АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ГЕМАТОЛОГІЇ ТА ТРАНСФУЗІОЛОГІЇ

КАРНАБЕДА Оксана Андріївна

УДК 616.155.392-036.12:616.155.392.2-036-08

КЛІНІКО-ГЕМАТОЛОГІЧНІ ТА ІМУНОФЕНОТИПОВІ ОСОБЛИВОСТІ У ХВОРИХ НА В-КЛІТИННИЙ ХРОНІЧНИЙ ЛІМФОЛЕЙКОЗ У ПІСЛЯЧОРНОБИЛЬСЬКИЙ ПЕРІОД

14.01.31-Гематологія та трансфузіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

КИЇВ-2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Київській медичній академії післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України

Науковий керівник:

доктор медичних наук, професор Гайдукова Світлана Миколаївна, Київська медична

академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України, завідувач кафедри гематології

та трансфузіології

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Третяк Наталія Миколаївна

Інститут гематології та трансфузіології АМН України, м. Київ

Завідувач відділення захворювань системи крові з групою клінічної біохімії

доктор медичних наук Базика Дмитро Анатолійович

Інститут клінічної радіології Наукового центру радіаційної медицини АМН України,

м. Київ, завідувач відділу клінічної імунології

Провідна установа: Інститут онкології АМН України, м. Київ

Захист відбудеться "21 "жовтня” 2003р. о "14" год. "30" хв.

На засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.612.01 в Інституті гематології та трансфузіології АМН України ( 04060, м. Київ, вул. Берлинського, 12)

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту гематології та трансфузіології АМН України (04060, м. Київ, вул. Берлинського, 12)

Автореферат розісланий "8 "вересня 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Коміссаренко В.Г.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Незважаючи на велику кількість досліджень, присвячених вивченню В-клітинного хронічного лімфолейкозу (В-ХЛЛ), залишається невирішеною та дискутабельною значна частина питань, таких як невизначеність клінічного перебігу, пов'язаного з неоднорідністю захворювання, термін початку лікування, тактика лікування та прогноз у цілому. Недостатньо вивчені особливості клінічного перебігу В-ХЛЛ під впливом негативних факторів, зокрема радіаційного.

За даними постанови Кабінету Міністрів України 2/3 території Київської області після аварії на Чорнобильській атомній електростанції (ЧАЕС) було забруднено радіоактивними опадами з тривалим періодом піврозпаду, які обумовлюють додаткове опромінення населення цих територій протягом багатьох років. В теперішній час злоякісні новоутворення лімфоїдної і кровотворної тканин, в тому числі і В-ХЛЛ, офіційно вважаються МОЗ України захворюваннями, що можуть бути пов'язані з впливом радіації. Результати проведеного епідеміологічного дослідження свідчать про зростання за період після аварії захворюваності на ХЛЛ серед осіб, які постраждали у період з 1987 по 1991 рік (Присяжнюк А.Е. и соавт.,1999). За даними досліджень окремих авторів В-ХЛЛ у хворих, які зазнали несприятливого впливу факторів Чорнобильської аварії, характеризувався агресивністю, швидким прогресуванням та рефрактерністю до стандартної хіміотерапії (ХТ), що, можливо, пов'язано з особливостями їх біологічних властивостей, але патогенетичні механізми залишаються ще не з'ясованими (Клименко В.І. і співавт., 2002; Глузман Д.Ф. и соавт., 2000). Проте дані літератури стосовно особливостей морфологічної картини пухлинного клону, імуноцитохімічних характеристик лімфоїдних клітин у хворих на В-ХЛЛ, які постраждали внаслідок аварії на ЧАЕС, що визначають перебіг захворювання, діагностичну та лікувальну тактику, малочисельні та інколи суперечливі (Клименко В.І. і співавт.,2002; Глузман Д.Ф. и соавт.,2000; Базыка Д.А. и соавт.,1998).

Відомо, що за своїм перебігом і клінічними проявами В-ХЛЛ є неоднорідним. Є випадки, коли у хворих на В-ХЛЛ в аналізі периферичної крові зустрічаються пролімфоцити (10-15%), великі лімфоцити та лімфобласти (1-2%) (Яхнина Е.И. и соавт., 1997; Oscier D.G. et al., 1997). Описані поодинокі дослідження В-ХЛЛ з експресією окремих активаційних та мієломоноцитарних антигенів на лімфоїдних клітинах, але без співставлення із клінічними особливостями перебігу захворювання (Голенков А.К. и соавт., 1998; Molica S. et al., 1993; Desablens B. et al., 1998). Імунофенотипічні особливості лімфоїдних клітин при В-ХЛЛ вивчались, головним чином, для розробки методів діагностики і диференційної діагностики різних форм хронічних лімфопроліферативних захворювань (ХЛПЗ) без співставлення із клінічними і морфоцитохімічними особливостями В-ХЛЛ. Недостатньо вивчені особливості перебігу різних клінічних форм В-ХЛЛ та прогностичні критерії, що дозволило б передбачати розвиток перебігу хвороби та визначати тактику лікування. Окрім того, є дані про значення географічної і расової розбіжностей щодо характеру перебігу і частоти В-ХЛЛ (Воробьев А.И. и соавт.,2000; Tamura K. et al., 2001 ).

В останні роки В-ХЛЛ розглядають як захворювання, пов`язане, передусім, не з прискореною проліферацією клітин пухлинного клону, а зі зниженням його чутливості до запуску програми апоптозу (Возианов А.Ф. и соавт., 1998; Выговская Я.И. и соавт., 2002; Giordano M., 2000). Серед рецепторів, які регулюють життєвий цикл лімфоцитів, є мембранний білок CD95/FAS/APO-1(Виговська Я.І. і співавт.,2002; Полосухин Е.Р. и соавт., 2000; Кузнецов С.В., 1998). Сьогодні інтенсивно вивчається патогенетична роль і прогностична вагомість експресії молекул апоптозу CD95 на поверхні пухлинних клітин при В-ХЛЛ (Митина Т.А. и соавт., 1996; Возианов А.Ф. и соавт., 1998; Novak V.L. et al., 1998; Williams J.F. et al., 1999).

Лікування В-ХЛЛ сьогодні розглядають із позиції індукції апоптозу (Воронцова А.Л., Кудрявец Ю.И., 2002; Червонобаб Ю.В.и соавт., 2000). Провідне місце серед природних регуляторів програмованої клітинної смерті посідають цитокіни, а саме - інтерферони (ІФН) (Возианов А.Ф. и соавт., 1998; Ветра Я.Я. и соавт., 2000; Jewell A.P., 1996). Відомо, що природний ІФН-альфа (ІФН-?) є агентом, що здійснює антипроліферативну, імуномоделюючу і антивірусну дію. У доступній літературі ми не зустріли даних стосовно застосування ІФН-? при В-ХЛЛ залежно від клінічного перебігу хвороби. Залишаються невирішеними і дискутабельними питання терміну початку лікування та тактики ведення хворих на В-ХЛЛ у ранніх стадіях.

Тому є важливим подальше вивчення В-ХЛЛ за допомогою сучасних клінічних, цитологічних та імунофенотипічних методів дослідження, що надасть змогу значно глибше зрозуміти механізми лімфогенезу.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами і темами. Дисертаційна робота виконана згідно з планом науково-дослідної роботи (НДР) Київської медичної академії післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика і є фрагментом НДР "Вивчення особливостей перебігу, клініко-гематологічних рис та фенотипу субстратних клітин у пацієнтів із лімфо- та мієлопроліферативними захворюваннями" (№ державної реєстрації 0193И040741). Дисертант є співвиконавцем даної НДР.

Мета роботи. На основі вивчення клініко-гематологічних та імунофенотипічних особливостей перебігу В-ХЛЛ у післячорнобильський період у хворих, які проживають на забрудненій території Київської області та на "чистій" території, виділити прогностичні критерії для різних форм захворювання та визначити тактику лікування у І-ІІ стадіях В-ХЛЛ.

Основні задачі дослідження.

1.

2.

3.

4.

Об'єкт дослідження - 71 хворий на В-ХЛЛ, які постійно проживали на контрольованих територіях Київської області (ІІІ-ІV зона) та 78 хворих, які захворіли В-ХЛЛ після аварії, але не брали участі у ліквідації наслідків аварії (ЛНА) на ЧАЕС, не належали до постраждалих внаслідок аварії та проживали на "чистій" території.

Предмет дослідження - клініко-гематологічні та імунофенотипічні особливості перебігу В-ХЛЛ.

Методи дослідження: загальноклінічні, морфологічне дослідження мазків периферичної крові, кісткового мозку, фарбованих за Паппенгеймом; цитохімічні методи визначення активності пероксидази, кислої фосфатази, кислої неспецифічної естерази та вмісту PAS - позитивних речовин; гістологічне дослідження трепанобіоптатів здухвинних кісток; імунофенотипування пухлинних клітин проводилось за допомогою моноклональних антитіл (МКАТ) до антигенів різних кластерів диференціації; вивчення рівня спонтанного апоптозу - за допомогою аннексін V (Annexin V-FITC) (Clonteck, США) та Hoechst 33342 (Sigma, США); статистичні методи.

Наукова новизна одержаних результатів. На підставі комплексного аналізу морфологічних, цитохімічних та імунофенотипічних методів встановлено, що серед хворих на В-ХЛЛ, постраждалих внаслідок аварії на ЧАЕС, переважала атипова форма В-ХЛЛ.

Вперше встановлено, що серед несприятливих прогностичних чинників є: атиповий морфологічний варіант пухлинного клону, низький рівень великих грануловмісних лімфоцитів (ВГЛ); високий рівень експресії CD23, CD22; експресія активаційних (CD25, CD38) та мієломоноцитарних антигенів (CD11c,CD11b); низький рівень апоптозу.

Встановлено, що для атипової форми В-ХЛЛ є характерним: поліморфізм лімфоїдних елементів пухлинного клону зі зниженням кількості малих лімфоцитів і ВГЛ при одночасному збільшенні кількості великих лімфоцитів і пролімфоцитів; збільшення PAS-позитивних клітин і експресія, окрім класичних, активаційних та мієломоноцитарних антигенів у різних комбінаціях.

Клінічний перебіг В-ХЛЛ у хворих з атиповою формою характеризувався особливою тяжкістю проявів, швидким прогресуванням захворювання та більш коротким загальним виживанням хворих порівняно з типовою формою В-ХЛЛ.

Встановлено, що у хворих з атиповою формою В-ХЛЛ знижений апоптоз пухлинних клітин, який визначався кількістю CD95 - позитивних клітин і рівнем спонтанного апоптозу (СА).

Застосування ІФН у І-ІІ стадіях В-ХЛЛ є ефективним у хворих із типовою формою В-ХЛЛ, що характеризується низьким ступенем пухлинного прогресу. Застосування ІНФ сприяє збільшенню тривалості до цитостатичного періоду.

Практичне значення отриманих результатів. Визначено прогностичні чинники, що дозволяють прогнозувати перебіг В-ХЛЛ і сприятимуть оптимізації тактики лікування хворих. Матеріали досліджень впроваджено в практичну діяльність гематологічного відділення Київського обласного онкологічного диспансеру (КООД), в педагогічний процес на циклах спеціалізації з гематології та трансфузіології, на передатестаційних циклах з гематології та трансфузіології, а також на циклах тематичного удосконалення на кафедрі гематології та трансфузіології Київської медичної академії післядипломної освіти імені П.Л.Шупика МОЗ України.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійною науковою роботою автора. Особистий внесок полягає в аналізі матеріалів обраної актуальної теми, виборі та опрацюванні методик дослідження. Автором особисто проведено клінічне обстеження хворих на ХЛЛ, стернальні пункції, трепанобіопсії здухвинної кістки, вивчено морфологічні і цитохімічні особливості клітин периферичної крові і кісткового мозку, проведено підготовку проб крові і кісткового мозку до імунофенотипування, теоретичне узагальнення отриманих результатів. Здійснено статистичну обробку результатів досліджень. Виявлено закономірності, сформульовані у висновках.

Імунологічні дослідження виконано у відділі цитохімії та імуноцитології Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. акад. Р.Е. Кавецького НАН України (зав. відділу д-р мед. наук, проф. Глузман Д.Ф. ) та у Центральній науково-дослідній лабораторії (ЦНДЛ) Київської медичної академії післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика (керівник Ігнурова К.М. ).

Гістологічне дослідження проводили у патогістологічній лабораторії КООД та на кафедрі патологічної анатомії Київської медичної академії післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були представлені у доповідях та обговорювалися на конференції молодих вчених Київської медичної академії післядипломної освіти МОЗ України ім. П.Л. Шупика "Медикаментозна та немедикаментозна профілактика та відновне лікування в клінічній практиці" (Київ, 2001), на ІV-ому з'їзді гематологів та трансфузіологів України (Київ, 2001), на науково-практичній конференції "Проблеми онкогенетики: наукові та прикладні аспекти" (Київ, 2002), на Міжнародній науково-практичній школі-семінар з гематології та трансфузіології Київської медичної академії післядипломної освіти МОЗ України ім. П.Л. Шупика (Київ, 2002), на Російській науково-практичній конференції "Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии" (Санкт-Петербург, 2002), на 7th Congress of the European Haematology association ( 6-9 June, 2002, Florence, Italy).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 11 наукових праць, 5 - у наукових журналах, 2 - у збірниках наукових статей, 4 - у збірниках матеріалів і тез конференцій.

Обсяг та структура дисертації. Дисертацію викладено на 126 сторінках тексту, вона складається з вступу, трьох розділів, обговорення результатів дослідження, висновків, практичних рекомендацій, переліку літератури, який включає 357 джерел, в тому числі 137 кирилицею та 220 латиницею. Роботу проілюстровано 51 таблицями, 4 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. У розділі представлені загальні дані про вплив іонізуючого опромінення на розвиток онкогематологічних захворювань, клініко-гематологічні, імуноцитохімічні особливості пухлинного клону у хворих на В-ХЛЛ, показана патогенетична роль апоптозу у розвитку захворювання та сучасний стан лікування ХЛЛ. Аналіз даних літератури показав, що залишаються не визначеними особливості клінічного перебігу В-ХЛЛ під впливом негативних факторів, зокрема радіаційного. Імунофенотипічні особливості лімфоїдних клітин при В-ХЛЛ вивчались, головним чином, для розробки методів діагностики і диференційної діагностики різних ХЛПЗ без зіставлення із клінічними і морфоцитохімічними особливостями В-ХЛЛ. Не визначені особливості перебігу різних клінічних форм В-ХЛЛ та прогностичні критерії, що дозволило б передбачати розвиток перебігу хвороби та тактику лікування.

Матеріали і методи досліджень. Для вирішення поставлених в роботі завдань нами обстежено 149 хворих на В-ХЛЛ, які знаходились на лікуванні у КООД або на диспансерному обліку у поліклініці КООД. Першу групу формували 71 хворий на В-ХЛЛ, які постійно проживали на контрольованих територіях Київської області (ІІІ-ІV зони), забрудненість радіонуклідами ґрунту - від 37 кБк/м2 до 555 кБк/м2. Належність хворих до постраждалих внаслідок аварії на ЧАЕС отримана згідно із посвідченням потерпілих. За даними загально-дозиметричної паспортизації населених пунктів України, які зазнали радіоактивного забруднення після Чорнобильської аварії (1997), дози внутрішнього опромінення хворих становили від 1,3 до 33,1мЗв. З них чоловіків - 48 (68%), жінок - 23 (32%). Вік хворих на момент встановлення діагнозу В-ХЛЛ становив від 41 до 82 років (у середньому 62,1±1,0 років). До другої групи (ІІ) віднесено 78 (49 чоловіків і 29 жінок) хворих на В-ХЛЛ, які проживали в Київській області. Вони захворіли на В-ХЛЛ після аварії, але не належали до постраждалих внаслідок аварії і проживали на "чистій" території. Вік хворих на момент встановлення діагнозу коливався від 52 до 84 років (у середньому 65,6±0,75 років). Контрольну групу склали 59 донорів Київської обласної станції переливання крові. Сформовані групи обстежених хворих були однорідні за віковою і статевою структурою та соціально-економічними ознаками.

Діагноз верифікували на підставі загальноклінічних даних та особливостей морфологічного, цитохімічного і імунологічного досліджень пухлинних клітин. При встановленні діагнозу враховували клінічні і лабораторні параметри: вік хворого, первинний статус, кількість лейкоцитів, час подвоєння лімфоцитів периферичної крові (ЧПЛ), швидкість приросту лімфоцитів (ШПЛ), тип ураження кісткового мозку.

Оцінку морфологічних характеристик елементів гемопоезу проводили на мазках периферичної крові та пунктатах кісткового мозку, забарвлених за Паппенгеймом. Кістковомозкове кровотворення оцінювали в пунктатах із грудини та/або із здухвинної кістки при трепанобіопсії.

На підставі цитологічних особливостей лейкемічних клітин, вираховували лімфоцитограму: кількість малих, великих лімфоцитів і ВГЛ на 200-400 лімфоцитів периферичної крові.

Морфологічний варіант В-ХЛЛ визначали згідно із FAB критеріями: типовий В-ХЛЛ (> 90% малих лімфоцитів, < 10% пролімфоцитів, <10% великих лімфоцитів) та атиповий варіант В-ХЛЛ (< 90% малих лімфоцитів, > 10% і < 55% пролімфоцитів, <10% великих лімфоцитів, >5% і <30% лімфоцитів із розщепленим ядром).

Проводили гістологічне дослідження трепанобіоптатів здухвинних кісток.

Для цитохімічного дослідження використовували наступні методики: визначення активності кислої фосфатази (КФ) за методом Goldberg і Barкa (1962), активності кислої неспецифічної естерази (КНЕ) за методом Muller et al. (1975), виявлення PAS-позитивних речовин за McManus (1946) і Hotchкiss (1948). Активність ферментів і вміст РAS-позитивних речовин оцінювали напівкількісним методом - визначали відсоток позитивно реагуючих клітин, вираховували середній гістохімічний коефіцієнт (СГК) за формулою Астальді й Верга (1957). Цитохімічне дослідження проводили з метою визначення ензимохімічних відмінностей патологічних і нормальних лімфоцитів та підтвердження точки зору про гетерогенність пухлинних клітин.

Імунофенотипування пухлинних клітин проводили за допомогою моноклональних антитіл (МКАТ) до антигенів різних кластерів диференціювання (CD), характерних для різних стадій лімфопоезу, методом прямої і непрямої імунофлюоресценції за методикою О.М. Лєжньової та ПАП-методом. Імунофенотипування проводилося з метою діагностики В-ХЛЛ. Панель складалася з вітчизняних і імпортних зразків МКАТ.

Вивчення рівня спонтанного апоптозу проводили за допомогою барвників аннексін V (Annexin V-FITC) (Clonteck, США) та Hoechst 33342 (Sigma, США).

Розрахунок загального п'ятирічного виживання (pS) проводили за методом Kaplan-Meier (1958). Порівняння загального виживання (pS) у групах проводили з використанням log-rank тесту (Mantel, 1968).

Дані досліджень обробляли методами варіаційної статистики. Для статистичної обробки матеріалу використовували програму "Statistica for Windows".

Результати досліджень, їх аналіз та узагальнення. Вік хворих І групи на момент встановлення діагнозу був вірогідно меншим порівняно із середнім віком хворих ІІ групи (р<0,05). Діагноз у хворих, молодших 55 років, було встановлено у 14 (19,7%) осіб І групи та у 11 (14%) осіб ІІ групи. За даними літератури кількість хворих до 55 років, зазвичай, не перевищує 10-15% (Д.Ф. Глузман и соавт., 1999; B.Desablens et al.,1998; Desablens B., 1998).

У більшості обстежених хворих двох груп, відповідно до клінічної класифікації Rai K. R. et al., (1975), діагноз було встановлено у стадії високого ризику (ІІІ-ІV), що впливає на перебіг захворювання та прогноз у цілому (табл.1).

Таблиця 1

Клінічні стадії у хворих І та ІІ групи

Стадія захворювання

( Rai, 1975) | Групи спостереження (n=149)

Хворі на В-ХЛЛ (n=71) | Хворі на В-ХЛЛ (n=78)

абс. | % | абс. | %

0 | 0 | 0 | 0 | 0

І | 5 | 7,0 | 7 | 7,8

ІІ | 10 | 14,1 | 19 | 24,7

ІІІ | 32 | 45,1 | 27 | 35,1

ІV | 24 | 33,8 | 25 | 32,5

Неспецифічні прояви захворювання (підвищена стомлюваність, слабкість, пітливість, схуднення), що вказують на активність хвороби, спостерігалися у більшості (80,2%) хворих І групи, які постраждали внаслідок аварії на ЧАЕС, порівнюючи з 51,9% хворими ІІ групи.

У результаті досліджень встановлено, що у 49 (69%) хворих І групи В-ХЛЛ перебігав на фоні інфекційних ускладнень (бактеріальних і вірусних), а у групі хворих з "чистої" території інфекційні ускладнення спостерігалися у меншої кількості хворих 39(51%). За даними літератури (Бутенко А.К. 2000; Клименко В.І. і співавт., 2002) у хворих, які мешкають на забруднених територіях, внаслідок аварії на ЧАЕС або тих, хто брав участь у ліквідації її наслідків, порушення показників Т та природних кілерних клітин (ПКК) - ланцюгів імунітету було особливо виразним, що може пояснити більший відсоток інфекційних ускладнень у хворих із "забруднених" територій.

Для хворих на В-ХЛЛ з забруднених територій (І група) характерна була більша кількість ураження ділянок лімфоїдної тканини та у більшої кількості хворих спостерігали спленогепатомегалію, що свідчить про розповсюдженість пухлинного процесу і значний об'єм пухлинної маси. Дані наведено у таблиці 2.

Таблиця 2

Ураження лімфатичних вузлів, печінки і селезінки у хворих на В-ХЛЛ І та ІІ групи

Зони ураження | Хворі на В-ХЛЛ (n=71) | Хворі на В-ХЛЛ

(n=78)

абс. | % | абс. | %

Шийні лімфатичні вузли | 5 | 7,0 | 10 | 13

Шийні, пахвові лімфатичні вузли | 24 | 33,8 | 35 | 45,5

Генералізована лімфаденопатія | 42 | 59,1 | 32 | 41,6

Генералізована лімфаденопатія та абдомінальні | 25 | 35,2 | 20 | 26

Генералізована лімфаденопатія та медіастенальні | 7 | 9,8 | 2 | 2,6

Гепатомегалія | 7 | 9,8 | 2 | 2,5

Спленомегалія | 19 | 26,8 | 12 | 15,4

Гепатоспленомегалія | 28 | 39,4 | 20 | 25,6

У хворих І групи лімфаденопатія зберігалася у стабільному стані у меншої кількості хворих (р<0,05) та менший період часу (р<0,05), що є одним з критеріїв, який вказує на швидке прогресування пухлинного процесу.

При клінічному вивченні периферичної крові було виявлено, що кількість еритроцитів, гемоглобіну і тромбоцитів у межах норми мала місце у 15 (21,1%) хворих І групи та дещо вище у ІІ групі - 25 (32,5%), але достовірної різниці не виявлено. Анемія тяжкого ступеня була більш характерною для хворих із контрольованих територій, яка спостерігалася у 29 (64,4%) хворих порівняно із 12 (35,3%) хворими з "чистих" територій. Різниці у кількості хворих із тромбоцитопенією не виявлено. У 13 (54,2%) хворих із контрольованих територій (І група) тромбоцитопенія супроводжувалася ознаками геморагічного синдрому, тоді як у ІІ групі - тільки у 6 (24,0%) хворих. Лейкоцитоз з лімфоцитозом є характерною ознакою В-ХЛЛ і спостерігався у всіх хворих як І, так і ІІ групи. У хворих з контрольованих територій (І група) середній рівень лейкоцитів був достовірно вищим порівняно із середнім рівнем лейкоцитів хворих ІІ групи і дорівнював 98,8±9,8·109/л та 64,0±4,9·109/л відповідно (р<0,05). Кількість лімфоцитів у периферичній крові та кістковому мозку у хворих І та ІІ групи статистично не відрізнялася (р>0,05). Кількість гранулоцитів у мазках периферичної крові хворих двох груп спостереження в абсолютних числах залишалася у межах норми. ЧПЛ у периферичній крові хворих І та ІІ стадії (за класифікацією Rai.K.R., 1975), більше 12 місяців, був встановлений у двох (13,3 %) хворих І групи, що менше за кількість хворих (14 (56%) із ІІ групи. ШПЛ у хворих І групи становила від 2,8 до 14,8, (у середньому 6,2±0,4), а у хворих ІІ групи - від 0,9 до 8,9 (у середньому 2,5±0,3) (р<0,05).

При підрахунку лімфоцитограми периферичної крові кількість малих лімфоцитів у хворих ІІ групи була статистично більшою, а кількість великих лімфоцитів та пролімфоцитів - меншою порівняно із кількістю цих клітин у хворих І групи (табл.3).

Таблиця 3

Лімфоцитограма периферичної крові хворих на В-ХЛЛ І та ІІ групи

Лімфоцити | Кількість лімфоцитів, %

Хворі І групи( n=71) | Хворі ІІ групи( n=78)

Малі | 80,3±0,6* | 93,4±0,6*

Великі | 9,2±0,2* | 1,5±0,1*

Пролімфоцити | 12,8±0,2* | 4,8±0,1*

ВГЛ | 0,21±0,01* | 3,1±0,1*

Примітка.

*- статистична достовірність між І та ІІ групою (р<0,05).

За FAB (1989) критеріями типовий морфологічний варіант, який характеризується мономорфною популяцією малих лімфоцитів, у І групі був встановлений у 39 (54,9±5,9%) хворих, атиповий - у 32(45,1±5,9%). У ІІ групі типовий морфологічний варіант діагностовано у 59 (75,3±4,9%) хворих і атиповий - у 19 (24,7±4,9%). Кількість ВГЛ, які належать до клітин імунної системи, у хворих ІІ групи була статистично більшою, порівнюючи з лімфоцитограмою хворих, які постраждали внаслідок аварії на ЧАЕС (І група), що може також вказувати на більш значні порушення в імунній системі і обумовлює більш агресивний перебіг захворювання та швидке прогресування хвороби у хворих І групи. При проведені кореляційного аналізу між рівнем різних популяцій лімфоцитів (малих, великих, пролімфоцитів та ВГЛ) і такими відомими чинниками прогнозу, як ЧПЛ, ШПЛ та дифузний тип ураження кісткового мозку, отримані наступні результати. Відносна кількість малих лімфоцитів та ВГЛ негативно корелює з кількістю хворих з дифузним типом ураження кісткового мозку (r=-0,67; r=-0,72; р<0,001), з ШПЛ (r=-0,69; r=-0,61; р<0,001) та позитивно - з ЧПЛ більше 12 місяців (r=+0,71; r=+0,74; р<0,001). Кількість великих лімфоцитів та пролімфоцитів позитивно корелювала з ЧПЛ менше 12 місяців (r=+0,61; r=+0,70, р<0,001) та з ШПЛ- коефіцієнт кореляції дорівнював r=+0,75 та r=+0,69 (р<0,001). Таким чином, типовий морфологічний варіант асоціює з помірним прогресом захворювання у порівнянні із хворими на В-ХЛЛ, у яких атипова морфологічна картина пухлинного клону.

При гістологічному дослідженні кісткового мозку встановлено, що кількість хворих із дифузним ураженням кісткового мозку у І та ІІ групі співпадає з даними літератури про розповсюдження дифузного типу ураження кісткового мозку у хворих на В-ХЛЛ ( Глузман Д.Ф. и соавт., 2000; Desablens B. et al., 1998; Kroft S.H. et al.,1995). Дифузне ураження у хворих І групи зустрічалося у достовірно більшої кількості хворих із контрольованих територій порівняно із хворими "чистих" територій Київської області, що, в цілому, є негативним чинником (табл.4).

Таблиця 4

Тип ураження кісткового мозку у хворих І та ІІ групи

Тип ураження | Групи спостереження (n=149)

Хворі І групи (n=71) | Хворі ІІ групи (n=78)

абс. | % (M ± m) | абс. | % (M ± m)

Осередковий | 15 | 21,1±4,8 | 19 | 24,7±4,9

Інтерстиціальний | 17 | 23,9±5,1 | 32 | 41,6±5,6

Змішаний | 7 | 9,9±3,5 | 10 | 13±3,8

Дифузний | 32 | 45,1±5,9* | 17 | 22±4,7*

Примітка.

*- статистична достовірність між І та ІІ групою (р<0,05).

При цитохімічному дослідженні пухлинних клітин у хворих І та ІІ групи реакція на мієлопероксидазу (МПО) була негативна, що є підтвердженням лімфоїдного походження пухлинного клону у обстежених хворих (Глузман Д.Ф. и соавт., 1998; Хейхоу Д.Ф.Г. и соавт.. 1983). СГК PAS- реакції у хворих І та ІІ групи був достовірно вищим порівняно із групою контролю, що вказує на високий вміст глікогену, який є характерним для ХЛПЗ, в тому числі і для В-ХЛЛ (Глузман Д.Ф. и соавт., 1998). Активність PAS-реакції за даними СГК у хворих І групи (1,59±0,01) була достовірно вищою, ніж у хворих ІІ групи (1,16±0,01). Встановлено прямий кореляційний зв'язок між рівнем СГК PAS-реакції та кількістю лімфоцитів у периферичній крові (r=0,71; р<0,001). Отримані дані доводять, що рівень СГК PAS-реакції також може вказувати на активність пухлинного процесу і висока її активність свідчить про більш злоякісний перебіг В-ХЛЛ. У всіх випадках КФ була чутлива до дії інгібітору, що допомагало диференціювати з волосатоклітинним лейкозом (Глузман Д.Ф. и соавт., 1998). Активність КФ виявлялась у цитоплазмі лімфоцитів. СГК КФ у хворих І групи дорівнював 1,24±0,02, а у хворих ІІ групи - 1,21±0,01 (р>0,05). Активність КФ за даними СГК достовірно не відрізнялася від групи контролю (р>0,05) як у І, так і у ІІ групі хворих. У лімфоцитах хворих І групи активність КНЕ за даними СГК (0,56±0,04) була статистично нижчою, ніж у лімфоцитах хворих ІІ групи (0,79±0,01) та групи контролю (1,17±0,01) (р<0,05). Отже, результати нашого дослідження щодо цитохімічних особливостей лімфоцитів при В-ХЛЛ свідчать, з одного боку, про значні ензимохімічні відмінності патологічних та нормальних лімфоцитів, а з другого - підтверджують точку зору про гетерогенність пухлинних клітин хворих на В-ХЛЛ.

Нами проведено порівняльний аналіз вивчення спонтанного апоптозу (СА) та експресії антигену апоптозу CD95 у хворих із контрольованих територій та хворих із "чистих" територій Київської області. Рівень як СА пухлинних клітин, так і рівень та кількість CD95-позитивних клітин у хворих на В-ХЛЛ були значно нижчими у обох групах порівняно з групою контролю, що може пояснити один з механізмів виникнення хвороби (р<0,05). Рівень СА в нашому дослідженні корелював з осередковим типом ураження кісткового мозку (r=0,67; р<0,001) та стадією захворювання (r=-0,65; р<0,001). Проведений кореляційний аналіз виявив, що СD95-позитивний фенотип пухлинних клітин хворих В-ХЛЛ асоціює з такими прогностичними чинниками, як кількість лейкоцитів (r=-0,86; р<0,001), ЧПЛ периферичної крові (r=0,57; р<0,001) та із осередковим типом ураженням кісткового мозку (r=0,49; р<0,001). Встановлено, що апоптоз пухлинних клітин у хворих І групи був статистично нижчим у порівнянні із хворими ІІ групи як за даними СА, так і за експресією CD95 антигену. Це, можливо, пов'язано з тим, що рівень експресії рецептора апоптозу у хворих на В-ХЛЛ вищий на CD4-позитивних Т-клітинах порівняно із CD19+ клітинами (Dianzani U. et al., 1994). У хворих В-ХЛЛ, які зазнали опромінення внаслідок аварії на ЧАЕС, кількість CD4-позитивних клітин достовірно менша порівняно із кількістю цих клітин у хворих, які не були визнаними постраждалими внаслідок аварії на ЧАЕС (Клименко В.І. і співавт., 2002; Бутенко А.К., 2000).

Імунофенотипування підтвердило В-клітинну природу пухлинного клону у хворих І та ІІ групи. Пухлинні клітини експресували пан-В-клітинні антигени CD19, CD20, HLA-DR, диференційний Т-клітинний антиген CD5 та sIg з слабким рівнем експресії. Експресія CD19, CD20, HLA-DR, CD5 антигенів та sIg статистично не відрізнялася (р>0,05). У всіх хворих І та ІІ групи виявлялася експресія активаційного антигену CD23+, рівень експресії дорівнював 65,3±0,8% та 55,3±0,7% відповідно. У більшої кількості хворих, яких визнано постраждалими (І група), визначалися CD25 та CD38 позитивні клітини порівняно з хворими ІІ групи. Рівень експресії антигенів (CD25, CD38) статистично не відрізнявся (р>0,05). При вивченні клінічної вагомості експресії CD25 антигену на лімфоцитах хворих В-ХЛЛ було виявлено, що CD25 фенотип спостерігався у достовірно більшої частини обстежених хворих - 30 (81,1±6,4%) з атиповим морфологічним варіантом пухлинного клону та у 35 (94,5±3,7%) хворих із дифузним ураженням кісткового мозку порівняно із хворими, у яких CD25 антиген був негативний на лімфоцитах периферичної крові у 35 (94,5±3,7%) і у 19 (16,7±3,5%) хворих відповідно. Присутність CD38 антигену на лімфоцитах хворих у достовірно більшої кількості хворих 28 (84,8±6,2%) була з атиповою морфологією пухлинних клітин порівняно із 9 (7,8±2,4%) хворими з CD38-негативним фенотипом (р<0,05). Отже, присутність CD38 антигену також вказує на неоднорідність походження пухлинного клону при В-ХЛЛ, що узгоджується з даними літератури (Никитин Е.А. и соавт., 2000; Danle R.N. et al., 1999). Кількість хворих з CD22-позитивними клітинами у І та ІІ групі становила 29 (40,8%) та 41(53,2%), а рівень експресії дорівнював 51,6±0,6% та 48,6±0,6% відповідно. Експресію CD21 антигену у хворих І групи виявлено у 46 (65%), з рівнем експресії 42,6 ± 0,7% та у 21 (27,3%) хворого ІІ групи, з рівнем - 40,6 ± 0,7%. Вивчення фенотипу у хворих В-ХЛЛ показало, що CD5 позитивні випадки при коекспресії антигена CD21 асоціювалися з атиповою морфологією лімфоцитів. Рівень експресії та кількість хворих з CD21 фенотипом був вірогідно вищим у хворих з атиповою морфологічною картиною пухлинного клону та у стадії ІІІ-ІV, що, можливо, обумовлено високою проліферативною активністю В-клітин, які мають CD21 антиген. У обстежених нами хворих І та ІІ групи на пухлинних клітинах виявлена також експресія мієломоноцитарних антигенів - CD11b, CD11с. У І групі хворих CD11b - позитивні клітини виявлені у 27(38%) хворих, а CD11с - у 35 (49%). Рівень експресії CD11b антигену складав 50,7±0,2% та 48,4±0,2% антигену CD11с. CD11b - позитивні клітини у ІІ групі визначені у 12 (15%) хворих і CD11с-позитивні клітини - у 16 (21%) хворих, з рівнем експресії 40,3±0,2% та 39,9±0,3% відповідно. У більшої кількості хворих ІІІ-IV стадії захворювання пухлинні клітини експресували CD11b антиген, а у хворих І-ІІ стадії даний антиген був відсутній. Пан В-клітинний антиген CD11а було виявлено в IV стадії у 7 (9,9%) хворих І групи, рівень експресії становив 38,4±0,4% та тільки у двох (2,5%) хворих ІІ групи В-ХЛЛ, рівень експресії дорівнював 32,4±0,5% (р>0,05).

При дослідженні стану імунної системи у хворих на В-ХЛЛ нами виявлено суттєве зниження відносного вмісту основних субпопуляцій Т-лімфоцитів у обстежених І та ІІ групи хворих. Рівень експресії CD3 антигену був вірогідно знижений у хворих І групи та ІІ групи порівняно із групою донорів та дорівнював 3,1±0,1 та 6,2±0,4 відповідно (р<0,05). Відносні величини CD8+ та CD4+ також були нижчими за показники контрольної групи: CD8+ становили 8,3±0,29% та CD4+ - 4,5±0,1% у І групі хворих та 10,5±0,9%, 7,5±0,4% відповідно в ІІ групі. Аналогічні зміни спостерігались у відношенні вмісту природних кілерів (CD16): їх відносна кількість була вірогідно зниженою порівняно із контрольною групою (12,5±0,2%) як у хворих І групи (1,4±0,1%), так і у хворих ІІ групи (2,5±0,1%). Рівень CD56+ у хворих І групи дорівнював 4,3±0,2% та 8,4±0,3% - у хворих ІІ групи, що було вірогідно нижчим, ніж у контрольній групі (р<0,05). У хворих з контрольованих територій (І група) рівень експресії CD3, CD4, CD56,CD16 антигенів був статистично нижчим порівняно з рівнем експресії у хворих без факту опромінення. Отримані дані дають можливість вважати, що порушення в імунній системі є одним із патогенетичних факторів, які сприяють розвитку хвороби та пояснюють частоту інфекційних ускладнень.

Загальне виживання за 5 років спостереження (1997-2002р.р.), що проводилось за методом Kaplan-Meier, для хворих І групи становило 55,1±0,4%, а для хворих ІІ групи - 69,5±0,4% (р>0,05). Одержані дані низького відсотка виживання хворих, можливо, пов'язані з тим, що у більшої кількості хворих діагноз В-ХЛЛ було встановлено у стадії ІІІ-IV.

Отже, серед обстежених хворих з контрольованих територій (І група) у більшості випадків виявлена атипова форма В-ХЛЛ, при якій, окрім головних антигенів (CD5+,CD20+,CD19+,HLA-DR+,CD23+,CD22+,sIgslow), виявлялася експресія CD11c, CD11b, CD25, CD38 антигенів. Особливостями клінічного перебігу захворювання для хворих І групи були: генералізована лімфаденопатія, гепатоспленомегалія та неспецифічні прояви захворювання. Більш, ніж у половини хворих, захворювання перебігало на фоні інфекційних ускладнень. Характерною виявилася анемія тяжкого ступеня та достовірна більшість хворих з високим лейкоцитозом у порівнянні з хворими на В-ХЛЛ ІІ групи. Морфологічне дослідження мазків периферичної крові встановило, що у достовірно більшої кількості хворих І групи домінував атиповий морфологічний варіант із достовірно нижчим рівнем ВГЛ, а при гістологічному дослідженні - дифузний тип ураження кісткового мозку. Цитохімічні дослідження клітин периферичної крові хворих виявили статистично вищий вміст глікогену у лімфоцитах (PAS - реакція) та зниження активності кислої неспецифічної естерази у хворих І групи. Встановлено, що апоптоз пухлинних клітин у хворих І групи був достовірно нижчим як за даними спонтанного апоптозу, так і за експресією CD95 антигену у порівнянні з групою хворих без факту опромінення. Виявлено також суттєве зниження відносного вмісту основних субпопуляцій Т-лімфоцитів у хворих І групи та вмісту природних кілерів.

На основі вивчення експресії антигенів нами були виділені дві форми В-ХЛЛ: типова, з класичним фенотипом (CD5+, CD20+,CD19+, HLA-DR+, CD23+, CD22+, sIgslow ) та атипова - з експресією активаційних (CD11с, CD11b) та/або мієломоноцитарних антигенів (CD25, CD38), окрім класичних. Атипова форма В-ХЛЛ у хворих, яких визнано постраждалими від аварії на ЧАЕС, встановлена у більшої кількості хворих (62%), порівнюючи із хворими (39,7%) без факту опромінення (ІІ група). Рівень експресії CD19+, CD20+, HLA-DR+, CD5+ антигенів на пухлинних клітинах хворих І та ІІ групи як з типовою, так із атиповою формами В-ХЛЛ, статистично не відрізнявся. Однак у хворих з атиповою формою як І, так і ІІ групи спостереження рівень експресії CD23, CD22+ антигенів та sIg+ був достовірно вищим, ніж у хворих із типовою формою В-ХЛЛ (табл.5).

Таблиця 5

Експресія В-клітинних антигенів та CD5 антигену у хворих з типовою та атиповою формою В-ХЛЛ у І та ІІ групі

Антигени,

CD | Рівень експресії, %

І група хворих (n=71) | ІІ група хворих (n=78)

Хворі з типовим В-ХЛЛ (n=27) | Хворі з атиповим В-ХЛЛ (n=44) | Хворі з типовим В-ХЛЛ (n=47) | Хворі з атиповим В-ХЛЛ (n=31)

CD19+ | 67,2±0,5 | 65,4±0,5 | 65,2±0,8 | 62,4±0,7

CD20+ | 70,9±0,4 | 69,8±0,4 | 67,5±0,4 | 65,1±0,4

HLA-DR+ | 65,4±0,6 | 69,4±0,2 | 70,1±0,6 | 69,4±0,2

CD5+ | 90,2±0,2 | 87,9±0,4 | 88,1±0,1 | 75,2±0,4

CD23+ | 49,4±0,5* | 71,1±0,4* | 45,3±0,3** | 69,7±0,4**

CD22+ | 39,2±0,8* | 51,8±0,4* | 38,1±0,4** | 50,2±0,1**

sIg+ | 25,8±0,2* | 33,2±0,2* | 24,5±0,4** | 35,4±0,2**

Примітка:

*- статистична достовірність між атиповою та типовою формами В-ХЛЛ І групи (р<0,05);

**- статистична достовірність між атиповою та типовою формами В-ХЛЛ ІІ групи (р<0,05).

Встановлено прямий кореляційний зв'язок між рівнем експресії CD23, CD22 антигенів та кількістю лейкоцитів (r=0,71; r=0,70; р<0,001), кількістю хворих з клінічною стадією ІІІ-ІV (r=0,68; r=0,72; р<0,001) та зворотній з ЧПЛ у периферичній крові (r=-0,69; r=-0,73; р<0,001). Отримані результати нашого дослідження вказують, що високий рівень експресії даних антигенів свідчить про високу активність пухлинного клону.

Відповідно клінічній класифікації RaiK.R. et al., (1975), хворим обох груп спостереження як з типовою, так із атиповою формами В-ХЛЛ було встановлено І, ІІ, ІІІ та ІV стадії захворювання. Кількість хворих з типовою та атиповою формою В-ХЛЛ у стадії низького ризику (І-ІІ) порівняно із стадією високого ризику (ІІІ- IV) статистично не відрізнялася у підгрупах. Це свідчить про те, що пухлинний клон у хворих первинно гетерогенний, а не є наслідком прогресування захворювання.

Нами встановлено, що для атипової форми В-ХЛЛ як для хворих І, так і для хворих ІІ групи характерна була більша кількість ураження зон лімфатичних вузлів та кількість хворих з спленомегалією, гепатомегалією та гепатоспленомегалією.

У більшої кількості хворих з атиповою В-ХЛЛ характерні були неспецифічні прояви захворювання, які встановлені у 95,5% хворих І групи та у 67,7% хворих ІІ групи. Інфекційні ускладнення також були більш характерні для атипової форми В-ХЛЛ, які діагностовані у 84,1% та у 70,9% хворих І та ІІ групи відповідно.

В аналізі периферичної крові у більшої кількості хворих І та ІІ