НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О. В. ПАЛЛАДІНА

КАНЮК Микола Ігорович

УДК 577. 15: 543. 554: 504. 064

РОЗРОБКА ТА ВИВЧЕННЯ РОБОЧИХ

ХАРАКТЕРИСТИК ЕНЗИМНИХ СЕНСОРІВ ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ РІВНЯ ФОСФОРОРГАНІЧНИХ ПЕСТИЦИДІВ ТА ІОНІВ ВАЖКИХ МЕТАЛІВ

03.00.20 – біотехнологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України.

Науковий керівник – доктор біологічних наук, професор

Стародуб Микола Федорович,

Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна

НАН України, завідувач відділу біохімії сенсорних і регуляторних систем.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник

Курдиш Іван Кирилович,

Інститут мікробіології та вірусології

ім. Д. К. Заболотного НАН України,

завідувач відділу мікробіологічних процесів

на твердих поверхнях;

кандидат біологічних наук

Семенчук Ірина Миколаївна,

Інститут біоколоїдної хімії

ім. Ф. Д. Овчаренка НАН України,

науковий співробітник відділу

біоколоїдних систем.

Провідна установа – Київський національний університет

імені Тараса Шевченка,

кафедра біохімії.

Захист відбудеться " 24 " лютого 2003 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України (01601, м. Київ – 30, вул. Леонтовича 9).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії

ім. О. В. Палладіна НАН України (м. Київ, вул. Леонтовича 9).

Автореферат розісланий " 24 " січня 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Кірсенко О. В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Контроль за наявністю та складом шкідливих речовин в об'єктах довкілля, в тому числі іонів важких металів та фосфорорганічних сполук, набуває пріоритетного значення у зв'язку зі значним збільшенням масштабів застосування пестицидів фосфорорганічної природи, що підвищує ймо-вірність їхнього негативного впливу на біооб'єкти та здоров'я людини. Зазвичай, для проведення аналізу на вміст іонів важких металів та пестицидів у воді застосовуються відомі традиційні фізико-хімічні методи - газорідинної хроматографії та мас-спектроскопії, а також комплекси методів, які поєднують мас-спектрометрію, тонкошарову хроматографію, капілярний зональний електрофорез, капілярний ізотахофорез та міцелярну електрокінетичну й капілярну хроматографію. Цим методам притаманна висока чутливість та специфічність, але застосування їх обмежене через громіздкість приладів, значну собівартість експлуатації та довготривалість аналізу. Тому нині велика увага приділяється розробленню таких методів визначення токсичних речовин, які мають високу чутливість, задовольняють вимогам практики і дають можливість контролювати наявність їх безпосередньо в польових умовах. У разі виявлення токсичних речовин у довкіллі в лабораторних умовах уточнюють склад та кількість забруднювачів навколишнього середовища за допомогою чутливіших, але й дорожчих методів.

Сьогодні для проведення екологічного моніторингу довкілля, аналізу питної та побутової води й продуктів харчування все частіше застосовуються біосенсори, серед яких особливу увагу привертають ензимосенсори. Останні внаслідок компактності, простоти та невеликої тривалості аналізу й помірності експлуатаційних витрат виявилися придатними для проведення експрес-діагностики.

Для визначення в розчинах незначної кількості фосфорорганічних пестицидів та інших токсичних органічних сполук найчастіше застосовують ензими - ацетилхолін (АХЕ)- та бутирилхолін (БХЕ)-естеразу. Ензим уреазу (УР) використовують для визначення іонів важких металів, які пригнічують його активність у мікромолярних концентраціях. Розщеплення субстратів цими ензимами супроводжується генерацією протонів або гідроксил-іонів, які спричиняють зміну рН розчину. Тому для реєстрації перебігу біохімічних реакцій можна застосовувати електрохімічні прилади. Перспективною конструкцією електрохімічного біосенсора такого типу є комбінація іонселективного електрода (ІСЕ) з ензимною мембраною. Як іонселективний електрод найчастіше використовують іонселективні польові транзистори (ІСПТ) з іончутливим шаром нітриду кремнію. Застосування ІСПТ може забезпечити досить високу чутливість аналізу, що особливо важливо в разі уточнення його результатів у лабораторних умовах. Крім того, використання ІСПТ відкриває перспективу створення “інтелектуальних” сенсорів, коли на одному кристалі кремнію розташовано сенсор та мікропроцесор, що дає можливість поєднати одержання та опрацювання інформації. Водночас герметизація ІСПТ для аналізу розчинів є складною процедурою, але необхідною для попередження виникнення струму витоку та нестабільності вихідного сигналу. Ємнісні структури типу електроліт - діелектрик - напівпровідник (ЕДН), майже не поступаючись ІСПТ у швидкості дії, позбавлені таких недоліків, оскільки струми витоку в імпе дансних вимірах низькоомних структур не мають істотного значення, а простота герметизації дозволяє легко створювати багатоелементні масиви сенсорів у контакті з електролітом. Для функціонування ЕДН-сенсорів можна безпосередньо використовувати метод вольтємнісних вимірів (С-V) або реалізувати режим постійної ємності. Дисертаційну роботу присвячено розробленню ензимних сенсорів на основі ІСПТ та ємнісних ЕДН-структур. Об'єднання таких сенсорів дає можливість створити мультиензимний багатопараметричний біосенсорний масив, який дозволяє проводити скринінгові дослідження у польових умовах та здійснювати верифікацію результатів аналізу в лабораторії.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано у відділі біохімії сенсорних та регуляторних систем Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України з 1995 по 2001 р. у межах науково-дослідних тем. Вона є складовою частиною фундаментальних досліджень відділу і пов'язана з його науковими програмами та планами досліджень: темою № 8 “Створення наукових основ експресної доклінічної біохімічної діагностики й моніторингу довкілля з використанням селективних взаємодій біомолекул та біосенсорної технології”, № держреєстрації 01974004371; темою “Розробка наукових основ експрес-контролю вмісту фосфорорганічних пестицидів у довкіллі” (проект 6.4\194) - за програмою Фонду фундаментальних досліджень державного комітету України з питань науки та інтелектуальної власності.

Міжнародні наукові зв'язки. Дослідження проводили за спільним проектом з Інститутом біокібернетики та біомедичної інженерії Польської АН (Програма КОПЕРНІКУС) “Розробка та створення нових типів хімічних сенсорів і сенсорних масивів для медицини, біології та екології”. Контракт з ЕС № IC15-CT96-0818 (DG 12-MUYS).

Мета й задачі дослідження. Метою дисертаційної роботи було розроблення та дослідження робочих характеристик ензимних сенсорів для визначення рівня фосфорорганічних пестицидів та іонів важких металів на основі іонселективних польових транзисторів та напівпровідникових структур.

Для досягнення поставленої мети вирішували такі задачі:

1) розробити модель нового типу мультиензимного сенсора і підібрати ефективні методи іммобілізації відповідних ензимів для виявлення фосфорорганічних пестицидів та іонів важких металів,

2) визначити оптимальні умови проведення аналізу за допомогою ензимного сенсора для модельних розчинів,

3) оптимізувати метод для проведення аналізу в польових і лабораторних умовах,

4) розробити методику повторного використання ензимного сенсора для проведення серійних аналізів за умов інгібування ензимів.

Наукова новизна одержаних результатів. У роботі вперше розроблено та запропоновано модель принципово нового аналітичного пристрою - мультиензимного сенсора на основі ємнісних структур типу електроліт - діелектрик - напівпровідник (ЕДН) з іончутливим шаром нітриду кремнію для визначення рівня фосфорорганічних пестицидів та іонів важких металів. Також розроблено методику швидкої заміни інактивованих ензимів, яка грунтується на іммобілізації чутливих біологічних молекул на нітроцелюлозних плівках або в альгінатних гелях.

Практичне значення одержаних результатів. На основі одержаних результатів можна стверджувати, що новий мультиензимний сенсор характеризується багатьма перевагами порівняно з відомими на сьогодні біосенсорними пристроями. Визначення оптимальних умов застосування мультиензимного сенсора з ємнісними структурами типу ЕДН дозволяє рекомендувати його для впровадження та застосування в дослідженнях. Розроблена методика заміни інактивованих ензимів дає можливість швидко і без значних витрат визначати рівень фосфорорганічних пестицидів та іонів важких металів у зразках. В цьому полягає новизна та актуальність проведеної роботи.

Особистий внесок здобувача. Головну ідею роботи та напрям досліджень було запропоновано науковим керівником, а її практичне втілення належить здобувачеві. Автором дисертаційної роботи здійснено аналіз літератури, проведено біохімічні дослідження, статистичну обробку даних, підготовлено до публікації статті за матеріалами одержаних результатів. В роботах із співавторами [1, 2, 3 та 4] (пункт “Список робіт за темою дисертації”) переважну частину експерименту було проведено пошукачем. З керівником дисертаційної роботи здійснювалося обговорення одержаних даних та репрезентація експериментального матеріалу на наукових семінарах і конференціях. Аналіз результатів досліджень, їхнє узагальнення, інтерпретація, формулювання основних положень та висновків, написання й подання статей до друку проведено також спільно з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, які наведено в дисертації, було репрезентовано на таких міжнародних наукових конференціях та симпозіумах: “The Third International Symposium and Exhibition on Environmental Contamination in Central and Eastern Europe” (Warsaw, 1996); “Eurosensors X of 10th European Conference on Solid State Transducers” (Leuven, Belgium, 1996); “World Congres on Medical Physics and Biomedical Engineering” (14-19 Nice France, 1997); “Eurosensors XI. The 11th European Conference on Solid-State Transducers” (Warsaw, 1997); Conference “Czujniki optoelektroniczne i electroniczne” (Jurata, 1998); “The 12th European Conference in Solid-State Transducers and the 9th UK Conference on Sensors and their Applications” (Southampton, 1998); “7th European Conference on ElectroAnalysis” (Coimbra, 1998); NATO Advanced Research Workshop “New trends in biosensor development” (Vorzel, 1998); “Sensor 99” (Germany, 1999); “The 2nd Eurel Workshop on European Advanced Robotic Systems Development and Medical Robotics” (Pisa, 1999). Крім того, одержані результати обговорено на семінарах відділу та на міжінститутському науково-теоретичному семінарі “Сучасні проблеми біотехнології, біосенсорики і біомедичної оптики”.

Публікації. Матеріали дисертаційної роботи опубліковано у 5 статтях: в “Analytica Chimica Acta”(1), “Sensors and Actuators”(2), “Оптоэлекроника и полупроводниковая техника”(1), та в збірнику “Biosensors for Direct Monitoring of Environmental Pollutants in Field”// Eds. Nikolelis D. P. et al. Kluwer Acad. Publ. Printed in the Netherlands (1), а також в 11 повідомленнях і тезах міжнародних конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційну роботу викладено на 146 сторінках машинописного тексту. Вона складається з таких розділів: “Вступ”, “Огляд літератури”, Матеріали та методи досліджень”, “Результати досліджень та їхнє обговорення”, “Висновки” і “Список використаних джерел літератури”, який містить 306 джерел. Роботу ілюстровано 27 рисунками та 5 таблицями.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Огляд літератури складається з чотирьох підрозділів. У першому підрозділі наведено характеристику відомих типів біосенсорів, у другому - загальні відомості щодо іммобілізації ензимів, у третьому й четвертому - дані літератури з визначення пестицидів сучасними методами та визначення іонів важких металів із використанням біосенсорів.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження проводили на наступних чотирьох парах ензим - субстрат: глюкозооксидаза (ГО) - глюкоза, ацетилхолінестераза (АХЕ) - ацетилхолінйодид (АХЙ), бутирилхолінестераза (БХЕ) - бутирилхолінйодид (БХЙ), уреаза (УР) - сечовина. Для запобігання залежності сенсорних сигналів від хімічного складу зразків, виміри проводили у стандартних буферних розчинах:

1 - 5 мM трис-HCl (рН 7,3) з 0,14 М NaCl. Усі виміри здійснювали за кімнатної температури.

Іонселективні польові транзистори (ІСПТ) і прилад було виготовлено в Інституті біокібернетики та біомедичної інженерії Польської АН (Варшава). Чутливість ІСПТ становила близько 45 мВ/pH. Розміри підзатворної області транзистора дорівнювали 30ґ600 мкм, об'єм вимірювальної комірки для ІСПТ- 1 мл.

Під час визначення іонів важких металів або пестицидів спочатку реєстрували інтенсивність перебігу ензимних реакцій із застосуванням субстратів заданої концентрації. Потім у систему вводили розчин пестициду або солі важких металів без субстрату. Через 10 хв повторно реєстрували відгуки тих самих реакцій після додавання в комірку субстратів. За величиною залишкової активності ензимів визначали концентрацію інгібітоpів.

Нами спільно із співробітниками Інституту фізики напівпровідників НАН України було розроблено мультибіосенсор, який мав від 10 до 25 комірок із ємнісними структурами типу електроліт - діелектрик - напівпровідник та іончутливим шаром нітриду кремнію ( Si-SiO2-Si3N4 ). Для реєстрації фізичних змін, які відбуваються під час функціонування ємнісних структур, застосовували метод вольтємнісних вимірів. Чутливість цих структур у діапазоні значень рН 2 - 9 становить близько 55 мВ/рН. Похибка вимірювань рН стандартних буферних розчинів не перевищує 3% одиниці рН.

Проточна система мультибіосенсора має від двох до п'яти паралельних каналів, в кожному з яких є п'ять комірок. Загальну схему каналу сенсора наведено на рис. 1. Усі комірки одного каналу мають спільний верхній електрод (рис. 1, а), де зв'язок кремнієвої основи з останнім утворюється за допомогою алюмінієвого контакту. Кожна комірка складається з рН-чутливої структури із шаром нітриду кремнію, електроліту та металевого електрода (рис. 1, б). Фактично комірка - це плоский мікрореактор з ензимною мембраною.

Методика вимірів мультиензимним сенсором була наступною:

Мембрани з іммобілізованими ензимами вносили в чотири мікрореакторні комірки. П'яту комірку використовували як контроль. В неї вносили нітроцелюлозну мембрану з нанесеним бичачим сироватковим альбуміном (БСА). У проточну систему вводили розчини різних субстратів. Вимірювання сигналів відгуку всіх ензимних каналів здійснювали за диференційною схемою.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХНЄ ОБГОВОРЕННЯ

Розроблені нами ензимні мембрани використовували одноразово з метою швидкої заміни інактивованих ензимів разом із носієм. Передусім проведено експерименти з оптимізації методу іммобілізації ензимів під час виготовлення ензимних мембран.

Виготовлення ензимних мембран здійснювали таким чином. На нітроцелюлозні мембрани ("Amersham" - тип hybond-N) наносили розчин ензиму водночас із БСА для адсорбції їх на поверхні. Глутаровий альдегід (ГА) використовували для ковалентної іммобілізації ензимів сумісно з БСА на поверхні носія. Встановлено, що оптимальне співвідношення між компонентами ензим (10 мг/мл) - БСА (1 %) - ГА (2,5%) становить 1 : 1 : 1.

Нами доведено, що ензимні мембрани найкраще зберігаються при 4° C в 20 мМ буферному розчині трис-HCl (pH 7,4), який містить 2,5% сахарози, 5% гліцеролу, 1 мМ EДTA та 0,1% азиду натрію.

Для створення ензимних змінних мембран, крім нітроцелюлози, використовували також 1%-й Ca-альгінатний гель. Застосування альгінатного гелю можливе в буферних розчинах трис-HCl, оскільки у фосфатному буфері він руйнується.

1. Характеристика показників ензимних польових транзисторів

Лінійний діапазон чутливості ензимного польового транзистора (ЕПТ)

на основі АХЕ до o,o-диметил -2,2-дихлорвінілфосфату (ДДВФ) становить 10-5 -10-7 М (рис. 2). Субстрат - 0,2 мМ розчин АХЙ.

Для визначення токсичних речовин у природних продуктах використовували соки картоплі й капусти. Відомо, що рослинний сік впливає на величину відповіді сенсора, внаслідок чого утворюється неспецифічний сигнал, який не пов'язаний з ензимною реакцією. З метою запобігання впливу деяких компонентів соку на ензимну активність його розбавляли від 20 до 100 разів 5 мM трис-HCl (рН 7,3) - буфером, який містив 0,14 М NaCl. Розведення соку в 100 разів не змінювало початкову активність АХЕ (рис. 3). Але за недостатнього розведення соку проведення аналізу виявляється неможливим унаслідок значного впливу його компонентів на ензимну активність та на вихідний сигнал АХЕ ензимного мембранного сенсора.

Вивчали дію пестициду фозалону на АХЕ-сенсор у соках капусти та картоплі (рис. 4). Перед аналізом соки розбавляли в 100 разів 5 мМ трис-HCl - буфером, що містив 0,14 М NaCl. З даних рис. 3 випливає, що величина вихідного сигналу АХЕ-сенсора прямолінійно залежить від концентрації фозалону в соці капусти та картоплі (у межах 10-7 - 10-9 М, що становить

40 - 0,4 мкг/л).

Під час аналізу фосфорорганічні пестициди інгібують активність АХЕ та БХЕ, а іони важких металів – активність уреази. Для проведення наступного аналізу потрібно відновити активність ензимів або замінити їх. Після дії пестицидів ензими АХЕ та БХЕ можуть бути реактивовані за допомогою піридин- 2-альдоксим-метйодиду (ПАМ-2), а після інгібування уреази іонами важких металів її активність відновлюється дитіотреїтолом. За деякими даними (Takrumi L. A. та ін., 1993) відновлення початкової активності ензимів може досягати 100%.

У дослідженнях ми вивчали вплив оборотного інгібітору АХЕ прозеріну на відповідь АХЕ- та БХЕ-біосенсорів. Згідно з одержаними даними, діапазон чутливості сенсора до прозеріну під час використання 1,5 мМ субстрату становить 40 - 280 нМ, що відповідає 0,01 - 0,07 мг/л. Показано, що використання ПАМ-2 не відновлює початкової активності ензиму. Подібне явище спостерігається також після інгібування хлорпірофосом.

Під час вивчення впливу хлорпірофосу на відповідь АХЕ- та БХЕ- біосенсорів було з'ясовано, що оброблення ПАМ-2 в цьому випадку не відновлює початкової активності ензимів (рис. 5). Після дії 5·10-5 М хлорпірофосу на ЕПТ показники активності АХЕ знижуються до 15% початкової, а реактивація ензиму з використанням ПАМ-2 відновлює активність АХЕ лише до 30%.

Аналогічні дані було одержано при відновленні активності УР після інгібування ензиму іонами важких металів. Після інгібування 1·10-7 М Hg2+ активність УР становила близько 45% від початкової, а використання дитіотреїтолу відновлює активність УР, збільшуючи її до 60% від початкового рівня (рис. 6).

Наведені результати з реактивації біосенсорів свідчать про недоцільність повторного їхнього використання. Тому для проведення наступного аналізу доцільно застосовувати змінні мембрани на основі нітроцелюлози.

2. Характеристика показників мультиензимного сенсора на основі

напівпровідникових структур

Для роботи мультиензимного сенсора було підібрано оптимальні концентрації субстратів: для глюкози, АХЙ, БХЙ та сечовини вони становлять 1, 10, 10 та 20 мМ відповідно. Така суміш субстратів у каналі мультиензимного сенсора протягом 10 хв у кожній комірці дає сигнал близько 100 мВ. При цьому всім сенсорам притаманний адекватний відгук за відсутності взаємовпливу реакції на сусідні комірки (рис. 7). З графіка вихідних сигналів випливає, що ензими АХЕ та БХЕ характеризуються деякою перехресною чутливістю до субстратів АХЙ та БХЙ.

Принцип роботи мультиензимосенсора грунтується на різній чутливості окремих ензимосенсорів до певних інгібіторів. Так сигнал УР-каналу суттєво зменшується за наявності в реакційному середовищі іонів важких металів. При цьому пестициди практично не впливають на активність УР (рис. 7). Навпаки, пестициди значно інгібують активність ензимів АХЕ та БХЕ, тоді як іони важких металів діють на них менше. Для врахування сигналу, який утворюється за наявності в середовищі неспецифічного інгібітору у випадку аналізу пестициду за допомогою АХЕ- або БХЕ-сенсора, потрібна додаткова інформація від УР-сенсора. І, навпаки, під час визначення іонів важких металів, крім основного сигналу УР-сенсора, потрібна інформація, яку одержують за допомогою АХЕ- або БХЕ-сенсора.

Виявлено, що фосфорорганічні пестициди не інгібують глюкозооксидазу (рис. 7), а іони важких металів пригнічують активність ензиму за концентрації 10-3 - 10-4 М (рис. 8).

Виявлено, що іони міді та олова інгібують ензим БХЕ за концентрації 10-5 М (рис. 9).

Встановлено, що подібна, але дещо вища чутливість до іонів важких металів притаманна АХЕ-сенсору. Пригнічення ензимної активності зазначеними іонами металів оборотне. Під час промивання ензимної мембрани буферним розчином відбувається поступове відновлення активності ензимів до попереднього значення.

Водночас усі іони важких металів суттєво й незворотно знижують активність лише УР (рис. 10), що є типовим для цього ензиму. Дія іонів олова має деякі особливості. Якщо їхня концентрація збільшується від 10-4 до 10-3 М, то відбувається поступове збільшення активності ензиму майже на 25% від початкової. За подальшого підвищення концентрації іонів олова (до 10-3 М) спостерігається поступове інгібування активності ензиму. На підставі одержаних показників залишкової активності УР під час інгібування її іонами Hg2+ (рис. 6), Cu2+, Co2+, Cd2+, Ni2+, Zn2+, Pb2+, Sr2+ та Sn2+ (рис. 10), можна дійти висновку, що діапазон гранично вимірюваної концентрації іонів важких металів становить від 10-5 до 10-7 М і залежить від їхнього типу. Лінійний діапазон детекції знаходиться в межах двох - трьох концентраційних порядків. Чутливість визначення іонів важких металів залежить також від тривалості інкубації ензимних мембран у середовищі з іонами важких металів.

Іонам важких металів порівняно з пестицидами притаманна незначна інгібувальна дія на ензими АХЕ та БХЕ (рис. 11). І як уже зазначалось вище, пригнічення ензимів іонами важких металів оборотне. Фосфорорганічні пестициди інгібують активність тільки АХЕ та БХЕ, гранична концентрація вимірювання їх становить 10-9 М, а лінійний діапазон детекції знаходиться в межах 10-5-10-8 М.

Ензим АХЕ в цих умовах виявляє аналогічні до БХЕ властивості, але його чутливість до фосфорорганічних пестицидів дещо вища. Таким чином, за допомогою окремого УР-сенсора можна з високою точністю визначити рівень іонів важких металів у зразках, а за допомогою АХЕ- (БХЕ)- сенсора - вірогідно реєструвати фосфорорганічні пестициди. Проте дослідження ускладнюється, якщо аналізують суміш розчинів пестициду й солі важкого металу, тому що за цих умов у відгуку кожного зі згаданих вище сенсорів з'являється додатковий сигнал, який утворюється іншим неспецифічним інгібітором. Щоб врахувати цей неспецифічний сигнал у випадку переважно пестицидного аналізу для АХЕ (БХЕ)- сенсора потрібна додаткова інформація від УР-сенсора. І, навпаки, у разі визначення вмісту іонів металів у розчинах на додаток до основного сигналу УР-сенсора потрібна інформація від АХЕ або БХЕ-сенсора.

Із тривимірних графіків залишкової активності в системі розпізнавання з трьома ензимами (УР, БХЕ, ГО) після пригнічення останніх іонами важких металів (рис. 12-13) та пестицидами (рис. 13) у різних концентраціях випливає, що криві інгібування зазначеними речовинами просторово відокремлені.

Запропонована схема свідчить про можливість здійснення за допомогою мультиензимосенсора специфічних та точних визначень токсичних речовин у разі збільшення в ньому кількості різних ензимів. Одночасне застосування декількох ензимів дає можливість одержати достовірнішу інформацію та провести швидший і глибший аналіз зразків.

Розроблений мультисенсор порівняно з іншими краще задовольняє реалізацію мультиензимного аналізу, тому що він за певних умов дозволяє водночас проводити до 20 ензимних реакцій. Незважаючи на деякі обмеження (неможливість проведення прямих вимірів, тобто вимірів без попереднього розведення нативного зразка стандартним буфером), метод мультиензимного аналізу із зазначеними перевагами застосування масиву ємнісних структур типу ЕДН, можна використовувати для експресного аналізу об'єктів навколишнього середовища. Застосування декількох ензимів збільшує як чутливість, так і специфічність та діапазон вимірювання. При цьому для визначення загальної токсичності не завжди потрібна висока точність вимірювання рівня у зразках окремих токсичних речовин, а буває достатнім оцінити лише сумарний ефект їхньої дії.

ВИСНОВКИ

1. Розроблено, досліджено та запропоновано для практичного використання ензимні сенсори на основі іонселективних польових транзисторів для роздільного експресного визначення фосфорорганічних пестицидів і іонів важких металів. Доведено можливість проведення складного аналізу за одночас-ного перебігу декількох різних ензимних реакцій та створено мультиензимний, багатоканальний сенсор для визначення зазначених вище типів токсичних речовин.

2. Досліджено та застосовано в експериментах ефективні методи іммобілізації ензимів на нітроцелюлозних плівках та альгінатних гелях для виготовлення постійних та змінних “ензимних мембран” біосенсорних пристроїв.

3. Розроблено та визначено робочі характеристики ензимного сенсора на основі холінестераз на фосфорорганічні пестициди з порогом чутливості до 10-9 М.

4. Розроблено та визначено робочі характеристики ензимного сенсора для

детекції концентрації іонів важких металів на основі уреази з чутливістю до 10-7 М.

5. Встановлено оптимальні умови проведення за допомогою мультиензимного сенсора експрес-аналізу природних зразків (наприклад, овочевого соку) та модельних середовищ на вміст різних типів токсичних речовин (іонів важких металів та фосфорорганічних пестицидів).

6. Показано доцільність і перспективність застосування багатоканального

мультиензимного сенсора в експрес-діагностиці та для екологічного моніторингу у разі використання змінних “ензимних мембран”.

СПИСОК РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Кукла А. Л, Ширшов Ю. М., Канюк Н. И., Стародуб Н. Ф., Прохорович А. В. Мультиферментный сенсор на основе емкостных структур типа электролит – диэлектрик – полупроводник // Оптоэлекроника и полупроводниковая техника. - 1998.– Вып. 33. - С. 63-69.

2. Starodub N. F., Shirshov Yu. M., Torbicz W., Kanjuk N. I., Starodub V. M., Kukla A. L. Biosensor for in field measurements: optimisation of parameters to control phosphororganic pesticides in water and vegetables // Eds. Nikolelis D. P. et al. Biosensors for Direct Monitoring of Environmental Pollutants in Field. Kluwer Academic Publishers. Printed in the Netherlands. – 1998. – P. 209-219.

3. Starodub N. F., Kanjuk N. I., Kukla A. L., Shirshov Yu. M. Multi-enzymatic electrochemical sensor: field measurements and their optimisation // Analytica Chimica Acta. – 1999. – Vol. 385. – P. 461-466.

4. Kukla A. L., Kanjuk N. I., Starodub N. F., Shirshov Yu. M. Multienzyme electrochemical sensor array for determination of heavy metal ions // Sensors and Actuators B. – 1999. – Vol. 57. – P. 213-218.

5. Starodub N. F., Torbicz W., Pijanowska D., Starodub V. M., Kanjuk N. I., Dawgul M. Optimization methods of enzyme integration with transducers for analysis of irreversible inhibitors // Sensors and Actuators. - 1999. - Vol. 58, №1-3. - P. 420-426.

6. Starodub N. F., Kanjuk N. I., Starodub V. M., Ternovoj K. S., Torbicz W., Pijanowska D., Dawgul M., Arthjukh V. P., Bariljak I. R. Development of Enzymatic Sensors for Monitoring of the Organophosphorus Pesticide Level in the Environment // Proc. оf 3rd International Symposium and Exhibition on Environmental Contamination in Central and Eastern Europe. Sept., 10-13, Warsaw, Poland. – 1996. – P. 51–53.

7. Starodub N. F., Torbicz W., Pijanowska D., Kanjuk N. I., Ternovoj K. S., Dawgul M., Phosphororganic pesticide control in some vegetables by enzymatic sensors based on the ISFETs // Proc. of Eurosensors X of 10th European Conference on Solid State Transducers, Leuven, Belgium, Sept. 8–11. – 1996. – Vol. 3–5. – P. 925–928.

8. Torbicz W., Dawgul M., Starodub V. M., Kanjuk N. I. Determination of heavy metal ions in blood serum by multi-enzymatic based on the ISFETs // World Congres on Medical Physics and Biomedical Engineering. Nice France. Journal of the International Federation for Medical and Biologial Engineering, Sept. 14–19. – 1997. – Vol. 35. Supplement Part I. – P. 134.

9. Shirshov Yu. M., Starodub N. F., Kukla A. L., Kanjuk N. I., Prokhorovich A. V., Merker R. Creation of the multi-enzymatic sensor for simultaneous determination of phosphororganic pesticides and heavy metal ions in solution // Proc. of Eurosensors XI. The 11th European Conference on Solid State Transducers, Warsaw, Poland, Sept. 21–24. – 1997. – Vol. 2. – P. 727–730.

10. Starodub N. F., Torbicz W., Starodub V. M., Kanjuk N. I., Dawgul M., Pijanowska D. and Ternovoj K. S. Control of heavy metal ion level in some vegetables by enzymatic sensors based on the ISFETs // Proc. of Eurosensors XI. The 11th European Conference on Solid State Transducers, Warsaw, Poland, Sept. 21–24. – 1997. – Vol. 2. – P. 1233–1236.

11. Starodub N. F., Shirshov Yu. M., Kukla A. L., Kanjuk N. I., Prokchorovich A. V., Merker R. Multi-enzymatic sensor for simultaneous determination of phosphororganic pesticides and heavy metal ions // Electrochemical Society Proceedings.–

1997. – Vol. 19. – P. 799–808.

12. Torbicz W., Pijanowska D., Dawgul M., Starodub N., Kanjuk N. Wplyw technologii wytwarzania enzymatycznych polprzewodnikowych bioczjunikow na ich wlasciwosci // Materialy konf. “Czujniki optoelektroniczne i electroniczne”, Jurata, 10–13 maja. – 1998. – Vol. 2. – P. 383–390.

13. Kukla A. L., Kanjuk N. I., Starodub N. F., Shirshov Yu. M. Use of multienzyme analysis for determination of heavy metal ions and phosphororganic pesticides in solutions // Proc. of the 12th European Conference jn Solid-State Transducers and the 9th UK Conference on Sensors and their Applications. Southampton, UK, 13–16 Sept. – 1998. – Vol. 1, Edt. N. M. White. Inst. Of Physics Publ., Bristol and Philadelphia. – 1998. – P. 521–524.

14. Starodub N. F., Torbicz W., Pijanowska D., Starodub V. M., Kanjuk N. I., Dawgul M. Optimization methods of enzyme integration with transducers for analysis of irreversible inhibitors // Proc. of the 12th European Conference in Solid-State Transducers and the 9th UK Conference on Sensors and their Applications, Southampton, UK, 13–16 Sept. 1998. Edt. N. M .White. Inst. of Physics Publ., Bristol and Philadelphia. – 1998. – Vol. 1. – P. 837–840.

15. Starodub N. F., Starodub V. M., Kanjuk N. I., Kukla A. L., Shirsjov Yu. M. Biological sensor array for express determination of a number of biochemical quantities // Proc. of the 2nd Eurel Workshop on European Advanced Robotic Systems Development and Medical Robotics. 23–24 September. 1999. Scuola Skuperiore Sant'Anna, Pisa, Italy. – 1999. – P. 57–62.

16. Starodub N. F., Kukla A. L., Kanjuk N. I., Shirsjov Yu. M. Simultaneous Control of Phosphororganic Pesticides and Heavy Metal Ions by Multi-Enzymatic Sensor // Sensor 99. 18–20. May. 1999. Germany. – 1999. – P. 105–110.

АНОТАЦІЯ

Канюк М. І. Розробка та вивчення робочих характеристик ензимних сенсорів для визначення рівня фосфорорганічних пестицидів та іонів важких металів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 - біотехнологія. - Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ, 2003.

Дисертація присвячена розробленню ензимних сенсорів на основі іонселективних польових транзисторів (ІСПТ) та ємнісних структур типу електроліт - діелектрик - напівпровідник (ЕДН) з іончутливим шаром нітриду кремнію для визначення рівня фосфорорганічних пестицидів та іонів важких металів у розчинах з використанням ензимного інгібіторного аналізу.

Підібрано оптимальні умови визначення обох токсичних агентів у соках овочів за допомогою ензимного сенсора на основі ІСПТ. Мультиензимний сенсор на основі ЕДН може також бути ефективно використаний для експресного аналізу об'єктів навколишнього середовища на наявність обох зазначенних вище токсичних агентів. Використання змінних “ензимних мембран” дозволяє проводити аналіз із швидкою заміною інактивованих ензимів, що забезпечує високий рівень вірогідності вимірів, точність та зниження вартості проведення аналізу.

Ключеві слова: Біосенсор, мультиензимній електрохімічній сенсор, іонселективні польові транзистори, ємнісні структури типу електроліт - діелектрик - напівпровідник, іони важких металів, фосфорорганічні пестициди.

АННОТАЦИЯ

Канюк Н. И. Разработка и изучение рабочих характеристик энзимных сенсоров для определения уровня фосфорорганических пестицидов и ионов тяжелых металлов. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических

наук по специальности 03.00.20 - биотехнология. - Институт биохимии

им. А. В. Палладина НАН Украины, Киев, 2003.

Диссертация посвящена разработке энзимных сенсоров на основе ион-селективных полевых транзисторов и емкостных структур типа электролит - диэлектрик - полупроводник (ЭДП) с иончувствительным слоем нитрида кремния для определения уровня фосфорорганических пестицидов и ионов тяжелых металлов в растворе. Основой принципа определения является энзимный ингибиторный анализ.

В работе представлены результаты по определению ионов тяжелых металлов и фосфорорганических соединений в водных растворах. В качестве чувствительных элементов биосенсоров применяли такие иммобилизированные на нитроцеллюлозной мембране энзимы, как глюкозооксидаза, ацетилхолинэстераза, бутирилхолинэстераза и уреаза. Наличие ингибиторов оценивали путем определения остаточной активности энзимных мембран. Поскольку примененные энзимы имеют неодинаковую чувствительность к токсичным веществам, предложено использовать метод мультиэнзимного анализа для определения пестицидов и ионов тяжелых металлов в образцах.

Проточная система мультибиосенсора имеет от двух до пяти параллельных каналов с пятью измерительными ячейками в каждом. Измерительная ячейка состоит из рН-чувствительной емкостной структуры типа ЭДП и иончувствительного слоя нитрида кремния. Камера представляет собой плоский микрореактор с энзимной мембраной. Для регистрации физико-химических изменений, происходящих во время функционирования емкостных структур, применен метод вольтемкостных измерений. Чувствительность этих структур в диапазоне значений рН 2 - 9 составляет около 55 мВ/рН. Погрешность измерений рН стандартных буферных растворов не превышает 3% единицы рН.

Методика измерения при использовании мультиэнзимосенсора была следующей. Мембраны с иммобилизованными энзимами помещали в четыре микрореакторные ячейки. Пятую ячейку использовали в качестве контрольной. В нее помещали нитроцеллюлозную мембрану с нанесенным бычьим сывороточным альбумином. В проточную систему вводили смесь растворов различных субстратов. Измерение сигналов отклика всех энзимных каналов проводили по дифференциальной схеме.

С целью создания биосенсора для осуществления быстрого анализа на содержание фосфорорганических пестицидов и ионов тяжелых металлов был разработан метод смены инактивированых энзимов. В качестве носителей использовали нитроцелюлозные мембраны. Исследованы и выбраны оптимальные способы иммобилизации и сохранения активности энзимов для изготовления сменных “энзимных мембран”.

В работе впервые разработано и предложено принципиально новое аналитическое устройство - мультиэнзимный сенсор на основе емкостных структур типа ЭДП с иончувствительным слоем нитрида кремния - для одновременного определения уровня фосфорорганических пестицидов и ионов тяжелых металлов. На примере многоканального мультисенсора показана возможность их определения при одновременном протекании нескольких энзимных реакций.

В работе определены оптимальные условия проведения экспресс-анализа естественных (овощной сок) сред на содержание ионов тяжелых металлов и фосфорорганических пестицидов с помощью энзимного сенсора на основе

рН-чувствительных полевых транзисторов. Применение принципа комбинированного мультиэнзимного и многоканального анализа дает возможность определения концентрации как пестицидов, так и ионов тяжелых металлов в модельных растворах с порогом чувствительности ниже предельно допустимой концентрации. Уровень чувствительности разработанного энзимного сенсора к ионам тяжелых металлов (Hg2+, Cu2+, Co2+, Cd2+, Ni2+, Zn2+, Pb2+ и Sn2+) находится в диапазоне от 10-5 до 10-7 М и зависит от их природы. Линейный диапазон определения концентрации фосфорорганических пестицидов находится в области 10-5-10-8 М. Предельная концентрация измерения фосфорорганических соединений составляет 10-9 М.

Разработанный мультисенсор лучше удовлетворяет требования к реализации мультиэнзимного анализа по сравнению с существующими на сегодня сенсорными устройствами, так как он при определенных условиях позволяет одновременно проводить до 20 энзимных реакций. Метод мультиэнзимного анализа, учитывая преимущества применения массива емкостных структур типа ЭДП, можно использовать для экспрессного мониторинга окружающей среды.

Предложенная схема комбинированного мультиэнзимного и многоканального анализа свидетельствует о принципиальной возможности проведения с помощью мультисенсора специфических и точных определений токсичных веществ при условии использования увеличенного количества разных энзимов. Одновременное применение нескольких энзимов повышает чувствительность, специфичность и расширяет диапазон измерения, дает возможность проведения быстрого и более глубокого анализа проб, позволяет получить больше достоверной информации.

На основе полученных данных можно утверждать, что новый мультиэнзимный сенсор вследствие своей компактности и короткого промежутка времени для отклика является более перспективным по сравнению с другими существующими на сегодня биосенсорными устройствами.

Ключевые слова: Биосенсор, мультиэнзимный электрохимической сенсор, ионселективные полевые транзисторы, емкостные структуры типа электролит - диэлектрик - полупроводник, ионы тяжелых металлов, фосфороргани-ческие пестициды.

SUMMARY

Kanjuk N. I. Development and study of working characteristics of enzymatic sensors for determination of a level of phosphororganic pesticides and heavy metal ions. - Manuscript.

Thesis for a scientific degree of Candidate of Biological Sciences (equivalent to Doctor of Philosophy) by speciality 03.00.20 - Biotechnology. – Palladin Institute of Biochemistry of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2003.

The dissertation is devoted to development of enzymatic sensors on a basis of ion sensitive field-effect transistors (ISFET) and capacitance structures of electrolyte - dielectric - semiconductor (EDS) type with ion-sensitive silicon nitride layer for determination of the levels of phosphororganic pesticides and heavy metal ions in solutions by use of method of enzymatic inhibitory analysis.

Optimal conditions for control of both toxic agents in vegetables by ISFET – based enzymatic sensor were determined. Multienzymatic EDS – based sensor can also be effectively used for express simultaneous analysis of the environment for presence of both indicated toxic agents. Use of replaceable “enzyme membranes” allows to carry out analysis with fast replacement of inactivated enzyme, which ensures a high level of measurements reliability, accuracy and depreciation of analysis cost.

Key words: Biosensor, multienzymatic electrochemical sensor, ion sensitive field-effect transistors, capacity frames of electrolyte - dielectric - semiconductor type, heavy metal ions, phosphororganic pesticides.