інститут біології тварин УААН

кліщ іван миколайович

УДК 616.36-002-099-092.9-065.616-008.92-053

Вікові особливості перебігу окиснювальних процесів за умов токсичного ураження печінки та способи їх корекції

03.00.04 - біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Львів - 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Тернопільській державній медичній академії ім.І.Я.Горбачевського Міністерства охорони здоров’я України.

Науковий консультант - доктор медичних наук, професор Гонський Ярослав Іванович, Тернопільська державна медична академія ім.І.Я.Горбачевського, завідувач кафедри медичної хімії.

Офіційні опоненти: - доктор біологічних наук, професор Стойка Ростислав Степанович, завідувач відділу регуляції проліферації клітин Інституту біології клітини НАН України;

- доктор біологічних, професор Костерін Сергій Олексійович, завідувач відділу біохімії м’язів, заступник директора з наукової роботи Інститу біохімії ім. О.В. Паладіна НАН України

- доктор медичних наук, професор Кульчицький Олег Костянтинович, завідувач лабораторії регуляції метаболізму, заступник директора з наукової роботи Інситуту геронтології АМН України;

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка, кафедра біохімії, м. Київ

Захист відбудеться “ 25” червня 2003 р. о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01 у Львівському інституті біології тварин за адресою: 580123, м. Львів, вул. В. Стуса, 38

З дисертацією можна ознайомитись в науковій бібліотеці Львівського інституту біології тварин (79034, м. Львів, вул. В. Стуса, 38)

Автореферат розісланий “21 травня 2003 р.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради . Віщур О.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Оксидно-відновні реакції посідають важливе місце в системі метаболічних перетворень, а їх порушення відіграють значну, а іноді й вирішальну роль у розвитку патологічних процесів (Барабой В.А., Сутковой Д.А., 1997). Особливе значення мають процеси окиснення у печінці, де за їх участю здійснюється виконання органом основних його функцій, зокрема знешкодження ендо- та екзотоксинів. Токсичні ураження печінки біоцидними ксенобіотиками супроводжуються суттєвими порушеннями перебігу окиснювальних реакцій, які деякими дослідниками характеризуються як “окиснювальний стрес” (Гонський Я.І., 2001; Mecca M.M., Castro G.B., 1993; Ciolino H.P., 1997; Nultall S.L., 1998). І фаза метаболічних перетворень переважної більшості ксенобіотиків відбувається, головним чином, за участю залежної від цитохрому Р-450 монооксигеназної системи ендоплазматичного ретикулуму гепатоцитів. Внаслідок цих перетворень можуть утворюватися полярні проміжні сполуки, які в подальшому знешкоджуються шляхом кон’югації, або ж високореактивні інтермедіати (епоксиди, N-, S-оксиди, вільні радикали), що здатні взаємодіяти з макромолекулами клітини, започатковуючи ланцюги патологічних процесів, а це в подальшому може призвести до токсичної загибелі клітини шляхом некрозу чи апоптозу (Арчаков А.И., Карузина И.И., 1988, Владимиров Ю.А., 1998; Coleman J.B., 1988; Decker K., 1993; Papa S., 1997). За даними ряду дослідників, концентрація цитохрому Р-450 та активність процесів гідроксилювання у мікросомах печінкових клітин мають вікові особливості (Парамонова Г.І., 1994; Kato R., Takanaka A., 1986). Враховуючи це, можна припустити, що інтенсивність та шляхи метаболічних перетворень ксенобіотиків також будуть залежати від віку. Однак ці питання залишаються не дослідженими.

Універсальним механізмом, який відіграє ключову роль у реалізації дії більшості токсичних агентів, є активація вільнорадикальних процесів. Механізм ушкодження клітин радикальними метаболітами, які утворюються в результаті біотрансформації значної кількості біоцидних ксенобіотиків, полягає у їх здатності ініціювати перекисне окиснення ліпідів та білків, ковалентно зв’язуватися з біомакромолекулами, а також генерувати активні форми кисню (АФК), які є високотоксичними і здатні започатковувати нові ланцюги вільнорадикальних реакцій (Владимиров Ю.А., 1998, Тимочко М.Ф., 1998; Slater T.F., 1989; Brent J.A., 1993; Dogru-Abbasoglu S., 1997). Вираженість ушкоджувальної дії радикальних продуктів залежить від інтенсивності їх продукування та швидкості знешкодження антиоксидантною системою. Як показано багатьма дослідниками, обидва ці процеси також мають вікову залежність. Вказується на пригнічення у старості інтенсивності радикалоутворення і зниження концентрації субстратів ліпопероксидації (Лемешко В.В. 1987; Анисимов В.Н., 1999; Romero F.J., 1998). Однак з віком знижується також функціональна активність антиоксидантної системи (АОС), що сприяє впливу радикалів на клітинні структури (Воскресенский О.Н., 1982; Ланкин В.З., 1981; Rikans L.E., 1992).

Важлива роль у реалізації токсичної дії ксенобіотиків належить порушенню енергетичного забезпечення клітини. Особливого значення це набуває у статевонезрілих та старих тварин, в яких у нормі спостерігається їх напруження, обумовлене особливостями функціонування ряду ферментних систем, які забезпечують перебіг реакцій тканинного дихання та окисного фосфорилювання в мітохондріях (Литошенко А.Я., 1993; Hansford R. G., 1983), однак ці процеси досліджені недостатньо.

Сучасні наукові підходи до фармакотерапії хімічних ушкоджень печінки зводяться до таких основних заходів: застосування специфічних антидотів, медикаментозна корекція метаболічних процесів у гепатоцитах, застосування методів очищення внутрішнього середовища організму (еферентна терапія), тимчасове заміщення функцій гепатоцитів, уражених патологічним процесом (Губський Ю.І., 2001). Проте проблема лікування токсичних уражень печінки залишається далекою від свого розв’язання. Невирішеними, зокрема, є питання вікових підходів до фармакотерапії токсичних гепатопатій.

Усе викладене вище стало підставою для дослідження вікових особливостей окиснювальних процесів у тварин з токсичним ураженням печінки та пошуку нових способів корекції їх порушень.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом планових наукових тем кафедр медичної хімії та біології Тернопільської державної медичної академії ім. І.Я. Горбачевського “Порушення окиснювальних процесів, захисних систем організму і нуклеотидного обміну при ураженні печінки хімічними та біологічними токсинами і шляхи їх корекції” (№ держреєстрації 0195U023938) та “Вікові особливості окиснювальних процесів та нуклеотидного обміну за умов ураження печінки хімічними і біологічними токсинами та способи їх корекції” (№ держреєстрації 0101U001317), в якій автор досліджував в динаміці зміни мікросомного, вільнорадикального і енергозабезпечувального окиснення у щурів різних вікових періодів за умов токсичних уражень тетрахлорметаном та солянокислим гідразином і їх корекції карнітину хлоридом, ліпосомами, начиненими карнітину хлоридом, бурштиновою кислотою і цитохромом С , а також поєднаним застосуванням ліпосом та ентеросорбенту “Силард П”.

Мета і задачі дослідження. З’ясувати особливості процесів мікросомного, вільнорадикального та енергозабезпечувального окиснення в динаміці токсичного ураження печінки тетрахлорметаном і солянокислим гідразином у щурів різного віку та розробити нові способи корекції їх порушень.

Для досягнення поставленої мети було необхідно:

- з’ясувати роль системи цитохром Р-450-залежних монооксигеназ ендоплазматичного ретикулуму гепатоцитів у процесах метаболізму тетрахлорметану та солянокислого гідразину у тварин різних вікових періодів;

- встановити ступінь порушення окиснювальних процесів у мікросомах печінки за умов токсичного ураження тварин різного віку тетрахлорметаном та солянокислим гідразином;

- дати оцінку змін інтенсивності перекисного окиснення ліпідів в печінці та плазмі крові щурів різних вікових періодів, уражених тетрахлорметаном та солянокислим гідразином;

- дослідити вираженість процесів окиснювальної модифікації білків та розкрити взаємозв’язок між процесами вільнорадикального окиснення ліпідів та білків в динаміці токсичного ураження печінки у тварин різного віку;

- з’ясувати вікові особливості функціонування системи антиоксидного захисту, роль її порушень у патогенезі токсичних гепатопатій, викликаних уведенням тетрахлорметану та солянокислого гідразину;

- встановити ступінь порушення енергозабезпечувального окиснення в мітохондріях гепатоцитів за дії тетрахлорметану та солянокислого гідразину у тварин різних вікових періодів;

- дослідити вплив карнітину хлориду на активність окиснювальних процесів у тварин різних вікових періодів за умови токсичного ураження тетрахлорметаном та солянокислим гідразином;

- розробити ліпосомну форму препарату з інкорпорованими бурштиновою кислотою, карнітину хлоридом та цитохромом С і дати оцінку ефективності його застосування з метою корекції токсичних уражень тетрахлорметаном та солянокислим гідразином у тварин різного віку;

- дослідити ефективність поєднаного застосування ліпосом, навантажених бурштиновою кислотою, карнітину хлоридом й цитохромом С, та ентеросорбенту “Силард П” за умов токсичного ураження тетрахлорметаном та солянокислим гідразином у щурів різних вікових періодів.

Об’єкт дослідження – хімічне ураження печінки тетрахлорметаном та солянокислим гідразином у тварин різних вікових періодів.

Предмет дослідження – показники мікросомного, вільнорадикального та енергозабезпечувального окиснення, стан антиоксидантної системи у тварин різних вікових періодів з токсичним ураженням тетрахлорметаном та солянокислим гідразином та після корекції карнітину хлоридом, холінфосфатидними ліпосомами з інкорпорованими карнітину хлоридом, бурштиновою кислотою і цитохромом С, а також за умов поєднаного застосування ліпосом з ентеросорбентом “Силард П”.

Методи дослідження – біохімічні, фізико-хімічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено комплексне дослідження та дано інтегральну оцінку активності окиснювальних процесів у тварин різних вікових періодів, уражених ксенобіотиками з різними механізмами біотрансформації – тетрахлорметаном та солянокислим гідразином:

- встановлено, що при токсичному ураженні печінки тетрахлорметаном у молодих тварин пригнічення активності мікросомного окиснення та активація вільнорадикальних процесів виражені значно більше, ніж у дорослих та старих. Показано, що це обумовлено токсифікацією тетрахлорметану за участю мікросомної монооксигеназної системи, активність якої у молодих щурів значно вища, ніж у дорослих та старих;

- показано, що за умов токсичного ураження тетрахлорметаном у молодих тварин переважає утворення високоактивних радикалів, які ініціюють процеси ліпопероксидації мембранних фосфоліпідів, а у старих – низькоактивних трихлорметильних радикалів, котрі здатні безпосередньо взаємодіяти з макромолекулами біополімерів;

- встановлено, що активація вільнорадикальних процесів у печінці старих тварин, уражених тетрахлорметаном, обумовлена не тільки прямим прооксидантним ефектом ССl4, а й його здатністю пригнічувати активність антиоксидантних ферментів;

- з’ясовано, що метаболічна біотрансформація в ендоплазматичному ретикулумі гепатоцитів не відіграє вирішальної ролі в активації вільнорадикальних процесів за умови інтоксикації солянокислим гідразином;

- доведено, що токсичне ураження солянокислим гідразином спричиняє найбільш виражені порушення мікросомного, вільнорадикального та енергозабезпечувального окиснення у гепатоцитах старих тварин.

Вперше всебічно досліджено механізми антиоксидного ефекту карнітину хлориду і показано його гепатопротекторні властивості при токсичному ураженні печінки.

Експериментально доведена висока ефективність холінфосфатидних ліпосом з інкорпорованими в них карнітину хлоридом, бурштиновою кислотою та цитохромом С за токсичного ураження печінки.

Встановлено, що у старих тварин з токсичними ураженнями печінки ефективним є поєднання ентеросорбції із засобами антиоксидантної і метаболічної дії.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати поглиблюють уявлення про початкові механізми патологічних процесів, викликаних отруєнням ксенобіотиками з різним типом метаболізму в ендоплазматичному ретикулумі печінки залежно від віку, що відкриває можливість пошуку диференційованого підходу до терапії.

Клініко-лабораторну інтерпретацію вмісту окиснено модифікованих білків можна застосовувати як додатковий діагностичний критерій для оцінки важкості перебігу токсичного ураження печінки ксенобіотиками.

У результаті проведених досліджень виявлені нові властивості анаболічного засобу нестероїдної природи - карнітину хлориду і доведена його висока ефективність у лікуванні токсичних уражень печінки, особливо у молодих тварин, що може бути використано у практиці.

Запропоновано і експериментально доведено високу ефективність нової лікарської форми - холінфосфатидних ліпосом з інкорпорованими в них карнітину хлоридом, бурштиновою кислотою та цитохромом С, які, діючи на різні ланки метаболічних процесів, сприяють швидкому відновленню порушень, викликаних токсичною дією ксенобіотиків, що відкриває перспективи для реалізації шляхів її використання в гепатологічній практиці.

Отримані результати дозволяють науково обґрунтувати доцільність комбінованого застосування за умов токсичного ураження печінки сорбенту “Силард П” та холінфосфатидних ліпосом, навантажених карнітину хлоридом, бурштиновою кислотою та цитохромом С.

Результати роботи впроваджені у практику наукових досліджень і навчальний процес ряду кафедр медичних академій і університетів України, що підтверджено відповідними актами впровадження.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно розроблена дослідницька програма, самостійно проведені більшість біохімічних і фізико-хімічних досліджень. За участю наукового консультанта підібрані засоби для корекції метаболічних порушень, сформульовані висновки. Полярографічні методи дослідження і деякі експерименти на ізольованих гепатоцитах виконані з допомогою співробітників кафедри медичної хімії. Приготування суспензії холінфосфатидних ліпосом здійснювалось за сприяння співробітників кафедри екології та біотехнологій Тернопільського державного педагогічного університету ім. В. Гнатюка, за що автор висловлює їм щиру подяку.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, які проводились в ході виконання дисертації роботи, доповідались на VІ Українському біохімічному з’їзді (Київ, 1992); республіканській науковій конференції гастроентерологів “Нове у діагностиці та лікуванні органів травлення” (Вінниця, 1993); республіканських науково-практичних конференціях “Фізіологія і патологія ПОЛ, гемостазу та імуногенезу” (Полтава, 1993, 1995); I Українському з’їзді біофізичного товариства (Київ, 1994); VII Українському біохімічному з’їзді (Київ, 1997); Республіканській науково-практичній конференції “Дослідження та невирішені питання гастроентерології (Харків, 1998); ІІІ Національному конгресі геронтологів та геріатрів України (Київ, 2000); ІІ Національному з’їзді фармакологів України (Дніпропетровськ, 2001); VIIІ Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002); обласних науково-практичних конференціях (Тернопіль, 1995-2002).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 42 наукових роботи, з яких 25 – у фахових виданнях, що затверджені ВАК України, 5 робіт у наукових журналах та 16 у матеріалах і тезах конференцій та симпозіумів.

Структура дисертації. Дисертація викладена на 372 сторінках і складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, 5 розділів власних досліджень, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних літературних джерел (всього 662 найменування, з них 390 кирилицею та 272 латиницею) та 10 додатків. Робота проілюстрована 89 таблицями та 34 рисунками. Загальний обсяг ілюстрацій, таблиць та додатків – 86 сторінок, списку використаних джерел - 66 сторінок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Досліди виконані на білих нелінійних щурах-самцях трьох вікових періодів: статевого дозрівання (молоді, 3-міс., маса 70-120 г); статевої зрілості (дорослі, 8-10-міс., маса 150-220 г); старіння (старі, 18-24-міс., масою 300 г і більше), яких утримували на стандартному раціоні віварію. У процесі роботи використано 972 тварини.

Моделями токсичного ураження печінки служила інтоксикація тварин тетрахлорметаном, який вводили внутрішньоочеревинно одноразово з розрахунку 2 мл (20,7 ммоль)/кг маси тіла у вигляді 50 % олійного розчину (Губський Ю.І., 1984), та солянокислим гідразином, який вводили внутрішньоочеревинно одноразово у вигляді 6 % водного розчину солянокислого гідразину (NH2-NH2·2HCl) із розрахунку 0,3 мл на 100 г маси тіла тварини (56 мг/кг у перерахунку на чистий гідразин) (Дудник Л.Б. и др., 1987). Декапiтацiю тварин, уражених тетрахлорметаном, проводили під легким ефірним наркозом через 24 год, 3 та 7 діб, а тварин, уражених солянокислим гідразином - через 24 год, 48 год, та 5 діб від моменту введення отрут, що відповідає періодам жирової інфільтрації, виникнення вогнищ некрозу на фоні посиленого відкладання жиру та початку регенераторних процесів (Терентьєва Л.А., Копылова Т.Н., 1988). Для дослідження використовували цільну кров, плазму крові, сироватку крові, гомогенат печінки, мікросоми та мітохондрії гепатоцитів. Експерименти на тваринах проводили відповідно до “Правил використання лабораторних експериментальних тварин”.

Всіх піддослідних тварин розділили на такі групи: I – інтактнi; II - уражені тетрахлорметаном; III - уражені солянокислим гідразином; IV – уражені тетрахлорметаном, яким проводилась корекція карнітину хлоридом; V – уражені солянокислим гідразином, яким проводилась корекція карнітину хлоридом; VI – уражені тетрахлорметаном, яким проводилась корекція ліпосомами; VII - уражені солянокислим гідразином, яким проводилась корекція ліпосомами; VIII - уражені тетрахлорметаном, яким проводилась корекція ліпосомами та ентеросорбентом “Силард П”; IX - уражені солянокислим гідразином, яким проводилась корекція ліпосомами та ентеросорбентом “Силард П”.

Фармакопейний 20 % розчин карнітину хлориду розводили в 10 разів ізотонічним розчином натрію хлориду і вводили внутрішньоочеревинно щоденно в дозі 50 мг/кг у всі дні проведення експерименту (Richter V., Rassoul F., Shulz G., 1987).

Суспензію холінфосфатидних ліпосом з інкорпорованими карнітину хлоридом, бурштиновою кислотою та цитохромом С, отриману за методикою (Будкер В.Г., Вахрушева Т.Е., Киселева Е.В., 1987), вводили внутрішньоочеревинно щоденно одноразово в дозі 0,1 г/кг протягом усього експерименту (Корда М.М., 1997).

Ентеросорбент “Силард П” вводили внутрішньошлунково зондом із розрахунку 1 г/кг маси тіла щоденно протягом всього терміну експерименту одночасно з уведенням суспензії ліпосом.

У мікросомній фракції, отриманій методом низькошвидкісного центрифугування (Shenkman J.B., Cinti D.L., 1974), досліджували активність НАДФН-цитохром-с-редуктази за зміною коефіцієнта поглинання цитохрому С при переході від окисненої форми до відновленої, N-деметилазну активність за кількістю утвореного формальдегіду в реакції окисного деметилювання ДМА; п-гідроксилазну активність за кількістю утвореного пара-амінофенолу в реакції гідроксилювання аніліну (Карузина И.И., Арчаков А.И., 1977); визначали концентрацію цитохромів Р-450 та b5 двохвильовим методом (Omura T., Sato R., 1964 у модифікації Мансурова И.Д., 1976). В окремій серії експериментів у модельних системах визначали інтенсивність радикалоутворення за накопиченням продуктів, що реагують з тіобарбітуровою кислотою (ТБК-активних продуктів); в одній з систем інкубували мікросоми щурів різного віку з НАДФН (ферментативне ПОЛ), в іншій у середовище інкубації додавали також тетрахлорметан, у третій був присутній ще й цитохром С. В окремій модельній системі визначали інтенсивність нагромадження ТБК-активних продуктів у присутності аскорбату (неферментативне ПОЛ). Детоксикаційну функцію мікросом визначали за тривалістю гексеналового сну, яку оцінювали за ефектом бокового положення тварин.

Інтенсивність вільнорадикального окиснення ліпідів у печінці та плазмі крові оцінювали за показниками вмісту продуктів ПОЛ - гідропероксидів ліпідів (ГПЛ) (Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.Г., 1983), ТБК-активних продуктів (Андреева Л.И. и др., 1988), основ Шифа (ШО) (Шведова А.А., Полянский Н.Б., 1992). Ступінь окиснювальної модифікації білків плазми крові досліджували за вмістом альдегідо- та кетонопохідних білків нейтрального (ОМБ370) та основного (ОМБ430) характеру (Дубинина Е.Е., Шугалей И.В., 1993 у модифікації Мещишена І.Ф., 1999). Стан ферментної ланки антиоксидної системи оцінювали за супероксиддисмутазною активністю (СОД) [КФ 1.15.1.1], яку визначали за ступенем інгібування відновлення нітротетразолію синього (Чевари С. и др., 1985); каталазною активністю (КТ) [КФ 1.11.1.6], яку досліджували фотоколориметричним методом за інтенсивністю забарвлення комплексу, що утворюється при взаємодії пероксиду водню з молібдатом амонію (Королюк М. А. и соавт, 1988); глутатіонпероксидазною активністю (ГП) [КФ 1.11.1.9] - за кількістю відновленого глутатіону, що використовується у реакції (Кругликова Т.О., Штутман Ц.М., 1976); глутатіонредуктазною активністю (ГР) (Маслова Г.Т., Боборико Т.Л., 1990) та вмістом церулоплазміну (ЦП) [КФ 1.16.3.1] - за кількістю окисненого п-фенілендіаміну (Колб В.Г., Камышников В.С., 1982).

У виділених методом диференційного центрифугування мітохондріях печінки полярографічним методом визначали швидкість дихання та окиснювального фосфорилювання на полярографі РА-2 (Чехія) з використанням відкритого платинового електрода (Кондрашова М.Н. и др., 1973). Розраховували такі показники (Chance B., Williams C.R., 1956): V2 - дихання в присутності екзогенного субстрату (сукцинат, 6мМ); V3 - до суспензії мітохондрій, крім сукцинату, добавлено акцептор фосфату (АДФ, 200 мкМ): V4 - в системі вичерпується акцептор фосфату, але концентрація субстрату залишається високою; Vднф - швидкість дихання в присутності розєднувача (2,4-ДНФ, 50 мкМ). Розраховували також дихальний контроль за Чансом (ДК=V3/V4) та показник співвідношення V2/V4, який дозволяє оцінити здатність мітохондріальних мембран утримувати енергетичний потенціал. Досліджували також активність ферментів, які беруть участь у процесах утворення енергії в мітохондріях – сукцинатдегідрогенази (СОД) [КФ 1.3.99.1] за швидкістю відновлення фериціаніду калію (Прохорова М.И., 1982), цитохромоксидази (ЦО) [КФ 1.9.3.1] за швидкістю окиснення диметил-п-фенілендиаміну (Кривченкова Р.С, 1977) та протонної Са-залежної АТФ-ази (Н+-АТФ-ази) [КФ 3.6.1.3] за вмістом фосфору, який звільняється внаслідок гідролізу АТФ (Габибов М.М., 1986).

В гомогенаті печінки визначали вміст АТФ, АДФ та АМФ за допомогою наборів Test Combination фірми “Boehringer Manheim” та неорганічного фосфору за допомогою набору Біо-Ла-Тест. З отриманих показників розраховували енергетичний заряд (ЕЗ) за формулою ЕЗ = (АТФ + 1/2АДФ)/(АТФ + АДФ + АМФ) (Atkinson D.E., 1977), потенціал фосфорилювання (ПФ) за формулою ПФ=АТФ/(АДФ·Фн), а також відношення діючих мас аденілаткінази ДМАК=(АТФ·АМФ)/АДФ2 (Veech R.L., Raijman L., 1978).

Антирадикальні та антиоксидантні властивості карнітину хлориду оцінювали за здатністю пригнічувати у модельній системі інтенсивність автоокиснення гідрохінону та утворення ТБК-активних продуктів в результаті індукованого окиснення лінолевої кислоти (Метеліцина І.П., Панько О.М., 1998).

Результати досліджень піддавали статистичному аналізу (Гублер Е.В., 1978). Достовірність отриманих результатів визначали, використовуючи t-критерій Стьюдента. Зміни вважали достовірними при Р0,05. Для розрахунків використовували комп’ютерну програму Exel (Microsoft, USA).

Основні результати досліджень. Результати проведених досліджень показали, що інтоксикація тетрахлорметаном призводить до значного пригнічення окиснювальної здатності мікросом гепатоцитів. Це проявилось у зниженні інтенсивності транспорту електронів у НАДФН-залежному ланцюзі, на що вказує пригнічення НАДФН-цитохром-с-редуктазної активності. Значних змін зазнали також концентрації мікросомних гемопротеїнів – цитохромів Р-450 та b5. Якщо порівняти ступінь їх зниження у віковому аспекті, то можна побачити, що він найвищий у тварин 3-місячного віку. Зважаючи на те, що первинні механізми біотрансформації тетрахлорметану здійснюються, в основному, за участю цитохром Р-450-залежних мікросомних монооксигеназ, активність яких, як вказує ряд дослідників (Парамонова Г.І., 1994; Kato R., 1986) і випливає з наших експериментів, у 3-місячних тварин достовірно вища, ніж у дорослих і старих, ймовірним поясненням отриманих нами результатів видається утворення у мікросомах молодих тварин значно більшої кількості активних метаболітів, здатних впливати на компоненти ланцюга транспорту електронів та їх фосфоліпідне оточення.

Аналізуючи динаміку змін мікросомних гемопротеїнів, можна побачити, що у дорослих тварин показники мають тенденцію до нормалізації і до 7-ї доби достовірно не відрізняються від здорових, чого не спостерігається у щурів 3-місячного віку та старих. Якщо таку тенденцію у молодих тварин можна пояснити вираженими змінами, обумовленими утворенням великої кількості вільнорадикальних продуктів, що не здатні знешкодитись системою антиоксидного захисту, то у старих щурів цю причину навряд чи можна вважати визначальною, зважаючи на слабку інтенсивність у них радикалоутворення, зумовлену низьким вихідним рівнем окиснювальних процесів у мікросомах. У результаті біотрансформації тетрахлорметану за участю мікросомних монооксигеназ утворюється два типи радикалів – ССl3О2я, який здатний взаємодіяти, завдяки своїй високій хімічній активності, з поліненасиченими ацилами фосфоліпідного оточення у безпосередній близькості від місця свого утворення, та низькоактивний ССl3я, що може дифундувати і ковалентно зв’язуватись з макромолекулами (Костюк В. А., 1991). Тому можливим поясненням отриманих нами результатів може бути припущення, що у молодих щурів переважає утворення висореакційних кисневмісних радикалів й активація за їх участю вільнорадикальних процесів, а у старих тварин – трихлорметильних радикалів, що призводить до ковалентного зв’язування і розвитку необоротних змін гемопротеїнів. Трихлорметильні радикали здатні також проникати в ядро гепатоцитів і призводити до пригнічення транскрипційно активного хроматину та порушення процесів реплікації і транскрипції, що супроводжується гальмуванням білкового синтезу (Губський Ю.І., 2001).

З метою підтвердження висловлених припущень нами було проведено серію експериментів, у яких досліджували функціональну здатність мікросомних НАДФН-залежного та аскорбатзалежного ланцюгів транспорту електронів. Оскільки метаболічна активація тетрахлорметану ферментним ланцюгом, за даними ряду авторів (Каган В.Е., Козлов Ю.П., 1972), може відбуватися у різних ділянках – на молекулі цитохрому Р-450 і на ділянці ФАД-вмісного флавопротеїну, ми досліджували 3 модельні НАДФН-залежні системи: у першій інкубували мікросоми печінки тварин різного віку тільки з НАДФН, у другій у середовище інкубації додавали також тетрахлорметан, у третій був присутній ще й цитохром С, який, як відомо (Белова В.С., 1971), має здатність перехоплювати електрони від ФАД-вмісного флавопротеїну, призводячи до шунтування цитохрому Р-450. Аналізуючи динаміку накопичення ТБК-активних продуктів в інкубаційному середовищі, ми відмітили, що стимуляція НАДФН супроводжувалась значно інтенсивнішим їх зростанням у мікросомах молодих інтактних тварин, порівняно з дорослими і, особливо, старими. Уведення в середовище інкубації окрім НАДФН ще й тетрахлорметану значно інтенсивніше стимулювало накопичення ТБК-активних продуктів у 3-місячних тварин, що підтверджує припущення про інтенсивнішу метаболічну активацію даного ксенобіотика мікросомною системою клітин печінки щурів саме цього вікового періоду. Виключення цитохрому Р-450 шляхом його шунтування цитохромом С призводило до найбільш вираженого зниження нагромадження продуктів, здатних реагувати з ТБК, також у щурів 3-місячного віку (рис.1).

Рис. 1. Динаміка нагромадження ТБК-активних продуктів мікросомами печінки молодих (А), дорослих (Б) та старих (В) щурів за умови інкубації з НАДФН, CCl4 та цитохромом С.

Це може служити доказом того, що токсифікація тетрахлорметану у мікросомах молодих тварин відбувається за більшої участі цитохрому Р-450. Відсутність достовірної активації тетрахлорметаном інтенсивності нагромадження ТБК-активних продуктів у модельній системі, де донором електронів служив аскорбат, вказує на непричетність неферментативної системи ліпопереокиснення мікросом до метаболічної активації даного ксенобіотика.

Зниження функціональної активності електрон-транспортного ланцюга мікросом та концентрації цитохрому Р-450 позначається на інтенсивності окиснення субстратів. Отримані нами результати свідчать, що інтоксикація тетрахлорметаном призводить до ушкодження мембран ендоплазматичного ретикулуму гепатоцитів з порушенням каталітичної активності мембранозв’язаних ферментних комплексів гідроксилювання. Найбільшого пригнічення зазнавало окиснення субстрату І типу – диметианіліну у мікросомах гепатоцитів 3-місячних тварин. Інтенсивність окиснення аніліну - гідрофобного субстрату ІІ типу знижувалась значно менше, що вказує на різницю у лімітуючих стадіях мікросомної біотрансформації двох типів ксенобіотиків, які відрізняються молекулярними механізмами взаємодії з електрон-транспортним ланцюгом.

Інші результати ми отримали при дослідженні окиснювальних процесів у мікросомах печінки щурів за умов ураження солянокислим гідразином. Як відомо, цей ксенобіотик також зазнає метаболічних перетворень переважно у печінці (Nelson S.D., 1982). Однак, на відміну від тетрахлорметану, під час І етапу біотрансформації гідразин набуває функціональних груп, які підвищують його полярність і служать центрами для наступної стадії - кон’югації. Таким чином, результатом І етапу метаболічних перетворень гідразину є не токсифікація, а детоксикація ксенобіотика. Це визначає особливості його впливу на процеси окиснення у мікросомах гепатоцитів тварин різних вікових груп. Найбільш інтенсивне зниження основної оксидази мікросомного електрон-транспортного ланцюга - цитохрому Р-450 під впливом солянокислого гідразину в динаміці спостерігалось у щурів 18-24-місячного віку (54 % через 48 год після отруєння), а найменші зміни зафіксовано у молодих тварин. Концентрація цитохрому b5 у щурів 3-місячного віку взагалі не зазнавала суттєвих змін, тоді як у дорослих та старих тварин спостерігалось їх достовірне зниження. Аналогічно до показників мікросомних гемопротеїнів знижувалась швидкість транспорту електронів НАДФН-залежним ланцюгом та інтенсивність гідроксилювання субстратів монооксигеназами ендоплазматичного ретикулуму.

Для отримання повнішої інформації про вплив гідразину на електрон-транспортну систему мікросом ми досліджували інтенсивність НАДФН- та аскорбатзалежного ПОЛ у присутності токсину. Отримані нами результати свідчать, що солянокислий гідразин, на відміну від тетрахлорметану, пригнічує НАДФН-залежний ланцюг транспорту електронів ендоплазматичного ретикулуму, причому найбільш виражено у щурів 18-24-місячного віку (рис. 2).

Рис. 2. Динаміка нагромадження ТБК-активних продуктів мікросомами печінки щурів різних вікових груп за умови інкубації з НАДФН (А), та аскорбатом (Б).

Можливою причиною інгібування цього процесу може бути інактивація гідразином цитохрому Р-450, оскільки доведено (Портянная Н.И., 1999), що останній може утворювати з гемопротеїном стійкі комплекси внаслідок ковалентної взаємодії. Можливий також інший механізм, пов’язаний з утворенням азо- і діазенових сполук – продуктів розпаду гідразину, котрі здатні взаємодіяти з цитохромом Р-450. Розпад цих комплексів супроводжується алкілюванням гемів і, відповідно, інактивацією мікросомних гемопротеїнів.

Дослідження активності аскорбатзалежного ПОЛ, у присутності солянокислого гідразину, показало протилежний результат. Інтенсивність генерації ТБК-активних продуктів мікросомами, інкубованими з гідразином, зростала у порівнянні з інтактними, причому найбільше у тварин 3-місячного віку.

Як було показано вище, значну роль у патогенезі токсичних гепатопатій, викликаних ксенобіотиками з різними шляхами метаболізму, відіграє активація вільнорадикальних процесів.

Отримані експериментальні дані вказують на те, що з віком інтенсивність процесів ліпопереокиснення у печінці здорових тварин знижується. Це може бути наслідком зменшення концентрації фосфоліпідів - субстратів вільнорадикальних реакцій, а також сповільненого радикалоутворення внаслідок зниження інтенсивності окиснювальних процесів у мітохондріях та мікросомах, де відбувається генерація вільних радикалів. Інтоксикація тетрахлорметаном супроводжується найбільш вираженою інтенсифікацією процесів ліпопероксидації у печінці та плазмі щурів 3-місячного віку. Концентрація у печінці гідропероксидів ліпідів через 24 год від моменту отруєння зростала у них в 1,8 рази, тоді як у дорослих відповідно у 1,3, старих – у 1,1 рази. Дослідження цього показника у динаміці показало, що у дорослих та молодих тварин він поступово знижувався, тоді як у старих спостерігалось подальше його зростання. Ймовірною причиною цього може бути більш виражене пригнічення у щурів даного вікового періоду ферментних компонентів антиоксидної системи внаслідок ковалентного зв’язування з ними низькореакційних радикалів ССl3я та електрофільних метаболітів ССl3+, а також знижена концентрація фосфоліпази А2, яка видаляє поліненасичені жирні кислоти, в тому числі їх оксипохідні, що утворились внаслідок переокиснення, зі складу мембранних фосфоліпідів з подальшим включенням у метаболічні процеси. На користь цієї тези свідчить також динаміка вмісту ТБК-активних продуктів. Через 24 год після отруєння у печінці молодих тварин показник проміжних продуктів ліпопероксидації зростав в 1,5, у дорослих – в 1,3 рази, а у щурів 18-24-місячного віку майже не змінювався. На 3-тю добу зафіксовано зниження вмісту ТБК-активних продуктів, яке у печінці молодих та дорослих щурів було значнішим, ніж показників ГПЛ. У старих тварин концентрація ТБК-активних продуктів з часом навпаки, достовірно зростала, що може бути підтвердженням попередньої думки про зниження інтенсивності знешкодження продуктів ліпопереокиснення у щурів даної вікової групи. Підтвердженням цього можуть бути результати, отримані нами при дослідженні кінцевих продуктів ПОЛ – шифових основ. Найбільш інтенсивне зростання через 24 год після отруєння зафіксоване у печінці щурів 3- та 18-24-місячного віку, однак у динаміці концентрація основ Шифа у молодих та дорослих тварин поступово знижувалась, а у старих навпаки, мала тенденцію до зростання.

Прооксидантна дія тетрахлорметану була підтверджена також in vitro, у процесі інкубації з ізольованими гепатоцитами, причому динаміка накопичення у середовищі інкубації як ГПЛ, так і ТБК-активних продуктів була аналогічною до динаміки НАДФН-залежного ПОЛ у мікросомах печінкових клітин різних вікових періодів, що можна вважати ще одним доказом вирішальної ролі метаболічної активації тетрахлорметану мікросомною системою в ініціації процесів ліпопероксидації (рис. 3).

Рис.3. Динаміка нагромадження ГПЛ в інкубаційному середовищі з ізольованими гепатоцитами (2106 клітин/мл) 3-місячних (А), 8-10-місячних (Б) та 18-24 місячних щурів без тетрахлорметану та у його присутності.

З метою оцінки здатності мікросом гепатоцитів, виділених з печінки отруєних тетрахлорметаном тварин ініціювати процеси ліпопероксидації, нами було проведено відповідне дослідження. Його результати показали, що мікросоми тварин, уражених CCl4, на відміну від інтактних, не здатні ініціювати НАДФН-залежне ПОЛ. Це, на наш погляд, пов’язано з порушенням структурної організації електрон-транспортного ланцюга та розщепленням мікросомних гемопротеїнів. Найбільш виражене пригнічення спостерігалось у мікросомах молодих тварин (рис. 4).

Рис.4. Динаміка показників НАДФН-залежного (А) та аскорбатзалежного (Б) ПОЛ у мікросомах печінки тварин різного віку з токсичним ураженням ССl4.

За умови отруєних солянокислим гідразином найбільш виражене зростання ГПЛ зафіксовано у печінці та плазмі щурів 18-24-місячного віку з максимумом через 48 год від моменту отруєння. Дослідження в динаміці показали, що у печінці молодих та дорослих тварин вміст гідропероксидів достовірно знижувався, тоді як у старих майже не змінювався. Динаміка змін ТБК-активних продуктів була аналогічною, за винятком того, що зростання у відсотковому відношенні було меншим, ніж ГПЛ. При дослідженні вмісту кінцевих продуктів ПОЛ – основ Шифа також отримали найбільш інтенсивне їх зростання у печінці старих щурів з динамікою, аналогічною іншим продуктам переокиснення ліпідів.

Дослідження здатності мікросом, виділених із печінки уражених солянокислим гідразином тварин, активувати НАДФН- та аскорбатзалежне ПОЛ підтвердило здатність гідразину пошкоджувати ферменти електрон-транспортного ланцюга мікросом та його кінцевої гемоксигенази, що проявилось у пригніченні накопичення ТБК-активних продуктів за умов активації НАДФН. Активність неферментного ПОЛ зростала, що вказує на здатність гідразину, завдяки його відновним властивостям, постачати відновні еквіваленти для активації ліпопереокиснення (рис 5).

Рис. 5. Динаміка показників НАДФН-залежного (А) та аскорбатзалежного (Б) ПОЛ у мікросомах тварин різного віку з токсичним ураженням солянокислим гідразином.

Таким чином, за умов інтоксикації солянокислим гідразином біологічна роль порушень процесів ліпопероксидації суттєво відрізняється від їх ролі за інтоксикації тетрахлорметаном. Деякі автори навіть вважають (Копылова Т.Н., Майоре А.Я., 1982), що це компенсаторний процес, спрямований на зниження концентрації вільних жирних кислот у гепатоцитах, що має місце за отруєння гідразином.

Активні форми кисню, що генеруються в процесі метаболізму ксенобіотиків, як відомо, зумовлюють не лише пероксидацію ліпідів, але й окиснювальну модифікацію білків (ОМБ). Результати проведених нами досліджень свідчать, що за умов ураження ССl4 концентрація ОМБ інтенсивніше зростає у молодих тварин.

Причинами цього можуть бути зниження активності системи антиоксидного захисту, особливо ферментів першого ряду, які здатні знешкоджувати активні форми кисню, котрі і є безпосередніми ініціаторами пероксидного окиснення білків, а також пригнічення активності внутрішньоклітинних протеаз, що забезпечують деградацію білкових молекул, в тому числі окиснено модифікованих (Мещишен І.Ф., 1999). Проведені нами дослідження активності антиоксидантних ферментів підтвердили це.

Нами зафіксовано достовірне зниження активності СОД, каталази, глутатіонпероксидази та глутатіонредуктази у печінці отруєних тетрахлорметаном, причому найбільш виражене у молодих щурів.

Інтоксикація солянокислим гідразином також супроводжувалась пригніченням активності ензимної ланки антиоксидного захисту у печінці. Найбільше зниження їх активності зафіксовано у старих тварин.

Важливе значення у патогенезі токсичних уражень печінки належить порушенню біоенергетичних процесів у мітохондріях, тому наступним нашим завданням було дослідження функціональної активності мітохондрій та стану енергетики гепатоцитів щурів різних вікових періодів. Отримані результати засвідчують суттєве пригнічення активності сукцинатдегідрогенази після введення тваринам тетрахлорметану, особливо у старих та молодих тварин. На порушення під впливом ССl4 електронного транспорту в термінальній ланці дихального ланцюга вказує достовірне пригнічення активності цитохромоксидази в мітохондріях печінки отруєних гепатотоксином щурів, причому найбільш виражені зміни зафіксовано у старих тварин. Це не співпадає із концентрацією продуктів ліпопероксидації, оскільки у щурів даного вікового періоду інтоксикація тетрахлорметаном супроводжувалась найменшим їх зростанням. Такий результат може служити ще одним доказом на користь твердження, що у механізмі дії ССl4 у старих щурів переважають процеси ковалентного зв’язування, а не вплив продуктів ліпопероксидації.

Для детальнішого вивчення механізмів впливу тетрахлорметану на процеси транспорту електронів у мембранах мітохондрій і пов’язані з ним реакції фосфорилювання, ми провели серію полярографічних досліджень. Введення тетрахлорметану призводило до значних змін показників поглинання кисню та окиснювального фосфорилювання мітохондрій печінки тварин всіх вікових груп, однак у відсотковому відношенні пригнічення поглинання кисню у метаболічних станах V2,V3, V4 мітохондріями дорослих тварин було нижчим, ніж молодих та старих, а в присутності ДНФ зміни були не достовірними. Якщо взяти до уваги те, що у дорослих щурів не достовірним було також зниження коефіцієнта V2/V4, який вказує на здатність внутрішньої мітохондріальної мембрани утримувати протонний потенціал, можна констатувати, що у мітохондріях печінки щурів цього вікового періоду введення тетрахлорметану призводить до функціональних порушень дихального ланцюга. Наслідком таких змін є роз’єднання процесів дихання та окиснювального фосфорилювання, тоді як у молодих та старих виникають деструктивні зміни мембран і порушення структури дихального ланцюга, що супроводжується пригніченням транспорту електронів по ньому. На це вказує достовірне зниження у них показників дихання в роз’єднаному стані (Vднф) та співвідношення V2/V4. До найбільш інформативних параметрів стану системи окисного фосфорилювання і регуляторних взаємовідношень між окисним фосфорилюванням і тканинним диханням належить коефіцієнт дихального контролю (ДК). Нами зафіксовано різке зменшення цього показника, особливо у молодих та старих тварин. Цей факт свідчить про зниження залежності інтенсивності дихання від концентрації АДФ в уражених токсином гепатоцитах, що характерно для “роз’єднаних” мітохондрій.

Ферментною системою, відповідальною за синтез АТФ у мітохондріях, є протонна Са2+-залежна АТФ-синтетаза. Використовуючи іони Н+ і ОН-, що знаходяться по обидва боки мембрани, даний фермент може працювати у зворотному напрямку, тобто в певних умовах функціонувати як АТФ-аза. Зафіксоване нами значне підвищення активності протонної АТФ-ази в мітохондріях печінки уражених тетрахлорметаном щурів, особливо 3- та 18-24-місячного віку, є, очевидно, наслідком порушення генерації трансмембранного потенціалу йонів водню - джерела електрохімічної енергії для роботи АТФ-синтетази. В цих умовах активація Н+-АТФ-ази спрямована на підтримку електрохімічного потенціалу за рахунок гідролізу АТФ.

Пригнічення під впливом тетрахлорметану процесів окиснення у мітохондріях відбивається на виконанні ними основної функції – синтезу АТФ. Наші дослідження вказують на порушення окиснення субстратів та активності ферментів дихального ланцюга. Це, ймовірно, і є основною причиною пригнічення синтезу аденілових нуклеотидів. Порушення цих показників призводило, однак, лише до незначного зниження енергетичного заряду гепатоцитів. Як відомо (Atkinson D.E., 1977), енергетичний заряд є головним параметром, який відображає кількість макроергічних звязків АТФ та АДФ у загальному фонді аденілових нуклеотидів та контролює енергетичний стан клітин в тому плані, що підвищення енергетичного заряду викликає активацію ферментів, котрі утилізують АТФ з утворенням АДФ чи АМФ та інактивацію реакцій протилежного характеру. Зменшення енергетичного заряду, навпаки, призводить до активації синтезу АТФ і гальмування його розпаду. Величина енергетичного заряду підтримується на постійному рівні завдяки збереженню рівноваги між АТФ, АДФ і АМФ в клітині за участю аденілаткінази. При дії тетрахлорметану зниження вмісту АТФ, ймовірно, компенсується утворенням цієї макроергічної сполуки при взаємодії двох молекул АДФ, що підтверджується пропорційним зниженням вмісту АДФ та зростанням показника діючих мас аденілаткіназної реакції (ДМАК). В результаті цієї реакції утворюється також АМФ, проте