УКРАЇНСЬКИЙ НАУКОВИЙ ГІГІЄНІЧНИЙ ЦЕНТР

ХЛІВНА

Людмила Анатоліївна

УДК 618.3: 616-053.1/-076.5

ПІДВИЩЕННЯ ЕФЕКТИВНОСТІ ПРЕНАТАЛЬНОЇ ДІАГНОСТИКИ ХРОМОСОМНОЇ ПАТОЛОГІЇ

03.00.15 - генетика

Автореферат дисертації

на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ - 1998

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Донецькому міжобласному медико-генетичному центрі МОЗ України.

Наукові керівники: | доктор медичних наук

Арбузова Світлана Борисівна,

Донецький міжобласний

медико-генетичний центр,

завідуюча,

доктор медичних наук, професор

Бариляк Ігор Романович,

Український науковий

гігієнічний центр, директор.

Офіційні опоненти: | доктор медичних наук, ст. н. с.

Пілінська Марія Андріївна,

Інститут експериментальної

радіології наукового центру

АМН України,

завідуюча відділом цитогенетики,

кандидат біологічних наук, ст. н. с.

Стефанович

Ганна Володимирівна

Український науковий центр

медичної генетики, завідуюча

відділом раннього розвитку

людини.

Провідна установа: Національний Університет ім. Тараса Шевченка, Міністерство Освіти України, кафедра загальної та молекулярної генетики, м. Київ.

Захист відбудеться 28 січня 1999 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д26.604.01 Українського наукового гігієнічного центру, 253660, м. Київ-94, вул. Попудренка, 50.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Українського наукового гігієнічного центру,

Київ-94, вул. Попудренка, 50.

Автореферат розісланий 25 грудня 1998 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради ______________ Селезньов Б.Ю.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальнiсть теми. Одною з важливих задач медичної генетики є профiлактика хромосомних захворювань, якi мають значну питому вагу в структурi причин дитячої смертностi та iнвалiдностi.

Актуальнiсть проблеми посилюється високою популяцiйною частотою хромосомних синдромiв, якi виявляються у 7 з 1000 живонароджених дiтей Бариляк I.Р., Гнатейко О.З., 1991. Частота найбiльш поширеної патологiї - синдрому Дауна (СД) - складає в середньому 1 на 800-1100 новонароджених Лазюк Г.И., 1979; Бариляк І.Р. і співавт., 1984; Козлова С.И., 1987; Арбузова С.Б., 1996.

Ефективнiсть пренатальної дiагностики (ПД) хромосомних захворювань залежить, головним чином, вiд рiшення двох питань - формування груп ризику, в яких проводяться iнвазивнi дослiдження, та вибору методiв, що використовують для цитогенетичної ПД. Враховуючи те, що переважна бiльшiсть хромосомних синдромiв вiдносяться до мутацiй «de novo», тiльки розробка чiтких критерiїв та ретельний вiдбiр вагiтних при призначеннi iнвазивної ПД може пiдвищити ступiнь виявлення хромосомної патологiї водночас iз зниженням обсягу виконуваних дiагностичних манiпуляцiй.

Формування груп ризику повинно здійснюватися з урахуванням особливостей популяцiї. Використання традицiйного показання для проведення iнвазивних дослiджень - вiк жiнки бiльше 35 рокiв - не може суттєво вплинути на популяцiйну частоту хромосомних захворювань в Українi, тому що кiлькiсть лiтнiх вагiтних не перевищує 9% Arbuzova S.B., 1997.

При виборi методiв iнвазивної ПД необхiдною та обовязковою умовою є безпечнiсть і висока iнформативнiсть дослiдження. Таким вимогам перш за все вiдповiдає трансабдомiнальний амнiоцентез (АЦ) Tabor A., 1988; Mennuti M., 1989; Wolstenholme J., 1994.

Проте, аналiз амнiотичної рiдини (АР) не одержав поширеного використання в Українi через трудомiсткість дослiдження та тривалий термін культивування, що пояснюється недосконалiстю традицiйно використовуємих культуральних методик Золотухина Т.В.,1980; Nadler H., 1969; Gregson N., 1970; Nelson M., 1973.

У звязку з вищезазначеним, метою дослiдження є удосконалення методологiчних та методичних пiдходiв до допологової дiагностики хромосомної патологiї.

Завдання дослiдження.

1. Визначити можливостi стимуляцiї росту амнiоцитiв одночасно зі зниженням витрат та часу, необхідних для культивування амнiотичної рiдини.

2.Розробити оптимальнi умови отримання хромосомних препаратiв високої якостi з культури клiтин амнiотичної рiдини.

3.Обгрунтувати дiагностичну значущiсть переважного використання трансабдомiнального амнiоцентезу для ПД хромосомної патологiї.

4.Проаналiзувати ефективнiсть виявлення хромосомної патологiї в рiзноманiтних групах генетичного ризику.

5.Встановити найбiльш iнформативнi критерiї формування потокiв на iнвазивну пренатальну дiагностику.

Научна новизна дослiджень.

1. Встановлено фактори, які впливають на тривалість строків культивування амніоцитів.

2. Запропоновано спосiб отримання високоякiсних хромосомних препаратiв з 25-30 метафазами на склi.

3. Вперше виконано роботу з порiвняльноїй характеристики якостi культури з клітин АР та готових хромосомних препаратiв, в залежностi вiд складу культуральних середовищ.

4. Запропоновано новий диференцiйований пiдхiд до формування груп високого генетичного ризику з урахуванням вiку вагiтних, акушерського анамнезу, даних бiохiмiчного та УЗ-скринiнгiв.

Теоретична та практична значущiсть дослiдження.

1. Запропоновано модифiковану методику культивування та фiксацiї амнiоцитiв, яка дозволяє в найкоротший термін провести цитогенетичний аналiз.

2. Проведено пiдбiр культуральних сумiшів з оптимальним складом, який дозволяє знизити витрати робочого часу та реактивiв, що використовуються при культивуваннi та фiксацii амнiоцитiв.

3. Запропоновано новi принципи до формування потокiв на цитогенетичну допологову дiагностику з розрахунком iндивiдуального ризику, якi дозволяють пiдвищити ефективнiсть виявлення хромосомної патологiї одночасно зі зниженням кiлькостi проведених iнвазивних дослiджень.

4. Удосконалено традицiйний пiдхiд до призначення iнвазивних дослiджень вагiтним вiком понад 35 рокiв.

Впровадження в практику.

Отриманi данi покладенi в основу призначення та проведення iнвазивних дослiджень в Донецькому ММГЦ. Модифiкована методика культивування та фiксацiї амнiоцитiв використовується в ряді генетичних консультацiй та центрів України.

Новi принципи формування груп високого генетичного ризику враховують при роботi з вагiтними в жiночих консультацiях та пологодопомiжних закладах.

На пiдставi результатiв роботи були запровадженi рацiоналiзаторськi пропозицiї: «Способ получения хромосомных препаратов из культуры лимфоцитов периферической крови»; «Способ получения хромосомных препаратов из культуры амниотической жидкости» (№№ 3416, 3417, 1996 г.).

Основні положення дисертації були розроблені в рамках Національної Програми «Діти України», затвердженою Указом Президента України №63/96 від 18.01.96.

Особистий внесок здобувача в проведення досліджень.

Дисертант особисто розробив і запровадив в практику Донецького мiжобласного медико-генетичного центру модифiковану методику культивування та фiксацiї амнiоцитiв. Дисертантом особисто готувалися живильнi середовища, якi використовувалися для культуральних дослiджень, виконувався цитогенетичний аналiз клiтин амнiотичної рiдини, бiоптату плаценти та пуповинної кровi, проводився аналiз отриманих даних. Автором самостiйно опрацьованi результати роботи та пiдготовлений текст дисертацiї.

Апробацiя результатiв роботи.

Основнi положення дисертацiйної роботи доповiдалися на: 2-му зїздi медичних генетикiв України (жовтень 1995, Львів); конференцiях по пренатальнiй дiагностицi в Центральних та Схiдноєвропейських країнах (вересень 1996, Прага; червень 1997, Будапешт); 1-му Конгресi Української Асоцiацiї спецiалiстiв ультразвукової дiагностики в перинатологiї, генетицi та гiнекологiї (травень 1997, Харкiв); обласних, мiських та мiжрайонних семiнарах з медичної генетики (1993-1998 рр.).

Публiкацiї.

З теми дисертацiї опублiковано 11 робiт, в тому числі 6 журнальних статей.

Обєм та структура роботи.

Дисертацiйна робота викладена на 137 сторiнках машинописного тексту у вигляді 5 розділів і складається з вступу, огляду лiтератури, опису об’єкту та методик дослідження, розділів власних досліджень, обговорювання результатів, висновкiв та списку лiтератури. Текст дисертацiї iлюстрований 15 таблицями та 20 малюнками. Список лiтератури мiстить 196 назв.

ЗМIСТ РОБОТИ

Матерiали та методи дослiдження.

Комплексна пренатальна дiагностика здiйснювалася в Донецькому ММГЦ. Формування потокiв на iнвазивнi дослiдження виконувалося на пiдставi даних анамнезу, результатiв цитогентичних дослiджень, ультразвукового та бiохiмiчного скринiнгiв.

Ультразвуковий скринiнг проводився за схемою, запропонованою Гречанiною О.Я. (1992).

При аналiзi маркерiв материнської сироватки (МС) використовувалися розробленi базовi та граничнi значення альфа-фетопротеiну (АФП) та хорiонiчного гонадотропiну (ХГ) для кожного тижня вагiтностi та їх змiну при хромосомних порушеннях у плода Николенко М.И., 1997. Комбiнований ризик розраховували згiдно принципу Wald i Cuckle (1988).

Для iнвазивної ПД переважно використовувався трансабдомiнальний амнiоцентез. Основою для проведення дослiджень стало удосконалення традицiйного способу отримання хромосомних препаратiв з культури АР. Модифiкована методика була опрацьована на 150 культурах паралельно з культивуванням i фiксацiєю АР за класичною методикою Nadler, 1969; Gregson, 1970; Nelson, 1973.

Усього проведено 1603 амнiоцентеза, 104 плацентоцентеза i 11 кордоцентезiв. Аспiрацiя матерiалу для iнвазивних дослiджень проводилась у термiнi вагiтностi 14-25 тижнiв пiд контролем ультразвукового сканеру Aloka - SSD 630.

Для оцiнки хромосомного набору в клiтинах плаценти аналiзували препарати, виготовленi «напiвпрямим» методом Кулешов Н.П., 1989.

Культивування пуповинної кровi плода та периферичної кровi батькiв проводили за загальновизнаною методикою Hungerford D., 1965, використовуючи запропонований нами спосiб синхронiзацiї мiтозiв в культурi - до початку фiксацiї культуру лiмфоцитiв витримували 2-2,5 години у термостатi з температурою 36 С.

Для отримання диференцiйного забарвлення хромосом, оцiнки розмiрiв гетерохроматинових та ядерцеутворюючих районiв використовували G-, C- i Ag- методи Селезнев Ю.В., 1972; Sumner, 1971; Bloom, 1976.

Математична обробка результатiв виконувалась на компютерi IBM PC/AT 486 з використанням програми STATGRAPHICS версiї 3.0; Excel 5.0; SAS версiї 6.04.

Результати дослiджень та їх обговорення

Модифiкацiя етапiв культивування амнiотичної рiдини.

Були встановленi чинники, якi впливають на тривалiсть культивування амнiоцитiв та якiсть хромосомних препаратiв.

Практично в усiх iснуючих на сьогоднi методиках наступним за аспiрацiєю АР проводять етап центрифугування отриманої рiдини з метою вiдокремлення ембрiональних клiтин вiд iншої сумiшi. Пiд час центрифугування клiтини можуть пошкоджуватися; крiм того, при вiдокремленнi надосадової рiдини вiдбувається їх часткова втрата. Таким чином, в цiй пробi АР первiсно знижена проліферативна активнiсть амнiоцитiв.

При усуненнi етапу центрифугування АР, який виступає перед ставленням культури, через 72 години пiсля початку культивування на днi флакону було вiдмiчено значну кiлькiсть прикрiплених до субстрату клiтин. Крім того, до цього часу у 75% культур були сформованi колонiї дiаметром 2-3 мм. В паралельнiй культурi, де АР пiдлягала центрифугуванню, за аналогiчний промiжок часу кiлькiсть прикрiплених до культуральної поверхнi клiтин була значно меншою.

Важливим чинником, який сприяє скороченню часу культивування, є використання експериментально дiбраних комплексних живiльних сумiшiв, до яких входять синтетичнi середовища Ham's F-10, Ham's F-12, RPMI - 1640, а також ембрiональна теляча сироватка (ЕТС) (80 та 20%, вiдповiдно). При культивуваннi АР на загальновизнаному середовищi Chang’s, спецiально призначеному для стимуляцiї в’ялоростучих клiтин та лiнiй Chang H., 1991, i комплекснiй живильнiй сумiшi, часових вiдмiн не вiдзначено. Крiм цього, вартiсть середовища Chang’s майже в 10 разiв перевищує вартiсть комплексного середовища.

Важливою перевагою запропонованої методики є те, що вона не потребує використання СО- iнкубатора для культивування клiтин АР, так як пiдiбраний склад сумiшiв, до яких входить HEPES, дозволяє пiдтримувати оптимальний рiвень кислотностi (7.2-7.4). Вiдсутнiсть СО-iнкубатора часто виступає перешкодою використанню амнiоцитiв для цитогенетичної ПД, тому що всi традицiйнi методики адаптованi саме до цiєї умовi культивування клітин АР.

Ще одним культуральним заходом, який впливає на термін культивування, якiсть хромосомних препаратiв та вартiсть обстежень, є змiна живильної сумiшi не раніше 5-6 доби. Нашi дослiдження довели, що, на вiдмiну вiд класичних методик, немає потреби кожнi 3-4 днi проводити змiну живильної сумiшi, тому що середовища складенi з великим запасом поживних речовин, і на протязі зазначеного перiоду часу вичерпання їх не вiдбувається. Першу змiну живильного субстрату проводили зa 16-18 годин до початку фiксацiї, синхронiзуючи мiтотичний розподiл клiтин в культурi. Завдяки цьому, вдалося збiльшити мiтотичний iндекс у 2-2,5 рази порiвняно з аналогiчною пробою АР, зафiксованою традицiйним способом. Двократну зміну живильного середовища - на 5 добу та за 16-18 годин до початку фіксації - проводили лише в культурі з низькою проліферативною активністю.

Таким чином, внаслiдок проведеної роботи, була запропонована удосконалена методика культивування та фiксацiї амнiоцитiв, що дозволяє протягом 7-9 дiб, на вiдмiну вiд класичної, яка потребуї 15-18 дiб, отримати хромосомнi препарати високої якостi з 25-30 метафазами на склi (табл. 1, мал.1).

Таблиця 1

Якісно-часова характеристика традиційної то модифікованої методик

Методика, яка використовується | Період адгезії, доби | Період віднов-лення мітотичної активності, доби | Період форму-вання диферен-ційованого моно-слою, доби | Кількість метафаз на одному склі

Традиційна | 5 | 5-8 | 15-18 | 10-15

Модифікована | 3 | 3-5 | 7-9 | 25-30

Мал. 1. Кількість метафаз, отримана традиційним (а) методом та модифікованим (б) з використанням синхронізації мітозів.

Запропонована методика була апробована на паралельних культурах АР, яку аспiрували в рiзних термiнах вагiтностi. Часових вiдмін при культивуваннi АР, отриманої з 16 по 25 тижнi, не помiчено. В процесi роботи з АР, яка була аспiрована до 16 тижня, встановлено, що час культивування складас в середньому 14 діб. Тому, виконуючи раннi амнiоцентези, для скорочення перiоду культивування АР пропонується збагатити живiльну сумiш середовищем IMDM.

Обгрунтування переважного використання трансабдомiнального АЦ для цитогенетичної ПД.

Головною перевагою трансабдомiнального амнiоцентезу є його безпечнiсть, що продемонстровано усiма дослiдниками та було показано у нашiй роботi. Ризик переривання вагiтностi пiсля проведення цiєї iнвазивної манiпуляцiї, згiдно з лiтературними даними, не перевищує 0,5-0,7% Бочков Н.П., 1982; Tabor A., 1988; Mennuti M.,1989. З 1603 дiагностичних АЦ, проведених в ММГЦ м. Донецька, перериванням вагiтностi закiнчилися 4 iнвазивнi манiпуляцiї, що склало 0,2% вiд загальної кiлькостi обстежених. В одному з цих випадкiв була виявлена хромосомна патологiя плода - трисомiя 21.

Застосовуючи модифiковану методику, яка дозволяє отримати високоякiснi хромосомнi препарати при зниженнi строкiв культивування АР, дiагностичний амнiоцентез виконувався як головний метод iнвазивної діагностики хромосомних захворювань.

Як додатковi методи ми використовували плаценто- та кордоцентез. До методу кордоцентезу зверталися в крайніх випадках, що пояснюється складнiстю виконання та високим ризиком ускладнень пiсля даної iнвазивної манiпуляцiї Кулиев А.М.,1990; Nicolaides K., 1986. В наших дослiдженнях кордоцентез виконувався з метою верифiкацiї дiагнозу, а також при значному маловоддi - коли аспірація навколоплодної рiдини була неможлива.

Плацентоцентез проводили у випадках пiзнього звертання жiнки до МГЦ (у термiнi вагiтностi 23-25 тижнiв), в тому числi, при виявленнi в цих строках УЗ-ознак хромосомної патологiї плода. Практично єдиною перевагою плоцентоцентезу були малi терміни субiнкубування (2,5-3 години) отриманого бiоптату. Провести якiсний хромосомний аналiз у клiтинах бiоптату плаценти вдалося у 71% випадкiв. Невдачi при аналiзi карiотипу в рештi випадках були зумовленi наявнiстю великої кiлькостi гiпоплоїдних пластинок внаслiдок втрати хромосом пiд час мацерацiї тканини оцтовою кислотою (10,6%), низькою якiстю хромосомних пластинок (10,7%), вiдсутнiстю метафаз на готових препаратах (4,8%) та малим обємом аспiрованої тканини (2,9%). З аналогiчними проблемами зустрічаються й iншi дослiдники, вiдмiчаючи також i бiльш високий ризик ускладнень пiсля даної манiпуляцiї у порiвняннi з трансабдомiнальним амнiоцентезом Кулешов Н.П., Барцева О.Б., 1989; Wapner R., Jackson L., 1988.

Паралельно з плацентоцентезом виконували амнiоцентези. Клiтинну масу, потрiбну для фiксацiї, отримували через 7-9 дiб. З усiх проб АР були виготовленi високоякiснi хромосомнi препарати.

Суттєвою вадою плацентоцентезу є висока частота тканинного мозаїцизму, який реєструють, аналiзуючи препарати з бiоптату плаценти. В наших дослiдженнях вона складала 5,4%, хоча в лiтературi вказують i бiльш значне число вiдсотків. Так, при цитогенетичному аналiзi клiтин плаценти у 4 випадках були вiдзначенi хромосомнi порушення: трисомiя по хромосомах 21 (2 випадки) та маркерних хромосомах (mar = G та mar < E).

Тканинний мозаїцизм в АР практично не зустрiчається Bui T. et al., 1984; Worton R., 1984. Аналiзуючи хромосомнi препарати, виготовленi з культури амнiоцитiв, ми зiткнулися лише з явищем помилкового (культурального) мозаїцизму, частота якого склала 2,9%, що узгоджується з лiтературними даними Masis A., 1986; Krawczun M., 1989; Jha A., 1992.

Порiвняння дiагностичної значущостi описаних методiв демонструє перевагу трансабдомiнального АЦ, безперечними i головними якостями якого є мiнiмальний ризик ускладнень, висока iнформативнiсть, а також найменше число вiдсотків мозаїцизму.

Виявлення хромосомної патологiї плода в рiзних групах генетичного ризику.

В ходi комплексної ПД рiзноманiтний спектр хромосомних та геномних порушень в карiотипi плода був виявлений у 8% обстежених. В структурi геномних патологій значна питома вага нале-жала синдрому Дауна - 41,5%, синдрому Едвардса - 15,1% та синдрому Тернера - 15,1% (мал. 2).

Таблиця 2

Ступінь виявлення хромосомних порушень в каріотипі плода в різних групах генетичного ризику

Група ризику | Кількість амніоцентезів

абсолютне / % | Кількість плодів з хромосомними порушеннями

абсолютне / %

Вік матері більше 35 років | 324/20,2 | 6/1,85

Високий комбінований ризик че-рез вік матері (більше 35 років) та ОАА | 141/8,8 | 6/4,26

Високий комбінований ризик че-

рез вік матері (більше 35 років) та рівень маркерів МС | 242/15,1 |

33/13,60

Дитина з синдромом Дауна в анамнезі | 128/8,0 | 1/0,78

Дитина з ПВР в анамнезі | 55/3,4 | -

Змінений рівень маркерів МС (вік матері менше 35 років) | 579/36,1 | 55/9,50

Наявність хромосомної перебудо-ви в каріотипі батьків | 30/1,9 | 15/50,0

Виявлені УЗ-маркери хромосом-ної патології | 86/5,4 | 6/7,0

Захворювання, зчеплені зі статтю | 18/1,1 | -

Ступiнь виявлення хромосомних аберацiй плода варiювала в рiзних групах ризику i залежала вiд принципiв їх формування.

Аналiз ефективностi виявлення хромосомних патологiй в трьох групах вагiтних вiком понад 35 рокiв показав, що з 324 жiнок, яким дiагностичний АЦ був призначений тiльки з причин вiку, хромосомнi порушення в карiотипi плода були виявленi лише у 6 обстежених, що склало 1,85%.

В другу групу лiтнiх вагiтних вiднесенi жiнки з обтяженим акушерським анамнезом (ОАА), тобто наявністю спонтанних викиднiв, тривалого безплiддя, порушень менструального циклу. В данiй групi, сформованiй на пiдставi врахування декiлькох показникiв, хромосомнi аберацiї плода були виявленi у 6 з 141 обстеженої (4,26%).

Третю групу вагiтних, направлених на iнвазивну ПД, склали жiнки, вiком 35 рокiв i бiльше, зі змiненим рiвнем АФП i ХГ. Загальна кiлькiсть лiтнiх жiнок, обстежених на маркери МС складала 1970. На пiдставi результатiв біохімічного скринiнгу в групу ризику були вiднесенi лише 242 вагiтнi. Хромосомнi порушення у плода виявленi у 33 обстежених, що склало 13,6%. Аналiз катамнестичних даних показав, що серед жiнок вiком понад 35 рокiв, яким АЦ не був призначений, не зареєстровано випадкiв народження дитини з хромосомними захворюваннями. Таким чином, завдяки використанню скринiнгу маркерiв МС та диференцiйованому пiдходу до формування груп ризику, вдалося значно пiдвищити ступiнь виявлення хромосомної патологiї одночасно з рiзким зниженням кiлькостi iнвазивних обстежень серед жiнок старшого вiку.

Традицiйним показником до призначення дiагностичного АЦ, крiм вiку матерi, є наявнiсть дитини з СД в анамнезi. Однак, за даними лiтератури, ризик повторного народження дитини з хромосомною патологiєю, зокрема з трисомiсю 21, не перевищує 1% Milunsky A., 1979; Stene J. et al., 1984, що було пiдтверджено в ходi нашого дослiдження. Так, в результатi проведення цитогенетичної допологової дiагностики 128 жiнкам цiєї групи, хромосомна патологiя була виявлена лише у одного плода - 46, del(X) / 45, X0 - мозаїчна форма синдрому Тернера. Крiм того, в 3-х випадках були дiагностованi дефекти невральної трубки плода. Тобто, хоча цi жiнки i вiдносяться до групи високого ризику, вiн не завжди пов’язаний з iмовiрнiстю народження дитини з хромосомною патологiєю. До цієї групи вагiтних так само, як i до групи жiнок, що мають в анамнезi дитину з природженими вадами розвитку (ПВР), треба використовувати диференцiйований пiдхiд, враховуючи данi ультразвукового та бiохiмiчного скринiнгiв при призначеннi iнвазивних дослiджень.

Особливо актуальним є розрахунок iндивiдуального ризику з використанням рiвня маркерiв МС у жiнок вiком до 35 рокiв. Завдяки масовому скринiнгу вагiтних на маркери МС, питома вага жiнок цiєї групи в структурi направлянь на АЦ склала 36,1%. Хромосомнi порушення в карiотипi плода були виявленi у 9,5% випадкiв.

Показаннями до проведення дiагностичного АЦ, якi не потребують додаткового розрахунку iндивiдуального ризику, є наявнiсть в карiотипi батькiв геномних анеуплоїдій або хромосомних перебудов. В данiй групi хромосомнi порушення у плода були виявленi в 50% випадках, представленi в 36,7% сбалансованими транслокацiями, успадкованими вiд батькiв i в 13,3% - несбалансованими.

Дiагностичний АЦ проводили i тим жiнкам, у котрих при ультразвуковому дослiдженнi (УЗД) плода в 2-му триместрi були виявленi специфiчнi для хромосомної патологiї маркери: шийна цистогiгрома, збiльшення розмiрiв шийної складки, пiєлоектазiя, гастромегалiя, скорочення довжини стегна, порушення обєму навколоплодної рiдини. Хромосомнi захворювання в цiй групi дiагностованi у 3-х плодiв з шийною цистогiгромою, карiотип - 45,X0. Проведенi дослiдження узгоджуються з лiтературними даними, згiдно яких iнформативнiсть УЗ- маркерiв в 2-му триместрi не така значна, щоб вплинути на популяцiйну частоту хромосомної патологiї Brombati B., 1995; Orlandi F., 1997. Згiдно останнiх даних, найбiльш iнформативним УЗ-маркером визнано комiрцевий простiр плода (nuchal transluency) в 1-му триместрi вагiтностi. Збільшення його розмiру понад 2,5 мм в 85% випадкiв сполучується з трисомiєю 21 Nicola1des K.,1992; Brizot M., 1995. Такі зміни спостерiгалися нами в 3-х випадках, в одному з яких дiагностований СД.

Результати проведеного порiвняльного аналiзу ступеня виявлення хромосомних порушень вказують на необхiднiсть використання диференцiйованого пiдходу до оцiнки iндивiдуального ризику при призначеннi iнвазивної ПД.

Отриманi данi лягли в основу запропонованої схеми формування груп ризику для проведення iнвазивних дослiджень, в якiй взаємозвязок та спадкоємнiсть методiв комплексної ПД дозволяють пiдвищити ефективнiсть виявлення хромосомних патологiй плода (мал. 3).

Мал. 3. Формування груп ризику для проведення діагностичного АЦ з урахуванням комплексної ПД.

Таким чином, пiдсумком проведеної роботи є розробка модифiкованої методики отримання хромосомних препаратiв високої якостi з культури клітин амнiотичної рiдини, яка дозволяє широко використовувати дiагностичний амнiоцентез для пренатальної дiагностики хромосомних захворювань, та удосконалення пiдходів до формування груп високого генетичного ризику.

ВИСНОВКИ

1. Отримання хромосомних препаратiв високої якостi з культури клітин амнiотичної рiдини при зниженнi витрат та часу, потрiбних для проведення дослiджень, пiдвищує дiагностичну значущiсть амнiоцентезу, який являється найбiльш безпечним та iнформативним методом пренатальної дiагностики хромосомних захворювань.

2. Усунення етапу центрифугування АР до ставлення її в культуру та використання комбiнацiї середовищ RPMI - 1640; Ham's F-10; Ham's F-12 з доданням HEPES скоротшує час культивування амнiоцитiв до 7-9 дiб, а також не вимагає застосування спецiалiзованих дорогих сумiшiв та СО-iнкубатора.

3. Синхронiзацiя мiтотичного розподiлу амнiоцитiв в культурi за 16-18 годин до початку її фiксацiї дозволяє отримати хромосомнi препарати з 25-30 метафазами на склi.

4. Запропонована методика дозволяє отримати культуру клiтин АР незалежно вiд термiнiв вагiтностi, на яких вона аспiрована. Для скорочення перiоду культивування АР, яка отримана ранiш 16 тижня вагiтностi, до 9-10 діб, необхiдно додаткове збагачення живильної сумiшi середовищем IMDM.

5. Перевагою використання АЦ в 2-му триместрi вагiтностi є можливiсть бiльш старанного вiдбору груп високого ризику, що дозволяє пiдвищити ступiнь виявлення хромосомної патологi при зниженнi кiлькостi проведених манiпуляцiйї .

6. Висока ефективнiсть виявлення хромосомної патологiї плода, незалежно вiд вiку жiнки, досягається розрахунком iндивiдуального ризику, заснованому на комплекснiй оцiнцi результатiв бiохiмiчного скринiнгу, даних УЗД та анамнезу.

Список опублікованых наукових робіт, які відображають

основні положення дисертації

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

Хлiвна Л.А. Пiдвищення ефективностi пренатальної дiагностики хромосомної патологiї.

Рукопис дисертацii на здобуття вченого ступеня кандидата бiологiчних наук по спецiальностi 03.00.15 - генетика (бiологiчнi науки). Украiнський науковий гiгiснiчний центр. Киiв, 1999.

Встановлено фактори, що дозволяють скоротити час культивування амнiоцитiв до 7-9 дiб. Розроблено оптимальнi умови, завдяки яким зявилася можливiсть отримувати високоякiснi хромосомнi препарати з 25-30 метафазами на склi; запропонована модифiкована методика була дозволяє проводити цитогенетичний аналiз плода в клiтинах АР незалежно вiд термiнiв вагiтностi, на яких вона аспiрована. Обгрунтовано дiагностичну значущiсть переважного використання трансабдомiнального амнiоцентезу для пренатальної дiагностики хромосомноїi патологii. Визначено найбiльш iнформативнi критерiї формування груп високого генетичного ризику для проведення iнвазивноi ПД.

З теми дисертацiї опублiковано 11 наукових робiт.

Ключовi слова: iнвазивнi дослiдження, трансабдомiнальний амнiоцентез, культура клiтин, живильна сумiш, диференцiйований пiдхiд, група високого генетичного ризику.

Хлевная Л.А. Повышение эффективности пренатальной диагностики хромосомной патологии.

Рукопись диссертации на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 - генетика (биологические науки). Украинский научный гигиенический центр. Киев, 1999.

Эффективность пренатальной диагностики (ПД) хромосомной патологии зависит, главным образом, от решения двух вопросов:

n

n выбора наиболее информативного и безопасного метода кариотипирования плода, использование которого было бы доступно для широкого практического применения;

В связи с этим, целью настоящего исследования было усовершенствование методологических и методических подходов к дородовой диагностике хромосомной патологии.

Основой для проведения цитогенетических исследований явилась модификация традиционного способа получения хромосомных препаратов из культуры амниотической жидкости (АЖ), что было продиктовано несовершенством существующих методик.

Усовершенствованая методика была отработана на 150 культурах АЖ, аспирированной в различные сроки беременности. Были установлены факторы, влияющие на длительность культивирования амниоцитов, качество хромосомных препаратов, стоимость исследования; экспериментально подобран состав питательных сред; определены оптимальные условия стимуляции роста культуры клеток АЖ.

Предложенная методика позволяет при минимальных затратах в течение 7-9 дней, в отличие от классической, требующей 15-18 дней, получить хромосомные препараты высокого качества с 25-30 метафазами на стекле (по стандартной методике - 10-15 метафаз).

Применяя модифицированную методику, амниоцентез использовался в качестве основного метода инвазивной ПД. Проведено 1603 диагностических амниоцентеза. Широкий спектр хромосомных нарушений обнаружен в 123 случаях, степень выявления которых варьировала от 1,85% до 13,6% в различных группах риска и зависела от принципов их формирования.

Сравнительный анализ эффективности цитогенетической ПД показал, что использование только традиционных показаний к проведению исследований не может существенно повлиять на популяционную частоту хромосомной патологии. Предложена схема дифференцированного подхода к назначению инвазивной ПД, основанного на многофакторном анализе и расчете индивидуального риска.

Khlevnaya L.A. The increase of the efficiency of chromosomal pathology’ prenatal diagnosis.

The manuscript of dissertation for a Candidate’s degree in Biology, speciality 03.00.15- genetics (biological science). Ukrainian Scientific Hygienic Centre. Kyiv. 1999.

The facts reducing the terms of amniocyte’s cultivation had been esteblished. The optimal conditions for the obtaining of high-quality chromosomal preparations with 25-30 metaphases on the glass had been elaborated. The proposed modified method permits to provide fetus’s cytogenetic analysis on the basis of amniotic fluid culture irrespective of the term of it’s aspiration. The diagnostic significance of the preferable use of transabdominal amniocentesis for the prenatal diagnosis of chromosomal patologies had been founded. The most informative criterions of the formation of high genetic risk groups for invasive prenatal diagnosis had been determined.

11 scientific papers within the context of dissertation had been publised.

Key words: invasive investigations, transabdominal amniocentesis, culture of cells, feeding mixture, differentiative approach, group of high genetic risk.