Кондрацька Олена Леонардівна

УДК 577.354+615.322:612.822

ГЛІЦИНОВІ РЕЦЕПТОРИ В ПІРАМІДНИХ НЕЙРОНАХ ГІПОКАМПУ ЩУРА ТА МЕХАНІЗМИ ЇХ МОДУЛЯЦІЇ ГІНКГОЛІДАМИ

03.00.02 – біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ-2003

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у відділі фізико-хімічної біології клітинних мембран

Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України

Науковий керівник: академік НАН України, доктор біологічних наук

0.1.1. Кришталь Олег Олександрович

Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України

зав. відділом фізико-хімічної біології клітинних мембран

Офіційні опоненти: академік НАН України, доктор біологічних наук

Магура Ігор Сильвестрович

професор Кафедри молекулярної фізіології і біофізики

Фізико-технічного Навчально-Наукового центру НАН України

кандидат біологічних наук

Пархоменко Микола Тимофійович

провідний науковий співробітник відділу нейрохімії

Інституту біохімії ім. Паладіна НАН України

Провідна установа: Національний Університет ім. Т. Г. Шевченка, біологічний факультет, кафедра біофізики, м. Київ

Захист відбудеться 06.05.2003 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д-01.13.01 при Інституті фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України за адресою:01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України за адресою:01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий 03.04.2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З. О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Гліцин та -аміно-масляна кислота відіграють провідну роль в центральній нервовій системі ссавців, опосередковуючи гальмівну синаптичну передачу у переважній більшості її відділів . Специфічні рецептори до цих амінокислот відносяться до родини ліганд-керованих канал-утворюючих білків, як і решта подібних рецепторів: нікотиновий, ацетилхоліновий, серотоніновий 3-го типу тощо . Гліцин-активовані рецептори пригнічують активність нейронів шляхом відкривання хлорних каналів , тому модуляція функціонального стану таких рецепторів неминуче призводить до впливу безпосередньо на нейрональне збудження.

Наразі відомо, що гліциновий рецептор складається із пя’ти субодиниць та , що найчастіше поєднуються у стехіометричному співвідношенні як 3 :2, та формують центральну пору іонного (хлор-проникного) каналу . У відкритому стані канал рецептора може бути блоковано неспецифічними блокаторами, що діють як неконкурентні антагоністи рецептора. Для гліцинового рецептора існує кілька блокаторів, зокрема цианотрифенілборат та пікротоксин , дія яких визначається субодиничним складом рецептора, який потерпає певних змін у процесі онтогенетичного розвитку живого організму. При патологіях гліцинового рецептора, наприклад, гіперфлексії, змінюється афінність рецептора до агоніста, а також чутливість канальної пори до неконкурентних антагоністів , тому пошук специфічних модуляторів гліцинового рецептора як за фізіологічних умов, так і при точкових мутаціях генів, що кодують його білки, вважається доцільним і потребує особливої уваги.

Раніше вважалося, що гліцин як нейромедіатор, домінує в нижчих відділах ЦНС, наприклад, у спинному мозку та стовбурових частинах мозку , тоді як -аміно-масляна кислота притаманна вищим відділам (гіпокамп, кора, мозочок) . Проте на сьогодні достовірно відомо, що гліцин присутній у гіпокампі, причому здатний слугувати не лише як ко-агоніст для NMDА-керованих рецепторів , а також активує специфічні рецептори, чутливі до стрихніну, нарівні з ендогенними агоністами гліцинових рецепторів, таурином та -аланіном . Поява таких фактів змусила переосмислити основні положення функціональної значимості гліцинових рецепторів у ряді процесів, що мають місце у гіпокампі.

Поточний брак уваги до гліцинових рецепторів в гіпокампі з боку науковців, зацікавлених у процесах нейронального гальмування, є непередбаченим, оскільки очевидно, що ціла машинерія, необхідна для гліцин-рецептор-опосередкованого інгібування була виявлена в гіпокампі в результаті багатьох експериментальних досліджень. Як приклад, синаптонейросоми, виділені із гіпокампу дорослих щурів, містили гліцин в концентраціях, однакових із концентраціями ГАМК (36 нМ ГАМК/мг протеїну супроти 42 нм гліцину/мг протеїну) та виявили вивільнення обидвох гальмівних амінокислот із використанням Са2+-залежного та Са2+-незалежного механізмів, що свідчить про можливість везикулярного та транспортер-опосередованого виділення обидвох амінокислот . На додаток, таурин, відомий як агоніст гліцинового рецептора в окремих системах , та присутній у гіпокампі у високих концентраціях здатний попереджати екзитотоксичну смерть нейронів та пригнічувати збудливість пірамідних нейронів у гіпокампі . Вірогідно, що ці ефекти таурину в гіпокампі опосередковані активацією гліцинових рецепторів.

Фізіологічна роль гліцинових рецепторів у гіпокампі достеменно невідома, однак їх наявність та висока густина поширення диктує потребу їх детального дослідження, включаючи вивчення субодиничної структури, модуляцію біологічно активними агентами та ідентифікації процесів, що мають місце у гіпокампі, і у котрі, прямо чи опосередковано ці рецептори можуть бути залучені.

Екстракт Ginkgo biloba є комплексом біологічно активних речовин, включаючи флавонові глікозиди 22-27% (кверцитин, каемферол, ізорхамнетин) та терпенові лактони, що обіймають близько 2.8-3.4%, та включають гінкголіди (А, В, С та J), білобалід і гінкголідову кислоту, яка посідає найменший відсоток серед складових екстракту .

Усі гінкголіди є 20-карбон-вмісними молекулами (гінкголід В має хімічну формулу С20Н24О10), що містять шість кілець, що включають тетрагідрофуранову групу, спірононанову систему, три лактонових кільця та tert-бутилову групу. Гінгколід В характеризується присутністю двох гідроксильних груп, що кріпляться до вуглеців у положенні С1 та С3 спірононанової системи.

Протягом останніх років зусиллями когорти вчених було виявлено, що використання екстракту є ефективним за широкого спектру захворювань, що пов’язані із фізичними та розумовими розладами, такими як хвороба Альцгеймера, чи деменція , шизофренія , епілептичні судоми , апоптоз нервових тканин у людей похилого віку тощо.

Проте, дані відомості стосувалися екстракту як суміші речовин, і до цього часу бракує наукових фактів, що здатні пролити світло на те, які саме складові екстракту Ginkgo biloba спричиняють кожен із цих впливів на ЦНС. Зокрема, зовсім небагато відомо про ефекти окремих складових на функціонування нейронів на молекулярному рівні. Окремо слід наголосити про факт того, що гінкголіди проявляють антагоністичну активність супроти рецепторів до фактора активації тромбоцитів, так як пригнічують зв’язування 1-O-алкіл-2-ацетил-sn-гліцеро-3-фосфохоліну (PAF) до його мембранних рецепторів. Дослідження модуляторних аспектів дії гінкголідів стосовно ліганд-активованих рецепторів у нейронах є доцільним і вимагає грунтовного дослідження.

Дослідження проводились відповідно до планів наукової роботи відділу фізико-хімічної біології клітинних мембран Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України за темою “Дослідження стрихнін-чутливих гліцин-активованих рецепторів в пірамідних нейронах зони СА1 гіпокампу щурів та їх модуляції гінкголідами (складовими екстракту Ginkgo biloba)”.

Мета і задачі дослідження: із застосуванням методик фіксації потенціалу та внутрішньоклітинної перфузії нейронів з’ясувати фармакологічні характеристики гліцин-керованих рецепторів у пірамідних нейронах гіпокампу, та вивчити механізми дії нового класу блокаторів гліцин-керованого хлорного каналу – гінкголідів (складових екстракту Ginkgo biloba) з метою їх подальшого клінічного використання. З’ясувати потенційний внесок гліцинових рецепторів у каскад подій довготривалої потенціації в гіпокампі, виходячи із здатності гінкголідів модулювати цей процес та пригнічувати гліцин-активовані струми. Для досягнення поставленої мети, в роботі слід було вирішити такі задачі:

1)

2)

3)

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в дисертаційній роботі детально вивчено механізми дії нового класу антагоністів гліцинових рецепторів, гінкголідів. Виявлено основні характеристики взаємодії гінкголідів із гліциновим рецептором та досліджено специфіку їх дії як селективних каналоблокаторів гліцинового рецептора. На підставі даних електрофізіологічного скринінгу гінкголідових складових екстракту Ginkgo biloba висловлено припущення про існування всередині канальної пори гліцинового рецептора специфічного центру, чутливого до гінкголідів, як речовин певної хімічної будови. За результатами експериментів, здійснених із використанням обраного методичного підходу, зроблено висновки про специфічність дії нового блокатора гінкголіда В на канал гетеромерного гліцинового рецептора. що стосовно дії цього класу блокаторів показано вперше.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Отримано принципово нові дані стосовно дії цілого щойно відкритого класу селективних блокаторів каналу гліцин-керованого рецептора в нейронах гіпокампу. Отримані у роботі дані дають основу для розробки високоселективних фармакологічних засобів, здатних вирізняти нативний гліциновий рецептор із складом 2/3.

Крім того, результати експериментів дають можливість досить чітко сформулювати основні фармакологічні особливості гліцинових рецепторів у гіпокампі та передбачити фізіологічну роль гліцину як другорядного інгібуючого нейромедіатора. Практичне значення здійсненої серії експериментів полягає у тому, що знайдено новий клас селективних канальних блокаторів гліцин-керованого хлорного каналу із діє-залежним ефектом. Доповнено відомості про принцип дії цілого екстракту Ginkgo biloba як комплексу біологічно активних сполук, а саме завдяки активності його складових гінкголідів як блокаторів гліцинових рецепторів, що надалі має бути відображено у клінічному застосуванні як цілого екстракту, так і при потенційному застосуванню окремих його компонентів, ураховуючи специфічність їх дії. Таке використання гінкголідів як лікарського засобу потребує більш детальних клінічних досліджень за фізіологічних та патологічних умов експресії нативного гліцинового рецептора, причому не лише в гіпокампі, а й в інших частинах ЦНС. Подальше практичне застосування нового класу блокаторів гліцин-керованих каналів неминуче, оскільки вони єдині відомі до цього часу блокатори каналу, що не викликають судомної активності, що, найбільш ймовірно, можливо завдяки їх діє-залежному (“use-dependent”) ефекту.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто було виконано більшу частку електрофізіологічних експериментів. В розробці наукових концепцій роботи приймали участь також інші співавтори публікацій. Для отримання даних та обрахування результатів експериментів використовувалось програмне забезпечення, створене Я. Бойчуком.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідались на семінарах Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, викладалися та обговорювалися на ІІ Конференції Українського Товариства Нейронаук (Донецьк, 2001), на IV Конференції Чеського Товариства Нейронаук (Прага, 2001), Міжнародному літньому симпозіумі “Фармакологія синаптичної передачі у нервовій системі” (Київ, 2002) та ІІ Богомолець-Ненскі Конференції (Київ, 2002).

Публікації. За результатами роботи опубліковано три статті та тези чотирьох доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел із 291 найменування. Робота викладена на 160 сторінках та ілюстрована 30 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Матеріали та методи досліджень. В експериментах використовувались білі щурі лінії Вістар WAG\GSto (Москва, Росія) віком 7 та 14 днів, що утримувались на стандартній лабораторній дієті.

Для дослідження фармакологічних характеристик гліцин-активованих струмів та модуляції їх гінкголідами, а також з’ясування потенційного внеску гліцин-активованих рецепторів у каскад подій довготривалої потенціації використовувалися такі методичні підходи:

а) приготування зрізів гіпокампу щурів;

б) виділення окремих клітин із зрізів гіпокампу з використанням методу вібродисоціації нервових клітин;

в) метод “петч-клемп” у конфігурації "ціла клітина" для реєстрації гліцин-активованого струму;

г) реєстрація збуджуючих постсинаптичних потенціалів (ЗПСП) із ділянки stratum radiatum СА1 зони гіпокампу із використанням біполярної стимуляції колатералей Шафера.

Отримання ізольованих нейронів. Для отримання окремих пірамідних нейронів гіпокампу, придатних для дослідження методом фіксації потенціалу, використовувався метод м’якої ферментативної обробки зрізів гіпокампу . Після декапітації тварини гіпокамп переносили у штучний спинномозковий розчин (А) наступного складу (у мМ): 150 NaCl, 5 KCl, 0.9 CaCl2, 1.1 MgCl2, 26 NaHCO3, 10 глюкоза, 1.25 NaH2PO4, pH=7.4; далі у цьому розчині гіпокамп нарізали на зрізи 200-400 мкм, які витримували протягом 30 хвилин при кімнатній температурі (24С) у розчині (В) наступного складу (у мМ): 150 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 26 NaHCO3, 10 глюкоза, 1.25 NaH2PO4, pH=7.4. Розчин постійно насичувався газовою сумішшю (95% O2, 5% CO2), pH 7.4. Для ферментативної обробки використовували протеазу (в розчині А) (Sigma, P-5147, Aspergillus oryzae) у концентраціі 0.4 мг/мл (при t=32 Cо, 10 хвилин). Для виділення окремих, ізольованих нервових клітин із зрізів гіпокампу застосовувалась модифікована методика вібродисоціації клітин із тканини, запропонована Воробйовим .

Реєстрація хемоактивованих трансмембранних струмів. Реєстрація іонних струмів через мембрану нейронів проводилася методом внутрішньоклітинної перфузії із використанням скляних мікропіпеток, які мали опір 2-5 МОм . Використання пристрою “рухомий столик” (виробництво “Pharma Robot”, Київ) у експериментах дозволяло провести швидку зміну позаклітинних розчинів за 15-20 мсек. Піпетки заповнювалися внутрішньоклітинним розчином (у мМ): 70 Tris-PO4, 5 EGTA, 40 TEA-Cl (Tetraethylammomium chloride), 30 Tris-Cl, 5 Mg-ATP, 0.5 GTP; pH 7. Склад позаклітинного розчину (у mM): 130 NaCl; 3 CaCl2; 5 KCl; 2 MgCl2, 10 n-2-гідроксиетилпіперазин-N’-2-етансульфонової кислоти (n-2-hydroxyethyl-piperazine-N’-2-ethanesulphonic acid) (HEPES), 0.1 мкM TTX; pH=7.4.

Всі реактиви, які використовувалися в роботі, були вироблені фірмою Sigma Chemical Co. (St. Louis, США). Вода для розведення розчинів була деіонізована на апараті Super-Q фірми Millipore і мала питомий опір 10-12 МОм* см. Гінкголіди (складові екстракту Ginkgo biloba) були люб'язно надані фірмою Dr. Willmar Schwabe GmbH & Co. (Німеччина).

Дані були апроксимовані згідно із рівнянням Хіла (1) де - концентрація речовини, - концентрація речовини, при якій пригнічення струму дорівнює 50% від максимального, -коефіцієнт Хіла та рівняння , де КD1 та КD2 відображають афінність гомо- та гетеромерних рецепторів до гінгколіда В (BN52021) та [BN]-концентрація гінкголіда В. Первинна обробка даних (вимірювання амплітуди, нормалізація тощо) здійснювалась із використанням програми “AnDatRa”, створеної Я. Бойчуком на мові Delphi1.0. Статистичну обробку даних та побудову графіків виконували з використанням програмного пакету Origin 6.0 (Microcal Software, Inc., Northampton MA, USA). Статистичні порівняння виконувалися за t-тестом Стьюдента, застосовуючи описані алгоритми (Урбах, 1964).

Результати досліджень.

Властивості гліцин-активованих струмів у пірамідних нейронах СА1 зони гіпокампу щурів

Аплікація гліцину (Gly) (100-200 мкМ) на ізольований пірамідний нейрон СА1 зони гіпокампу спричиняє появу відносно великого за амплітудою (до 5 нА) трансмембранного Cl- струму у 95% випадків. Визначене значення EGly для нейронів гіпокампу при фіксації потенціалу складало –16 мВ (при внукрішньоклітинній концентрації хлору [Cl-]in 70 мM та зовнішньоклітинній концентрації [Cl-]out 140 мM), що корелює із значенням рівноважного потенціалу для хлорного струму, вирахуваним за рівнянням Нернста (-18 мВ) та свідчить про активацію хлорних каналів. Концентрація половинної дії гліцину складала ЕС50=69.951.7 мкМ n=1.60.1. Гліцин-активовані струми були чутливими до дії конкурентного антагоніста гліцинового рецептора стрихніну (ІС50=15.721.8нМ, n=1.00.1) та не блокувалися бікукуліном, використаним у концентраціях, в котрих дана сполука повністю пригнічує ГАМК-активовані струми (2-10 мкМ). Таурин, що є більш слабким агоністом гліцинових рецепторів, активував гліцинові рецептори, що блокувалися стрихніном в присутності 2 мкМ бікукуліну. Концентрація половинної дії ЕС50 для таурину складає 4.88 мМ, що корелює із даними літератури, отриманими для гліцинових рецепторів пірамідних нейронів у зрізах гіпокампу .

Вище наведені експериментальні дані свідчать, що в нейронах СА1 зони гіпокампу щурів дійсно досліджувалися гліцин-активовані струми, і вивчення модуляційних аспектів дії фармакологічних агентів адекватно відображає їх ефективність стосовно стрихнін-чутливого гліцинового рецептора в пірамідних нейронах зони СА1 гіпокампу як обраної моделі.

Селективність дії гінкголідів по відношенню до гліцин-керованих стрихнін-чутливих рецепторів

Наступною частиною досліджень було визначення фармакологічних характеристик гінкголідів А, В, С та J (складових екстракту Ginkgo biloba). Для гінкголіда В хімічну структуру відображено на рисунку 1.А. Результати дослідів свідчать, що гінкголіди продемонстрували значну селективність до гліцин-активованих рецепторів, адже вони не впливали на NMDA- та AMPA-активовані струми та пригнічували ГАМК–активовані струми із активністю, у 20 разів меншою, ніж гліцин-активовані (Рис.1.Б).

Рис. 1. А. Хімічна будова гінкголіда В, як представника нового класу модуляторів гліцинового рецептора.

Б. Селективна дія гінкголідів А, В, С та J стосовно гліцин-активованих струмів порівняно з іншими ліганд-активованими трансмембранними струмами в пірамідних нейронах гіпокампу та нейронах Пуркін’є мозочка. Гліцин 100мкМ, ГАМК 100мкМ, L-аспартат 300 мкМ +10мкМ гліцин (як ко-агоніст) аплікувалися кожні 60-сек при підтримуваному потенціалі – 70 мВ. Гліцин- та NMDА -активовані струми реєструвалися на нейронах гіпокампу. ГАМК-активовані струми реєструвалися на нейронах Пуркін’є мозочка.

Діє-залежність та залежність від концентрації ефекту гінкголіда В на гліцин-активовані струми

Повторювані аплікації досліджуваних речовин виявили діє-залежність ефекту (use-dependent характер) усіх гінкголідів (А, В, С, J). Повторне аплікування кожного із гінкголідів призводило до поглиблення ефекту при незмінній концентрації агента. Пікове значення відповіді блокувалося набагато слабше, ніж значення, виміряне за “хвостом” струму (Рис. 2 А,Б).

Рис. 2. А. Діє-залежний ефект гінкголіда В (1 мкМ) на гліцин-активовані струми. Амплітуду струму було виміряно як значення піку та хвоста (2.7 сек після аплікування агоніста). Гінкголід В був аплікований сумісно із агоністом після п’яти успішних контрольних відповідей, а далі нейрон преаплікували в розчині, що містив гінкголід В, але вільному від агоніста і (n=9).

Б. Діє-залежний ефект гініголіда С (10 мкМ) на гліцин-активовані струми.

Для з’ясування механізмів дії гінкголідів, концентрації, в котрих вони аплікувалися, поступово збільшували. Так ефект гінкголіда В, як й інших гінкголідів, поглиблювався із збільшенням концентрації (Рис.3.А). Було побудовано криві концентраційної залежності дії для кожного із гінкголідів. Пікове значення відповіді (І) було нормалізовано відносно контролю (І0) і подано як відношення log концентрації відповідного гінкголіда. SD репрезентує стандартне відхилення. На рисунку 3.А. відображена крива концентраційної залежності для гінкголіда В.

Рис.3. А. Оригінальні записи відображають дію гінкголіда В в залежності від концентрації.

Б. Крива концентрація-ефект для гінкголіду В на гліцин-активовані струми (200 мкМ). Підтримуваний потенціал складав – 70 мВ. Отримані дані апроксимувалися рівняннм Хіла.

Гінкголіди діють безпосередньо на канал гліцин-керованого стрихнін-чутливого рецептора

Було з’ясовано, що гінкголіди приєднуються до каналу гліцинового рецептора, оскільки при аплікуванні агоніста протягом усього експерименту, та виключно під час аплікації агоніста характер дії досліджуваної сполуки був однаковий. Проте жодного ефекту на гліцин-індуковані відповіді не спостерігалося при аплікації гінкголіду В між аплікаціями агоніста. Тому було зроблено висновок, що найбільш вірогідно, гінкголід діє на іонну пору рецептора.

Отримані результати не виявляють точного сайту зв’язування представника нового класу антагоністів гліцинового рецептора, а лише вказують на його локалізацію всередині канальної пори, як найбільш вірогідний висновок, що випливає із проведених досліджень.

Гінкголід В не конкурує за центр зв’язування із агоністом гліцином та антагоністом стрихніном

Зв’язування гінкголіду із відкритим каналом робить малоймовірним приєднання молекули досліджуваної речовини до центру зв’язування агоніста гліцину чи, конкурентного антагоніста гліцинового рецептора, стрихніну. Проте ми прагнули перевірити таку можливість, для чого обчислили криву концентраційної залежності дії агоніста (у контролі) та криву дії агоніста на фоні аплікації гінкголіда В у концентрації 1 мкМ. Як видно із рисунка 4.А, крива концентраційної залежності для гліцину не потерпає статистично достовірного зсуву, що свідчить про відсутність конкуренції за центр зв’язування на гліциновому рецепторі між цими агентами.

Антагоністичний ефект гінкголіду В на гліцин-активовані струми також не залежав від концентрації стрихніну в інтервалі концентрацій 0.1 нМ-300 нМ (10 нейронів), що свідчить про відсутність конкуренції гінкголіду В за центр зв’язування із стрихніном на гліциновому рецепторі (Рис.4. Б). Гінкголід В (1 мкМ) не змінює антагоністичної дії стрихніну на гліцин-активовані струми.

Рис. 4. А. Ефект 1 мкМ гінкголіда В на концентраційну криву агоніста гліцину. Пік кожного гліцин-індукованого струму був нормалізований до максимального значення гліцин-активованого струму (1 мМ гліцину), н=13.

Б. Крива концентраційної залежності дії антагоніста стрихніну на гліцин-індуковані відповіді, та на фоні попереднього блокування гліцинової відповіді гінкголідом В (1 мкМ). Спочатку гліцинові відповіді блокувалися гінкголідом в насичуючій концентрації (до 5 аплікацій). Далі гінкголід В (1 мкМ) сумісно із стрихніном у вибраній концентрації аплікували на нейрон. Підтримуваний потенціал у всіх експериментах складав – 70 мВ.

Величини ЕС50 дії гліцину у контролі і на фоні дії гінкголіду складали EC50=69.51.7 мкM та EC50=97.316.8 мкM відповідно. За обчисленням t-тесту значення складало р>0.57, що свідчить відсутність конкуренції між гліцином та гінкголідом В за центр зв’язування.

Так обчислені із концентраційних кривих дії стрихніну та стрихніну на фоні насичуючої концентрації гінкголіду В, значення IС50 складали IC50(STR)= 15.72 1.8 та IC50 STR+1M ГінкголідВ= 14.95 0.18. Значення коефіцієнта Хіла у обидвох випадках не змінювалися (Рис. 4).

Потенціалзалежність дії гінкголіду В на гліцин-активовані струми

Було помічено, що дія гінкголіда В на гліцин-керовані рецептори є більш ефективною при негативних мембранних потенціалах (Рис.5). Така дія характерна для блокування відкритого каналу позитивно зарядженого хлорного каналу. Потенціалзалежність доведена як індивідуальна ВАХ (Рис.5 А,Б) чи середнє значення для 5 окремих клітин потенціалзалежності (Рис.5 В).

Рис.5. Потенціалзалежність антагоністичної дії гінкголіду В на гліцин-активовані струми.

A. Оригінальні відповіді гліцину (контроль) та на фоні 1 мкМ гінкголіду В. Гліцин у концентрації 100мкМ був аплікований кожні 60 сек (тривалість аплікації 3 сек.).

Б. Вольт-амперна характеристика струмів, зображена в секції А (н=5).

В. Середнє значення для 5-ти клітин зображено як нормалізований пік струму (I/I0) до підтримуваного мембранного потенціалу(Vh)

Відсутність конкуренції за центр зв’язування із блокатором хлорних каналів пікротоксином

Відомо, що пікротоксин - блокатор хлорних каналів, що активуються ГАМК, при застосуванні у високих мікро- та мілімолярних концентраціях здатний блокувати гліцин-активовані хлорні канали із меншою ефективністю. Оскільки за допомогою пікротоксину як фармакологічного агента, що діє виключно на гомомерні гліцинові рецептори та не приєднується до гетеромерного / рецептора , можна вирізнити гліцинові рецептори із певною субодиничною композицією, нами було використано пікротоксин як індикатор рецепторів із переважним складом 1 та 1/, що присутні в нейронах гіпокампу на різних стадіях постанального розвику. Пікротоксин у концентраціях до 1 мкМ не впливав на гліцин-індукований струм. В той час як високі (100 мкМ) концентрації пікротоксину пригнічували гліцинові відповіді концентраційно- залежно. За даними експериментів було побудовано криву концентрація-ефект дії пікротоксину на гліцинові рецептори і нейронах гіпокампу щурів 7- та 14-денного віку. У випадку наявності гетеромерних рецепторів, вклад яких зростає із розвитком тварини і починається з першого тижня постанатального розвитку, пікротоксин навіть у високих концентраціях не блокує такі струми. Значення ІС50 для дії пікротоксину на гліциновий рецептор у двох вікових групах складали 35443 мкM and 14012 мкM для 14 -та 7 -денних щурів відповідно.

Найбільш вірогідно, такі дані свідчать про різний субодиничний склад у двох обраних вікових групах. Такі результати дали змогу припустити, що внесок гетеромерних рецепторів у сумарну гліцинову відповідь на 7-ий та 14-ий день розвитку щурів дещо відрізняється, та наштовхнуло на думку про необхідність перевірки дії гінкголіда В на гліцинові рецептори в пірамідних нейронах 7-денних щурів.

За результатами експериментів побудовано криві концентраційної залежності дії блокатора відкритого гліцин-керованого каналу гінкголіда В на гліцинові рецептори у пірамідних нейронах гіпокампу щурів 7-денного віку. Дані були апроксимовані рівнянням Хіла за методом найменших квадратів. Відповідно, криві концентраційної залежності дії гінкголіда В у двох вікових групах як просторово взаєморозміщені, відображені на рисунку 6. Б.

Рис.6. А. Відсутність конкуренції за центр зв’язування між гінкголідом В та пікротоксином. Вимірювання проводилися на пірамідних нейронах гіпокампу щурів 14 днів віку. Для обчислення блокуючої дії пікротоксину на фоні аплікації гінкголіду В, останній використовували у концентрації 1 мкМ.

Б. Взаєморозміщення кривих концентрація-ефект для гінкголіда В на гліцин-активовані відповіді в пірамідних нейронах щурів різного віку (7 та 14 діб). Гліцинові відповіді індукувалися прикладанням гліцину в концентрації 200 мкМ. Підтримуваний потенціал складав у всіх випадках – 70 мВ.

Результати отриманих даних свідчать, що ІС50 дії гінкголіду на гліцинові рецептори у нейронах вибраних двох вікових груп суттєво відрізняються і складають ІС50(14)=0.267 мкМ та ІС50(7)=1.54мкМ. Ці дані можуть вказувати на те, що, на відміну до пікротоксину, гомомерні рецептори мають значно меншу афінність до гінкголіду В, ніж гетеромерні. Для перевірки цього припущення було проведено аналіз кривої концентрація-ефект для гінкголіду В, щодо виявлення двох різних концентраційних кривих які відповідали б дії цієї речовини на гомомерні та гетеромерні рецептори. На рисунку 6. Б. пунктирною лінією показана апроксимація даних рівнянням Хіла за методом найменших квадратів. Отримані параметри половинної блокуючої дії IC50 та коефіцієнт Хіла nH становили відповідно 1.6 M та 0.83 для 7-денних і 0.27 M та 0.92 для 14-денних щурів. Безперервною лінією показана апроксимація цих даних рівнянням за методом найменших квадратів, коли параметри n1 та n2 відповідно дорівнювали 1 та 0.9. Інші параметри KD1, KD2 та A варіювали протягом процедури ітерації. Найкращого узгодження було досягнуто при таких значеннях: KD1=2.9 M, KD2=0.2 M, A=71% для 7-денних та KD1=3.1 M, KD2=0.2 M, A=9% 14-денних щурів.

Отже, було встановлено наявність двох сигмоїдальних функцій з такими параметрами: відносна кількість гомомерних рецепторів ?1/б1 становила приблизно 71% та 9% для 7 та 14 денних щурів відповідно, а константа дисоціації KD була близькою до 3 мкМ, тоді як відносна кількість гетеромерних рецепторів ?1/в ?кладала 29% та 91% для цих вікових груп відповідно, а константа дисоціації KD становила близько 0.2 мкМ. Отримані результати підтверджують наше припущення про різну афінність гінкголіду В до гомомерних та гетеромерних гліцинових рецепторів.

Оскільки пікротоксин є блокатором хлорних каналів (в малих концентраціях до 10 мкМ блокує ГАМК-активовані рецептори і у високих - гліцин-активовані), було перевірено потенційно можливе перекривання центрів зв’язування всередині канальної пори пікротоксину та гінкголіда В (Рис. 6.А). При зіставленні кривих концентраціїної залежності дії пікротоксину та пікротоксину на фоні гінкголіда В зміщення кривої, характерної для конкурентної дії, не спостерігалося. Як видно із рисунка 6.А, присутність гінкголіда В у каналі сприяла посиленню активності пікротоксина як блокатора, значення ІС50 для пікротоксину у присутності гінкголіда В (1мкМ) складало 92 мкМ. Для пояснення такого зсуву концентраціїної кривої можна припустити, що в нейронах гіпокампу щурів 14-денного віку крім експресованих гетеромерних 1/ рецепторів, ще залишається частина гомомерних 1/1 рецепторів, які мають більшу афінність до пікротоксину.

Таким чином, полегшення дії пікротоксину в присутності гінколіду В у пірамідних клітинах гіпокампу 14-денних щурів може відбуватися завдяки більш ефективному блокуванню (1 мкМ) гінкголідом В гетеромерних рецепторів.

Прикладання гінкголіду В попереджає індукцію LTP

Для отримання ЗПСП, що визначають феномен довготривалої (LTP) та короткотривалої потенціації (STP) в зоні СА1 гіпокампу щура використовувався 1 сек та 0.2 сек епізоди високочастотної стимуляції відповідно. Концентрацію гінкголіда було вибрано, виходячи із раніше опублікованих даних про пригнічення гінкголідом В довготривалої потенціації як в зоні СА1 гіпокампу, так і в інших структурах мозку, для яких описано присутність феномену LTP . Аплікація гінкголіду В в концентрації 5 мкМ повністю пригнічувала ЗПСП (LTP). Натомість, ЗПСП, що вимірювалися на 15 хвилині після стимуляції (STP), були пропотеційовані внаслідок прикладання гінкголіду В (Рис.7 А,Б)

Рис. 7. Зміни в тривалості спаду збуджуючих постсинаптичних потенцалів ЗПСП в СА1, індукованого високочастотною стимуляцією (100 Гц) колатералей Шафера.

А. ЗПСП, індуковані епізодом 0.2 сек та 1 сек-тривалістю відповідно в контролі.

Б, В. Вплив гінкголідів (гінкголіда В (5 мкМ) та гінкголіда J (5 мкМ)) на стривалість спаду ЗПСП, індукованих епізодом 0.2 сек та 1 сек-тривалістю відповідно..

У наступному експерименті було використано гінгколід J, котрий виявився найслабкішим модулятором гліцинових рецепторів та слабким антагоністом PAF. Оскільки значення половинної дії для блокування гінкголідом J GlyRs складало 2 мкМ, а для блокування PAF рецептора – 54 мкМ, то таке концентраційне вікно дало змогу використати гінкголід J у концентрації, в котрій ця сполука активна виключно відностно гліцинових рецепторів, та не впливає на функціонування PAF рецепторів (5 мкМ). Було з’ясовано, що ефект пригнічення гліцинових рецепторів не впливає на параметри ЗПСП (LTP) (Рис.7 В).

При використанні конкурентного антагоніста гліцинових рецепторів стрихніну (2 мкМ), зміни параметрів LTP не спостерігалося також, у той час як прикладання гінкголіду В на фоні стрихніну призводило до повторювання ефекту прикладання гінкголіду В поодиноко (Рис.8)

Рис. 8. Тривалість та амплітуда ЗПСП, викликаних 0.2-сек та 1-сек епізодом високочастотної стимуляції після аплікації стрихніну (2 мкМ) та після аплікації стрихніну (2 мкМ) та гінкголіду В (5 мкМ).

Варто прокоментувати два основні висновки, що випливають із результатів проведеної серії експериментів. По-перше, було виявлено, що синаптосомальний антагоніст рецептора фактора активації тромбоцитів перешкоджає індукуванню LTP в зоні СА1 гіпокампу щурів, що викликалась високочастотною стимуляцією. По-друге, аплікування слабкого антагоніста PAF рецепторів, гінкголіда J, в концентрації, достатній для блокування гліцинових рецепторів, ніяк не вплинула на індукцію чи подовження в часі LTP в зоні СА1 гіпокампу.

Таким чином, було експериментально доведено, що антагоністи PAF рецептора в СА1 зоні гіпокампу пригнічують LTP. В зв’язку із раніше отриманими даними, стосовно антагоністичної ролі гінкголідів на гліциновий рецептор було проведено ряд дослідів, в котрих потенційна роль гліцинових рецепторів в LTP не була доведена, тобто, в основі ефекту гінкголідів на LTP феномен в СА1 зоні гіпокампу лежить їх конкурентна дія на PAF-активовані рецептори. В той час, доведено вклад гліцин-активованих стрихнін-чутливих рецепторів в гіпокампі в явищі STP, індукованому високочастотною стимуляцією.

Обговорення результатів

Виходячи із факту, що екстракт Ginkgo biloba представляє собою комплекс компонентів, ми прагнули проаналізувати їх окремі ефекти на основні типи рецептор-канал-систем в мембрані нейронів. Було проведено дослідження дії гінкголідів А, В, С та J на Na-TTX-чутливі, Na-TTX-нечутливі канали та AMPA-, NMDA-, ATP- та гліцин-індуковані струми. Всі перелічені гінкголіди в концентрації 10 мкМ не змінювали жоден із потенціал- чи хемо-активованих струмів, окрім гліцин-індукованих. Всі гінкголіди у концентрації 10 мкМ суттєво зменшували амплітуду гліцин-індукованого струму. Їх дія була концентраційно-залежною, та ефект мав діє-залежний (use-dependent) характер. Крім того, кожен із гінкголідів проявляв антагоністичну активність лише у випадку відкритого каналу гліцинового рецептора. Стосовно гінкголіду В, як і інших гінкголідів, було зареєстровано потенціал-залежність ефекту, що разом із фактом діє-залежності ефекту свідчить про дію сполук як канальних блокаторів гліцин-керованого каналу.

Для більш повного з’ясування сили дії сполук на гліциновий рецептор було отримані дані, що використалися для побудови кривих доза-ефект для інгібування гліцинової відповіді, викликаної аплікацією 200 мкМ гліцину кожним із гінкголідів. Величини ІС50, отримані із кривих, складають 1.97; 0.273, 0.267 та 2.0 мкM для гінголідів А, В, С та J відповідно. Значення коефіцієнта Хіла у всіх випадках було наближено до одиниці, що свідчить про поєднання молекули блокатора та каналу гліцин-активованого рецептора у стабільному відношенні 1:1.

Гінгколід В, як найбільш активний представник нового класу блокаторів гліцин-керованого рецептора не конкурував за центр зв’язування гліцину та конкурентного антагоніста стрихніну. Відсутність перекривання сайту зв’язування стрихніну і гінкголіду В, вкупі із раніше виявленими ефектами діє-залежності, потенціалзалежності та дії виключно на відкритий в присутності агоніста канал підтверджують факт дії гінкголіду, як і інших гінкголідів на певний, можливо специфічний сайт всередині пори іонного каналу.

Наступна серія експериметнів була спрямована на визначення можливого зв’язку між ефективністю блокатора та субодиничною будовою гліцинового рецептора. Нами було використано пікротоксин як фармакологічний агент за допомогою якого можна вирізнити гліцинові рецептори, що є гомомерними та гетеромерними. Оскільки за даними літератури ембріональна 2 субодиниця у постнатальному періоді заміщується на 1, а імуногістохімічні експерименти виявили лише 1- та 1/- вмісні рецептори в пірамідних нейронах гіпокампу, то використання пікротоксину як індикатора структури рецепторів можна вважати єдино доцільним.

За даними блокування пікротоксином гліцин-індукованих відповідей у нейронах 7- та 14 денних щурів можна зробити висновок про присутність гетеромерних рецепторів як в першій, так і в другій вікових групах. Аналізуючи дві сигмоїдальні криві, що були апроксимовані функцією 2, ми встановили приблизний внесок гомомерних рецепторів у двох вікових групах. Так у 7-денних щурів відсоток гомомерних рецепторів складав 71%, в той час як у 14-денних- 9%. Оскільки при прикладанні гінкголіду В пригнічувались в більшій мірі гетеромерні гліцинові рецептори, то, таким чином відбувалося збільшення відсоткового внеску гомомерних, котрі далі блокувалися пікротоксином. Так значення половинної дії пікротоксину на фоні гінкголіду В складало ІС50=92 мкМ, що значно відрізняється від значення половинної дії ІС50=354 мкМ, отриманого із кривої концентраційної залежності дії пікротоксину, прикладеного поодиноко. Тобто, із проведених експериментів випливає, що, дійсно, гінкголід В є більш ефективним відносно гетеромерних гліцинових рецепторів.

Як відомо, існує ряд модуляторів функцій гліцинового рецептора, проте за умов відсутності фармакологічних агентів, із застосуванням яких можна безпосередньо визначити субодиничний склад рецептора, тонкі механізми їх дії часто залишаються невідомими. Для визначення потенційного складу гліцинових рецепторів відомо небагато агентів. Так цианотрифенілборат пригнічує 1-вмісні гліцинові рецептори із значенням половинної дії IC50=1.3 M, в той час як 2 гомомерні рецептори пригнічуються цим блокатором значно слабкіше (IC5020 M). Другим агентом є пікротоксин, що був використаний у наших експериментах. Таким чином, згідно із отриманими результатами, гінкголід В є першим відомим канальним блокатором, дія якого залежить від конфігурації рецептора, має вищу чутливість до переважно гетеромерних гліцинових рецепторів.

У другій серії експериментів було перевірено можливість залучення гліцинових рецепторів до каскаду подій довготривалої потенціації, викликаної високочастотною стимуляцією в гіпокампі щурів, виходячи із факту двоякого антагонізму гінкголіда В стосовно PAF та гліцинових рецепторів. Отримані нами результати підтвердили, що антагоніст фактора активації тромбоцитів, гінкголід В, BN52021, в концентрації 5 мкм, дійсно пригнічує індукцію LTP, викликану високочастотною стимуляцію в зоні СА1 гіпокампу щурів. В наших експериментах аплікація гінкголіда В (5 мкМ) повністю інгібувала появу ЗПСП (LTP), що вимірювався на 60 хв після 1 сек високочастотної стимуляції. В той самий час, гінкголід В, що аплікувався в концентрації 5 мкМ значно підвищував значення STP, ЗПСП, що реєстрували на 15 хв після 0.2 сек високочастотної стимуляції. Таким чином, виходячи із ефектів гінкголіда В на ініціацію LTP, можна припустити потенціальну роль PAF рецептора в каскаді цих реакцій. Окрім тавтологічної ролі гліцинових рецепторів поряд із ГАМК в гіпокампі, ми припустили, що здатність гінкголідів блокувати гліцин-керовані канали може екранувати ефект гінкголіда В безпосередньо на PAF рецептор. Тому у наступній серії експериментів ми використали конкурентний антагоніст гліцинових рецепторів стрихнін в концентрації 2 мкМ, в котрій стрихнін не викликає судом чи епілептичної активності , також не здатний блокувати ГАМКА рецептори, як це відомо (ІС50=6.7 мкМ) . Аплікування стрихніну в такій концентрації не змінювала індукції LTP. Поєднане аплікування стрихніну (2 мкМ) із гінкголідом В (5 мкМ) повторювало ефект, отриманий при аплікації лише гінкголіду В.

Наступним кроком було проведення експерименту із використанням іншого гінкголіду J в концентрації 5 мкМ, в якій він здатний антагонізувати гліцинові рецептори, проте неефективний відносно PAF рецепторів. При аплікації гінкголіду J, в концентрації 5 мкМ, не було виявлено жодних ефектів на індукцію чи подовження процесів LTP. Керуючись висновками, що випливають із даних експериментальних досліджень, можна підсумувати, що припущена нами роль гліцинових рецепторів в індукції LTP не підтвердилася. Не можна безкомпромісно стверджувати відсутність будь-якого опосередкованого впливу гліцинергічної передачі на реакції довготривалої потенціації, проте в умовах, прийнятих в нашій роботі, та із використанням обраного методичного підходу вище прийнята гіпотеза в експериментах не підтвердилася.

Висновки

1. Використовуючи метод “петч-кламп” у конфігурації “ціла клітина” було доведено присутність гліцин-активаних стрихнін-чутливих рецепторів в ізольованих пірамідних нейронах гіпокампу щурів та доповнено відомості щодо раніше відомих фармакологічних властивостей.

2. Відкрито новий клас селективних блокаторів гліцин-керованого хлорного каналу серед гінкголідів (складових екстракту Ginkgo biloba). Активні концентрації гінкголідів як модуляторів визначаються наномолярною та субмікромолярною шкалою. Значення половинної дії (ІС50) складають 1.97; 0.273, 0.267 та 2. мкM для гінголідів А, В, С та J відповідно. Значення коефіцієнта Хіла у всіх випадках було наближено до одиниці, що свідчить про поєднання молекули антагоніста та гліцин-активованого рецептора у стабільному відношенні 1:1.

3. З’ясовано механізм антагоністичної дії гінкголіду В, як представника нового класу блокаторів на гліциновий рецептор. Доведено, що гінкголід В є блокатором гліцин-керованого хлорного каналу із характерною унікальною особливістю діє-залежного ефекту, що пояснює поступовість дії цієї сполуки в залежності від прикладання. Діє-залежність гінкголіда, що в поєднанні із фактом залежності від потенціалу свідчить про приєднання молекули сполуки до