НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІООГРАНІЧНОЇ ХІМІЇ ТА НАФТОХІМІЇ

Костенко Олександр Миколайович

УДК 577.336+57.08.088.5+542.95

Застосування реакції пірилоціанінів з амінами в синтезі кон’югатів піридоціанінів з біомолекулами

02.00.10 – біоорганічна хімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата хімічних наук

Київ – 2003

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі структури і функцій нуклеїнових кислот Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ.

Науковий керівник: |

Кандидат хімічних наук, старший науковий співробітник

Ярмолюк Сергій Миколайович

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ

старший науковий співробітник відділу структури і функції нуклеїнових кислот

Офіційні опоненти: | Доктор хімічних наук, старший науковий співробітник

Броварець Володимир Сергійович

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, м. Київ

провідний науковий співробітник відділу хімії азотовмісних біоактивних гетероциклічних основ

Кандидат хімічних наук, старший науковий співробітник

Ковтун Юрій Петрович

Інститут органічної хімії НАН України, м. Київ

старший науковий співробітник відділу кольору та будови органічних сполук

Провідна установа: | Фізико-хімічний інститут ім. О. В. Богатського НАН України, м. Одеса

відділ медичної хімії

Захист відбудеться 28 березня 2003 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д26.220.01 в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, 02660, Київ-94, вул. Мурманська, 1.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, 02660, Київ-94, вул. Мурманська, 1.

Автореферат розісланий 28 лютого 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д. М. Федоряк

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Стрімкий розвиток молекулярної біології та біотехнології потребує швидких і зручних методів детекції нуклеїнових кислот (НК) та білків. На заміну радіоактивним міткам, що традиційно застосовуються з цією метою, приходять ефективніші, зручніші, дешевші та безпечніші спектрально-люмінесцентні методи детекції. Це вимагає пошуку як нових барвників, придатних для цієї мети, так і методів їх ковалентної кон’югації з біомолекулами.

Завдяки своїм унікальним спектрально-люмінесцентним властивостям ціанінові барвники є найчутливішими з нині існуючих флуоресцентних зондів для кількісного та якісного визначення НК. Молекулярні зонди, що містять ковалентно приєднану молекулу ціанінового барвника, успішно застосовуються для проведення полімеразної ланцюгової реакції, детекції НК в розчинах та гелях, для локалізації рецепторів у клітинах.

Хоча реакція пірилоціанінів з амінами добре відома, систематичних досліджень взаємодії пірилоціанінів з біомолекулами не проводилось.

Майже всі функціональні групи, які здатні реагувати з аміногрупою, широко застосовуються в біоогранічній хімії для кон’югації. Солі пірилію до наших досліджень з цією метою не використовувались.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалася в рамках державної бюджетної теми “Синтез та вивчення механізму взаємодії ціанінових флуоресцентних зондів з нуклеїновими кислотами” № 2.2.4.16 за 1997-99 р. ( № держ. реєстрації: 0197U004292), а також в рамках спільного міжнародного проекту Інституту молекулярної біології і генетики НАН України та Ліверморської національної лабораторії Каліфорнійського університету (Lawrence Livermore National Laboratory, Livermore, CA, USA) за програмою ІРР Міністерства енергетики США, реєстраційний номер В507077.

Мета роботи полягала в розробці нового синтетичного методу для кон’югації пірилоціанінів з біомолекулами, в синтезі та дослідженні спектрально-люмінесцентних властивостей модельних кон’югатів ціанінових барвників з олігонуклеотидами та білками.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

· провести реакцію пірилоціанінів з аліфатичними амінами в таких умовах, в яких не руйнується більшість біомолекул;

· дослідити кінетику реакції пірилоціанінів з низкою амінокислот, вивчити вплив природи амінокислоти, температури, лужності середовища та природи буфера і розчинника на перебіг реакції;

· дослідити можливі побічні реакції з іншими функціональними групами (ФГ) біомолекул;

· вивчити вплив природи ціанінових барвників та замісників у пірилієвому циклі на перебіг реакції кон’югації;

· синтезувати модельні кон’югати ціанінових барвників з олігонуклеотидами та білками, дослідити їхні спектрально-люмінесцентні властивості у вільному стані та при взаємодії з біомолекулами.

Об’єкт дослідження – пірило- та піридоціаніни, кон’югати піридоціанінів з амінокислотами, білками та синтетичними аміноалкілолігонуклеотидами.

Предмет дослідження – реакція пірилоціанінів з амінами в м’яких умовах, застосування цієї реакції для ситезу кон’югатів піридоціанінів з біомолекулами.

Методи дослідження – хімічний синтез, УФ та видима електронна спектроскопія, флуоресцентна спектроскопія, тонкошарова, високоефективна рідинна та газова хроматографія, хроматомасспектрометричний аналіз, гель-фільтрація та електрофоретичні методи.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше застосовано реакцію пірилоціанінів з аліфатичними амінами для ковалентного мічення аміноалкілолігонуклеотидів та білків. Досліджено вплив природи амінокомпоненти, температури, рН середовища, природи буфера та розчинника на перебіг реакції мічення білків та аміноалкілолігонуклеотидів. Вивчено вплив природи ціанінових барвників та замісників у пірилієвому циклі на перебіг реакції кон’югації, досліджено взаємодію пірилоціанінів з іншими ФГ біомолекул. Синтезовано низку модельних кон’югатів піридоціанінів з олігонуклеотидами та білками, досліджено їхні спектрально-люмінесцентні властивості.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено і запропоновано для практичного використання зручний метод кон’югації пірилоціанінів з біомолекулами. Інститут молекулярної біології і генетики та фірма Fluorescent BioProbes GmbH підписали контракт та подали заявку на патент “Verfahren und Verbindungen zur Fluoreszenzmarkierung von Biomolekulen und Polymer-Partikeln” (Ger. Appl. 101.53.818.9 (05. Nov. 2001)) на спільне комерційне використання реакції пірилієвих солей та описаних пірилоціанінів для кон’югації флуорофорів з аміногрупою біомолекул.

Особистий внесок здобувача. Основний об’єм експериментальної роботи, обробка і аналіз отриманих результатів, формулювання висновків дисертаційної роботи виконані пошукувачем одноосібно. Автором особисто досліджено кінетику взаємодії пірилоціанінів з амінокислотами, запропоновано оптимальні умови проведення реакції для різних пірилоціанінів, інтерпретовано результати хроматографічних та хроматомасспектрометричних аналізів, синтезовано, виділено та охарактеризовано олігонуклеотидні та пептидні кон’югати піридоціанінів. Частину спектральних досліджень та ПЛР проведено у співпраці з Дмітрієвою С.Ю., Дубеєм І.Я., Дмитренко В.В., Ковальською В.Б. та Лосицьким М.Ю. Постановка задачі та обговорення результатів проведені з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи доповідалися на Міжнародній конференції з органічної хімії (Харків, 1995), 8 Європейській конференції з спектроскопії біологічних молекул (Голландія, Еншеде, 1999), XV Науковій конференції з біоорганічної хімії та нафтохімії (Київ, 2000), 3 Хорватській конференції з біотехнології та навколишнього середовища (Хорватія, Загреб, 2001), VII Конференції з методів та застосування флуоресцентної спектроскопії (Голландія, Амстердам, 2001), а також на наукових семінарах відділу структури і функцій нуклеїнових кислот ІМБіГ НАН України.

Публікації. Основний зміст роботи відображено у 6 статтях в наукових фахових журналах та 7 тезах доповідей на наукових конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 154 сторінках друкованого тексту. Вона складається із вступу, основної частини (огляд літератури, матеріали і методи, обговорення результатів) та підсумкових висновків. Перелік цитованої літератури налічує 109 найменувань. Робота містить 53 рисунки та 12 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У першому розділі розглянуто методи кон’югації молекул-зондів з аміногрупою біомолекул. Як правило, такі молекули містять амінореактивні ацилюючі групи, які утворюють аміди, сульфаміди, сечовини або тіосечовини в результаті реакції з амінами. Використовуються також реакції алкілування та відновлювального алкілування аміногрупи біомолекули для кон’югації з зондами. Співставлено переваги та недоліки відомих методів кон’югації.

Детально розглянуто ціанінові барвники, які використовуються для ковалентного мічення олігонуклеотидів, НК та білків. Показано, що ціанінові барвники набувають дедалі більшого поширення як флуоресцентні мітки біомолекул.

Наведено огляд літератури про механізм реакції солей пірилію з первинними амінами, акцентовано увагу на можливих побічних реакціях. Окремо розглянуто реакцію пірилоціанінів з амінами.

У другому розділі наведено методики проведення реакції пірилоціанінів з амінокислотами, синтезу кон’югатів піридоціанінів з олігонуклеотидами та пептидами. Описано процедури виділення та аналізу синтезованих речовин, дослідження їх спектральних властивостей.

У третьому розділі подано результати експериментальних досліджень та їхнє обговорення.

Дослідження реакції пірилоціанінів з амінами. Реакція пірилієвих ціанінових барвників з первинними амінами є одним із добре відомих методів отримання піридинієвих ціанінових барвників, однак жорсткі умови її проведення абсолютно не прийнятні для мічення біологічних об’єктів (рис. 1).

Рис. 1. Реакція пірилоціаніну Cyan39 з амінами.

Для розробки м’яких умов проведення реакції була застосована 6-аміногексанова (Аср) кислота як модельна амінокомпонента. Її аміногрупа схожа за хімічними властивостями як на аміногрупу аміноалкілмодифікованих олігонуклеотидів, так і на -аміногрупу лізину, по якій, як правило, модифікуються пептиди та білки. У якості буферів для проведення реакції було застосовано натрійкарбонат-бікарбонатний та триетиламонійацетатний (ТЕАА) буфери. Вони не містять катіонів амонію і первинних та вторинних аміногруп, які можуть реагувати із солями пірилію. Наявність оцтової кислоти у триетиламонійацетатному буфері, згідно з літературними даними, повинна сприяти циклізації проміжного нециклічного продукту реакції.

Реакція досліджувалася при молярному співвідношенні 6-аміногексанової кислоти та Cyan39 1:1. Для реальної кон’югації краще брати надлишок барвника, але при спостереженні за перебігом реакції за зміною електронного спектру поглинання надлишок пірилієвого барвника маскував би перехід Cyan39Cyan40 (рис.2).

Рис. 2. Електронні спектри поглинання барвників Cyan39 та Cyan40.

У результаті проведених досліджень було встановлено, що кон’югацію з аміноакілмодифікованими олігонуклеотидами краще проводити при температурі 50С у 0,1М ТЕАА буфері, насиченому триетиламіном (рН 12).

Нуклеотидні основи аденіну, гуаніну та цитозину, що входять до складу природних та синтетичних полінуклеотидів, мають екзоциклічні аміногрупи. Основність цих аміногруп досить низька, але вони можуть ацилюватися хлорангідридами або активованими естерами кислот. Для перевірки їхньої реакційної здатності стосовно пірилоціанінів ми провели низку експериментів. Еквімолярні співвідношення Cyan39 та аденозину, гуанозину або цитидину, відповідно, нагрівали у суміші вода-ДМСО в присутності ТЕАА або карбонат-бікарбонатного буферів. Спектрофотометричний контроль реакційних сумішей показав, що перетворення пірилоціаніну в піридоціанін не відбувається навіть при використанні буферів з максимально лужним рН і при нагріванні до 65С протягом 6 год.

Отже, при проведенні кон’югації з аміноалкілолігонуклеотидами реакція проходить винятково по алкіламіногрупі, а екзоциклічні аміногрупи нуклеотидних основ при цьому не модифікуються.

Використання цієї реакції для кон’югації ціанінових барвників з білками та пептидами вимагає більш детального вивчення взаємодії пірилоціанінів з амінокислотами.

Нами було досліджено час реакції Cyan39 з аміногрупами різних амінокислот в залежності від їхньої природи. Реакція досліджувалась при 50оС в інтервалі рН 9,2-11,6 в двох буферах.

Як природа амінокислоти впливає на швидкість реакції при різних рН видно з табл. , 2.

Таблиця 1

Час реакції (хв) Cyan39 з амінокислотами в 0,1М карбонат-бікарбонатному буфері

рН | Acp | Lys | Ser | Cys | Gly | Ala | Val | Trp | His | Asp

9,2 | 115 | 42 | 240 | 80 | 150 | - | - | - | - | -

9,8 | 20 | 35 | 95 | 65 | 30 | - | - | >240 | >240 | >240

10,1 | 11 | 30 | 60 | 50 | 26 | 180 | 240 | 180 | 135 | 160

10,5 | 7 | 10 | 40 | 10 | 22 | 50 | 105 | 80 | 75 | 60

10,8 | 5 | 7 | 32 | 10 | 12 | 45 | 90 | 75 | 65 | 40

- -реакція практично не йде

Таблиця 2

Час реакції (хв) Cyan39 з амінокислотами в 0,1М ТЕАА буфері

рН | Acp | Lys | Ser | Cys | Arg | Gly | Ala | Val | Trp | His | Asp

11,3 | 40 | 40 | >150 | 150 | - | 25 | - | - | - | - | >150

11,45 | 35 | 37 | 150 | 100 | - | 15 | - | - | - | - | 145

11,6 | 20 | 20 | 80 | 60 | 95 | 9 | 85 | 95 | 100 | 95 | 110

- -реакція практично не йде

Амінокислоти реагують з Cyan39 і при температурах, нижчих за 50оС, але швидкість реакції при цьому значно знижується. Так, у ТЕАА буфері з рН 12 реакція повністю проходить з усіма амінокислотами при кімнатній температурі менше, ніж за 24 години. Отже, дану реакцію можна застосовувати і для термонестабільних білків. Дані про швидкість перебігу реакції Cyan39 з амінокислотами при різних температурах наведено у табл. 3.

Таблиця 3

Час реакції Cyan39 з амінокислотами при різних температурах (ТЕАА рН 12, 30% ДМСО)

t,єC | Acp | Gly | Ala | Val | Ser | His | Trp | Arg | Asp

18 | 2год | 2год | 24год* | 24год* | 24год* | 24год* | 24год* | 24год* | 24год*

25 | 85хв | 70хв | - | - | - | - | - | - | -

40 | 15хв | 12хв | 60хв | - | 90хв | - | - | 2год | -

* – час проходження реакції в інтервалі 2 год – 24 год;

- - вимірювання не проводилися

Крім вивчення швидкості взаємодії амінокислот з Cyan39, були досліджені також реакції з бічними функціональними групами амінокислот. Встановлено, що гідроксильна, тіольна, карбоксамідна, гуанідінова групи та імідазольне кільце не заважають проведенню кон’югації з -аміногрупами при використанні триетиламонійацетатного буферу. Іншими словами, при кон’югації Cyan39 з білками реакція повинна проходити, головним чином, по -аміногрупах лізину та, меншою мірою, по N-кінцевій аміногрупі в залежності від її природи.

Ми дослідили можливість застосування інших пірилоціанінів для ковалентного мічення біомолекул цим методом. Так, було вивчено реакційну здатність низки монометинових та карбоціанінових пірилієвих барвників стосовно аміногрупи різних амінокислот в триетиламонійацетатному буфері при 50С. В табл. 4 наведено хімічні структури пірило- та піридоціанінів та максимуми їх електронних спектрів поглинання.

Таблиця 4

Хімічні структури, умовні позначення та максимуми поглинання (у етанолі) досліджених пірило- та піридоціанінів

Встановлено, що на реакційну здатність -пірилієвих барвників щодо амінокислот впливають природа азотовмісного гетероциклу молекули ціаніну та стерична доступність гетероциклічного атома кисню. -Пірилоціаніни з бензтіазольними та індоленільними ядрами можуть бути застосовані для кон’югації з біомолекулами, у той час як з бензоксазольними аналогами провести реакцію у водному розчині не вдалося. Замісники в азотовмісному гетероциклі -пірилоціаніну виявляють незначний вплив на перебіг реакції, у той час як об’ємні замісники у -положенні пірилієвого гетероциклу ціаніну заважають утворенню піридоціаніну.

Подовження метиленового ланцюгу пірилоціанінів знижує їхню розчинність у воді, тому для проведення кон’югації з карбоціанінами необхідно підвищувати вміст органічного полярного розчинника в реакційній суміші до 50% - 90%. -Пірилокарбоціаніни також реагують з амінокислотами з утворенням піридокарбоціанінів у 90% ДМСО. -Пірилієвий монометиновий барвник Cyan104 не реагував з амінокислотами у жодних із досліджених нами умовах.

Кон’югація пірилоціанінів з модельними аміноалкіл-олігонуклеотидами. 5’-Аміногексилпентадекатимідин був синтезований твердофазним карбонілдіімідазольним методом і використовувався для кон’югації без попередньої очистки. Для підвищення виходу олігонуклеотидного кон’югату використовували 50-кратний надлишок пірилієвого барвника.

Рис. 3. Профіль ВЕРХ неочищеного кон’югату Т-15-Cyan40 (детекція на 260 нм та 444 нм), та електронний спектр поглинання продукту.

З профілю ВЕРХ (рис. 3.) видно, що вихідний аміноалкілпентадекатимідилат (час виходу 20,9 хв) більше ніж на 90% перетворюється у кон’югат (час виходу 24,1 хв). Піки з часом виходу до 20 хв (близько 30% по інтегральній площі поглинання на 260 нм) відповідають домішкам у вихідному олігонуклеотиді і не містять аміноалкільних груп. Співвідношення інтенсивностей поглинання А444/А260 кон’югату (0,56) свідчить про співвідношення барвник:олігонуклеотид 1:1 і задовільно збігається з розрахованим значенням (0,52).

Барвник MDO39 був аналогічно кон’югований до 5’-аміногексилпентадекатимідіну з виходом близьким 90%. На рис. 4 наведено профіль ВЕРХ та спектр поглинання кон’югату, очищеного електрофорезом на поліакриламідному гелі.

Рис. 4. Профіль ВЕРХ очищеного кон’югату Т-15-MDO40, детекція на 260 нм, та електронний спектр поглинання продукту.

Для модифікації монометином Indo40 та карбоціанінами Cindo40, CСyan40 і MDOC40 було використано 5’-аміногексилмодифікований фрагмент гену -галактозидази довжиною в 18 основ. Зазначені барвники вступають у реакцію з аміногрупою у м’яких умовах лише при відносно високій концентрації органічного розчинника в реакційній суміші, тому кон’югація проводилась в 50% ДМФА. Як буфер використовували 0,1М ТЕАА, насичений триетиламіном, з рН 12.

Структура отриманих кон’югатів наведена на рис. 5.

На рис. 6 наведено результати хроматографічного аналізу переосадженого олігонуклеотидного матеріалу кон’югату Cindo40. Незначні залишки вихідного аміноалкілолігонуклеотиду (час виходу 12 хв) свідчать про високий ступінь кон’югації. Досить інтенсивні піки з меншим часом виходу відповідають неаміноалкілованим домішкам полінуклеотидної природи, що містилися у вихідному олігонуклеотиді. Чистий кон’югат має час виходу 13,8 хв, а його електронний спектр поглинання свідчить про співвідношення барвник:олігонуклеотид 1:1.

Рис. 5. Структура кон’югатів ціанінових барвників з фрагментом гену 18--галактозидази

Рис. 6. Профіль ВЕРХ неочищеного кон’югату Cindo40-Gal18 (детекція на 256 нм та 519 нм), та електронний спектр поглинання продукту

Підсумовуючи, можна сказати, що для кон’югації з аміноалкілолігонуклеотидами найкраще використовувати триетиламонійацетатний буфер з рН 11,5 – 12. Враховуючи здатність ціанінових барвників до специфічного нековалентного зв’язування з нуклеотидними основами у складі НК, для кон’югації краще брати великий надлишок пірилоціаніну. Після переосадження олігонуклеотидного матеріалу у ньому практично не залишається нековалентнозв’язаного барвника, а електронні спектри поглинання свідчать про наявність стехіометричної кількості піридоціаніну, приєднаного до олігонуклеотиду.

Спектрально-люмінесцентні дослідження. Спектрально-люмінесцентні властивості кон’югатів Indo40, Cсyan40, Cindo40 та MDOC40 з фрагментом гену 18--галактозидази були досліджені у вільному стані та у дуплексах з комплементарними олігонуклеотидами. Електронні спектри поглинання вільних кон’югатів у видимій області мають форму, схожу на електронні спектри поглинання вільних піридинієвих барвників. Але максимуми поглинання барвників у складі кон’югатів зсунуті на 16-35 нм у довгохвильову область спектру порівняно з максимумами поглинання вільних піридинієвих аналогів.

Досліджувалась флуоресценція отриманих кон’югатів у вільному стані та при утворенні дуплексів з комплементарною ДНК. Спектри флуоресценції наведено на рис. 7,8.

Рис. 7. Спектри флуоресценції кон’югатів ціанінових барвників з -Gal-18

Рис. 8. Спектри флуоресценції кон’югатів ціанінових барвників з вGal-18 у складі дуплексів з комплементарною ДНК

Інтенсивність флуоресценції кон’югатів у дуплексах нижча, ніж у вільному стані. Найвища інтенсивність флуоресценції у кон’югата СCyan40-18Gal як у вільному стані, так і при утворенні дуплексів. Інтенсивність флуоресценції інших кон’югатів нижча у вільному стані та понижується у 2-3 рази при утворенні дуплексів.

Максимуми флуоресценції дуплексів майже не відрізняються від максимумів флуоресценції вільних кон’югатів, спектральні зсуви при утворенні дуплексів незначні та не перевищували 2 нм.

Вивчалась чутливість детекції вільних кон’югатів та утворених ними дуплексів. Водні розчини, що мали однакові концентрації олігонуклеотидних кон’югатів, та тих же кон’югатів у складі дуплексів з плазмідою pGEM-3Z, поступово розводили водою та вимірювали інтенсивність їхньої флуоресценції. “Найяскравішим” виявився кон’югат ціанінового барвника СCyan40. Його флуоресценція, як у вільному стані, так і у складі дуплекса, була помітною до концентрації порядку 10--8М. Флуоресценція інших кон’югатів спостерігалась до концентрацій порядку 10-7М.

Рис. 9. Гель-електрофорез продуктів ПЛР. 1- Indo40 - 18Gаl, 2 - Cindo40 - 18Gаl, 3 – MDOC40 - 18Gаl, 4 - CCyan40 - 18Gаl. Верхні смуги відповідають продуктам ПЛР, нижні – вільним кон’югатам.

Можливість використання зазначених піридоціанінів як флуоресцентних міток була підтверджена проведенням полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з використанням синтезованих кон’югатів у якості праймерів (рис. 9.).

Кон’югація пірилоціанінів з модельними пептидами. Для кон’югації барвників з білками використано лізоцим та сироватковий альбумін бика (БСА). Реакції з барвниками Cyan 39, Ccyan 39, Cindo39 та PhMe39 проводили при 450С. Виявилося, що мічення БСА цими барвниками відбувається протягом двох годин як у 50%, так і в 90% ДМСО. Реакція з лізоцимом ускладнювалася утворенням осаду при низьких концентраціях ДМСО в реакційній суміші. Осад не утворюється, якщо мічення проводити у 80% - 90% ДМСО.

При проведенні реакції додавали двократний надлишок барвника з розрахунку на вільні аміногрупи білка. Від барвника, що не прореагував, позбавлялись гель-фільтрацією на колонці з Sephadex® G25. Про утворення кон’югатів свідчать електронні спектри поглинання (рис. 10) та дані гель-електрофорезу.

Рис. 10. Електронний спектр поглинання отриманого кон’югату лізоциму з барвником Cindo40

Ми вважаємо, що проведення реакції мічення в 70-90% ДМСО при 450С протягом двох годин є оптимальним для мічення білків. Використання меншої концентрації ДМСО не завжди є доцільним.

ВИСНОВКИ

1. У дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що виявляється у вивченні та застосуванні реакції пірилоціанінів з амінами для флуоресцентного мічення аміноалкілолігонуклеотидів та білків.

2. Досліджено час перебігу реакції пірилоціанінів з різними амінокислотами, вивчено вплив природи амінокислоти, температури, рН середовища та природи буфера і розчинника на перебіг реакції.

3. Показано, що за запропонованих умов реакції кон’югації пірилоціанінів з біомолекулами не відбуваються побічні реакції з екзоциклічними аміногрупами нуклеотидних основ та бічними функціональними групами амінокислот.

4. На основі отриманих даних про вплив будови пірилоціанінів на перебіг реакції з аміногрупою біомолекул та результатів спектрально-люмінісцентних досліджень запропоновано низку пірилоціанінів для кон’югації з біомолекулами.

5. Синтезовано модельні кон’югати ціанінових барвників з олігонуклеотидами та білками, досліджено спектрально-люмінісцентні властивості отриманих кон’югатів.

6. Запропоновано для практичного використання зручний метод кон’югації пірилоціанінів з біомолекулами.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Yarmoluk S.M., Kostenko O.M., Kornushyna O.S., Dubey I.Y. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids. 4. Efficient 5’-fluorescent labelling of oligonucleotides with monomehtyne pyrilium cyanine dye, Cyan 39 // Біополімери і клітина.- 1998.- 14, №1.- С.82-86.

2. Sergiy M. Yarmoluk, Alexander M. Kostenko, Igor Y. Dubey. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids. IXX. New method for the covalent labeling of oligonucleotides with pyrylium cyanine dyes // Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters.- 2000.- 10.- Р.2201-2204.

3. Костенко О.М., Дмітрієва С.Ю., Ярмолюк С.М. Білки та ціанінові барвники. 2. Застосування реакції пірилієвих барвників з амінами для ковалентного мічення амінокислот і пептидів // Біополімери і клітина.- 2001.- 17, №1.- С. 80 – 84.

4. Костенко О.М., Дмітрієва С.Ю., Толмачов О.І., Курдюков В.В., Ярмолюк С.М. Мічення амінокислот і пептидів поліметиновими пірилієвими барвниками // Укр. хім. журнал.- 2002.- 68, № 1.- С. 39-44.

5. O.M. Kostenko, S.Y. Dmitrieva, O.I. Tolmachev, S.M. Yarmoluk. New Approach for Fluorescent Peptide Labeling with Pyrylium Cyanine Dyes // Journal of Fluorescence.- 2002.-12, No. 2.- Р. 173 – 175.

6. Ярмолюк С.М., Лосицький М.Ю., Ковальська В.Б., Томачинський С.М., Огульчанський Т.Ю., Костенко О.М., Курдюков В.В., Толмачов О.І. Взаємодія ціанінових барвників з нуклеїновими кислотами. Новий (піридо)(тіо)триметинціаніновий барвник CCyan40 для флуоресцентного мічення олігонуклеотидів // Біополімери і клітина.- 2002.- 18, №4.- С. 340 – 346.

7. Sergiy M. Yarmoluk, Alexander M. Kostenko, Igor Y. Dubey. New approach toward oligonucleotide labeling with cyanine dyes // 8th Europ. Conf. Spectroscop. Biolog. Molec.(29 Aug. –2 Sept. 1999, Enschede, Netherlands) Р. 9 –10.

8. Kostenko O.M., Dmitrieva S.Y., Tolmachev O.I., Yarmoluk S.M. New approach for fluorescent peptide labeling with pyrylium cyanine dyes // 7th Conference on Methods and Application of Fluorescence (Amsterdam, September 16-19, 2001) Р. 99.

9. Yarmoluk S.M., Kovalska V.B., Kocheshev I.V., Kostenko O.M., Dubey I.Y. Oligonucleotides labeled with pyridinium cyanine dyes: spectral properties and integration into PCR System // Fifth International Symposium on Functional р-Electron Systems, May 30 –June 4, 2002, Ulm/Neu-Ulm, Germany, P.119.

10. O. M. Kostenko, S. Y. Dmitrieva, S. M. Yarmoluk. New approach for fluorescent peptide labelling with cyanine dyes // In: Proc. Scientific conference “Biotechnology and Environment 2001”, Zagreb, Croatia, February 19-22, 2001, Р.51.

11. Костенко О.М., Дмітрієва С.Ю., Ярмолюк С.М. Застосування реакції пірилієвих барвників з амінами для ковалентного мічення амінокислот та пептидів // Міжнародна конференція “Хімія азотовмісних гетероциклів” (Харків, 2 – 5 жовтня 2000 р.), С.230.

12. Костенко О.М., Дмітрієва С.Ю., Ярмолюк С.М. Флуоресцентне мічення пептидів пірилієвими ціаніновими барвниками // ХІХ Українська конференція з органічної хімії (Львів, 10 –14 вересня 2001 р.), С.168.

13. Костенко О.М., Дмітрієва С.Ю. Застосування реакції триметинпірилоціанінів з амінами для ковалентного мічення амінокислот і пептидів // V Конференція молодих учених південного регіону України (Одеса, 3-4 жовтня 2002 р.), С. 33.

Костенко О. М. Застосування реакції пірилоціанінів з амінами в синтезі кон’югатів піридоціанінів з біомолекулами. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук за спеціальністю 02.00.10 – біоорганічна хімія. – Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, Київ, 2003.

Дисертація присвячена розробці та вивченню нового методу ковалентної кон’югації ціанінових барвників з біомолекулами. Вперше проведено реакцію пірилоціанінів з амінами в умовах, що не спричинюють руйнування більшості біомолекул. Досліджено час перебігу реакції пірилоціанінів з різними амінокислотами, вивчено вплив природи амінокислоти, температури, рН середовища та природи буфера і розчинника на перебіг реакції. Показано, що за умов реакції кон’югації пірилоціанінів з біомолекулами з використанням триетиламонійацетатного буферу не відбуваються побічні реакції з екзоциклічними аміногрупами нуклеотидних основ та бічними функціональними групами амінокислот. На основі дослідження впливу будови пірилоціанінів на перебіг реакції з аміногрупою біомолекул та спектрально-люмінісцентних властивостей утворюваних піридоціанінів запропоновано низку пірилоціанінів для кон’югації з біомолекулами. Синтезовано модельні кон’югати ціанінових барвників з олігонуклеотидами та білками, досліджено спектрально-люмінісцентні властивості отриманих кон’югатів. Запропоновано для практичного використання зручний метод кон’югації пірилоціанінів з біомолекулами.

Ключові слова: пірилоціаніни, піридоціаніни, кон’югація, флуоресценція.

Костенко А. Н. Использование реакции пирилоцианинов с аминами в синтезе конъюгатов пиридоцианинов с биомолекулами. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности 02.00.10 – биоорганическая химия. – Институт биоорганической химии и нефтехимии НАН Украины, Киев, 2003.

Диссертация посвящена разработке и изучению нового метода ковалентной конъюгации цианиновых красителей с биомолекулами с целью ковалентного флуоресцентного мечения биомолекул. Впервые проведена реакция пирилоцианинов с аминами в условиях, которые не приводят к разрушению аминоалкилмодифицированных олигонуклеотидов и большинства белков. Исследовано время прохождения реакции с различными аминокислотами, изучены влияние аминокислоты, температуры, кислотности среды и природы буфера и растворителя на протекание реакции. Показано, что при проведении реакции с использованием триэтиламмонийацетатного буфера не происходит побочных реакций с функциональными групами аминокислот и экзоциклическими аминогруппами нуклеотидных оснований.

Изучено влияние строения ряда пирилоцианинов на протекание реакции в предложенных условиях. Показано, что моно- и триметиновые пирилоцианиновые красители с бензоксазольными и индоленильными ядрами могут быть успешно использованы для конъюгации с биомолекулами, в то время как с бензоксазольными аналогами провести реакцию в присутствии воды не удалось. Заместители в азотсодержащем гетероцикле -пирилоцианина мало влияют на прохождение реакции, в то же время объемные заместители в -положении пирилиевого гетероцикла цианина значительно замедляют скорость образования пиридоцианина. Удлинение метиленовой цепи при переходе от монометинпирилоцианинов к триметинпирилоцианинам ухудшает растворимость последних, поэтому для успешного проведения конъюгации с карбоцианиновыми красителями следует повышать содержание апротонного полярного растворителя в реакционной смеси до 50% – 90%.

На основе изучения влияния природы цианиновых красителей на прохождение реакции и спектрально-люминесцентных свойств образующихся пиридоцианинов предложен ряд красителей, которые могут быть успешно использованы для флуоресцентного мечения аминоалкилолигонуклеотидов и белков. Синтезированы модельные конъюгаты цианиновых красителей с олигонуклеотидами и белками, исследованы спектрально-люминесцентные свойства полученных конъюгатов в свободном состоянии и при взаимодействии с биомолекулами. Четыре синтезированных конъюгата приридоцианинов с модельным олигонуклеотидом были успешно использованы в качестве праймеров при проведении стандартной полимеразной цепной реакции.

Предложен для практического применения удобный метод конъюгации цианиновых красителей с биомолекулами и ряд пиридоцианинов, которые могут быть использованы в качестве флуоресцентной ковалентной метки для олигонуклеотидов и белков.

Ключевые слова: пирилоцианины, пиридоцианины, конъюгация, флуоресценция.

Kostenko O. M. The synthesis of pyrydocyanine conjugates with biomolecules utilizing the reaction of pyrylocyanines with amines. – Manuscript.

Thesis for a candidate’s degree in Chemical Sciences on specialty 02.00.10 – bioorganic chemistry – The Institute of Bioorganic Chemistry and Petrochemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2002.

The thesis is devoted to development and studying of a new method of covalent conjugation of cyanine dyes with biomolecules. For the first time the reaction of pyrylocyanines with amines in conditions that do not result in destruction of the majority of biomolecules is carried out. The duration of reactions of pyrylocyanines with different amino acids and the influence of the temperature, pH of the medium and the nature of both buffer and solvent is investigated. It is shown that no side reactions with functional groups of amino acids occur when TEAA buffer utilized. The influence of the nature cyanine dyes on passage of reaction is studied. Model conjugates of cyanine dyes with oligonucleotides and proteins are synthesized, spectral-luminescent properties of obtained conjugates in a free state and upon interaction with biomolecules are investigated.

The convenient method of conjugation of cyanine dyes with biomolecules and a number of pyridocyanines, which can be used as fluorescent covalent labels for oligonucleotides and proteines, is offered for practical application.

Key words: pyrylocyanines, pyridocyanines, conjugation, fluorescence.