ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМ. В.Н. КАРАЗІНА

Клімова

Олена Михайлівна

УДК: 612.017 + 591.147.3 + 616.74-009.17

ФОРМУВАННЯ ІМУНОЛОГІЧНИХ ВАРІАНТІВ

при ПРИГНІЧЕННі НЕЙРОТРАНСМІТЕРНИХ РЕАКЦІЙ

03.00.13 – фізіологія людини і тварин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Харків – 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті загальної та невідкладної хірургії

АМН України, м. Харків

Науковий консультант: | доктор біологічних наук, професор

Божков Анатолій Іванович

Науково-дослідний інститут біології Харківського національного

університету ім. В.Н.Каразіна, директор

Офіційні опоненти: | - доктор біологічних наук, професор

Гавриленко Тетяна Іллінічна,

Інститут кардіології ім. М.Д.Стражеско АМН України, керівник відділу імунології

- доктор медичних наук, професор

Фролов Олександр Кирилович,

Запорізький державний університет Міністерства освіти і науки України, завідувач кафедри імунології та біохімії

- доктор біологічних наук, професор

Гладкова Алла Іванівна,

Інститут проблем ендокринної патології ім. В.Я.Данилевського АМН України, завідувач лабораторії репродуктивної ендокринології

Провідна установа: | Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця

НАН України (відділ нейрохімії), м. Київ.

Захист відбудеться 24.12.2003 р., о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д .051.17 Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, майдан Свободи, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України (61077, м. Харків, майдан Свободи, 4).

Автореферат розісланий 21.11.2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Падалко В.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Основною проблемою фізіології є вивчення механізмів регуляції гомеостазу. Інтегральні метаболічні процеси, що забезпечують підтримку фізіологічного гомеостазу і взаємодію регуляторних систем імуно-нейроендокринного комплексу – спільні і здійснюються за допомогою рецепторів і медіаторів (Wuttre W., 1980; Пінчинг Дж., 1982; Бутенко Г.М., 1983; Петров Р.В., 1988). Доведено, що різні варіантні поєднання метаболічних змін можуть викликати розвиток однакових короткочасних компенсаторно-адаптивних проявів або подібних стійких змін реакцій відповіді (Брондз Б.Д., 1987; Петров Р.В., 1988; Коляда Т.І., 1995; Харченко В.П., 1998; Ярилін О.О., 1999). Однак, механізми формування тих чи інших форм реакцій відповіді (адаптації чи стійких критичних станів) залишаються недослідженими (Пальцев М.А., 1995; Поддубіков О.В., 2001).

Система імунітету перебуває в субординаційних зв’язках з нервовою та ендокринною системами, які чинять на них регуляторний вплив (Поддубіков О.В., 2001). Останніми роками спостерігається зростання кількості системних захворювань автоімунної природи з вираженою клінічною гетерогенністю формування стійких станів (Andreus P.J., 1998). Показано, що розвитку автоімунної агресії можуть передувати різні зміни імуно-нейроендокринних реакцій, які лежать в основі нейротрансмітерних порушень, викликаючи пригнічення нервово-м’язової передачі (Петров Р.В., 1988). Формування імунофізіологічних варіантів реакції відповіді може бути пов'язане з тими механізмами, що спричиняють нейротрансмітерні порушення. Однак, дослідженню і характеристиці можливих імунофізіологічних варіантів за системних нейроендокринних захворювань автоімунної природи не приділялося належної уваги (Bonnet M., 1995; Araga S., 2000). Необхідно враховувати, що пригнічення нервово-м’язової передачі може визначатися генетичним поліморфізмом, підвищеною мутабельністю геному, вірусною персистенцією, що у свою чергу може впливати і на формування варіантів імунофізіологічних реакцій. Ряд дослідників вказують на недостатню вивченість цих питань (Кузін М.І., 1996; Bunce M., 1999). Разом з тим, ці знання дозволять не лише підійти до з'ясування механізмів регуляції гомеостазу, формування автоімунних захворювань і функціонування імунної системи вцілому, але й використовувати їх для потреб діагностики й оптимізації лікування.

Фундаментальні фізіологічні процеси доцільно розглядати з точки зору специфічних фізіологічних функцій. При вивченні фізіологічних механізмів підтримання гомеостазу використовують експериментальні та природні моделі. Як природну модель порушення функції регуляторних систем використовували оцінку альтетнативних метаболічних шляхів, що забезпечують ці процеси, при порушенні нервово-м’язової провідності. Прогресування нейротрансмітерних порушень може спричиняти розвиток синаптичних захворювань, серед яких найпоширенішою є м’язова слабкість - міастенія.

Механізми формування стійких нервово-м’язових порушень мають мультифакторіальну природу. Зміна синаптичної передачі може відбуватися на всіх рівнях організації біологічної системи. Особливості ієрархічної організації нервової системи передбачають можливість опосередкованого впливу на реалізацію м’язового скорочення зміни будь-якої ланки нейронних зв’язків і специфічних медіаторних систем.

Частота зустрічальності прогресуючої міастенії зростає щорічно, і це може бути пов'язане зі зміною імунореактивності у відповідь на різні фактори середовища (Burnet F., 1971). Розвиток міастенії пов'язують також з формуванням автоімунних реакцій (Almon R.R., 1974). У 60 % осіб зі стійкими порушеннями нервово-м’язової провідності виявляються специфічні антитіла до АХР. У 40 % - невідомі механізми, що лежать в основі модифікації синаптичної передачі ацетилхолінових рецепторів. Останніми роками ведуться інтенсивні дослідження етіології нейротрансмітерних порушень при міастенії з використанням молекулярно-генетичних, біохімічних та інших методів діагностики, але більш ніж у 30 % випадків діагноз міастенія та інших автоімунних захворювань ускладнений, що робить неможливим коректний вибір тактики лікування (Ваlаsе B., 1998; Sela M., 2000). У зв'язку з цим актуальним є розробка діагностичних тест - систем для скринінгу автоімунної патології.

Можна припустити, що одним з потужних екзогенних факторів, що впливають на фенотипічний прояв певної імунної відповіді, може бути вірусна інфекція при вираженому генетичному поліморфізмі чи порушенні компенсаторно-адаптивних процесів, що залежать від функції рецепторно-медіаторних систем. Прояв цих взаємозалежних факторів при міастенії залежить як від ендогенних регуляторних механізмів, так і від екзогенних впливів, що залишаються мало дослідженими (Пальцев М.А., 1995; Кузин М.І., 1996; Караулов А.В., 1999).

Послідовний розвиток незворотних імунофізіологічних змін на першому етапі може причиняти виникнення станів, так званих передзахворювань (Хорст А., 1982; Караулов А.В., 1999).

Можна припустити, що каскад незворотних патологічних реакцій залежить від розвитку альтернативних варіантів метаболічних шляхів, дослідження яких буде мати важливу роль у розумінні функціонування біологічних систем і вибору стратегії лікування при автоімунній та інших типах міастенії. Нині верифікація індивідуальних імунофізіологічних варіантів є складною через застосування великої кількостї діагностичних критеріїв. Для оптимізації оцінки всієї сукупності досліджуваних імунологічних, ендокринологічних і біохімічних параметрів доцільно використовувати комп’ютерну базу даних з наступною автоматизованою класифікацією і виділенням індивідуальних і значимих параметрів гомеостазу.

Існуючі класифікації типів нейротрансмітерних порушень засновані не на імунофізіологічних зрушеннях, а на таких характеристиках, як локалізація процесу, важкість перебігу, поширеність, темпи, прогресування і характер морфологічних змін вилочкової залози. Не з'ясовані причини виникнення, прогресування захворювання і варіантності клінічних форм, залишаються без пояснення механізми і тригерні фактори нейротрансмітерних порушень, не визначені основні критерії вибору тактики лікування.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана згідно з планом науково-дослідних робіт Інституту загальної і невідкладної хірургії АМН України: “Розробити та впровадити у практику методи хірургічного лікування та реабілітації хворих з запальними захворюваннями позапечінкових жовчних шляхів і їх ускладненнями в різних вікових групах”, СН.21.03.0004.86; тема “Розробити технологію інформаційного моделювання екстремальних станів організму та здійснити модельні експерименти в наукових дослідженнях в хірургії на підставі принципів системного підходу”, СН.02.03.001.86; тема “Прогноз здоров’я населення, розвитку охорони здоров’я і медичної науки з ургентної хірургічної допомоги в Українській РСР на період до 2010 р., ВН.02.01.0031.85.25; тема “Розробити оптимальну систему профілактики, діагностики та лікування поліорганної недостатності у ранньому періоді травматичної хвороби”, ВН.21.0000.91.89; тема “Корекція гомеостазу, профілактики та лікування післяопераційних ускладнень при невідкладних станах органів грудної та черевної порожнини”, ВН.21.0000.89.89; тема “Розробити оптимальну модель регіональної системи невідкладної хірургічної допомоги постраждалим з важкою механічною травмою”, ІН.21.03.0001.90; “Розробити ефективну систему невідкладної медичної допомоги постраждалим при важких одиничних, групових та масових травмах в умовах транспортних, промислових катастроф та стихійних лихах в Харківському регіоні”, ОК.21.00; тема “Фонові особливості метаболізму та імунітету у постраждалих від аварії на Чорнобильській АЕС та їх вплив на перебіг гострих хірургічних захворювань органів черевної порожнини, термічну травму та їх ускладнення”, 171-Ч.93; тема “Реінфузія крові в умовах критичного стану при невідкладній реанімаційно-хірургічній допомозі: експресні методи діагностики придатності крові, що реінфузується, та пошук оптимальних методів її узяття і передтрансфузійної обробки”, ІН..94.1.; тема “Органна і поліорганні недостатність як основна причина несприятливих наслідків при важкій політравмі і інших механічних ушкодженнях”, ВН.1.99; тема “Удосконалити методи діагностики та лікування постгеморагічної гіпоксії та поліорганної недостатності у хворих з виразковою хворобою шлунка та дванадцятипалої кишки, ускладненою важкою кровотечею”, ВН.3.99; тема “Апоптоз клітин-мішеней як біологічний феномен при міастенії і поразці вилочкової залози”, ІН.1.2000; тема “Розробка до профілактики і лікування поліорганної недостатності в умовах травматичної хвороби на підставі вивчення шлунково-кишкових і імунних порушень” ВН.2.2002; тема “Обґрунтування індивідуального застосування імунотропних препаратів, у тому числі клітинних і тканинних біотрансплантатів у невідкладних хірургічних хворих”, ВН.3.2002 .

Мета та завдання дослідження. Провести дослідження механізмів формування імунологічних варіантів реакції відповіді організму на природній моделі пригнічення нервово-м’язової передачі, оцінити роль різных ланок імунної відповіді, генетиченого поліморфізму лейкоцитарних антигенів, вірусної персистенції, зміну вмісту деяких гормонів і оксидантно-антиоксидантних реакції в підтриманні гомеостазу і розробити на цій основі класифікацію типів імунної відповіді та нових інтегральних діагностичних тест-систем для діагностики і імунокорекції.

Завдання дослідження:

1. Дослідження ролі факторів неспецифічної резистентності (фагоцитоз гранулоцитарних нейтрофілів й інтенсивність споживання компонентів комплементу) у формуванні різних варіантів імунної відповіді за пригнічення нервово-м'язової передачі.

2. Дослідження змін гуморальних реакцій (В-лімфоцити - CD 19, імуноглобуліни A, M, G, E; антитіла до нативної і денатурованої ДНК, органоспецифічні антитіла, вірусонейтралізуючі антитіла, що циркулюють, імунні комплекси) та кількісна оцінка субпопуляцій Т-лімфоцитів (CD-3, CD-4, CD-8) за пригнічення нервово-м'язової передачі.

3. Вміст прозапальних і запальних цитокінів за пригнічення нервово-м’язової провідності та зміни морфоструктури вилочкової залози (ВЗ).

4. Дослідження можливих тригерних факторів (вірусні інфекції - СМV; віруси гепатиту В та С), що впливають на розвиток імунопатологічних реакцій за пригнічення нервово-м’язової передачі.

5. Вивчення ультраструктурних змін вилочкової залози за різних клінічних типів міастенії.

6. Оцінка генетичного поліморфізму факторів, що впливають на імуногенетичний контроль (лейкоцитарні антигени HLA-DR – 1, 2, 3, 4, 5, 7, 52 , частота хромосомних аберацій у культурі лейкоцитів периферичної крові) за різних клінічних форм міастенії.

7. Оцінка експресії рецепторів антигенів II классу HLA-DR та молекул адгезії на лімфоцитах (рецептори ICAM-1 і ICAM-3) за пригнічення нервово-м'язової передачі і різних морфологічних змін вилочкової залози.

8. Дослідження співвідношення білкових фракцій та вміст пептидів середньомолекулярної маси за пригнічення нервово-м'язової передачі і різних морфологічних змін вилочкової залози.

9. Дослідження вмісту гормонів гіпофіза, наднирників і щитовидної залози за різних клінічних фенотипів міастенії.

10. Оцінка оксидантно-антиоксидантної системи при міастенії

11. Розробка клітинного біосенсору для оцінки можливих варіантів імунофізіологічних станів організму.

12. Розробка автоматизованої програми для оцінки провідних і значимих параметрів гомеостазу за пригнічення нервово-м'язової передачі і морфологічних змін вилочкової залози.

Об'єкт дослідження. Варіантні сполучення фізіологічних функцій імуно-нейро-ендокринного комплексу в контролі та при нейротрансмітерних порушеннях.

Предмет дослідження. Імунореактивність (гуморальні і Т-клітинні реакції), поліморфізм лейкоцитарних антигенів, вміст гормонів у сироватці, інтенсивність перекісного окислення ліпідів і вміст природних антиоксидантів, вірусна персистенція, частота хромосомних аберацій у нормі і за пригнічення нейротрансмітерних реакцій.

Методи дослідження. Для оцінки варіантів імунної відповіді, генетичного поліморфізму лейкоцитарних антигенів, частоти хромосомних аберацій і загальних гістологічних досліджень використовували світлову мікроскопію (імунологічні і цитогенетичні методи, сіротипування HLA) і люмінесцентну мікроскопію (з використанням антитіл до рецепторів, міченими флуоресцентними барвниками FITS і Hoсhst), електронна мікроскопія ультраструктури ВЗ, фотоколориметрія і спектрофотометрія гуморальних факторів у сироватці, імуноферментний аналіз (з використанням МКАТ, мічених пероксидазою), радіоізотопний аналіз (з використанням МКАТ мічених 125I), ПЛР-діагностику (праймери для визначення вірусів гепатиту С і цитомегаловируса (СMV)), визначали наявність міастогенних сироваткових факторів за допомогою біосенсора (одноклітинної тест-системи).

Наукова новизна. Запропоновано варіантну етіопатогенетичну концепцію пригнічення нейротрансмітерних реакцій, на підставі якої розроблена класифікація показників імуно-нейроендокринного комплексу за міастенії, що дозволяє здійснювати верифікацію імунофізіологічних варіантів за умов зміни фізіологічних станів організму і використовувати індивідуальні схеми корекції стійких критичних станів. Вперше показано, що в результаті формування реакції відповіді організму на тривалу вірусну персистенцію, що відбувається на тлі різноманітного генетичного поліморфізму антигенів рецепторів комплексу гістосумісності, формуються різні поєднання імунних, ендокринних, біохімічних і генетичних показників, що і визначають форми прогресування нервово-м'язових порушень.Вперше показано, що досліджувана популяція була представлена чотирма основними варіантами імунореактивності. Так 42 % обстежуваних мали гіперергічний тип, близько 30 % – гіпоергічний тип, інші 20 % - змішаний тип імунної відповіді, у 8 % обстежуваних визначався нормотип імунної відповіді. Запропоновано класифікацію варіантів імунної відповіді, на основі виділеннія провідних і значимих факторів. Для гіперергічного типу імунної відповіді характерно підвищення вмісту пептидів середньої молекулярної маси, органоспецифічних аутоантитіл, противірусних антитіл, антитіл до ДНК і циркулюючих імунних комплексів, а також підвищений вміст інтерлейкінів 4 і 8. Гипоергічний тип імунної відповіді характеризувався зниженими показниками гуморальних реакцій і зниженням функціонального стану Т-лімфоцитів, і найбільшою мірою пригніченням Т-супресорів. Змішаний тип характеризувався зниженням вмісту Ig А, G і підвищенням Ig, наявністю агресивних клонів Т - лімфоцитів.

Вперше показано, що гіпертип переважно виявляли у молодих пацієнтів з міастенією без ураження ВЗ і при міастенії і гіперплазії ВЗ. Виявлено, що гіпотип імунної відповіді найбільшою мірою характерний для пацієнтів з міастенією і неоплазією вилочкової залози. Змішаний тип імунної відповіді характерний для нейротрансмітерних порушень без ураження ВЗ.

Нейротрансмітерні порушення, що відбуваються без зміни морфології ВЗ, характеризуються значним пригніченням CD8 Т-супресорів, зниженням фагоцитарного числа, підвищенням антитіл до печінки, денатурованої ДНК, підвищенням IgЕ і IgM-антитіл.

Вперше показано, що в пацієнтів із пригніченням нервово-м'язової передачі, що відбувається на тлі тимоми, виявлялася висока частота зустрічальності виявлення лімфоцитарних фенотипів HLA DR7, у цих же пацієнтів виявлене багаторазове збільшення вмісту інтерлейкіна 8 (50-ти кратне), тоді як при міастенії і великих пухлинах середостіння з великою частотою виявлявся лейкоцитарний фенотип HLA DR3 (89% випадків). Доведено багаторазове збільшення вмісту IgЕ при міастенії і гіперплазії ВЗ, а його вміст при міастенії на тлі тимоми відповідав нижній межі норми. Показано значне збільшення експресії рецепторів молекул адгезії імунокомпетентних клітин при всіх клінічних фенотипах міастенії.

Продемонстровано, що істотний внесок у формування імунофізіологічних варіантів, що визначають клінічні фенотипи міастенії, роблять неспецифічні фактори імунорезистентності. Зокрема вперше показано, що при міастенії без ураження ВЗ і міастенії на тлі тимоми відбувається пригнічення фагоцитарної активності гранулоцитарних нейтрофілів, а при міастенії на тлі гіперплазії відбувається активація ендоцитозу гранулоцитарних нейтрофілів. У пацієнтів цієї групи виявлялося 3-х разове збільшення цього показника.

У роботі показано, що нейротрансмітерні порушення супроводжуються злоякісним ураженням ВЗ за умови наявності: лейкоцитарного фенотипу HLA DR 3,7; високої мутабельності хромосом (перевищення спонтанного рівня мутування до 7 %); активації експресії рецепторів молекул адгезії; збільшення щільності рецепторів головного комплексу гістосумісності і збільшення вмісту прозапальних цитокинів.

Вперше показано, що вірусна персистенція може призводити до різної реакції відповіді у формуванні імунофізіологічних варіантів, реалізація якої залежить від генетичного поліморфізму (зокрема молекул комплексу гістосумісності, рецепторів молекул адгезії і CD-маркерів Т-лімфоцитів), та пов’язана з віковим дебютом захворювання, який зумовлюється онтогенетичними особливостями функціонування регуляторних систем.

В усій досліджуваній вибірці пацієнтів з нейротрансмітерними порушеннями був виявлений поліморфізм в оксидантно-антиоксидантній системі, що виражався у тому, що у 40 % обстежених було виявлено високий вміст МДА, а в 60 % цей показник був значно нижчим від контролю.

Вперше виявлена вікова органоспецифічність спектра автоантитіл, який відрізнявся залежно від клінічних форм міастенії.

Виявлено, що міастенія, що протікає на тлі гіперплазії ВЗ, супроводжується значним підвищенням вмісту гіпофізарних гормонів - пролактину і тиреотропного гормону.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані результати дозволили сформулювати варіантну етіопатогенетичну концепцію, на основі якої може бути обґрунтована тактика комплексного індивідуального впливу на метаболізм, у тому числі спрямована імунокорекція прогресуючих нервово-м’язових порушень. Це положення захищене авторськими свідоцтвами “Автоматизована оцінка стану гомеостазу, прогноз спрямованості метаболічних порушень і порівняльна оцінка ефективності лікування хворих з гострою хірургічною патологією” (ПА №1768 від 15.02.99); “Методологія визначення імунопатологічних варіантів при різних формах міастенії і способи корекції метаболічних порушень при гетерогенності етіологічних факторів” (ПА №1767 від 24.02.99); “Діагностика функціонального стану організму на основі клітинних тест-систем” (Свідоцтво про авторські права на твір № 592, 1997); “Спосіб діагностики міастенії” (№1778704 від 01.08.92); “Спосіб лікування міастенії” (№ 1824187 від 12.10.92); “Спосіб прогнозування гематологічних ускладнень при хіміотерапії онкологічних хворих” (№ 1745041 від 01.03.92).

Результати роботи використовуються в клініці Інституту загальної і невідкладної хірургії АМНУ (ці розробки оформлені і включені до Національного реєстру нововведень №143/11/9, 1999 та Інформаційного бюлетеню Вип. 15, 2002).

Отримані результати дозволяють обґрунтувати вибір стратегії лікування розладу нейротрансмітерних реакцій, в тому числі і необхідність оперативного втручання на вилочковій залозі.

Розроблено клітинний біосенсор, що дозволяє здійснювати експрес-оцінку наявності міастогенних факторів сироватки крові пацієнтів і дає змогу здійснювати скринінг імунофізіологічних варіантів при порушенні нейротрансмітерних реакцій. Розроблений клітинний біосенсор може знайти застосування для діагностики не тільки автоімунних станів, а й інших патологій організму.

Результати роботи використовувалися при читанні курсів імунології, цитогенетики, загальної генетики у Харківському інституті удосконалення лікарів. Окремі положення дисертації увійшли до навчальних посібників і методичних рекомендацій в Інформаційному бюлетені “Журналу Академії медичних наук України”, Вип. 15 “Вибір тактики комплексного лікування з урахуванням тригерних факторів нейротрансмітерних порушень на фоні ультраструктурних змін вилочкової залози”; методичних рекомендацій “Лабораторна діагностика при ускладненій хірургічній патології”; методичних рекомендацій в Реєстрі галузевих нововведень, Вип. 10 - 11 “Нова методика корекції метаболічних розладів у тяжкохворих за допомогою кріоконсервованих клітин ембріонального походження”; методичних рекомендацій в ж. “Вісник невідкладної і відбудовної медицини”, Т.3, №2 “Обґрунтування індивідуального підходу в лікуванні міастенії, що супроводжується морфологічними змінами вилочкової залози”, методичних рекомендацій для студентів і лікарів-інтернів “Методи клінічної імунології при ускладненій хірургічній патології”.

Особистий внесок здобувача. Ідея дисертаційної роботи, обґрунтування мети, завдань і способів їхнього вирішення належать автору. Автором самостійно проведений аналіз вітчизняної та іноземної літератури. Оформлено протоколи всіх експериментів. Автором самостійно проведені експерименти з оцінки: системи комплементу, вмісту імуноглобулінів, субпопуляцій лімфоцитів. В оцінці фенотипування лімфоцитів антигенів II класу HLA DR брала участь співробітниця діагностичної лабораторії Інституту загальної і невідкладної хірургії Дроздова Л.А.

Дослідження наявності вірусної персистенції за допомогою ПЛР - метода проведено разом з к.б.н. Лиманським А.П. і Лиманською О.Ю., визначення активності оксидантно-антиоксидантної системи здіснено разом з д.б.н. Параничем А.В., розробка клітинного біосенсора проведена разом з науковим консультантом д.б.н. А.І. Божковим і к.б.н. Мензяновою Н.Г.

Планування, організація досліджень та їхнє обговорення по дисертаційній роботі і впровадження в практику отриманих результатів здійснювалось за участю директора ІЗНХ АМНУ д.мед.н., проф. Бойка В.В.Інтерпретація отриманих результатів проводилась разом з науковим консультантом і заст. директора з наукової роботи ІЗНХ АМНУ, професором, д.мед.н. Криворучком І.А. Обговорення та обгрунтування методів імунокорекції здійснювалось разом із д.мед.н., проф. Хижняком А.А., завідувачем торакального відділення, к.мед.н. Нечитайлом П.О. та лікарем-реаніматологом Сивоволовим В.Б. Підходи противірусної терапії обговорювались з лікарем - хірургом торакального відділення Костя Ю.П.

Апробація результатів. Матеріали дисертації доповідалися й обговорювалися на засіданні Вченої ради ІЗНХ АМНУ, на засіданні наукового товариства хірургів м. Харкова, ІІ Республіканському з'їзді медичних генетиків (Львів, 1988), II Республіканській конференції ендокринології (Харків, 1989), Обласній конференції ендокринологів (Харків, 1989), конференції “Використання фізичних методів у хірургії” (Харків, 1991), Республіканській науково-практичній конференції “Клініка, діагностика і лікування захворювань вилочкової залози” (Київ, 1994), II з'їзді медичних генетиків України (Львів, 1995), 34th Ahnual Meetcing of the Sosiety for Criobyology (Barcelona, 1997), I Національному конгресі України з імунології, алергології і імунореабілітації (Київ, 1998), XV з'їзді Українського фізіологічного товариства (Донецьк, 1998), I пленумі “Паліативна медицина і реабілітація” (Москва, 1998), Міжнародній науковій конференції “Стратегія і тактика боротьби з інфекційними захворюваннями” (Харків, 1998), VI Міжнародному конгресі з імунореабілітації (Ізраїль, 2000), ІІ Конгресі Української асоціації фахівців УЗД у перинатології, генетиці і гінекології (Харків, 2000), IV Міжнародному симпозіумі “Біологічні механізми старіння” (Харків, 2000), Республіканській науково-практичній конференції “Нове в етіології, патогенезі і терапії кардіоміопатій” (Харків, 2000), Міжнародному конгресі “Питання біоіндикації та екології” (Запоріжжя, 1999), XIX з'їзді хірургів України (Харків, 2000), Конгресі геронтологів, (Санкт-Петербург, 2000), I Всеросійській науково-практичній конференції з нейроімунології (Санкт-Петербург, 2001), Науково-практичній конференції “Проблеми діагностики і лікування дифузійних захворювань печінки” (Харків, 2001), I національному конгресі з біоетики (Київ, 2001), Міжнародній науково-практичній конференції “Нові тенденції в хірургії XXI сторіччя” (Київ, 2001), II науково-практичній конференції з міжнародною участю “Accelerated aging and the ways for its prevention” (Київ., 2001), IV з’їзді імунологів та алергологів СНД (Москва, 2001), VII Міжнародному конгресі з імунореабілітації “Алергологія та імунологія та глобальна мережа: погляд у нове тисячоліття” (Нью-Йорк, 2001), V симпозіумі “Біологічні механізми старіння” (Харків, 200 2), 3-й Міжнародній міждисциплінарній науково-практичній конференції “Сучасні проблеми науки та освіти” (Ужгород, 2002), конференції “Від сучасних біотехнологій до нових наукоємних технологій” (Пущино, 2002).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 75 наукових праць, серед яких 25 статей ( 24 з них у фахових виданнях, які затверджені ВАК України), 1 робота в Національному реєстрі галузевих нововведень, отримано 3 авторських свідоцтва, 1 патент, 5 свідоцтв про державну реєстрацію авторських прав, опубліковано 37 тез доповідей на міжнародних та національних конференціях, симпозіумах і конгресах, 3 методичних рекомендацій.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 365 сторінках машинописного тексту (з них відповідно: 307 – текст дисертації та 5 повних сторінок займають схеми, 53 сторінки – список джерел літератури) і складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, розділу результатів власних досліджень, який включає 16 підрозділів, їхнього обговорення, аналізу й узагальнення результатів дослідження, заключної частини, висновків і списку використаної літератури, що складає 603 джерела. Робота ілюстрована 39 таблицями і 43 рисунками.

Основний зміст роботи.

Огляд літератури.

Огляд літератури присвячений опису рецепторно-медіаторних взаємодій регуляторних систем, процесам регуляції імунофізіологічних реакцій, механізму синаптичної передачі. Систематизовані свідчення про механізми імунних реакцій і розвиток автоімунних процесів при системних захворюваннях. Висвітлені закономірності фагоцитарної активності і активації білків системи комплементу. Представлені свідчення щодо ролі цитокінів, субодиниць епітопів АХР, агресивних клонів Т-хелпер 1 лімфоцитів у формуванні імунонейроендокринних порушень при міастенії (Almon R.R., 1974; Пинчинг Дж., 1982; Кузин М.І., 1996; Sela M., 1999). Обґрунтовується значення генетичного поліморфізму лейкоцитарних антигенів у формуванні автоімунних захворювань. Описано значення персистуючої вірусної інфекції в зміні регуляції імунної відповіді і клітинної морфології (Лайсек Р.П., 1984; Balase B., 1997; Харченко В.П., 1998).

Матеріали і методи дослідження

Як модель вивчення можливих варіантів імунофізіологічних реакцій, що впливають на нейроендокринні функції, використовували таке мультифакторіальне захворювання, як міастенія, за якого відбувається порушення багатьох ланок регуляції. Матеріалом для досліджень служили: форменні елементи і сироватка крові хворих на міастенію з ураженням вилочкової залози (рис. 1).

Як експериментальну модель для оцінки міастогенних сироваткових факторів використовували клітинний біосенсор, що являє собою клітинну тест-систему, в якій застосовується культура клітин одноклітинної водорості Dunaliella viridis (Божков А.І., 2002). Обстежуваними були пацієнти з різними формами міастенії, що знаходяться в клініці ІЗНХ АМНУ в період з 1985 – 2002 р.р.. Дослідження з виявлення міастогенних сироваткових і клітинних факторів проведені у 623 пацієнтів з нейротрансмітерними порушеннями, у тому числі з морфологічними змінами ВЗ (вік від 16 до 78 років), що перебували на стаціонарному лікуванні з приводу міастенії. Обстежувані були розділені на 5 груп відповідно до різних форм захворювання: міастенія, що відбувається без ураження вилочкової залози (М) – 84 людини; локальні форми міастенії – 19 пацієнтів; міастенія, що відбувається на тлі гіперплазії вилочкової залози (МГ) – 270 людей; міастенія, що відбувається на тлі злоякісного ураження вилочкової залози (тимоми) (МТ) – 150 хворих; міастенія, що відбувається на тлі великих пухлин середостіння (ПС) – 62 людини.

Виконання лабораторно-діагностичних досліджень проводили в сироватці, форменних елементах крові і на гістологічних препаратах за допомогою уніфікованих методів оцінки (рис. 1).

Експериментальні дослідження в клітиннії тест-системі проводили в НДІ біології Харківського національного університету ім. Каразіна в лабораторії молекулярної біології та біотехнології.

Для статистичної обробки результатів використовували непараметричні і параметричні методи варіаційної статистики. Візуальний аналіз індивідуальних варіантів компенсаторно-адаптивних змін і типів імунофізіологічних станів проводили за допомогою методу побудови діаграм розсіювання (Бєлих Л.Н, 1988).

Фагоцитоз гранулоцитарних нейтрофілів досліджували за методом, описаним Маянським А.Н. (1989), типування лімфоцитарних антигенів HLA здійснювали методом Терасакі І. (1964), визначення міастогенних факторів виконували за допомогою клітинного біосенсора (Божков А.І., 2002), цитогенетичні дослідження проводили в культурі клітин за класичним методом Murhed 1964, візуалізацію результатів проводили з використанням світлової мікроскопії; співвідношення CD-субпопуляцій лімфоцитів, щільність поверхневих рецепторів HLA-DR антигенів, щільність рецепторів молекул адгезії і наявність Fas-рецепторів апоптозу визначали методом флуоресцентної мікроскопії (запропонований лабораторією біотехнологій Інституту експериментальної патології, онкології і радіології ім. Р.Е. Кавецького НАН України) з використанням моноклональних антитіл мічених FITC, вміст імуноглобулінів A, M, G визначали фотометрично за методом Гамалея Н.Б., 1994. За допомогою імуноферментної діагностики (ІФА) визначали вміст: органоспецифічних антитіл, антитіл до ДНК, інтерлейкінів IgE, і віруснейтралізуючих антитіл. Використовували ПЛР-діагностику для визначення вірусної інфекції. Вміст середньомолекулярних пептидів і циркулюючих імунних комплексів здійснювали методом спектрофотометрії, як описано Гриневичем Ю.А. (1981). Для оцінки препаратів вилочкової залози з морфологічними змінами використовували загальноморфологічні й ультраструктурні дослідження клітин (електронна мікроскопія). Гормони гіпофіза, щитовидної і надниркової залоз вивчали радіометричним методом, використовуючи МКАТ, мічені 125I. Показники перекісного окислювання ліпідів (ПОЛ) – дієнових (ДК), трієнових (ТК) та малонового альдегіду в сироватці крові вивчали спектрофотометрично за методом Гаврилова В.Б.(1983).

Результати та їх обговорення

Варіанти імунофізіологічних реакцій за різних форм міастенії і морфологічних змін вилочкової залози

Передумовою для розвитку імунопатологічного стану, у тому числі й автоімунних захворювань, може бути поява нового клону імунокомпетентних клітин внаслідок мутацій або впливу імунотропної вірусної інфекції. Частіше зустрічається оборотне зниження функціональної активності супресорних клітин і дисбаланс між імуногенною і толерогенною дією автоантигена. При цьому може відбуватися неадекватне розпізнавання імунною системою ендогенних структур, що може спричиняти формування толерантності, утворення антитіл і автоагресивних Т-лімфоцитів.

Виявлено 4 основних варіанти імунореактивності в усій обстежуваній популяції пацієнтів із пригніченням нейротрансмітерних реакцій: гиперергічний тип складало 42 % обстежених, 30 % пацієнтів мали гіпоергічний тип, 20 % - комбінований тип імунної відповіді, а у 8 % обстежуваних визначали нормотип імунної відповіді. (Рис. 2). Гіперергічний тип імунної відповіді характеризується підвищеним вмістом гуморальних сироваткових факторів і нормальними показниками у Т-клітинній ланці імунітету. За гіпоергічного типу імунної відповіді спостерігали знижені показники факторів неспецифічної резистентності, показники гуморальних реакцій, знижений функціональний стан Т-лімфоцитів. Комбінований тип характеризувався зниженням вмісту Ig А, G і підвищенням IgE, активації CD16-лімфоцитів.

Рис. 2. Імунофізіологічні варіанти в популяційній виборці пацієнтів з пригніченням нервово-м’язової передачі.

Виявлено різну частоту зустрічальності варіантів імунної відповіді у пацієнтів з різними клінічними фенотипами міастенії. Гіпертип імунної відповіді частіше виявляли при М и МГ; висока частота зустрічальності гіпоергічного типу виявлена у пацієнтів із МТ; комбінований тип імунної відповіді в основному виявляли при М.

Розроблена і впроваджена автоматизована програма оцінки провідних і значимих імунофізіологічних параметрів для пацієнтів з різними клінічними фенотипами і морфофункціональними змінами ВЗ. Програма дозволяє в автоматизованому режимі здійснювати інтегральну оцінку діагностично значимих показників імунорезистентності для обгрунтування спрямованої імунокорекції.

Зміна реактивності фагоцитуючих гранулоцитарних нейтрофілів при міастенії і ураженні вилочкової залози

В обстежених пацієнтів виявлені зміни фагоцитарної активності гранулоцитарних нейтрофілів. При М адгезивні властивості фагоцитуючих нейтрофілів (фагоцитарний індекс) були знижені порівняно з контролем у 1,9 раза. Ендоцитоз гранулоцитарних нейтрофілів і завершеність фагоцитозу в цій групі (М) були також вірогідно знижені (рис. 3).

Рис. 3. Показники фагоцитарної активності в контрольній групі та при різних клінічних формах міастенії в процентном виразі відносно контролю.

Примітка: К - коефіцієнт співвідношення: досліджувана група / контрольна група.

Пригнічення фагоцитарного індексу виявлено у пацієнтів з нейротрансмітерними порушеннями без ураження ВЗ (М) і з міастенією, що відбувається на тлі злоякісного ураження вилочкової залози (МТ) ((39,5 9,1)% і (41,4 8,6)% відповідно й у контролі (73,1 9,0) %)). Фагоцитарне число у цих групах пацієнтів, також було нижчим від контрольних показників і складало 2,2 0,2 при М и 2,6 0,9 при МТ (контроль - 3,6 0,14).

При МГ ендоцитоз фагоцитуючих нейтрофілів у 4,4 раза перевершував контрольні величини (фагоцитарне число складало 15,7 5,2 при 3,6 0,14 у контролі) (рис. 3). Адгезивні властивості нейтрофілів, що характеризуються фагоцитарним індексом гранулоцитарних нейтрофілів, у пацієнтів із МГ вірогідно не відрізнялися від контролю (рис. 3).

В усіх біологічних системах визначальною є система запуску конформаційних змін рецепторів. Активовані фагоцити мають здатність синтезувати продукти з ефекторною активністю, ці секреторні продукти можуть опосередковано викликати цитотоксичний вплив на клітини-мішені. Не виключено, що після дебюту розвитку нейротрансмітерних порушень підвищення ефекторних і адгезивних властивостей фагоцитів може бути початковим етапом інфільтрації і розвитку гіперплазії тканин залози. А недостатність ефекторної функції фагоцитуючих нейтрофілів може лежати в основі механізму розвитку неопластичних процесів у ВЗ за наявності вірусної інфекції.

Індуктором мобілізації гранулоцитарних нейтрофілів можуть бути інфекції. Зниження кількості нейтрофілів є наслідком фіксації інфекційних агентів на поверхневих лігандних імуноглобулінах активованих гранулоцитів. Показано виражене пригнічення фагоцитарної активності (в 2,4 раза нижче порівняно з контролем) у групі з нейротрансмітерними порушеннями на тлі тимоми (МТ) при персистуючій інфекції. Фагоцитарне число при вірусній персистенції у пацієнтів першої групи було нижчим від контрольних величин у 1,7 рази і складало 2,1 ± 0,1. При МГ фагоцитарне число в багато разів перевищує контрольні величини. Фагоцитуючі нейтрофіли поряд з макрофагами також забезпечують структурний гомеостаз. Механізми, що лежать в основі нейротрансмітерних порушень на тлі розвитку гіперплазії, мабуть, взаємозалежні з гіперактивацією фагоцитуючих клітин і пов’язані з розвитком системних патологічних процесів. Надлишкову активацію фагоцитів можна розглядати як вторинні прояви автоімунного процесу. Можна припустити, що якщо функції регуляторних систем недостатньо сполучені, то порушуються рецепторно-медіаторні взаємодії з наступним розвитком гіперактивації або незворотної толерантності. Невідповідність між захистом і пошкодженням сприяє переходу фізіологічної адаптації в гострий процес. У процесі негативної активації беруть участь фактори комплементу, після чого за каскадним принципом можуть розвиватись запальні й автоімунні реакції.

Особливості активації системи комплементу й утворення циркулюючих імунних комплексів при міастенії і різних морфологічних змінах ВЗ.

Виявили зміни активності факторів системи комплементу у 45 % пацієнтів із пригніченням нервово-м'язової провідності. Серед хворих з міастенією і тимомою з більшою частотою зустрічалися пацієнти з пригніченням факторів системи комплементу (32,6 %), а при міастенії і гіперплазії зниження даного показника спостерігали у 23,5 % випадків.

При статистичному аналізі діаграм розсіювання показників активності факторів комплементу виявили незначну активацію системи комплементу в групі хворих з міастенією без зміни морфології ВЗ. У літніх пацієнтів з міастенією відзначали більш істотне пригнічення активності комплементу – 0,63 ± 0,17 при 1,0 ± 0,2 у контролі. Багато вірусів є стимуляторами альтернативного шляху активації системи комплементу і певні компоненти комплементу сприяють звільненню медіаторів із тучних клітин. Ці реакції є пусковими в каскаді специфічних імунологічних механізмів, що забезпечуються В- і Т-лімфоцитами.

Фактори системи комплементу безпосередньо впливають на утворення таких макромолекулярних сполучень, як циркулюючі імунні комплекси (ЦІК). Утворення ЦІК та їхня елімінація з організму залежить від активності білків комплементу. Максимальне підвищення концентрації ЦІК (у 2,6 раза) виявлено у пацієнтів із пригніченням нейротрансмітерних реакцій без зміни морфології ВЗ. При МТ ЦІК у 2,2 раза перевищували контрольні величини. При МГ рівень ЦІК у 1,9 раза перевищував величину даного показника в контролі (рис.4).

Рис. 4. Коефіцієнти, що характеризують відсоток вмісту ЦІК за різних клінічних

фенотипів при міастенії щодо контролю.

Примітка: К – коефіцієнт співвідношення: досліджувана група/ контрольна група.

Білки системи комплементу, що входять до складу циркулюючих імунних комплексів, можуть мати особливе значення при формуванні автоімунних реакцій на тлі дефекту супресорних функцій імунокомпетентних клітин. Як наслідок зміни активності комплементу, виникають порушення імунорегуляції з гіперпродукцією антитіл, імунних комплексів і прозапальних цитокінів. Таким чином, стан факторів неспецифічної резистентності істотно впливає на параметри гуморального імунітету, а саме на активацію клітин – продуцентів імуноглобулінів.

Зміна вмісту імуноглобулінів класів А, М, G, Е при міастенії і морфологічних ураженнях ВЗ

Виявлено зниження вмісту IgА при МГ у 18,3 % пацієнтів, а при МТ зниження IgА виявили в 46,1 %. У 65 % з гіперплазією вилочкової залози вміст IgG відповідало референтним величинам, а у 32,1 % цей імуноглобулін був знижений. При міастенії, що протікає на тлі злоякісного ураження ВЗ, кількість пацієнтів зі зниженим рівнем IgG було майже в 2 рази більше, ніж при гіперплазії і складало 60,6 %. Статистична обробка результатів методом - c2 показала, що різниця розповсюдженості різноспрямованих кількісних змін імуноглобулінів в групах, які досліджували статистично достовірна. Так, наприклад, коефіцієнт спряженості ознак у групі з МГ складав c2р=10,35, при табличному значенні c2т = 8,99; отже c2р>c2т; u=2; р<0,05.

Проте, не виявили достовірних відмінностей від контролю в середніх величинах концентрацій імуноглобулінів А, М, G при МГ. Відзначена висока індивідуальна вариабельність даних показників у досліджуваній групі. Оцінка змісту IgЕ показала, що в групі пацієнтів при МГ із низькою продукцією IgА і IgG спостерігається значне підвищення середнього рівня даного показника, що складає 307,9 ± 51,05 ммоль/л при 100 ± 32 ммоль/л у контролі. Достовірне підвищення концентрації IgЕ виявили в 13,8 % пацієнтів з МГ. Зниження IgЕ виявлене у 35 % пацієнтів із МГ, і в 34,1 % пацієнтів із МТ. Рівень імуноглобулінів ІgA і IgG значно знижений у пацієнтів з МТ і складає 1,26 ± 0,185 і 5,43 ± 0,56 г/л відповідно (р < 0,05).

Рисунок 5 ілюструє коефіцієнти зміни вмісту імуноглобулінів класів А, М, G, E у пацієнтів досліджуваних груп. У пацієнтів з М знижений вміст ІgA. Кількість пацієнтів з тимомами, у яких не виявили зниження вмісту ІgA, була у 2 рази більшою ніж при МГ. Збільшення концентрації ІgA не було виявлено у жодного пацієнта (рис.5).

Рис.5. Коефіцієнти змін вмісту імуноглобулінів класів A, M, G, Е у пацієнтів з

пригніченням нервово-м’язової передачі і морфологічними змінами вилочкової залози.

Примітка: К - коефіцієнт співвідношення: досліджувана група/ контрольна група.

При міастенії і гіперплазії ВЗ у 51 % пацієнтів виявили нормальну концентрацію IgЕ, у 23,9 % у даній групі виявили значне підвищення даного показника (табл. 1).

Таблиця 1

Вміст імуноглобулінових антитіл за різних клінічних фенотипів міастенії

на фоні гіперплазії і неоплазії ВЗ в різних вікових групах.

Імунологічний показник | Вік пацієнтів

(років) | Контрольна група | Нейротрансмітерні порушення та

патоморфологічні зміни вилочкової залози

Міастенія без ураження вилочкової залози

n=83 | Гіперплазія вилочкової залози

n=129 | Неоплазія вилочкової залози

n=61

Ig A, г/л

= 50 | 1,5 0,3 | 1,34 ± 0,52 | 1,540,07 | 1,530,25

> 50 | 1,55 ± 0,45 | 1,450,13 | 0,980,12

Ig M, г/л |

= 50 | 1,1 0,2 | 1,20 ± 0,39 | 1,360,06 | 1,750,44

> 50 | 1,30 ± 0,37 | 1,20,1 | 0,860,1

Ig G, г/л | = 50 | 8,4 1,1 | 7,06 ± 2,6 | 7,790,43 | 6,070,7

> 50 | 8,28 ± 2,4 | 7,590,88 | 4,780,41

Ig E, ммоль/л | = 50 | 100 3,2 | 196,8 ± 32,9 | 169,0536,83 | -

> 50 | 205,15 ± 41,3 | 446,765,3 | 26,1513,35

р 0,05

Знайдено істотні відмінності в концентрації Ig-антитіл у групах пацієнтів з міастенією, що відбувається на тлі неопластичних змін ВЗ у групі пацієнтів старшого віку. Достовірне зниження IgG виявлене у пацієнтів з неоплазією віком старіше 50 років. У цій же групі виявлене достовірне зниження IgА і IgМ (табл.1).

Було показано, що існує динамічна рівновага, яка залежить від тривалості вірусної персистенції, між зміною сумарного вмісту сироваткових імуноглобулінів і рівнем специфічних противірусних антитіл Ig M і Ig G (Клімова О.М., 2001). Проведені дослідження показали, що в обстежених