hybridum hort. використовували туберидії, молоді пагони, сплячі бруньки молодих туберидіїв. Експланти культивувавали на середовищах Кнудсона С, модифікованому Кнудсона С, Вімбера, Мурасіге-Скуга, Мореля.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Характеристика виділених ізолятів ВМЦ та ВКПО

Рослини зозулинцевих Cymbidium hybridum hort., відібрані з колекцій захищеного грунту, мали симптоми мозаїки та кільцевих некрозів. Результати дослідження біологічних властивостей виділених ізолятів вірусів на спектрі рослин-індикаторів за допомогою методу механічної інокуляції подано в таблиці 1.

Оскільки дурман звичайний (Datura stramonium L.) є індикатором для виявлення ВМЦ, а гомфрена (Gomphrena globosa L.) - для виявлення ВКПО і ці рослини давали характерні симптоми на віруси, а на лободі (Chenopodium amaranticolor Coste. et Reyn.) і тютюні (Nicotiana glutinosa L.) симптоми виникають при ураженні як ВМЦ, так і ВКПО, то ми зробили припущення, що рослини Cymbidium hybridum hort. уражені вірусами ВКПО та ВМЦ.

Таблиця1

Симптоми ВМЦ та ВКПО на спектрі рослин-індикаторів

Вид рослини-індикатора | Симптоми

Локальні | Системні

Datura stramonium L. | некрози | відсутні

Gomphrena globosa L. | некрози брунатного кольору | відсутні

Chenopodium amaranticlor Coste. et Reyn | хлоротичні плями, що перетворюються на дрібні некрози | відсутні

Nicotiana glutinosa L. | некрози | відсутні

N. tabacum cv. Trapeson | відсутні | відсутні

N. tabacum cv. Samsun., | некрози | відсутні

N. affinis Host. | відсутні | деформація листкової пластинки

N. rustica L. | відсутні | відсутні

Petunia hybrida hort. | некрози | відсутні

Trifolium repens L. | відсутні | відсутні

За допомогою методу електронної мікроскопії в соці рослин Cymbidium hybridu hort. з симптомами вірусного ураження було виявлено паличкоподібні та ниткоподібні віріони (рис. 1) та визначені їх лінійні розміри: для перших - 314 ± 6 нм х 20± 0,6 нм, а для других - 490 ± 6 нм х 13 ± 0,6 нм, що за літературними даними відповідає розмірам ВКПО та ВМЦ, відповідно.

Рис.1. Електронномікроскопічне зображення

ВМЦ та ВКПО, інструментальне збільшення х 20000

При дослідженні структурних білків виділених вірусів методом електрофорезу у треках кожного з дослідних зразків спостерігалися два основних компоненти (рис. 2). За результатами електрофоретичного дослідження було встановлено, що виділені віруси містять по одному структурному білку, молекулярна маса якого становить 27692 73 Да – для ВМЦ та 17519 29 Да - для ВКПО.

Рис. 2. Електрофореграма білків ВМЦ та ВКПО:

1 – маркерні білки (зверху- вниз: .Phosphorilase B - 94 кДа, BSA - 67 кДа, Ovalbumin -43 кДа , Carbonic Anhydrase - 30 кДа, Soybean Tryspin – 20,1 кДа, Inhibitor, Alpha-lаctalbumin - 14,4 кДа); 2 - сік рослин Cymbidium hybridum hort., з симптомами ураження на листках (розведення 1:2), 3 - суміш вірусів ВМЦ та ВКПО, виділених з рослин Cymbidium hybridum hort. (5 мг/мл), 4 - суміш вірусів ВМЦ та ВКПО, виділених ВМЦ та ВКПО з рослин Calanthe vestita Lindl.(3 мг/мл); 5 – очищений препарат ВКПО (11 мг/мл).

1 2 3 4 5

Аналіз виділених фенол-хлороформним методом РНК досліджуваних ізолятів ВКПО за допомогою електрофорезу нуклеїнових кислот не виявив відмінностей у їх молекулярних масах. При проведенні електрофорезу нуклеїнової кислоти ізоляту ВКПО встановлений її розмір – 6,6 ± 0,1 kb.

Поєднання результатів біологічного тестування з результатами ІФА, електрофоретичними даними та результатами електронної мікроскопії дає підставу стверджувати про вірусну природу захворювання, а саме: змішану інфекцію ВМЦ та ВКПО.

Як відомо, за нуклеотидними послідовностями капсидного та транспортного білків (CP, MP) ВКПО належить до підгрупи 1 тобамовірусів (представники якої інфікують пасльонові рослини)), має високий відсоток гомології за послідовностями СР ВТМ і серологічно споріднений з вірусом зеленої крапчастої мозаїки огірка (ВЗКПО, 2 група тобамовірусів). При проведенні RT-PCR із застосуванням праймерів для капсидних білків ВТМ та ВЗКПО на РНК ВКПО доведена відмінність нуклеотидних послідовностей цих білків ВТМ, ВЗКПО та ВКПО. Використання жодного з праймерів не дозволило отримати позитивний результат при постановці RT-PCR. Це свідчить про відмінність у сайтах посадки праймерів, синтезованих до специфічних ділянок капсидного білка ВТМ та ВЗКПО, від послідовностей цих ділянок у ВКПО.

Для подальшого тестування зозулинцевих у колекціях ботанічних садів України була отримана поліклональна сироватка до суміші вірусів ВМЦ та ВКПО. За допомогою непрямого імуноферментного аналізу було встановлено робоче розведення поліспецифічної сироватки (1: 8000) при розведенні її в діапазоні від 1:50 до 1: 51200 (рис. 3). Як контроль використовували сік здорової рослини Cymbidium hybridum hort. в розведенні 1 : 50 та нормальну сироватку кроля.

Рис. 3. Результати титрування досліджуваної сироватки непрямим ІФА:

суміш ВМЦ та ВКПО;

сік здорової рослини;

нормальна сироватка.

У результаті проведення імуноелектроблотингу за Тоубіном з вірусними ізолятами та соком здорової рослини було встановлено, що одержана поліклональна антисироватка реагує з білками на мембрані, які відповідають білкам ВМЦ та ВКПО (молекулярні маси компонентів 27602 73 Да та 17519 29 Да, відповідно), та не реагує з іншими білками – компонентами соку рослин (рис. 4).

1 2 3 4 5 1 2 3

Рис. 4. a. - Електрофореграма білків ВМЦ (1) та ВКПО (2): 1 - маркерні білки (зверху- вниз: Phosphorilase B - 94 кДа, BSA - 67 кДа, Ovalbumin - 43 кДа, Carbonic Anhydrase - 30 кДа, Soybean Tryspin - 20 кДа, Inhibitor Alpha-loctalbumin - 14,4 кДа); 2, 3 - білки соку рослин Cymbidium hybridum (розведення 1:30); 4 - білки соку рослин Calanthe vestita (розведення 1:30); 5 - білки соку рослин Cattleya sp.(розведення 1:30).

b. - Імуноблотограма вірусних білків з використанням власної антисироватки до суміші ВМЦ та ВКПО ( розведення 1:3200): 1 - білки вірусів в рослинному соці Cymbidium hybridum hort.; 2 - білки вірусів в рослинному соці Calanthe vestita Lindl.; 3 - білки вірусів в рослинному соці Cattleya sp.

Таким чином, в результаті проведених досліджень нами була доведена вірусна природа захворювань зозулинцевих роду Cymbidium hybridum hort., що спричиняється інфекцією ВМЦ та ВКПО. Отримана діагностична поліклональна антисироватка, за допомогою якої в подальшому було проведене тестування рослин колекції ботанічних садів України.

2. Обстеження колекцій зозулинцевих захищеного грунту ботанічних садів України

При візуальному обстеженні ботанічних садів України найгірший фітосанітарний стан мали рослини колекції Національного ботанічного саду ім. М.М. Гришка НАНУ (Київ), ботанічного саду ім. О.В. Фоміна Київського національного університету (Київ), ботанічного саду Харківського національного університету ім. М.В. Каразіна (Харків). Таку картину, на наш погляд, можна пояснити тим, що в даних ботанічних садах зозулинцеві вирощувалися протягом багатьох років і за досить тривалий проміжок часу відбувалось перезараження рослин різними патогенами. Крім того, зазначені ботанічні сади мали колекції зозулинцевих, які характеризувалися значною чисельністю видів з багатьох регіонів світу. Перед розміщенням в теплицях ці рослини не проходили попереднього тестування на наявність вірусних патогенів. Слід також зазначити, що Національний ботанічний сад ім. М.М. Гришка НАНУ (Київ) є основним постачальником зозулинцевих для колекцій інших ботанічних садів України.

У всіх колекціях симптоми зараження були подібними і різнилися лише за ступенем прояву інфекцій. Найпоширенішими симптомами були листкова мозаїка, некротизація, деформація квіток та затримка розвитку рослин.

Дані, отримані за допомогою ІФА, показали, що досліджуваний матеріал усіх обстежених колекцій містив ВМЦ та ВКПО. У результаті порівняння даних діагностування було виявлено, що ураженими в усіх ботанічних садах України виявилися рослини родів Calanthe, Cattleya, Cymbidium, Dendrobium, Oncidium, Phalaenopsis та Coelogyne (рис. 5). З них рослини роду Cymbidium були найбільш чутливі до вірусного ураження ВМЦ та ВКПО, причому вміст ВКПО в даних рослинах (за результатами імуноферментого аналізу та електронної мікроскопії) був значно нижчим. Ці дані розходяться з даними досліджень, проведених у Новій Зеландії (Young, Blondell, 1979; Pearsone, Cole, 1986), в яких встановлено, що ВКПО є в три рази більш загальним для роду Cymbidium, але узгоджуються з результатами досліджень флоридських оранжерей (Zеttler et al., 1978), які показали, що ВМЦ більш розповсюджений, ніж ВКПО.

При обстеженні колекцій зозулинцевих в ботанічних садах України було відмічено, що рослини роду Paphiopedilum (Paphiopedilum insigne (Lindle)) є найбільш стійкими до вірусного ураження.

Рис. 5. Порівняння результатів тестування рослин зозулинцевих у колекціях ботанічних садів України методом непрямого ІФА за допомогою антисироваток до ВТМ та до суміші ВМЦ та ВКПО: A – Національний ботанічний сад ім. М.М. Гришка, B – ботанічний сад ім. О.В. Фоміна Київського національного університету, C - ботанічний сад Харківського національного університету ім. В.Н. Каразина, D -ботанічний сад Дніпропетровського національного університету, E - Криворізьський ботанічний сад НАНУ, F - Нікітський ботанічний сад Національного наукового центру УААН.

За допомогою методу електронної мікроскопії були повністю підтверджені результати ІФА. У соці уражених рослин зозулинцевих виявлено паличковидні віріони ВКПО та нитковидні – ВМЦ, лінійні розміри яких складають 18 х 300±20 нм та 13 х 490 ±20 нм, відповідно.

Встановлений неоднаковий ступінь ураженості рослин Cymbidium hybridum hort. різних сортів одного віку, що може бути пояснено генетичною різницею між ними. Хоча тенденція розвитку інфекції у всіх сортів була однаковою, найбільша концентрація вірусів за даними імуноферментного аналізу була у Cassandra ‘Gennifer’, найменша - у Lillian Stewart ‘Sundown’ (Табл. 2). Крім того, спостерігалося зниження концентрації вірусу в процесі росту рослин (у розрахунку на одиницю маси). Пробірочні рослини містили менше вірусу, ніж протокорми, а рослини у віці 2-х років - менше, ніж пробірочні рослини. Результати імунохімічного аналізу повністю корелювали з результатами електронної мікроскопії.

Таким чином, у результаті проведення дослідження сортів Cymbidium hybridum визначений толерантний до вірусної інфекції (ВМЦ, ВКПО) в умовах захищеного грунту сорт - Lilian Stewart ‘Sundown’.

Таблиця 2

Результати тестування трьох сортів Cymbidium hybridum hort. методом непрямого імуноферментного аналізу

Вид досліджуваного матеріалу | Lillian Stewart ‘Sundown’ | Maxham ‘Mary’ | Cassandra ‘Gennifer’

Концентрація вірусів, мкг/г сирої маси

Моноклональні антитіла до ВМЦ | Поліклональна сироватка до ВКПО | Моноклональні антитіла до ВМЦ | Поліклональна сироватка до ВКПО | Моноклональні антитіла до ВМЦ | Поліклональна сироватка до ВКПО

Протокорми | 49 1 ,83 | 181,2 | 71 0,82 | 25 1,023 | 80 2,24 | 37 1,228

Меристемні рослини | 27 1,06 | 7 1,17 | 42 1,08 | 12 1,28 | 57 1,42 | 25 1,325

Дворічні рослини | 19 1,63 | 4 1,03 | 21 1,31 | 10 1,35 | 38 1,5 | 18 1,6

Негативний контроль | 0,13 0,004 | 0,11 0,003 | 0,13 0,002 | 0,17 0,002 | 0,19 0,0019 | 0,18 0,003

Одним з основних джерел надходження тропічних та субтропічних зозулинцевих до ботанічних садів України є В’єтнам. Так, деякі зозулинцеві з колекції НБС ім. М.М. Гришка НАНУ були отримані з інституту Тропічної біології (Далат, В’єтнам) та з екосистем природних ландшафтів центрального В’єтнаму. При дослідженні даних рослин було виявлено, що такі зозулинцеві як Cattleya hybridum hort., Сymbidium hybridum hort., Vanda tricolor Lindl. уражені ВМЦ, в той час як рослини Coelogyne sp. були вільні від даного патогена. Стосовно ураження рослин ВКПО, то види Coelogyne sp., Cymbidium hybridum hort, Vanda tricolor Lindl. були ним інфіковані, на відміну від рослин Cattleya hybridum hort.. Таким чином, всі зозулинцеві, які привезені з В’єтнаму, були уражені вірусами, причому в більшості випадків спостерігалось сумісне інфікування рослин двома вірусами.

Співставлення результатів тестування зозулинцевих природних та штучних екосистем В’єтнаму показало різке збільшення концентрації вірусів у штучних умовах (рис. 6). Більше того, в орхідеях природної флори В’єтнаму не було відмічено наявності антигенів ВМЦ та/або ВКПО. Даний факт, на наш погляд, може бути пояснений зниженням природної стійкості рослин при утриманні їх в штучних ценозах та сприятливими для розповсюдження даних вірусів умовами (монокультура, неефективна агротехніка, наявність хворих рослин в колекції).

Рис.6. Результати тестування представників родини Orchidaceae Juss. методом непрямого ІФА з використанням поліклональних сироваток до ВТМ, ВМЦ та ВКПО: 1 - Bulbophyllum sp., 2 - Coelogine sp., 3 - Cymbidium sp. - з природных зон центрального В’єтнаму; 4 – 10 - Cymbidium sp. – рослини, які вирощуються в умовах захищеного грунту, размножені вегетативно та 11 - 12 – рослини Cymbidium hybridum hort., отримані методом культури апікальних меристем, 13 – негативний контроль.

Таким чином, отримані дані підтверджують необхідність утримання рослин зозулинцевих, що надходять в колекції, певний час в умовах карантину для їх обов’язкового вірусологічного контролю.

3. Дослідження зозулинцевих природної флори на наявність вірусної інфекції

Представники родини Potyviridae, такі як вірус пожовтіння жилок конюшини (ВПЖК), вірус жовтої мозаїки квасолі (ВЖМК), вірус мозаїки турнепсу (ВМТ), ідентифіковані як вірусні патогени зозулинцевих флори Європи, мають широке коло рослин – господарів і здатні уражувати як декоративні та сільськогосподарські культури агроценозів, так і дикоростучі рослини з природних екосистем. Виходячи з цього, в роботі був застосований набір сироваток до вірусів, які раніш не були визначені як патогени дикорослих зозулинцевих. Оскільки спостерігається висока частота реєстрації ВАТ та ВМГ в сільськогосподарських та декоративних культурах, що вирощуються поряд з основними центрами існування природних зозулинцевих, на наш погляд, існує велика загроза перенесення вірусів з агроценозів до природніх місць існування диких рослин.

У результаті біологічного дослідження зразків, виділених з зозулинцевих природної флори України, на рослинах-індикаторах нами були отримані результати, які представлені в таблиці 3.

Таблиця 3

Симптоми вірусного ураження на рослинах-індикаторах, інокульованих соком досліджуваних рослин зозулинцевих

Вид рослини – індикатора | Симптоми при інокуляції соком

Orchis pupurea | Orchis morio | Neottia nidus-avis | Dactylorhisa majalis | Limodorum abortivum | Listera ovata

Chenopodium amaranticolor Coste et Reyn | некрози | - | - | - | - | -

Gomphrena globosa L. | некрози | некрози | - | некрози | некрози | -

Datura stramonium L. | некрози | - | - | - | - | жовтуха

Nicotiana affinis Host. | дрібна мозаїка | - | хлороз | - | - | -

N. glutinosa L. | жовтуха | - | - | - | - | крайові брунатні некрози

N. tabacum cv. Samsun | мозаїка | - | - | - | - | -

N. rustica L. | брунатний некроз | - | - | - | - | -

Petunia hybrida hort. | - | - | - | - | - | -

Spinaceae oleracea L. | некрози | - | некрози | - | - | -

Trifolium repens L. | - | - | - | некрози | - | -

Phaseolus vilgaris L | - | - | - | - | - | некрози

Pisum sativum L. | - | - | - | - | - | -

Brassica campestris ssp. Rapa | - | - | - | - | - | -

Brassica oleraceae L. | - | - | - | - | некрози | -

Brassica nigra L. | - | - | - | - | - | -

Таким чином, більшість рослин-індикаторів не проявляли чітких симптомів при інокуляції соком досліджуваних рослин. А симптоми, які з’являлися на деяких з них, характерні для широкого кола вірусів. Хоча при співставленні з результатами ІФА та ЕМ можливо припустити, що на рослинах Orchis pupurea Hunds. виявлялися симптоми, характерні при ураженні вірусами, які відносяться до роду Potexvirus.

Як показало тестування зозулинцевих природної флори України, в цих рослинах найчастіше детектувалися ВАТ (Cucumovirus), ВМЦ (Potexvirus), ВМГ (Nepovirus) та ВБрТ (Tobravirus) (рис.7).

У результаті проведення електронномікроскопічних досліджень соку Orchis pupurea L. (околиці м. Севастополь) була показана наявність у ньому гнучких нитковидних часточок довжиною 480-510 5 нм і діаметром – 12 0,6 нм та уламки паличкуватих часточок. При інокуляції рослин-індикаторів соком даних рослин розвивалися симптоми, характерні для представників роду Potexvirus (табл. 3).

Рис. 7. Розповсюдження вірусів серед дикорослих зозулинцевих України:

a – півострів Крим; b – зона Карпат.

Серед зозулинцевих природної флори України, які були протестовані нами, види Listera ovata (L.) R. Br, Neottia nidus–avis (L) Reichenb. та Orchis purpurea Hunds. характеризувалися найвищим рівнем контамінації вірусами. Ці рослини відносяться до рідкісних та зникаючих (Orchis purpurea Hunds.) видів і занесені в Червону книгу країни. Їх ураження вірусами може сприяти зниженню видового різноманіття в ареалах існування зозулинцевих або їх повному зникненню на території України.

4. Розмноження зозулинцевих та отримання оздоровлених рослин в умовах in vitro.

На базі НБС ім. М.М. Гришка НАНУ (Київ) було модифіковано існуючу схему отримання та вирощування оздоровленого посадкового матеріалу (рис. 8).

На першому етапі відбувається відбір рослин зозулинцевих, які тестувалися на наявність вірусної інфекції. Здорові рослини відбирали для виділення апікальних меристем та пазушних бруньок молодих пагонів, сплячих бруньок туберидіїв, які використовували як експлант. Крім того, як експлант використовували протестоване вільне від вірусних патогенів насіння зозулинцевих. Утворення протокормів відбувалось через 1-1,5 місяця. При досягненні протокормами 3-4 мм в діаметрі їх розділяли на 2-3 частини, кожну з яких розміщували на новому поживному середовищі для розмноження. Після утворення протокормів, їх поділу та збільшення маси проводили дослідження даних протокормів на наявність вірусної інфекції. На наступному етапі рослини-регенеранти тестували та відбирали ті з них, які не містили вірусів (рис. 9). Здорові рослини-регенеранти висаджували в теплиці, притримуючись усіх санітарно-епідемічних правил.

Підібрані умови культивування та клонального мікророзмноження зозулинцевих роду Cymbidium Sw. є передумовою для одержання здорового посадкового матеріалу, вільного від вірусних патогенів.

Рис. 8. Схема отримання оздоровленого посадкового матеріалу при розмноженні Cymbidium hybridum hort. в культурі in vitro

Рис. 9. Рослини-регенеранти Cymbidium hybridum hort. на середовищі Мурасіге-Скуга

Проблема збереження біорізноманіття є однією з найважливіших проблем оздоровлення довкілля, оскільки антропогенний вплив призводить до зникнення багатьох видів рослин, у тому числі зозулинцевих. Відомо, що біотехнологічні методи можна використовувати для їх успішної інтродукції та регенерації. Однак методи мікророзмноження зозулинцевих помірної зони мають відмінності в порівнянні з розмноженням тропічних зозулинцевих.

Зозулинцеві природної флори Криму: Orchis purpurea Hunds., Comperia comperana (Stev.) Aschers. et Graebn., Limodorum abortivum (L.) Sw. та Neottia nidus-avis (L) Reichenb. розмножували за допомогою насіння в умовах in vitro з метою збереження біорізноманіття даних видів та вивчення можливості передачі вірусів за допомогою насіння зозулинцевих. Подовжений час стерилізації насіння дикорослих зозулинцевих в порівнянні з часом стерилізації тропічних видів та застосування активних хлорвмісних сполук (20 % Сhlorox), 70 % етилового спирту, 15 % пероксиду дало змогу отримати неконтаміноване вірусами насіння, а в подальшому і протокорми даних видів зозулинцевих (рис. 10).

Найкращими середовищами для проростання насіння виявилися середовища Кнудсона (модифіковане) та Харвейса.

Рис. 10. Протокорми Limodorum abortivum (L.) Sw., що утворилися на поживному середовищі Харвейс (6 тижнів після перенесення на середовище Мурасіге-Скуга)

Таким чином, в результаті проведених досліджень були підібрані оптимальні умови стерилізації та визначені найкращі асимбіотичні поживні середовища для пророщування насіння нетропічних видів зозулинцевих (Мурасіге-Скуга та Харвейса). Отримані нами дані в подальшому можуть бути використані для розмноження зозулинцевих помірних широт.

Висновки

Вперше проведено дослідження колекцій зозулинцевих захищеного грунту ботанічних садів України (Національний ботанічний сад ім. М.М. Гришка НАНУ (Київ), ботанічний сад ім. О.В. Фоміна Київського національного університету (Київ), ботанічний сад Харківського національного університету ім. М.В. Каразіна (Харків), ботанічний сад Дніпропетровського національного університету (Дніпропетровськ), Криворізьський ботанічний сад НАНУ (філія ДБС, Кривий Ріг) та Нікітський ботанічний сад Національного наукового центру УААН (Ялта)) на наявність вірусних патогенів та показано нерівномірне розповсюдження вірусних інфекцій.

Ідентифіковано найбільш розповсюджені віруси в колекціях ботанічних садів – вірус мозаїки цимбідіуму (Potexvirus) і вірус кільцевої плямистості одонтоглосуму (Tobamovirus) та вивчені їх біологічні властивості.

На основі багаторічного тестування визначено толерантний до вірусної інфекції (ВМЦ, ВКПО) в умовах захищеного грунту сорт Cymbidium - Lilian Stewart ‘Sundown’.

При дослідженні зозулинцевих В’єтнаму показано різке збільшення концентрації вірусів (ВМЦ, ВКПО, ВТМ) у рослин штучних ценозів, що може бути наслідком зниження їх природної стійкості в результаті інтродукції.

Отримано поліклональну діагностичну сироватку до ізолятів ВМЦ та ВКПО з робочим розведенням 1:8000 для створення діагностикумів на основі непрямого ІФА з використанням лужної фосфатази, що дозволить діагностувати ВМЦ та ВКПО в рослинах на різних стадіях онтогенезу.

У результаті моніторингу дикорослих зозулинцевих України, використовуючи методи біологічного тестуваня, електронної мікроскопії та ІФА, показано, що найбільш розповсюдженими є віруси мозаїки цимбідіуму (Potexvirus), аспермії томатів (Cucumovirus), мозаїки гусимця (Nepovirus) та брязкотіння тютюну (Tobravirus).

Удосконалено існуючу технологію отримання видів зозулинцевих природної флори в умовах in vitro на етапі утворення протокормів на підібраних поживних середовищах та модифіковано схему оздоровлення посадкового матеріалу тропічних видів. Процес оздоровлення базується на формуванні здорових рослин-донорів та насіння і обов’язковому контролю вірусних інфекцій на наступних етапах культивування.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Коротєєва Г.В., Поліщук В.П. Вірусні захворювання в колекції зозулинцевих ботанічного саду ім. O.В. Фоміна Київського національного університету ім. Тараса Шевченка// Наукові записки НаУКМА.- 2000.Т.19,-Ч.2.- С.399-400.

Коротєєва Г.В., Поліщук В.П. Изучение распространенности вирусных заболеваний среди растений семейства Orchidaceae в условиях закрытого грунта Украины// Садоводство и овощеводство. 2001. – С.132-137.

Коротєєва Г.В., Поліщук В.П. Вивчення вірусної інфекції деяких видів природних зозулинцевих Криму// Вісник КНУ серія “Біологія”, 2002, № 35.-С.43-45.

Koroteyeva A.V., Polischuk V.P., Bysov A.S., Lavrentyeva A.N., Boyko A.L. Necessity for virus control on different stages of Orchidaceae plants’ introduction// Бюллетень Никитского ботанического сада. 2002.N 86., -С. 47-49.

Korotyeyeva A.V., Polischuk V.P. Orchid Viruses of Natural Ukrainian Flora// Plant protection science. 2002.- V. 38., N.2.- P. 381 –383.

Коротєєва Г.В., Поліщук В.П. Вірусні інфекції орхідей природньої флори України.// Доповіді національної академії наук України. 2003., N 6.- С 162-166.

Polischuck V. P., Belonog S.A., Koroteeva A.V., Lavrentyeva A.N.. The virus control of Cymbidium hybridum hort. plants at different stages of microclonal reproduction// Охорона і культивування зозулинцевих.-К.:Наук.думка.-1999.-С.112-116.

Koroteeva A., Ryjkova A. and Polischuk V. Physiological changes among some members of Orchidaceae family affected by viruses// 12th congress of Federation of European soscieties of Plant Pathology, 21-25 August 2000, Budapest,- S 20-44.

Коротєєва Г.В., Поліщук В.П. Досліження орхідей природньої флори Криму на наявність вірусної інфекції// III Міжнародна конференція “Біоресурси та віруси”, 11-15 Вересня, 2000, Київ,-с.81.

Koroteyeva A.V., Polischuk V.P., Bysov A.S., Lavrentyeva A.N., Boyko A.L. Necessity for virus control on different stages of Orchidaceae plants’ introduction// International sympozium “Biotechnology approches for exploration and preservation of plant resourses”, 26-31 May, 2002, Yalta, Ukraine, p 45-46.

Korotyeyeva A.V., Рolischuk V.P. Orchid viruses of natural Ukrainian flora //6th conference of European foundation for Plant Pathology. 8-14 september 2002, Czech Republic, Prague.-p. 67.

Korotyeyeva A.V., Рolischuk V.P. Virus infection of some species from Orchidaceae family in natural Ukrainian flora //1st FEMS congress of European microbiologists. June 29- July 3 2003, Slovenia, Ljubljana.-p. 482.

АНОТАЦІЇ

Коротєєва Г.В. Віруси та вірусні хвороби родини представників родини Orchidaceae Juss. - біологічні характеристики та розповсюдження на території України - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.06 – вірусологія. – Київський національний університет ім. Тараса Шевченка, Київ, 2003.

Дисертація присвячена дослідженню властивостей вірусів зозулинцевих та вивченню їх розповсюдженості в умовах захищеного грунту та природній флорі. Виявлені та ідентифіковані збудники вірусних хвороб зозулинцевих захищеного грунту та природних екосистем України, показано їх нерівномірне розповсюдження. Виявлено факт відсутності шкодочинних вірусів зозулинцевих закритого грунту в їх природніх умовах існування. Виявлені толерантний до вірусної інфекції сорт рослин Cymbidium hybridum hort. Отримано поліклональну діагностичну сироватку до ізолятів ВМЦ та ВКПО для створення діагностикумів на основі непрямого ІФА з використанням лужної фосфатази, що дозволить ідентифікувати ВМЦ та ВКПО в рослинному матеріалі. Модифіковано схему оздоровлення посадкового матеріалу зозулинцевих та розроблено технологію отримання рослин терестріальних видів зозулинцевих в умовах in vitro.

Ключові слова: віруси, зозулинцеві, технологія оздоровлення.

Коротеева А.В. Вирусы и вирусные заболевания представителей семейства . Orchidaceae Juss – биологические характеристики и распространение на територии Украины. – Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.06 – вирусология. – Киевский национальный университет им. Тараса Шевченко, Киев, 2003.

Диссертация посвящена изучению свойств вирусов орхидей и исследованию их распространения в условиях защищенного грунта и природной флоры. Определены и идентифицированы возбудители вирусных заболеваний тропических орхидей защищенного грунта коллекций ботанических садов Украины – вирусы мозаики цимбидиума (ВМЦ; Potexvirus) и кольцевой пятнистости одонтоглоссума (ВКПО; Tobamovirus). Получена поликлональная диагностическая сыворотка к ВМЦ и ВКПО с рабочим разведением 1: 8000 для создания диагностикумов на основе непрямого ИФА с использованием щелочной фосфатазы. При тестировании коллекций тропических орхидей в ботанических садах Украины с помощью полученной антисыворотки показано неравномерное распространение данных патогенов. При визуальном обследовании ботанических садов Украины наихудшее фитосанитарное состояние было зарегистрировано у растений коллекции Национального ботанического сада им. Н.Н. Гришко НАНУ (Киев), ботанического сада им. О.В. Фомина Киевского национального университета (Киев), ботанического сада Харьковского национального университета им. В.Н. Каразина (Харьков). В результате сравнения данных диагностирования было определено, что пораженными во всех ботанических садах Украины оказались растения родов Calanthe, Cattleya, Cymbidium, Dendrobium, Oncidium, Phalaenopsis та Coelogyne. Среди коллекции тропических орхидей защищенного грунта НБС НАНУ определен толерантный к вирусной инфекции (ВМЦ, ВКПО) в условиях защищенного грунта сорт растений Cymbidium hybridum hort. - Lilian Stewart ‘Sundown’. Сопоставление результатов