НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ БІОКОЛОЇДНОЇ ХІМІЇ ІМ. Ф.Д. ОВЧАРЕНКА
КЕРНОСЕНКО ЛЮДМИЛА ОЛЕКСАНДРІВНА
УДК 544.77 : 579.266 : 628.516
КОЛОЇДНО-ХІМІЧНІ ПРОЦЕСИ БІОТРАНСФОРМАЦІЇ
ВАЖКИХ МЕТАЛІВ У ГРУНТІ
Спеціальність 02.00.11 – колоїдна хімія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата хімічних наук
Київ – 2003
Дисертацією є рукопис
Робота виконана у відділі колоїдної технології природних дисперсних систем Інституту біоколоїдної хімії ім. Ф.Д. Овчаренка Національної академії наук України
Науковий керівник: доктор хімічних наук, професор
Ульберг Зоя Рудольфівна,
Інститут біоколоїдної хімії ім. Ф.Д. Овчаренка НАН України,
директор Інституту
Офіційні опоненти: доктор хімічних наук, професор
Альтшулер Марк Аврамович,
Український науково-дослідний інститут нафтопереробної
промисловості “МАСМА”, старший науковий співробітник
доктор хімічних наук, професор
Мєшкова-Клименко Наталія Аркадіївна,
Інститут колоїдної хімії і хімії води ім. А.В. Думанського
НАН України, головний науковий співробітник
Провідна установа: Інститут сорбції та проблем ендоекології НАН України, м. Київ
Захист відбудеться 20.01.2004 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.209.01 в Інституті біоколоїдної хімії ім. Ф.Д. Овчаренка НАН України за адресою: 03142, Київ-142, бульвар академіка Вернадського, 42, к. 132
З десертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біоколоїдної хімії ім. Ф.Д. Овчаренка НАН України за адресою: 03142, Київ-142, бульв. академіка Вернадського, 42, к . 409
Автореферат розісланий 17.12.2003 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Д 26.209.01
кандидат технічних наук В.А. Прокопенко
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. У багатьох країнах світу значні території грунтів, забруднених важкими металами, стали непридатними для сільськогосподарського використання та створюють екологічну небезпеку довкіллю. Отже, проблема очистки грунту від важких металів, тобто його ремедіаціїї, є актуальною та має велике суспільно-економічне значення.
Грунт – це складна багатокомпонентна природна колоїдна система. В основі його утворення, розвитку та самооочищення від різних забруднень, в тому числі від важких металів, лежать фундаментальні, але ще мало вивчені колоїдно-хімічні процеси сорбції-преципітації-солюбілізації сполук хімічних елементів, які каталізуються мікроорганізмами. Останні є рушійною силою сучасних технологій біоремедіації довкілля. Вивчення трансформації колоїдно-хімічного стану важких металів, зв’язаних з грунтовими колоїдами, під впливом мікроорганізмів є актуальним для розробки наукових основ управління поведінкою металів у грунті, його ремедіації, розширює наші уявлення щодо колоїдно-хімічних взаємодій в системі важкі метали-довкілля. Беручи до уваги складність грунту як об’єкту наукових досліджень, для успішного розвитку останніх потрібен комплексний підхід з позицій біоколоїдної хімії, який враховує внесок біоколоїдів (мікроорганізмів та метаболітів) у хід колоїдно-хімічних процесів.
Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в ІБКХ НАН України в рамках держбюджетних тем: “Розробка колоїдно-хімічних біотехнологій моніторингу та знешкоджування грунтів і вод, які містять важкі метали (талій, уран, стронцій, кобальт) та ціаніди (металокомплекси) на основі генетично модифікованих штамів бактерій” (1999-2001 р.р. № Держреєстрації 0100V0002370, шифр теми 2.16.4.5); “Вивчення механізмів гетерофазних реакцій в процесах селективної взаємодії клітин з металами” (2002-2004 р.р. № Держреєстрації 0102V007055, шифр теми 2.16.4.6; 2.28.9.10).
Мета та задачі роботи. Основною метою роботи є вивчення колоїдно-хімічних процесів мікробної трансформації металів у грунті та розробка на основі отриманих даних біотехнологічних принципів їх вилучення.
Для досягнення мети поставлено та вирішено наступні задачі:
-
вивчення колоїдно-хімічних закономірностей перетворення урану (VI), стронцію, міді, кобальту в природному грунті під впливом клітинних метаболітів;
-
дослідження селективної сорбційної активності грунту щодо вказаних металів при інтродукції до нього бактеріальних клітин, зміни співвідношення рухомих, (водорозчинних, іонообмінних) та нерухомих форм металів у грунті;
-
оцінка можливості біологічного розпаду водорозчинних цитратних і фульватних металокомплексів та екологічної безпеки продуктів деструкції;
-
дослідження процесів біовилужування важких металів із грунту у двох варіантах: стаціонарному (in situ) та суспензійному в біореакторі (ex situ); розробка біотехнологічного процесу, який базується на інтродукції металорезистентної культури в грунт та подальшій його обробці, встановлення оптимальних умов та режимів реалізації біотехнологічного процесу;
Об`єкт дослідження – штучно контамінований водорозчинними солями урану (VI), міді, кобальту, стронцію опідзолений грунт у вигляді суспензії або грунтової колонки, збагачений металорезистентними бактеріями та поживними речовинами для їх розвитку.
Предмет дослідження – колоїдно-хімічні закономірності солюбілізації/ біовилужування важких металів з грунту під впливом металорезистентних бактерій.
Методи дослідження. Взаємодію важких металів з грунтом та мікроорганізмами вивчали методом сорбції із розчинів. Форми існування важких металів у грунті визначали методом послідовних екстракцій. Водорозчинні форми металів визначали у водних витяжках із грунту, обмінні форми – у витяжках ацетатним буфером, валовий/повний вміст металів – в кислотних екстрактах. Концентрацію міді, стронцію, кобальту контролювали методом атомно-абсорбційної спектрофотометрії в полум`ї повітря-ацетилен, концентрацію урану (VI) – спектрофотометричним методом з Арсеназо III. Розвиток мікроорганізмів у грунтових та водних системах вивчали за зміною кислотності середовища (методом потенціометрії), за збільшенням оптичної густини суспензій та кількості клітин (методом посіву на поживні середовища). Продукти метаболізму мікроорганізмів (екзополісахариди, органічні кислоти) аналізували біохімічними методами.
Наукова новизна роботи. На основі систематичних досліджень взаємодій мікроорганізмів з металами: ураном (VI), міддю, кобальтом та стронцієм у грунті вперше встановлено можливість та механізм їх колоїдно-хімічних перетворень під впливом клітинних метаболітів. Встановлено шляхи направленого регулювання процесів взаємної трансформації водорозчинних (рухомих) і колоїдних форм металів. В залежності від спрямованості метаболізму, основними продуктами біотрансформації металів у грунті є водорозчинні цитратні комплекси (мідь, кобальт, стронцій, ураніл) або гідроксидно-карбонатні колоїдні осади міді, кобальту, стронцію та водорозчинні карбонатні комплекси (ураніл). Досліджено колоїдно-хімічні процеси біологічного руйнування у грунті органокомплексів важких металів. При цьому винайдено умови утворення кінцевих продуктів екологічно безпечних сполук (карбонатів та гідроксидів) у колоїдній формі.
Вивчено сорбційні та седиментаційні властивості природного грунту, який містить метали та інтродуковані до нього спеціальні штами металорезистентних культур. Встановлено селективність сорбції важких металів та характер їх зв`язку в грунті.
Практична значимість роботи. В результаті проведених досліджень розроблено основи біотехнологічного процесу вилучення важких металів із грунту, що базуються на використанні колоїдно-хімічних процесів трансформації важких металів (ВМ) із зв`язаної у водорозчинну форми у вигляді нетоксичних цитратних комплексів. Подальше вилучення останніх із грунту відбувається шляхом його промивання, а залишкові кількості металокомплексів підлягають біологічному руйнуванню з утворенням нетоксичних карбонатів та гідроксидів у колоїдній формі. Біотехнологічний процес досліджено у двох варіантах: стаціонарному (in situ) та з видаленням грунту і наступною його обробкою у біореакторі (ex situ). Ефективність очищення складає 99% U(VI), 95% Cu, 94% Co, 90% Sr. За матеріалами цієї розробки отримано Патент України № 5857 від 15.08.03.
Особистий внесок здобувача. Особистий внесок автора полягав в обробці літературних джерел за дослідженою тематикою, безпосередній участі у плануванні, проведенні експериментів та обговоренні отриманих результатів. Мікробіологічна й біохімічна частина роботи, а також інтерпретація одержаних даних виконано під керівництвом с.н.с., к.б.н. Г.М. Ніковської. Науковий співробітник, к.ф.-м.н. О.Г. Максимчук приймав участь в аналізі концентрації важких металів методом атомно-абсорбційної спектрофотометрії, с.н.с, к.х.н. Л.Г. Надєл – в аналізі осадів важких металів методом рентгенофазного аналізу, н.с., к.х.н. Н.П. Стрижак приймала участь у дослідженнях щодо біодеструкції органокомплексів важких металів. Електромікроскопічні дослідження проводились за участю головного спеціаліста А.Г. Савкіна. Обговорення та узагальнення одержаних результатів роботи виконано за участю наукового керівника докт.хім.наук., проф. З.Р. Ульберг.
Апробація роботи. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися на Міжнародних конференціях: “Екологія та геохімічна діяльність мікроорганізмів (Україна, Одеса, вересень, 2001), друга міжнародна конференція “Interfaces Against Pollution” (Hungary, Miskolc-Lillafured, May, 2002), четверта міжнародна конференція “Сereco 2003” (Hungary, Miskolc-Tapolka, April, 2003); а також на третій всеукраїнській науково-практичній конференції молодих вчених “Екологія. Людина. Суспільство” (Україна, Київ, НТУУ “КПІ” травень, 2000).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 8 наукових праць у провідних наукових журналах, у тому числі 4 тези доповідей, отримано Патент України на винахід.
Структура та об’єм роботи. Дисертація складається із списку умовних скорочень, вступу, п`ятьох розділів, висновків, списку використаних літературних джерел (113 найменувань). Робота викладена на 121 сторінці машинописного тексту, ілюстрована 18 таблицями та 13 рисунками.
ЗМІСТ РОБОТИ
У вступі обґрунтовано актуальність теми дослідження, сформульовано цілі та задачі роботи, показано її актуальність і наукову новизну, теоретичне значення, практичну цінність одержаних результатів та особистий внесок здобувача.
Перший розділ містить літературний огляд, в якому розглянуто сучасний стан проблеми забруднення грунтів важкими металами та їх детоксикації. Представлено літературні дані щодо форм знаходження важких металів у грунті, їх дії на мікроорганізми, ролі останніх у зміні колоїдно-хімічного стану важких металів (ВМ), а також сучасні підходи до ремедіації грунтів. Аналіз наукової інформації свідчить про перспективність мікробіологічних методів ремедіації грунтів, які вивчені недостатньо.
На основі проведеного аналізу літературних джерел визначено наукові задачі, вирішення яких дозволяє досягти головної мети роботи.
У другому розділі наведено характеристики об`єктів дослідження та методи проведення експериментів. Дослідження проводили на темно-сірому опідзоленому грунті, який є характерним для лісостепової зони України. Для мікробіологічної обробки грунту обрано наступні металорезистентні культури, які виділені з грунтів, забруднених важкими металами: Bacillus cereus BKM 4368 (музей мікробних культур Інституту біоколоїдної хімії НАН Украіни) та Alcaligenes eutrophus CH 34 (центр “VITO”, Бельгія). Для забезпечення розвитку металорезистентних культур бактерій в присутності важких металів використано рідке тріс-мінімальне середовище. До сольового середовища додавали ацетат натрію (джерело вуглецю), який здатен активно асимілюватись обома тест-культурами та глюкозу або сахарозу у варіантах із бацилами. Для визначення концентрації мікроорганізмів використовували агаризовані тверді поживні середовища – м`ясо-пептонний та крахмало-аміачний агари. В дослідах використовували розчини важких металів міді, кобальту, стронцію, уранілу у вигляді відповідних солей та синтезовані нами цитратні й фульватні органокомплекси важких металів Ca, Mg, Sr, Fe(III), Zn, Cu, Ni, Co, U(VI).
Вилужування важких металів із грунту проводили в суспензійному та стаціонарному варіантах досліду у тріс-мінімальному синтетичному середовищі, що містило джерела вуглецю та мікроорганізми. В першому випадку біовилужування ВМ із грунту проводили в колбах Ерленмейера (аеробні умови); у другому – в грунтових колонках із запірним краном.
В роботі було використано: фізико-хімічні методи дослідження взаємодій у системах грунт–ВМ–мікроорганізми (метод сорбції із розчинів, метод послідовних екстракцій, атомно-абсорбційна спектрофотометрія, рентгенофазний аналіз, колориметричний, потенціометричний, електронно-мікроскопічний методи тощо); біохімічні методи аналізу мікробних метаболітів; мікробіологічні методи вивчення розвитку мікроорганізмів у присутності важких металів.
Третій розділ присвячено аналізу результатів досліджень колоїдно-хімічних закономірностей взаємодії мікроорганізмів з металами в грунті.
Вивчено сорбцію урану (VI), міді, кобальту та стронцію природним опідзоленим грунтом. Встановлено, що сорбція металів із індивідуальних розчинів зменшується в ряду: U (VI) Cu Co Sr. Слід зазначити, що така послідовність металів зберігається під час сорбції їх грунтом із індивідуальних розчинів та із розчинів, що містять суміш цих металів в еквімолярних співвідношеннях. Якщо сорбція урану (VI), міді та кобальту із багатокомпонентного розчину знижується відповідно на 20, 26 та 21 %, то стронцію – на 36 % (табл. 1).
Одержані дані відображають повну сорбцію металів грунтовими мінеральними та органічними сполуками. Послідовність, яка спостерігається, співпадає з рядом констант стійкості відповідних гуматних та фульватних комплексів. В результаті процесу сорбції можно визначити кількісний та якісний склад форм, в яких метали сорбуються грунтом.
Методом послідовних екстракцій встановлено, що 90 % уранілу, 85 % міді та лише 36% стронцію міститься у грунті в нерухомій формі. Серед рухомих (біодоступних) форм стронцію та уранілу переважає обмінна, міді – водорозчинна; для кобальту характерна рівновага обох вищевказаних рухомих форм.
Таблиця 1-
Сорбція важких металів природним грунтом із водних розчинів солей
Метал-іон | Питома сорбція | Cорбція, %
мг/г | ммоль/г
U (VI) | 14
12 | 0,059
0,042 | 98,33
78,0
Cu | 3,2
2 | 0,047
0,031 | 78,33
51,67
Co | 2
1,2 | 0,034
0,021 | 56,67
35,00
Sr | 1,1
0,8 | 0,011
0,009 | 51,67
15,00
Примітка. Чисельник дробу – сорбція із індивідуального розчину, знаменник – із змішаного розчину, який містить всі метали в концентрації 3 мM.
Четвертий розділ описує дослідження біологічної деструкції цитратних та фульватних металокомплексів, які утворюються під час мікробіологічної ремедіації грунту.
Важкі метали знаходяться у природних об`єктах, як правило, у вигляді комплексів з цитратами, оксалатами, фульватами, гуматами – основними продуктами біологічного кругообігу органічної речовини у воді та грунті. Цитринова кислота (центральний інтермедіат природного циклу вуглеводів) є біологічно лабільною сполукою, яка метаболізується багатьма мікроорганізмами до вуглекислоти. У зв`язку з недостатньою вивченістю процесу мікробіологічної деструкції органокомплексів важких металів, було досліджено деякі колоїдно-хімічні аспекти біодеградації природних цитратних та фульватних комплексів важких металів під впливом грунтових мікроорганізмів.
За тест об`єкти обрано синтезовані нами цитратні та фульватні комплекси Ca, Mg, Zn, Sr, Ni, Cu, Co, U (VI); для біодеградації цитратних комплексів було використано металорезистентну культуру B. сereus ВКМ 4368, фульватних – накопичувальну грунтову культуру.
Встановлено, що в процесі біодеструкції металоцитратів відбувається зміна величини рН до 8,5, а металофульватів – до 4,0. Ці зміни супроводжуються підвищенням кількості мікроорганізмів та оптичної густини бактеріальних дисперсій (рис.1). Хід кривих росту мікроорганізмів на різних формах цитрату та фульвату подібний, але відрізняється тривалістю лаг-фази. Це свідчить, що органокомплекси та продукти їх біодеструкції є нетоксичними та екологічно безпечними сполуками.
Як показали дослідження параметри біодеструкції металоцитратів близькі для двох груп комплексів: 1) Ca-, Mg-, Sr-, Fe-цитрати; 2) Co-, Zn-, Cu-, Cd-, Ni-цитрати. Але показники їх хімічної стійкості суттєво відрізняються навіть у межах однієї групи: Fe-CitCa-CitMg-CitSr-Cit. Найбільш біорезистентним виявився цитратний комплекс уранілу, який з хімічної точки зору менш стійкий у порівнянні з цитратом заліза. Біодеградабельність вивчених металокомплексів спадає в ряду: Ca - Cit Sr - Cit Mg - Сit Fe - Cit Co - Cit Zn - Cit Cu - Cit Ni - Cit Cd - Cit UО2 - Cit. Наведена послідовність відповідає відносній токсичності важких металів. Отже, біодеградабельність металорганічних комплексів безпосередньо не позв`язана з їх стійкістю, але спостерігається зв`язок між токсичністю координуючого металу та біологічною стійкістю відповідного металокомплексу.
Як відомо, цитрат-аніон легко мінералізується до вуглекислоти багатьма мікроорганізмами за допомогою внутрішньоклітинних ферментів. Як показали наші дослідження, при наявності у дисперсійному середовищі вуглекислоти (рН 8,5) відбувається утворення карбонатів та гідроксидів досліджуваних металів, оскільки інші іони (фосфати, сульфати, амоній, хлориди) використовувались у складі синтетичних поживних середовищ у мінімальних, необхідних для життєдіяльності мікроорганізмів концентраціях, та практично повністю споживались культурою бактерій в процесі росту. Співставлення показників розчинності карбонатних та гідроксидних осадів металів (табл.2) показало, якщо координуючим метал-іоном цитратного комплексу є кальцій або стронцій, то у складі продуктів метаболізму цих металів утворюються карбонати; для магнію, кобальту, міді характерно утворення менш розчинних, порівняно з карбонатами, гідроксидів. Під час деструкції уранілцитратного комплексу може утворюватись досить стійкий водорозчинний карбонатний комплекс. Результати проведених досліджень свідчать, що в результаті біологічного процесу цитратні металокомплекси можуть трансформуватись до екологічно безпечних карбонатів і гідроксидів та переходити з водорозчинної у дисперсну форму, за виключенням урану (VI), фазово-дисперсний стан якого не змінюється.
Таким чином показано можливість мікробної деградації цитратних та фульватних комплексів важких металів, які відрізняються за своїми фізико-хімічними і токсичними властивостями, з утворенням екологічно безпечних продуктів. Металоцитратні комплекси практично повністю метаболізуються з утворенням вуглекислоти металофільною бактеріальною культурою B.cereus BKM 4368, а фульватні – грунтовою накопичувальною культурою (при домінуванні актиноміцетів) з утворенням простих органічних кислот.
Таблиця 2-
Швидкість біомінералізації цитратів (V), що відрізняються
за типом координуючого метало-комплексу
Метали– | lg К | V
Cit 4- | ммольдіб-1 | уповільнення, %––
1,80 | 0
Ca | 4,68 | 1,35 | 25,0
Mg | 3,96 | 1,33 | 26,2
Sr | 2,90 | 1,35 | 25,0
Fe (III) | 11,40 | 1,20 | 33,7
Co | 5,00 | 0,77 | 57,2
Ni | 5,40 | 0,71 | 60,0
Zn | 4,98 | 0,90 | 50,0
Cu | 5,90 | 0,77 | 57,2
Cd | 5,36 | 0,68 | 62,2
U(VI) | 7,40 | 0,38 | 79,9
Примітка. Контрольна система з цитрат-іоном; метаболізм цитрату при С03ммоль/дм3 в усіх випадках досягав 90%.
У п`ятому розділі дисертаційної роботи розглянуто закономірності колоїдно-хімічної трансформації важких металів в процесі життєдіяльності мікроорганізмів та сформульовано основні принципи біоколоїдної технології ремедіації грунту, забрудненого важкими металами.
Біотехнологічний процес було змодельовано для двох варіантів: стаціонарного (in situ) та в біореакторі (ex situ).
Дослідження біовилужування металів у грунтовій суспензії
Проведені дослідження закономірностей трансформації металів, що відбуваються під впливом мікроорганізмів показали, що найбільш ефективно вказані процеси протікають у мінеральних дисперсіях. При цьому досягнуто практично повне (99%) вилучення із грунту урану та значне (>90%) вилучення інших досліджених металів у бактеріальному процесі метаболізму глюкози.
Дослідження проводили з використанням металорезистентних культур B.cereus ВКМ 4368 або A.eutrophus СН 34 в розчині з біогенними сполуками для їх розвитку. Як джерела вуглецю було використано глюкозу та ацетат натрію. В результаті внесення вказаних культур у грунтові суспензії та їх розвитку в цих умовах виявлено зміну кислотності грунтової дисперсії від рН 6,8 до 4,0 – при метаболізмі глюкози та до рН 9,2 – при утилізації ацетату, що обумовлено утворенням відповідних метаболітів.
Отримані дані свідчать (табл.3) про те, що всі досліджувані метали більш ефективно вилужувались у процесі розвитку B.cereus на глюкозі, ніж вивчені МРК на ацетаті.
Таблиця 3-
Вилужування важких металів із грунту під час розвитку мікроорганізмів
Метал |
Обробка | рН* | Вилужування, %
мікроорганізми | джерело
вуглецю
U (VI) | B.cereus | глюкоза
ацетат Na | 4,0
9,2 | 98,67
90,5
A.eutrophus | ацетат Na | 9,1 | 90,0
АМ | глюкоза
ацетат Na | 6,6
7,0 | 15,0
6,0
Cu | B.cereus | глюкоза
ацетат Na | 4,1
9,0 | 95,5
88,0
A.eutrophus | ацетат Na | 8,9 | 86,0
АМ | глюкоза
ацетат Na | 6,8
7,0 | 12,0
9,5
Сo | B.cereus | глюкоза
ацетат Na | 4,2
9,4 | 94,0
82,0
A.eutrophus | ацетат Na | 9,2 | 81,0
АМ |
глюкоза
ацетат Na | 6,7
7,0 | 12,0
8,5
Sr | B.cereus | глюкоза
ацетат Na | 4,0
9,2 | 90,0
80,0
A.eutrophus | ацетат Na | 9,3 | 82,0
АМ | глюкоза
ацетат Na | 5,8
7,5 | 20,0
25,0
Примітки: *Вихідна величина рН грунтово-мінеральної дисперсії 6,8; тривалість процесу 18 год; концентрація металу (мг) в 10 г грунту: U (VI) – 140, Cu – 32, Co – 20, Sr – 11.
Слід відмітити незначну ефективність вилужування важких металів у контрольних грунтових суспензіях, які не були оброблені МРК, так як автохтонна мікрофлора в них інгібована. Виключення складає малотоксичний стронцій. За ефективністю біовилужування вивчених важких металів повторився ряд, який відповідає їх сорбційній активності: U (VI) Cu Co Sr. Отримані еспериментальні дані показали, що металорезистентна культура B.cereus BKM 4368 в процесі рідкофазного культивування утворює мажорні метаболіти – цитринову кислоту (ріст на глюкозі) та вуглекислоту (ріст на ацетаті), а також мінорні метаболіти – екзополісахариди. Наведені метаболіти здатні утворювати комплекси та преципітати з важкими металами. Встановлено, що вилужування металів із грунту в залежності від типу мікробних метаболітів відбувалось, головним чином, у вигляді цитратів або гідроксокарбонатів, при цьому всі випробувані метали більш ефективно вилужувались у вигляді водорозчинних цитратних комплексів, ніж нерозчинних карбонатних комплексів міді, кобальту, стронцію та водорозчинних – уранілу. Продукція екстрацелюлярних метаболітів (цитринової кислоти та екзополісахаридів) інтенсифікується підвищенням концентрації важких металів у рідкій фазі.
Проведено порівняння ефективності біологічного та хімічного вилужування для забрудненого уранілом грунту. Встановлено (рис.2), що при однакових значеннях рН грунтової суспензії ефективність біовилужування уранілу суттєво (на 30–50%) перевищувала ефективність хімічного. Хімічне вилужування є ефективним лише при рН3 та рН 9. В першому випадку відбувається перехід урану (VI) із грунту до розчину у вигляді катіону уранілу UO22+ в результаті обміну на Н+-іони дисперсійного середовища, в другому – у вигляді уранатів UO42-, що обумовлено амфотерним характером гідроксиду уранілу.
В результаті реалізації бактеріального процесу ступінь вилужування урану (VI) у кислій області рН досягала 99%, у лужній – не перевищувала 85%. Аналогічна ситуація з хімічною мобілізацією урану (VI) – в кислій області рН вилужування металу відбувалось більш ефективно. Процес бактеріального вилужування достатньо ефективний також при наявності в грунті декількох металів. Встановлено, що уран, кобальт та мідь міцніше зв`язані з грунтом, ніж стронцій, який частково (на 20%) переходив у рідку фазу під впливом розчину поживних солей. В результаті обробки грунту, забрудненого металами, відбувалось не тільки вилучення металів із грунту, але й зміна деяких властивостей грунтової суспензії.
В процесі вилужування, пов`язаного з метаболізмом глюкози, швидкість седиментації очищеного грунту була вищою у два рази, ніж в процесі метаболізму ацетату, та в три рази вище, ніж грунту, який не підлягав обробці мікроорганізмами (табл.4). Обидві металорезистентні культури, які росли на ацетаті, виявляли седиментаційні властивості в грунтових суспензіях. При цьому грунт осідав у три рази швидше, ніж в контрольних зразках (рН суспензії 6,2 та 7,2). Слід зазначити, що інтродукція вивчених бактеріальних культур у грунтові суспензії веде до значних змін їх дисперсного стану.
Таблиця 4-
Седиментація грунту після мікробіологічної обробки та відстоювання
Обробка грунту | Джерело вуглецю середовища | рН* | D | Швидкість седиментації,
см3 * год -1
Bacillus cereus | глюкоза | 4,0 | 0,01 | 50,0–
// – // | 6,2 | 0,06 | 16,7
Bacillus cereus | ацетат натрію | 9,0 | 0,08 | 25,0–
// – // | 7,2 | 0,15 | 8,3
Alcaligenes eutrophus | ацетат натрію | 9,2 | 0,10 | 27,0–
// – // | 7,0 | 0,18 | 9,0
Примітки: * Вихідна величина рН суміші грунту з мінеральним середовищем – 6,8; тривалість обробки 18 год; грунт забруднений сумішшю важких металів.
Вивчення процесів вилучення важких металів у грунтовій колонці
В реальному грунті, на відміну від грунтової суспензії, масообмінні процеси, які контролюються густиною, в`язкістю, мікроагрегатністю, більш ускладнені. В зв`язку з цим вивчено ефективність біоекстракції ВМ із грунту в стаціонарних умовах (in situ), які прийнято моделювати за допомогою грунтових колонок. Встановлено, що в процесі розвитку мікроорганізмів на ацетаті відбувалось підвищення величини рН (криві 1,1*, рис. 3, а), на глюкозі – підкислення грунту (криві 2,2*, рис. 3, а).
Профілі рН зразків грунту, який збагачений однаковими джерелами вуглецю (криві 1,1*,2,2* рис. 3, а) подібні, однак у варіантах з інтродукованими металорезистентними штамами (криві 1,2, рис. 3, а) відмічена значна зміна рН у порівнянні з нестерильним грунтом, що вказує на більш активне протікання мікробіологічних процесів. В рідких культурах (криві 1,2, рис. 3, б) профілі рН мають більш різкий характер порівняно до відповідних грунтових систем (криві 1,2, рис. 3, а), що пов`язано з буферними властивостями грунту.
Дослідження динаміки кількості мікроорганізмів у забрудненому міддю або кобальтом грунті свідчать про те, що метали, які забруднюють грунт, інгібують активність грунтової мікрофлори (рис. 4). Однак у випадку збагачення забрудненого грунту біогенними елементами кількість мікрофлори відновлюється на десяту добу. У зразках із металорезистентними бактеріями кількість мікроорганізмів протягом усього досліду була на високому рівні і вони мали можливість активно метаболізувати вуглецевий субстрат, розмножуватись, утворювати комплексні сполуки з металами та екстрагувати їх із грунту.
З метою підбору дешевих та доступних джерел поживних речовин для реалізації способу біоекстракції ВМ із грунту в умовах стаціонару було випробувано сахарозу та розбавлену воду цукрового виробництва (джерела біогенних елементів для культури B.cereus, яка інтродукувалась у грунт).
Дані, які представлено в таблиці 5, свідчать, що у відкритій системі в зразках зі стерильним грунтом та грунтом, який не був збагачений джерелами вуглецю, азоту та фосфору (зразки №№ 1,2), вилучається лише незначна частина водорозчинної фракції – до 20% міді та 25% кобальту, що практично не впливає на валову концентрацію металів в цих зразках. У зразках грунту з інтродукованною МРК та збагаченого усіма біогенними елементами (зразки №№ 5-7) концентрація ВМ знижувалась більш суттєво – до 98% за водорозчинними формами та < 90% за валовим (повним вмістом).
На основі отриманих даних показано перспектівність використання металорезистентної культури Bacillus cereus; встановлено безпосередній зв`язок між ефективністю видалення важких металів із грунту та рівнем його мікробіологічної активності. Результати досліджень демонструють (табл.5, зразок № 7) високу ефективність мікробіологічної очистки грунтів, забруднених ВМ, також у випадку використання стічної води цукрового виробництва як джерела доступних і дешевих біогенних елементів та розширюють сировинну базу технології біоремедіації грунтів. Порівняно з відомими способами очищення грунту від важких металів нам вдалося суттєво покращити показники ефективності та тривалості обробки грунту. Важливою перевагою є м`яка обробка грунту, яка не руйнує його структури, та швидке відновлення мікробіологічної та біохімічної активності грунту.
Таблиця 5-
Ефективність біоекстракції важких металів із грунту в процесі розвитку металорезистентної культури (МРК) B.cereus BKM 4368 на різних джерелах біогенних елементів.
№ зразка | Зразок | рН | Ефективність біоекстракції ВМ, %
Cu | Co
I | II | III | I | II | III
1 | Стерильний грунт | 6,5 | 0 | 0 | 10,0 | 0 | 0 | 15,0
2 | Грунт | 6,5 | 0 | 0 | 20,0 | 0 | 0 | 25,0
3 | Грунт+солі+глюкоза | 6,0 | 20,2 | 30,0 | 40,2 | 25,0 | 32,2 | 45,0
4 | Грунт+солі+сахароза | 6,0 | 21,0 | 32,0 | 42,0 | 26,2 | 36,2 | 48,0
5 | Грунт+солі+глюкоза+МРК | 5,3 | 89,8 | 90,0 | 92,0 | 91,8 | 95,0 | 97,0
6 | Грунт+солі+сахароза+МРК | 5,3 | 90,5 | 92,0 | 93,0 | 92,5 | 96,0 | 98,5
7 | Грунт+стічна вода+МРК | 5,3 | 89,0 | 90,0 | 92,0 | 92,0 | 95,0 | 96,0
Примітки: I – валовий (повний) вміст; II – обмінні форми; III – водорозчинні форми; вихідна концентрація в грунті міді – 580 мг/кг (I), 100 мк/кг (II), 40 мк/кг (III); кобальту – 320 мк/кг (I), 45 мк/кг (II), 28 мк/кг (III); температура (22-24) 0С, тривалість обробки – 12 діб.
Основні принципи біоколоїдної технології ремедіації грунту, забрудненого важкими металами та/або радіонуклідами
Для сильно забруднених металами ділянок грунту, так званих “плям”, пропонується варіант біотехнології ex situ, який передбачає гетерофазне культивування МРК у грунтовій суспензії, що супроводжується гетерокоагуляцією, седиментацією грунту та вилужуванням металів у вигляді цитратних та полісахаридних комплексів (рис.5).
Стаціонарний варіант технології біоремедіації грунту (in situ), використовується для обробки менш забруднених важкими металами / радіонуклідами територій та базується на інтродукції в грунт МРК, яка в процесі свого розвитку забезпечує вилужування металів із грунту у вигляді водорозчинних екологічно безпечних органокомплексів (рис.6).
ВИСНОВКИ
1.
Проведено систематичні дослідження колоїдно-хімічних процесів біологічної трансформації металів: урану (VI), міді, кобальту та стронцію у темно-сірому опідзоленому грунті. Встановлено, що вилужування металів із грунту клітинними метаболітами відбувається ефективно у вигляді водорозчинних цитратних комплексів та, менш ефективно, гідроксидно-карбонатних колоїдних осадів (мідь, кобальт, стронцій) або водорозчинних карбонатних комплексів (ураніл). Отримані дані відкривають можливість направленого регулювання рухомості важких металів у грунті шляхом підбору джерел вуглецю та мікробних культур.
2.
Вивчено сорбцію урану (VI), міді, кобальту, стронцію опідзоленим грунтом. Показано, що сорбція урану з індивідуальних розчинів зменшується в ряду: U(VI)CuCoSr. Отриманий ряд селективності зберігається під час сорбції із розчинів, які містять суміші металів в еквімолярних концентраціях на фоні зменшення величин питомої сорбції як результат конкуренції між ко-іонами.
3.
Досліджено вилужування металів із грунтів забруднених індивідуальними металами та їх сумішами. Показано, що в обох випадках метаболітне вилужування металів знижується в ряду: U(VI)CuCoSr. Ефективність процесу вилучення індивідуальних компонентів зменшується на 20-25 % за наявністю в грунті або воді їх сумішей.
4.
Вивчено колоїдно-хімічні процеси біологічного руйнування цитратних та фульватних комплексів металів (Ca, Mg, Zn, Sr, Ni, Cu, Co, уранілу). Встановлено, що в результаті біотрансформації вказані комплекси переходять із розчинної форми у колоїдну, яка представлена практично нерозчинними карбонатами та основними солями у випадку цитратних комплексів, а під час руйнування фульватів – субстратами на основі простих органічних кислот. Особливістю біологічного руйнування вказаних водорозчинних органокомплексів порівняно з хімічним процесом є те, що основним фактором стає не хімічна стійкість комплексу, а токсичність координуючого металокомплексу.
5.
Встановлено, що під час росту металорезистентних культур Bacillus cereus BKM 4368 (на глюкозі) та Alcaligenes eutrophus CH 34 (на ацетаті) утворюються метаболіти, які мають розчинну та комплексоутворюючу активність по відношенню до металів: цитринова кислота та екзополісахариди під час росту на глюкозі, вуглекислота та екзополісахариди – на ацетаті.
6.
Показано, що в результаті біовилужування металів із грунту суттєво змінюється його дисперсний склад за рахунок процесу агрегування грунтових колоїдів. Встановлено, що швидкість седиментації збільшується вдвічі при використанні клітин, які метаболізують глюкозу порівняно з розчином ацетату та в шість разів у порівнянні з вихідним грунтом. Цей факт пов`язаний із флокулюючою дією екзополісахаридів, що виділяються клітиною.
7.
Розроблено принципи ефективної колоїдно-хімічної біотехнології очищення природного грунту від важких металів та радіонуклідів у двох варіантах: стаціонарному (in situ) та з його видаленням й обробкою у біореакторі (ex situ), які рекомендовано для використання при різних ступенях забруднення. Процес базується на інтродукції у грунт спеціальних штамів металорезистентних бактерій і трансформації токсичних металів у водорозчинні форми, які легко вилучаються із грунту. В першому випадку за тривалістю обробки до 10-14 діб ефективність очистки складала 90-92% (Cu, Co); в другому протягом 18-24 годин було досягнуто вилучення 99% U(VI), 95% Сu, 94,0% Co та 90% Sr.
8.
З метою практичної реалізації розробленої технології було досліджено дешеві та доступні джерела поживних середовищ для технологічного штаму бактерій B.cereus BKM 4368. Показано, що висока ефективність вилучення металу із грунту (вище 90%) досягається при використанні стічних вод цукрового виробництва як джерела біогенних елементів.
Основні результати дисертації викладено в роботах:
1.
Никовская Г.Н., Ульберг З.Р., Коваль Л.А. (Керносенко Л.А.) Коллоидно-химические процессы в биотехнологии извлечения тяжелых металлов из почвы // Коллоидный журнал. – 2001. – Т. 63. – №6. – С. 820-824. (Постановка та проведення експерименту, участь у трактуванні результатів досліджень та написанні статті).
2.
Никовская Г.Н., Ульберг З.Р., Коваль Л.А. (Керносенко Л.А.), Надел Л.Г., Стрижак Н.П. Некоторые коллоидно-химические аспекты биотрансформации цитратных комплексов тяжелых металлов // Коллоидный журнал. – 2002. – Т. 64. – №4. – С. 518-523. (Проведення експерименту та участь у трактуванні результатів досліджень).
3.
Никовская Г.Н., Коваль Л.А. (Керносенко Л.А.), Ульберг З.Р., Максимчук А.Г. Очистка почвы от меди и кобальта с помощью металлорезистентной культуры B.cereus BKM 4368 // Наукові вісті Національного технічного університету України. – 2000. – №3. – С. 150-153. (Проведення експерименту, участь в обговоренні результатів досліджень та написанні статті).
4.
Коваль Л.О. (Керносенко Л.О.) Біохімічні аспекти ремедіації грунтів, забруднених важкими металами та радіонуклідами // Укр. біохім. журнал. – 2002. – Т.74. – №4. – С. 155-156. (Проведення експерименту, інтерпретація результатів досліджень та написання статті).
5.
Патент України 58557, МКІ 6 А 01 N 25/00, C 02 F 1/28. Спосіб очищення грунту від важких металів та радіонуклідів /Ніковська, Г.М., Ульберг З.Р., Коваль Л.О. (Керносенко Л.О.) (Україна). – Бюл. №8. – 15.08.03. – I частина. (Участь у проведенні експерименту та оформленні Патенту).
6.
Коваль Л.А. (Керносенко Л.А.) Разработка микробиологического метода очистки почвы от тяжелых металлов // Тези доповідей учасників III всеукраїнської науково-практичної конференції молодих вчених “Екологія. Людина. Суспільство”. - Київ: Національний технічний університет України “КПІ”. – 2000. – С. 105-106. (Постановка та проведення експерименту, обговорення результатів досліджень та написання статті).
7.
Kernosenko M., Nikovskaya G., Ulberg Z. Colloidal and chemical bitransformation of heavy metal citrate complexes // Abstracts of the 4th International Conference on Carpathian Euroregion Ecology “Cereco 2003”. – Hungary, Miskolc-Tapolca. – 2003. – P. 73. (Проведення експерименту, трактування його результатів та написання тез та доповіді).
8.
Nikovskaya G., Gruzina T., Ulberg Z., Koval M. (Kernosenko M.) Novel approaches to bioremediation and monitoring of soils contaminated by heavy metals and radionuclides // Abstracts of the 2th International Conference “Role of interfaces in environmental protection”. – Hungary, Miskolc-Lillafьred. – 2002. – P. 28. (Постановка та проведення експерименту, участь у написанні статті).
9.
Никовская Г.Н., Коваль Л.А. (Керносенко Л.А.), Стрижак Н.П., Ульберг З.Р. Микробное разложение органокомплексов тяжелых металлов // Вісник Одеського Національного університету. – 2001. – Т. 6. - вып. 4. – С. 63-67. (Проведення експерименту, участь у трактуванні його результатів та написанні статті).
АНОТАЦІЯ
Керносенко Л.О. Колоїдно-хімічні процеси біотрансформації важких металів у грунті. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук за спеціальністю 02.00.11 – колоїдна хімія. Інститут біоколоїдної хімії ім. Ф.Д. Овчаренка НАН України, Київ, 2003.
Дисертацію присвячено вивченню колоїдно-хімічних процесів мікробної трансформації важких металів у забрудненому грунті під впливом металорезистентних спеціалізованих бактерій, які в процесі свого розвитку змінюють стан металів та властивості самого грунту.
Проведено дослідження колоїдно-хімічних процесів біотрансформації урану (VI), Cu, Co, Sr у природному опідзоленому грунті під впливом клітинних метаболітів, які утворюються при розвитку металорезистентних культур та мають комплексоутворюючу активність по відношенню до металів: цитринова кислота та екзополісахариди при метаболізмі глюкози, вуглекислота та екзополісахариди – ацетату. Показано, що вилужування металів із грунту в процесі мікробного метаболізму органічних субстратів різної природи відбувається більш ефективно у вигляді водорозчинних цитратних комплексів, ніж гідроксидно-карбонатних колоїдних осадів (мідь, кобальт, стронцій) або водорозчинних карбонатних комплексів (ураніл). Ефективність біовилужування металів зменшується в ряду: U(VI) Cu Co Sr. Продемонстрована можливість біологічного руйнування цитратних та фульватних комплексів металів Ca, Mg, Zn, Sr, Ni, Cu, Co, уранілу, що супроводжується переходом важких металів у колоїдну форму, яка представлена нерозчинними екологічно безпечними карбонатами та гідроксидами.
Розроблено принципи ефективної колоїдно-хімічної біотехнології очищення природного грунту від важких металів та радіонуклідів.
Ключові слова: грунт, колоїди, важкі метали, органокомплекси, екстракція, металорезистентні культури, біоремедіація.
ANNOTATION
Kernosenko L. A. Colloid-chemical processes of heavy metal biotransformation in soil.
Thesis for the degree of the Candidate of Sciences (chemistry) on the speciality 02.00.11 – colloid chemistry. F. D. Ovcharenko Institute of Biocolloidal Chemistry, NAS of Ukraine, Kyiv, 2003.
The thesis is devoted to the study of the colloid-chemical properties of the natural soil containing heavy metals: uranyl, copper, strontium, cobalt, and introduced metal-resistant culture, the possibilities to extract heavy metals by their bacterial transformation from bonded form into water-soluble form of non-toxic citrate complexes.
The processes for the biotransformation of uranium, copper, cobalt, and strontium in the natural ashes-containing soil under the action of cellular metabolites which are formed during the development of the metal-resistant cultures and possess complex-forming activity as to metals: citric acid and exopolysaccharides during the glucose metabolism, carbonic acid and exopolysaccharides during the growth on acetate. It is shown that metal leaching from soil during the microbial metabolism of the organic substrates takes place much effectively in the form of citrate complexes as compared with hydroxide-carbonate colloid precipitates (copper, cobalt, strontium) or water-soluble carbonate complexes (uranyl). The efficiency of the metal leaching decreases in the following succession: U(VI) > Cu > Co > Sr which coincides with the selectivity row of their sorption in the natural soil established by us. The possibility of the biological destruction of water-soluble organic Ca, Mg, Zn, Sr, Ni, Cu, Co, and uranyl complexes accompanied by the transfer of heavy metals in the colloid form represented by practically insoluble carbonates and hydroxides has been demonstrated. Non-toxicity (ecological safety) of the organocomplexes of heavy metals and the products of their biotransformation has been established.
The effective colloid-chemical biotechnology for the natural soil cleaning from heavy metals and radionuclides in two variants. stationary (in situ) as well as with its transferring and treatment in bioreactors (ex situ) recommended for the use at different degrees of the soil pollution has been developed.
Key words: soil, colloids, heavy metals, organocomplexes, extraction, metal-resistant culture, bioremeditation.
АННОТАЦИЯ
Керносенко Л.А. Коллоидно-химические процессы биотрансформации тяжелых металлов в почве. –
