НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ

КІГЕЛЬ НАТАЛЯ ФЕДОРІВНА

УДК 637.136.3/5:637.146+636.087.3

ТЕХНОЛОГІЇ БАКТЕРІАЛЬНИХ ПРЕПАРАТІВ ДЛЯ ФУНКЦІОНАЛЬНИХ ПРОДУКТІВ І БІОЛОГІЧНО АКТИВНИХ ДОБАВОК

03.00.20 - біотехнологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора технічних наук

Київ-2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Технологічному інституті молока та м'яса Української академії аграрних наук

Офіційні опоненти: доктор технічних наук, професор, академік УААН

Єжов Валерій Микитович

Нікітський ботанічний сад – Національний науковий центр

УААН, директор

доктор біологічних наук, професор,

член-кореспондент НАН України

Підгорський Валентин Степанович

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного

НАНУ, в/о директора

доктор медичних наук, старший науковий співробітник

Гуліч Марія Павлівна

Інститут гігієни та медичної екології ім. О.М.Марзеєва

АМН України, зав. лабораторії гігієни харчування

Провідна установа: Одеська національна академія харчових технологій

Міністерства освіти і науки України, м. Одеса

Захист відбудеться “10” грудня 2003 р. о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.058.03 Національного університету харчових технологій за адресою: 01033, м.Київ, вул. Володимирська, 68, корпус А, ауд. 311

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Національного університету харчових технологій за адресою: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 68

Автореферат розісланий “_05листопада 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради В.М.ПОВОДЗИНСЬКИЙ

Актуальність теми. Тенденцією сучасного ринку харчових продуктів є збільшення сектору натуральних та так званих “продуктів для здоров‘я”, або функціональних продуктів (А.А.Кочеткова, 1999; C.Stanton et al., 2001). За експертною оцінкою Міжнародної Молочної Федерації прогнозується, що ринок функціональних продуктів у Європі у 2003 році досягне 2,3-3,3 млрд. євро; значну частку в ньому складуть молочні продукти (Б.М.Двинский, 2000). Ці продукти характеризуються підвищеною біологічною активністю, яка нормалізує мікроекологічний статус організму споживача, завдяки чому успішно конкурують з лікарськими препаратами. Об'єктивним стимулом до створення функціональних продуктів є ріст захворювань, що пов‘язані з розладами нормальної мікрофлори, внаслідок нераціонального харчування, відмови від годування дітей материнським молоком, надмірного та неконтрольованого використання фармацевтичних препаратів, незадовільного стану довкілля, стресів тощо. Невтішна ситуація спостерігається в Україні. За даними Міністерства охорони здоров’я у 65 - 75% дорослого населення і близько 95% дітей нашої держави визначено дисбактеріози (Р.В.Богатирьова, 1998). Такий стан є загрозливим і вимагає найшвидшого вирішення. Одним із шляхів розв‘язання цих проблем є застосування функціональних продуктів нового покоління, що створюються на основі мікроорганізмів-пробіотиків. Асортимент функціональних продуктів на молочному ринку України доволі обмежений через відсутність адекватних заквашувальних препаратів і відповідних технологій. Все це вимагає глибокого наукового обґрунтування проблеми, кардинальних змін у виборі та оцінці заквашувальних культур мікроорганізмів, нових технологічних рішень щодо виробництва бактеріальних препаратів та продуктів з їхнім використанням. Отже, дослідження у цьому напрямку є актуальними і своєчасними.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась у межах 5 програм: Державної науково-технічної програми “Технологія виробництва дитячого, лікувального і профілактичного харчування” ДКНТ № 3.10.00 на 1993-1995 р. за темою “Розробити пробіотики на основі селекціонованих культур молочнокислих бактерій та розробити біотехнологію молочних продуктів для дитячого та спеціального харчування” реєстраційний номер проекту 03.11.00/012 К-95; Комплексної програми Міністерства сільського господарства та продовольства України “Продовольство-95” – “Розроблення технології одержання бактеріальних концентратів для виробництва ферментованих молочних продуктів безвідходної переробки м‘ясної і молочної сировини” ДР№ 0196U012880 і “Розроблення препаратів для заквашування, ферментованих молочних і м‘ясних продуктів для дитячого і спеціального харчування” ДР№ 0196U0012881; Науково-технічних програм УААН “Фундаментальні дослідження” на 1991-1995 рр. – “Створити сухі концентрати фізіологічно цінних мікроорганізмів для виробництва продуктів, що використовуються у тваринництві” ДР№ UA01003132, “Створення інформаційного банку даних про штами мікроорганізмів з метою ефективного забезпечення біотехнології переробки молока і м‘яса мікробними ресурсами” ДР 0196U003655 і “Розробити нові сухі продукти, збагачені мікрофлорою з високою біологічною активністю” ДР№ 0195U008333; “Переробка молока і м‘яса” (Наукове забезпечення розвитку м‘ясної та молочної промисловості) на 1996-2000 рр. – “Дослідити біологічну цінність компонентів і обґрунтувати технологічні параметри виробництва замінників незбираного молока зба лансованого складу” ДР№ 0196U012835, “Розробити технологію бактеріальних препаратів прямого внесення для ферментованих молочних продуктів” ДР№ 0198U000534; “Переробка молока та м‘яса” (Розробка сучасних технологій та обладнання для виробництва конкурентноздатних харчових продуктів переробки молока та м‘яса) на 2001-2005 рр. – “Розробити технологію нового кисломолочного продукту з біфідобактеріями” ДР№ 0100U002015.

Мета і завдання досліджень. Метою роботи було створення нових технологій бактеріальних концентратів і заквашувальних культур на основі мікроорганізмів-пробіотиків для сухих і рідких харчових і кормових молочних функціональних продуктів та біологічно активних добавок. Для досягнення поставленої мети як основні завдання роботи було визначено:

·

·

·

·

·

Об’єктами досліджень були штами молочнокислих, пропіоновокислих і біфідобактерій та їхні композиції; поживні та захисні середовища; бактеріальні препарати і заквашувальні культури, сухі та рідкі ферментовані молочні продукти. Предмет досліджень – біологічні та технологічні властивості культур біфідобактерій, молочнокислих та пропіновокислих бактерій, мікробіологічні та біохімічні показники розвитку заквашувальних штамів в монокультурі та в композиціях, активність та розчинність бактеріальних препаратів, мікробіологічні та фізико-хімічні показники сухих і ферментованих продуктів, функціональна активність готових продуктів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено аналіз промислових культур ТІММ за критеріями, які висуваються до пробіотиків, та сформовано колекцію перспективних до промислового використання у виробництві функціональних продуктів штамів молочнокислих, пропіоновокислих та біфідобактерій. Обґрунтовано та визначено стратегію пошуку штамів високої активності, яка регламентує джерело, умови, методи вилучення, критерії оцінки культур і їх промислову перспективність. Вперше показано (на 4 модельних системах) внесок поверхневих властивостей штамів молочнокислих та біфідобактерій у адгезію, що дозволило як експрес-метод для визначення адгезивних властивостей запропонувати фізичні моделі – гідрофобну та гідрофільну. Обґрунтовано шляхи розширення спектру функціональної активності заквашувальних культур – через модифікацію традиційних заквасок та створення нових оригінальних за складом композицій зі залученням пробіотичних штамів молочнокислих і біфідобактерій. Показано, що шляхом стандартизації середовищ за вмістом розчинного білка та вуглеводів, вибору способу культивування та режиму стабілізації одержаної біомаси можна регулювати її вихід, чисельність та активність молочнокислих бактерій і бактерій кишкового походження в напівсинтетичних поживних середовищах, що склало підґрунтя технологій заквашувальних препаратів прямого внесення. Визначено закономірності росту бактеріальних композицій, які містять біологічно активні шатами, показано необхідність застосування постадійного внесення інокуляту під час нарощування композицій, до складу яких залучено біфідобактерії. Узагальнено роль бактеріальних препаратів у технологіях функціональних харчових та кормових продуктів та визначено їхній вплив на якість продукту протягом всього терміну придатності.

Практичне значення одержаних результатів. Поповнено колекцію промислових організмів ТІММ 7 новими штамами, що задовольняють вимогам до пробіотиків, два з яких Bifidobacterium longum 352 та Lactobacillus acidophilus 7 захищено патентами. Вперше в Україні розроблено технологію синбіотичного функціонального кисломолочного напою, на основі гармонійного поєднання молочної ферментованої основи та фруктового соку з м‘якоттю і одержано принципово новий варіант продукту – питний. На підставі одержаних технологічних рішень затверджено 11 нормативних документів на виробництво бактеріальних концентратів АФ, АЛТ, БМК для сухих продуктів Лактовіт, заквашувальних культур прямого внесення Старт, СІ-2, БАТП-Ф, Біфідин і харчових продуктів з їхнім використанням: Добавка біологічно-активна йогурт сухий в капсулах, Біовіт і Фру-фру та кормовий – Біокорм. За результатами клінічної апробації розроблено та рекомендовано до впровадження у практику роботи дитячих профільних лікувальних закладів методику застосування бактеріального концентрату БМК та продукту Лактовіт білковий “Корекція стану колонізаційної резистентності піднебінних мигдаликів у дітей, які часто хворіють з хронічним тонзилітом” (Інформаційний лист МОЗ України за № 33-2000). Державним департаментом ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України затверджено та рекомендовано для господарств відповідного профілю Настанову по застосуванню Біфідину (№ 15-14/49 від 25.03.99) та Настанову по застосуванню продукту кормового Біокорм (№ 15-14/93 від 06.04.03).

Новизну та оригінальність бактеріальних композицій, технологій концентратів, заквашувальних культур та функціональних продуктів, створених під час виконання роботи, захищено 12 патентами. Розробка високоефективних технологій пробіотичних продуктів лікувально-профілактичного харчування була удостоєна премії УААН “За видатні досягнення в аграрній науці” 1999 року (витяг із Постанови Президії УААН від 10 березня 1999, № 6).

Виробництво заквашувальних препаратів та біологічно активної добавки впроваджено на Державному виробництві бактеріальних заквасок ТІММ, а кисломолочних продуктів – на молочних заводах України. Економічний ефект від впровадження технологій препаратів прямого внесення склав 19080 порцій на рік загальною вартістю 160272 грн. та 15-20 грн. з 1 т ферментованого продукту. Очікуваний економічний ефект цих технологій складе 500 тис. порцій на рік загальною вартістю близько 4 млн. грн. Обсяг випуску бактеріального концентрату для забезпечення виробництва таблеткованих продуктів Лактовіт складає 300 тис. лікувальних доз щорічно, що достатньо для оздоровлення біля 4 000 пацієнтів. Соціальний ефект від впровадження продуктів визначається оздоровленням населення шляхом нормалізації власної мікрофлори та профілактики дизбіозів, а також є запорукою збереження молодняка сільськогосподарських тварин.

Особистий внесок здобувача полягає в теоретичному аналізі проблеми, визначенні напрямку досліджень, організації виконання експериментальних досліджень, обробці та узагальненні одержаних результатів, у науковому обґрунтуванні технологічного процесу виробництва бактеріальних препаратів і окремих етапів технологій продуктів. Автором особисто або за безпосередньою участю підготовлено до публікації статті та патенти на винаходи, розроблено НД. Окремі фрагменти виконано у співавторстві: зі співробітниками ТІММ УААН к.б.н. О.М.Рожанською (селекційна робота), к.б.н. Г.Ф.Насировою (біохімічні властивості штамів та продуктів), н.с. О.В.Науменко (гідрофобні властивості та адгезію до скляних гранул); фахівцями НДІЄІХ АМНУ д.мед.н. О.І.Поліщук (антагоністична активність бактерій) і д.б.н. В.І. Загороньою (адгезія до клітинної лінії НЕр-2). Технології сухих таблеткованих продуктів серії Лактовіт розроблено н.с. Н.Г.Левитською (Н.Г.Макосій), ферментованих кисломолочних продуктів – к.т.н. Л.А.Шитовою, Л.А.Млечко та Л.В.Масіч, кормового продукту – к.т.н. Г.Б.Брік. Мікробіологічні параметри вищевказаних технологій визначені дисертантом. Автор висловлює подяку всім, хто допомагав у виконанні цієї дисертаційної роботи.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідались та обговорювались на Всеукраїнській науково-технічній конференції "Розробка та впровадження прогресивних технологій та обладнання у харчову та переробну промисловість", 17-20 жовтня 1995 р., Київ; Міжнародній науково-технічній конференції “Розроблення та впровадження прогресивних ресурсоощадних технологій та обладнання в харчову та переробну промисловість”, 21-24 жовтня 1997 р., м. Київ; ІІ-й конференції Асоціації дитячих лікарів України “Лікувально-профілактичне харчування та пробіотики в педіатрії” 1-3 червня 1998 р. м. Київ; Міжнародній науково-технічній конференції “Проблеми та перспективи створення та впровадження нових ресурсо- та енергоощадних технологій, обладнання в галузях харчової та переробної промисловості”, УДУХТ, 1999р., Київ; Науково-практичній конференції “Наука для молочної промисловості”, 1-3 жовтня 2002 р., м. Київ та Науково-практичній конференції “Актуальні питання гігієни харчування та безпечності харчових продуктів”, 24-25 квітня 2003 р., м. Київ.

Публікації результатів дисертаційної роботи включають 29 статей, у тому числі 19 у фахових виданнях, 12 тез і матеріалів конференцій та 12 патентів.

Обсяг і структура роботи. Дисертаційна робота складається з вступу, 6 розділів, висновків, списку літератури (434 джерела) та 6 додатків. Зміст роботи викладено на 287 сторінках машинописного тексту, включає 71 таблицю (4 на окремих сторінках), 58 рисунків (16 на окремих сторінках).

ЗМІСТ РОБОТИ

У Вступі висвітлено стан проблеми та її актуальність, сформульовано мету та завдання досліджень, викладено наукову новизну і практичне значення результатів, відображено їхню апробацію, окреслено особистий внесок здобувача, структуру та обсяг роботи.

Розділ 1 присвячено аналітичному огляду літератури стосовно медико-біологічних аспектів функціонального харчування, ролі та значенню молочнокислих та біфідобактерій у ньому. Висвітлено сучасні технології бактеріальних препаратів та молочних функціональних харчових і кормових продуктів, розглянуто харчову цінність та терапевтичні властивості пробіотичних продуктів. Визначено пріоритетні напрями розробки функціональних продуктів.

Розділ 2 відображує методологічні аспекти роботи – містить схему проведення досліджень (рис. 1), відомості стосовно об'єктів та предмету досліджень, характеристику використаних мікробіологічних, технологічних, біохімічних та статистичних методів досліджень.

Розділ 3 містить результати експериментальних досліджень щодо відбору і властивостей функціонально активних штамів молочнокислих та біфідобактерій з колекції промислових мікроорганізмів ТІММ УААН і вилучених із біологічного матеріалу від людини та тварин. За основні критерії оцінки придатності культур молочнокислих, пропіоновокислих та біфідобактерій як компонентів майбутніх бактеріальних препаратів було взято біологічну активність, що забезпечує пробіотичний ефект, та необхідні технологічні параметри.

Колекція промислових культур ТІММ представлена культурами, які використовуються у виробництві різноманітних ферментованих молочних продуктів, і належать до родів Lactococcus, Streptocococcus, Lactobacillus, Bifidobacterium і Propionibacterium. Вона формувалася з різних за

Рис. 1. Схема проведення досліджень

ФП – функціональні продукти, БК – бактеріальні концентрати, ЗК – заквашувальні культури,

МКБ – молочнокислі бактерії, ББ – біфідобактерії, БАД – біологічно активні добавки

походженням мікроорганізмів, відбір яких раніше здійснювали лише за технологічними властивостями, не приділяючи належної уваги функціональному потенціалу. Однак деякі з основних характеристик штамів, такі як стійкість до жовчі, HCl, фенолу, відношення до кислого та лужного середовища, можна використати для попередньої оцінки щодо перспективності застосування культур у виробництві функціональних продуктів. Загалом, скринінг 85 промислових штамів за цими ознаками показав, що 70% від їхньої загальної кількості були резистентними до рН 3 та 0,3% фенолу, 65% – до 40% медичної жовчі, 31% – до 4,5 % NaCl і 29 % – до рН 9,6. Переважна кількість музейних штамів була стійкою до 1 або 2 інгібіторів і лише одиниці – до 3 і більше. Як найстійкіші було відібрано наступні культури: L.lactis subs. lactis 45, L. lactis subs. lactis bv. diacetilactis 19, S. salivarius subsp. thermophilus 36-8, 27с, 74 i 30, Lb. casei 3300 та Lb. acidophilus 20у, 38, 43с, 5DC а серед біфідобактерій – B. adolescentis 4400 B. bifidum 4101, B. longum 4200 та P.freudenreichii subs. shermanii H-110.

У результаті цілеспрямованого відбору штамів із біологічного матеріалу ротової порожнини і кишечника дітей та телят, було вилучено близько 150 ізолятів, з яких на підставі попереднього аналізу властивостей було відібрано як перспективні наступні штами: L. lactis subsp. lactis 3/1, Lb. casei subsp. casei 3301, S. salivarius subsp. thermophilus 66, СТ-4 та 381, Lb. acidophilus 3112, Lb.delbrueckii subsp. bulgaricus 40, B. longum 4201 (352), B. infantis 4300 та B. animalis 135. Детальнішу оцінку функціональної активності in vitro проводили за антагоністичною і адгезійною активностями, жовчо- і кислоторезистентністю, здатністю до декон‘югації жовчних кислот та асиміляції холестерину.

Аналіз відібраних виробничих і виділених із біологічних об‘єктів штамів, за антагоністичною активністю показав, що не всім їм притаманна антимікробна дія. Найбільшу частку антагоністів встановлено серед штамів видів Lb. acidophilus, P.freudenreichii ssp. shermanii і Bifidobacterium sp. (60-100 %), менше їх було серед досліджених штамів S. thermophilus і Lb. bulgaricus. (20-60 %) Кількість штамів-антагоністів серед обстежених молочнокислих бактерій була неоднаковою. Кожен із них мав свій характерний спектр дії відносно тест-культур патогенних і умовно патогенних мікроорганізмів. Найчутливішими до досліджених лактобактерій були E.сoli, розвиток яких пригнічувався 15 штамами із 22 досліджених, тоді як ріст інших тест-культур стримувався 8-11 штамами (табл. 1).

Біфiдобактерії пригнічували від 70-85 % тест-культур, в тому числі небезпечний патоген Campylobacter sp. Прояв антибактеріальної активності пропіоновокислих бактерій був дещо слабшим – 64-80 % тест-культур. Визначено, що оцінку антибактеріальної дії біфідобактерій та пропіновокислих бактерій доцільніше проводити за методом спільного культивування з тест-культурами.

Вивчено адгезію молочнокислих та біфідобактерій у чотирьох модельних системах, які імітували неспецифічну взаємодію з гідрофільною і гідрофобною поверхнями та специфічну – з тканинною лінією клітин епідермоїдної аденокарциноми гортані людини НЕр-2 та ентероцитами свиней (табл. 2).

Таблиця 1

Частка штамів-антагоністів серед виробничих культур молочнокислих

бактерій

Вид та підвид | Число штамів | Кількість штамів-антагоністів | E.

coli | Bac.

subtilis | Ent. cloaceae | St. aureus | Ps. aerugi-nosa | Pr. vulgaris | S. salivarius ssp. thermophilus | 7 | 4 | 2 | 4 | 2 | 3 | 3 | L. lactis ssp. lactis | 5 | 3 | 2 | 2 | 1 | 1 | 2 | Lb. acidophilus | 5 | 5 | 5 | 3 | 5 | 5 | 5 | Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus | 5 | 3 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | Bifidobacterium sp. | 5 | 3 | 3 | 3 | 5 | 3 | 3 | P. freudenreichii ssp. shermanii | 4 | 3 | 4 | 2 | 4 | 4 | 3 |

Таблиця 2

Адгезія молочнокислих та біфідобактерій у різних модельних системах

Культура | Неспецифічна адгезія, % | Специфічна, ІА

н-гексадекан | скляні гранули | НЕр-2Ентероцити*)S. thermophilus | Т-95 | 11,72,4 | 11,70,3 | 0,990,14 | 3,201,70 | 27с | 7,81,6 | 12,21,0 | 0,660,18 | 11,201,40 | E, faecium | K-77 | 10,80,9 | 5,90,9 | 1,120,10 | 5,222,17 | L. lactis | 3 | 7,00,1 | 7,10,6 | - | 3,200,61 | Lb. acidophilus | 20y | 27,21,6 | 25,80,6 | 2,560,78 | 0,110,00 | 38c | 14,61,2 | 43,41,3 | 1,290,57 | 0,310,01 | 3500 | 10,21,2 | 43,01,4 | 0,360,18 | - | Lb. bulgaricus | 40y | 37,92,1 | 54,81,3 | - | - | B. bifidum | 4101 | 7,40,1 | 11,31,8 | 1,960,72 | 2,860.51 | B. longum | 352 | 4,00,4 | 12,91,9 | 2,190,24 | 3,200.61 | *) Адгезія молочнокислих бактерій до ентероцитів свиней досліджена науковцями ІМВ НАУ в межах договору № 18-93.

Внесок фізико-хімічних властивостей поверхні клітин у адгезію культур оцінювали на підставі коефіцієнту кореляції. Встановлено, що між гідрофобністю поверхні молочнокислих та біфідобактерій і адгезією до скляних гранул, гідрофобністю та адгезією до клітинної культури НЕр-2 існує відносно тісний зв‘язок (r = 0,64 та r = 0,75, відповідно; n = 13, p< 0,01), тоді як між гідрофобністю та адгезією до ентероцитів свиней спостерігали менш тісну і до того ж від‘ємну кореляцію – r = -0,57.

Таку закономірність визначали і для результатів, отриманих у фізичній та біологічних моделях – коефіцієнти кореляції між адгезією до скляних гранул і НЕр-2 та до скляних гранул і ентероцитів, склали, відповідно, r = 0,52 (n = 9, р < 0,05) та r = –0,54 (n = 8, p < 0,05). На підставі цих досліджень запропоновано як експрес-метод для попередньої оцінки адгезійних властивостей штамів молочнокислих та біфідобактерій використовувати простіші фізичні моделі зі скляними гранулами або з гідрофобним матеріалом (н-гексадекан).

Здатність досліджених лактобацил до закріплення на клітинній лінії НЕр-2 – досить цікавий факт, з огляду щодо функціонального впливу на макроорганізм. Колонізуючись на епітелії гортані, лактобацили формують перший захисний бар‘єр на шляху патогенів, особливо при ЛОР-інфекціях. Це припущення знайшло практичне підтвердження у клінічній практиці під час лікування хронічних тонзилітів препаратом БМК, що містить штам Lb. acidophilus 20у.

Кислотостійкість також є однією із обов‘язкових ознак, за якими вибирають штами-пробіотики. З одного боку, це протидія шлунковому соку, а з іншого – кислому середовищу ферментованого продукту. Відомо, що кислотність у шлунку визначається НСl і досягає рН 3 та нижче. В середньому, їжа знаходиться в ньому протягом 1-3 год. Кислотність кисломолочних продуктів зазвичай складає рН 4,3-4,6 і під час зберігання може істотно знизитися. З огляду на це, для максимального наближення до реальних умов було обрано наступні умови лабораторних досліджень: для НСl – рН 2 і 3, тривалість експозиції 0-5 год, для молочної кислоти – рН 3 і 4 і 0-24 год. Обрані умови є жорсткішими за реальні, що дозволяє оцінити потенціальні можливості життєздатності під час транзиту через шлунок та зберігання ферментованого продукту.

Встановлено, що обстежені штами істотно розрізнялися за стійкістю до соляної кислоти – у момент підкислення ферментованого ними молока до рН3 і рН2 гинуло від 8 до 69% клітин популяцій. Найвразливішими серед них були S.thermophilus V-2 і Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus 40 – виживало 31-35 і 40-44 % клітин, відповідно, а найстійкішими – штами Lb. acidophilus, втрати яких склали 10-14% і 50 – 45% за рН 3 і рН 2, відповідно. Штам ентерококів E. faecium K77, який є кишковим за походженням, під час першого контакту з HCl втрачав більше половини клітин популяції. Стійкішими до соляної кислоти виявилися біфідобактерії – лише 2,3–13% втрачених клітин. Для них не спостерігали істотних розбіжностей між окремими штамами за кількістю клітин, що вижили за рН 3 і рН 2.

Під час експозиції культур протягом 3 год у присутності HCl за рН 3 всі обстежені культури, за винятком штамів термофільних стрептококів 381, 66 і Т -95 та Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus 40y, не втрачали своєї життєздатності Таку поведінку спостерігали і за рН 2. Помічено, що швидкість відмирання клітин стрептококів за рН 2 була меншою, ніж за рН 3, що, можливо, є наслідком елімінації чутливих особин популяції на час першого контакту з кислотою, в результаті якої залишалися лише найстійкіші бактерії. Що стосується ентерококів і біфідобактерій, то за 5 год експозиції у присутності HCl вони втрачали від 2 до 7% клітин.

Чутливість молочнокислих бактерій до молочної кислоти була меншою і втрати популяцій в результаті підкислення до рН 4 і рН 3 склали для штаму Lb.delbrueckii subsp. bulgaricus 40 1-3 % та для термофільних стрептококів – 5-10% від початкової кількості клітин. Переважна кількість культур термофільних стрептококів протягом 24 год експозиції за рН 4 втрачала не більше 25 % клітин, за винятком штаму V-2 (гинуло 77 % життєздатних клітин). Ентерокок E. faecium К-77 за цей термін втратив близько 50 % своєї популяції. Збільшення концентрації молочної кислоти до рН 3 згубно впливало на життєздатність стрептококів і за 24 год відмирало від 73 до 90% клітин. Лактобацили за цих умов були істотно стійкішими. Вони добре зберігалися за рН 4 , а за рН 3 втрачали біля 50 % своєї популяції. Досліджені штами біфідобактерій були доволі стійкими до молочної кислоти за рН 4, тоді як збільшення концентрації молочної кислоти до рН 3 було згубним для них. В середньому, протягом доби за рН 4 і рН 3 відмирало, відповідно, біля 60% і 80% від вихідної кількості клітин мікроорганізмів.

Одним із проявів функціональної активності молочнокислих та біфідобактерій є здатність до нормалізації рівня холестерину. У лабораторних умовах вона оцінюється, зазвичай, за стійкістю до жовчі, здатністю до декон‘югації та асиміляції жовчних кислот. Результати досліджень показали істотні коливання цих показників як між видами, так і між окремими штамами (табл. 3).

Таблиця 3

Резистентність до жовчі, здатність до декон‘югації та асиміляції жовчних кислот молочнокислими і біфідобактеріями

Культура | Стійкість до жовчі, Сінг., % | Декон‘югація,

моль /мл | Асиміляція,

% | S. thermophilus 27c | 0,490,020,370,0137,70,1 36-8 | 0,440,030,310,0228,80,3 CT-4 | 0,870,011,380,0347,30,2L. lactis 3/1 | 0,470,011,000,0444,91,3Lb. acidophilus 20y | 0,860,031,480,0238,20,4 38c | 0,590,031,440,0137,70,5Lb. bulgaricus 40y | 0,540,011,140,0127,40,8E. faecium K-77 | 0,420,020,510,0124,30,8B. bifidum 4101 | 0,970,031,470,0146,80,6B. longum 352 | 0,870,010,150,0217,30,1B. adolescentis 4401 | 0,780,021,620,0150,90,7B. animalis 135 | 0,970,011,540,0132,10,4B. infantis 4301 | 0,97-,011,550,0233,40,5 |

Показано, що між стійкістю до жовчі та здатністю до декон‘югації жовчних кислот простежується взаємозв‘язок (r = 0,57; n = 14, p < 0,05). Водночас зміна вмісту холестерину в культуральній рідині під дією досліджених штамів практично не залежала від жовчостійкості (r = 0,23; n = 14, p < 0,05), тоді як зі здатністю до декон‘югації жовчних кислот встановлено зв‘язок на рівні r = 0,60 (n = 14, p < 0,05). Це свідчить про те, що під час пошуку перспективних до зниження холестерину штамів ліпше порівнювати їх за здатністю до декон‘югації.

Молочнокислі та біфідобактерії – це анаеробні мікроорганізми, що ускладнює їхнє промислове використання. Однак серед них зустрічаються аеротолератні форми, пошук яких є необхідним під час відбору промислових штамів. Нововиділені з кишечника штами молочнокислих бактерій вже після декількох пасажів звикали до кисню і добре розвивалися у його присутності. Втрати популяції МКБ в аеробних умовах складали не більше 5% у порівнянні з анаеробним культивуванням і 15-25% – за інтенсивної аерації, а біфідобактерій та пропіоновокислих бактерій – 6-24 % і 21-33 %, відповідно. За інтенсивної аерації гинуло 38-55 % біфідобактерій і 40-62% пропіоновокислих бактерій. У присутності кисню в популяціях біфідобактерій спостерігали інволютні форми (роздуті, подовжені тощо), а також зруйновані клітини (помічено стрілками на рис. 2).

а б

Рис. 2. Морфологія біфідобактерій B. longum 352 у анаеробних умовах (а) і

за інтенсивної аерації (б)

(середовище Блаурокк, збільшення 100х10)

Морфологія молочнокислих та пропіновокислих бактерій в аеробних умовах не змінювалася. Аеротолерантні штами було відібрано як перспективні для промислового використання.

Обстежені культури мали значний технологічний потенціал, здатний забезпечити необхідний перебіг технологічного процесу, якість кінцевого продукту та його стабільність під час зберігання (табл. 4).

Таблиця 4

Характеристика біотехнологічних властивостей відібраних штамів молочнокислих, пропіоновокислих та біфідобактерій

Вид | Топт.

оС | Урожай-ність у молоці,

*108 КУО/мл | Кількість молочної кислоти,

% | -галактози-дазна активність

103 од./мл | Ліполітична активність, 10-7

нМ.хв-1мл-1КУО-1 | L. lactis subs. lactis25-30 | 17,4-20,0 | 0,52-0,65 | 0,35-0,51 | 0,22-0,23 | L. lactis subs. lactis bv. diacetilactis25-27 | 10,5-12,1 | 0,48-0,50 | 0,30-0,42 | 0,99-1,15 | S. salivarius subsp. thermopilus35-40 | 6,4-15,0 | 0,68-0,90 | 0,16-1,82 | 4,95-15,50 | Lb. acidophilus | 35-43 | 5,6-7,4 | 1,37-1,55 | 1,33-2,76 | 6,62-44,45 | Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus38-45 | 6,8-7,8 | 1,35-1,60 | 2,25-2,38 | 8,05-10,91 | B. animalis | 37-45 | 4,2-5,0 | 0,25 | 0,05-0,07 | н.в.*)B. adolescentis | 37-42 | 5,4-6,7 | 0,12 | 0,01-0,02 | н.в. | B. bifidum | 37-40 | 3,10-3,15 | 0,20 | 0,05-0,06 | 0,22-0,49 | B. infantis | 37-40 | 1,10-2,25 | 0,15 | 0,02-0,03 | н.в. | B. longum | 37-42 | 1,00-1,25 | 0,31 | 0,05-0,08 | 0,58-0,76 | P.freudenreichii subs. shermanii | 30-35 | 1,65-4,60 | - | н.в. | н.в. | *) “н.в.” – не визначали.

У цьому розділі також подано результати досліджень динаміки розвитку перспективних штамів молочнокислих, пропіоновокислих та біфідобактерій у молоці та відповідних лабораторних і промислових середовищах. Визначено основні кінетичні параметри росту (питому швидкість, тривалість латентного періоду і фази логарифмічного росту, термін регенерації та ін.), які використано при створенні бактеріальних композицій та виборі способу і умов культивування.

У цілому, відібрані нами штами характеризуються високим біотехнологічним потенціалом. Це дає підстави очікувати, що залучення їх до складу бактеріальних препаратів або заквашувальних культур розширить спектр функціональної активності цільового продукту та забезпечить стабільність перебігу технологічних процесів.

Розділи 4-6 відображають результати теоретичних та експериментальних досліджень щодо розроблення технологій бактеріальних препаратів і продуктів з використанням мікроорганізмів високої біологічної активності. При цьому розділ 4 присвячено розробці технологій бактеріальних концентратів для сухих функціональних продуктів, призначених для нормалізації індигенної мікрофлори кишечника та попередження дисбактеріозів у дітей і дорослих, розділ 5 – технологіям заквашувальних культур для ферментованих функціональних продуктів, а розділ 6 – технологіям бактеріального препарату та кормового продукту для сільськогосподарських тварин.

На підставі теоретичного положенням щодо провідної ролі молочнокислих та біфідобактерій у регулюванні структури нормального мікробного ценозу кишечника людини обґрунтовано склад бактеріальних композицій для сухих і рідких функціональних продуктів, визначено методологію та способи одержання бактеріальних концентратів та продуктів у залежності від використаних мікроорганізмів та сфери їхнього застосування. Зокрема, бактеріальні композиції створювали на міжвидовій, багатоштамовій основі з використанням молочнокислих, пропіоновокислих і біфідобактерій, відібраних за критеріями, що висуваються до пробіотиків та з урахуванням синергізму біологічної активності. Як основний напрям функціональної активності бактеріальних композицій було визначено нормалізацію власної мікрофлори кишечника та попередження дисбактеріозів у дітей і дорослих.

Технологічний процес виробництва бактеріальних препаратів проводили за загальною схемою: підготовка поживного середовища для нагромадження біомаси, підготовка посівного матеріалу, нагромадження біомаси, охолодження та відокремлення біомаси від культуральної рідини, змішування із захисним середовищем та сублімація, подрібнення і фасування готового бактеріального препарату. Кожен із цих обов‘язкових етапів мав свої особливості, які визначалися індивідуальними властивостями культур мікроорганізмів та цільовим призначенням препарату.

Розділи 4-6 завершуються клінічним підтвердженням функціональної активності кінцевих продуктів і даними стосовно впровадження у промисловість.

Для забезпечення технологій сухих продуктів було створено 3 бактеріальні композиції з високим рівнем антагоністичної активності: АЛТ – на основі молочнокислих бактерій, що використовуються для виробництва класичних ферментованих продуктів (L. lactis 3, S. thermophilus штами 36-8 і 27с, Lb.acidophilus штами 20у і 38с, АФ – лактобацил і кишкового ентерококу (Lb.acidophilus 20у, E. faecium К-77) та БМК – молочнокислих і біфідобактерій (B.longum 352, S. salivarius ssp. thermophilus 27с і Lb. acidophilus 20у). Ці види мікроорганізмів є типовими представниками нормальної мікрофлори кишечника людини, характеризуються необхідною біологічною активністю та технологічністю. Антагоністичний потенціал композицій був високим, що зможе протидіяти збудникам кишкових інфекцій (табл. 5).

Таблиця 5.

Антагоністична активність композицій АЛТ, АФ і БМК

Тест-культура | Розмір зони затримки росту, мм | АЛТ | АФ | БМК | Escherichia coli 055

0111

0124 | 15±3

13±1

12±1 | 14±1

102

>25 | 15±3

13±1

29±1 | Yersinia enterocolitica 103 | >30 | 22±1 | 293 | Enterobacter aerogenes 418 | 10±2 | 13±2 | 10±2 | Bacillus prodigiosum 8 | 15±3 | 15±3 | 15±3 | Bacillus rettgeri | 16±1 | 18±1 | 16±1 | Pseudomonas aeruginosa | 23±3 | 22±4 | 23±3 | Proteus vulgaris HX 31/37 | 15±1 | 17±2 | 15±1 | Staphylococcus aureus Wood | 17±4 | 16±0 | 18±2

Salmonella typhimurium | 102 | 11±3 | 124 | Shigella dysenteriea 720 | >35 | >35 | >30 | Shigella flexneri 2a 176 | >30 | >30 | >32 | Сampilobacter jejuni 447 | 321 | 362 | 322 | С. jejuni 448 | 291 | 312 | 303 | C. laridis 442 | 311 | 301 | 233 | Примітка: Результати достовірні при p=0,05.

Використання бактеріальних концентратів АЛТ, АФ, БМК як функціональних збагачувачів сухої харчової основи вимагало забезпечення таких технологічних характеристик як високої концентрації живих клітин мікроорганізмів в одиниці біомаси та її негігроскопічності.

Під час розроблювання технології бактеріального концентрату АЛТ, складники якого розрізняються за ростовими параметрами, температурними і рН-оптимумами, необхідно було вирішити питання щодо узгодження росту мікроорганізмів композиції, визначити оптимальні режими розкислення та температуру культивування. Для нагромадження біомаси композиції АЛТ ефективним виявилося поживне середовище на основі молочної сироватки (гідролізованої та освітленої) з додаванням буферних солей, факторів росту і мікроелементів. Кількість інокуляту не перевищувала 3-5%. Співвідношення між окремими видами молочнокислих бактерій в інокуляті, визначене з урахуванням ростових і фізіологічних особливостей кожного із складників, було 2:1:1, відповідно, для L. lactis, S.thermophilus та Lb. acidophilus, оптимальна температура росту 37 оС і кислотність – рН 6,5. За цих режимів протягом 10-12 годин нагромаджували 1-5*109 КУО/см3. Одержану біомасу після відокремлення від культуральної рідини, змішували з захисним середовищем, що містить цукрозу, цитрат натрію або амоній фосфорнокислий, у співвідношенні 1:1, заморожували і сушили методом сублімації за наступних режимів: початкова температура мінус (25-30) оС і кінцева – плюс (30-35) оС.

Для розвитку композиції АФ використовували збалансоване за основними компонентами поживне середовище на основі гідролізованого протосубтиліном знежиреного молока з додаванням 1% цитрату натрію, 1% кукурудзяного екстракту (КЕ), 1% сухого знежиреного молока (СЗМ) та 0,0164% марганцю сірчанокислого. Такий склад середовища забезпечив вдвічі вищий вихід біомаси, ніж при використанні середовища на основі молочної сироватки.

Найліпші результати отримано за співвідношення між ентерококами та лактобацилами в інокуляті як 9:1. Складники композиції розвивалися з однаковою швидкістю (макс = 0,40 год-1) за рН 6,5 і температури 37оС, тоді як за рН 6,0 перевагу здобували ацидофільні палички, а за рН 7,0 домінували ентерококи (рис. 3).

Рис. 3. Динаміка росту культури АФ за різного рН культуральної рідини

1 – рН 6,0; 2 – рН 6,5; 3 – рН 7,0

Білі маркери – E.faecium,

сірі – Lb. acidophilus

Режим розкислення культуральної рідини до рН 6,5 може бути безперервним або періодичним (через кожні 3 години росту). Склад захисного середовища, його співвідношення з біомасою та режими сушіння були ті самі, як і для АЛТ.

Опрацьовані режими забезпечили вихід сухих бактеріальних концентратів АЛТ і АФ на рівні 6,0-6,5 г/л. Одержані препарати мають вигляд однорідної порошкової маси кремового або світло-коричневого кольору без запаху, солодкуватої на смак і характеризуються високим вмістом мікроорганізмів та активністю ( табл. 6).

Таблиця 6

Характеристика бактеріальних концентратів АЛТ і АФ

Показник | АЛТ | АФ

Загальна чисельність МКБ, х1011 КУО/г, в тому числі | 9,30,8 | 8,41,4 | лактококів | 8,60,5 | - | E.faecium- | 7,51,1 | лактобацил | 0,60,3 | 0,70,1 | Активність (1г/л молока, 37оС): | - за кислотністю через 3 год оТ | 322 | 355 | - за терміном згортання молока, год | 5,00,5 | 7,01,5 | Вологість, % | 5,0

Визначення технологічних параметрів виробництва бактеріального концентрату БМК проводили із розрахунку концентрації біфідобактерій, термофільних стрептококів і ацидофільних паличок не менше 1010, 109 і 108 КУО/г сухого бактеріального концентрату що відповідає природному співвідношенню між цими групами у кишечнику. Залучення до складу композиції таких технологічно складних об‘єктів як біфідобактерії істотно ускладнювало процес одержання бактеріального концентрату. Склад поживного середовища, яке задовольняло потреби кожного з компонентів цієї композиції, був наступним: протосубтиліновий гідролізат СЗМ, 0,5 % лактози, 5 % цитрату натрію, 0,05 % сірчанокислого заліза (закисного) і 2% кукурудзяного екстракту (КЕ) як стимулятора росту та 0,5 % глюкози, 0,1 % відновленого СЗМ і 0,005% аскорбінової кислоти як оксиданта для зниження ОВП.

Штами, що входять до складу БМК, істотно розрізнялися за ростовими характеристиками. Це обумовило рішення стосовно застосування постадійного внесення інокуляту. Однак за певного співвідношення між складниками композиції можливо також і їх одночасне нарощування. У першому разі культивування вели у дві стадії. Спочатку вносили біфідобактерії у кількості 5 об.%, вирощували їх до досягнення максимальної швидкості росту, тоді додавали лактобацили та стрептококи по 1 об.% кожного штаму і продовжували культивувати до кінця логарифмічної фази росту. У варіанті зі спільним культивуванням у поживне середовище вносили інокулят, який містив всі складники композиції БМК у кількості 5 і 0,01 і 0,005 об.%, відповідно біфідобактерій, термофільних стрептококів та лактобацил. Таке вихідне співвідношення між культурами забезпечувало розвиток складників композиції БМК до однакового фізіологічного стану (рис. 4).

а б

Рис. 4. Розвиток культури БМК у процесі постадійного (а) і одночасного (б) способах нагромадження біомаси

В – біфідобактерії, T – термофільні стрептококи, A – лактобацили

Нагромадження біомаси БМК здійснювали за температури 37 оС і постійного контролю кислотності на рівні рН 6,8. Обидва способи культивування забезпечували високий вміст біфідобактерій – від 6,7.108 до 6,9.108 КУО/мл та молочнокислих бактерій – (1,0-2,75).107 КУО/мл культуральної рідини.

Із досліджених 8 захисних середовищ як найефективніше було відібрано середовище на основі освітленої молочної сироватки із додаванням сахарози, цитрату натрію та гліцерину. Його використання забезпечувало виживання 89-95% клітин та стабільність чисельності складників БМК протягом 6 місяців зберігання за