Національна академія наук України
Національна академія наук України
Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця
КОЛОТУШКІНА ОЛЕНА ВАДИМІВНА
УДК 616.8-009:611.018:57.086
СТРУКТУРНІ ОСОБЛИВОСТІ ПРОЦЕСІВ МІЄЛІНІЗАЦІЇ ТА
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНО ВИКЛИКАНОЇ ДЕМІЄЛІНІЗАЦІЇ В УМОВАХ КУЛЬТИВУВАННЯ НЕРВОВОЇ ТКАНИНИ
03.00.13 – фізіологія людини та тварин
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
Київ – 2003
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України
Науковий керівник: доктор медичних наук, професор
Скибо Галина Григорівна,
завідувач відділу цитології Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
Сторожук Віктор Максимович,
завідувач відділу фізіології головного мозку Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України
доктор біологічних наук
Стеченко Людмила Олександрівна,
професор кафедри гістології та ембріології Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця МОЗ України
Провідна установа: Київський Національний університет імені Тараса Шевченка
Захист відбудеться 11.03.2003 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.
Автореферат розісланий 10.02.2003 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,
доктор біологічних наук З.О.Сорокіна-Маріна
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Мієлінові оболонки, які вкривають аксони, виконують декілька важливих функцій, а саме: прискорення проведення нервового імпульсу, захист аксонів, їх ізоляція та живлення. (Хухо, 1990; Chan et al., 1998).
Зміна компактної структури мієліну лежить в основі так званих демієлінізуючих неврологічних захворювань. Одним з найбільш поширених представників даної групи нозологічних одиниць є розсіяний склероз (РС) (Bernard and de Rosbo, 1992). Це аутоімунне прогресуюче захворювання центральної нервової системи (ЦНС), для якого характерні демієлінізація, деструкція аксонів і присутність численних ділянок запалення (Хондкариан и др., 1987).
Для вивчення фізіологічних і клітинних механізмів, що лежать в основі РС, був виконаний ряд досліджень із застосуванням модельних систем in vitro (культивування клітин з наступним додаванням до культури факторів, що викликають руйнування мієлінових оболонок) та in vivo (відтворення у тварин захворювань, для яких характерні такі ж фізіологічні та клітинні зміни, що й для РС, наприклад, експериментальний алергічний енцефаломієліт (ЕАЕ) (Жаботинский и Иоффе, 1975; Хохлов и Савченко, 1990; Zajicek and Compston, 1995; Zhou et al., 1998; Bar-Or et al., 1999; Xiao and Link, 1999; Kornek et al., 2000). Однак, не зважаючи на численні дослідження, точні механізми РС досі залишаються нез'ясованими.
Значний інтерес в останній час викликають роботи з вивчення речовин, які впливають на стан мієлінових оболонок. Відомо, що деякі гриби (так звані медичні) виявляють фізіологічні та фармакологічні якості (Chang, 1996). Нещодавно встановлено, що екстракт одного з таких грибів, Hericium erinaceus, стимулює імунну систему, виявляє нейротропну дію та сприяє синтезу фактора росту нервів (ФРН) (Lee et al., 2000; Kenmoku et al., 2002). Ці дані наводять на думку, що цей екстракт може мати регулювальний вплив на розвиток нервової тканини і, зокрема, на процеси мієлінізації та ремієлінізації. Тому дослідження дії екстракту H. erinaceus на нервові клітини і формування мієлінових оболонок є дуже актуальним і важливим.
У зв'язку з цим з метою подальшого поглиблення уявлень щодо механізмів формування мієлінових оболонок та їх деструкції, зокрема, при РС, найбільш актуальним є вирішення таких питань. По-перше, створення та удосконалення адекватної експериментальної моделі in vitro, що дозволить відтворити як нормальний процес мієлінізації, так і процес демієлінізації за умов, схожих до таких при РС. По-друге, вивчення за допомогою цієї моделі структурних змін мієлінових оболонок та культивованих клітин нервової тканини у відповідь на дію сироваток крові хворих на РС різного ступеня тяжкості. По-третє, дослідження впливу екстракту H. erinaceus на стан мієлінових оболонок та клітин у нормі та під впливом демієлінізуючих факторів.
Зв'язок з науковою тематикою організації. Робота відповідає плану науково-дослідної тематики відділу цитології Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України і виконана у рамках держбюджетної теми N 019725009158 “Молекулярні механізми інтегративної функції нервових клітин у нормі та при патології”.
Мета і задачі дослідження. Метою роботи було виявлення та характеристика процесів мієлінізації та демієлінізації у тканинах мозочка щурів в системах in vitro та in vivo, а також з'ясування впливу екстракту H. erinaceus на стан мієлінових оболонок і клітин у нормі та під впливом демієлінізуючих факторів. Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні задачі:
1. Простежити етапи формування мієлінових оболонок у культурі клітин мозочка.
2. Провести порівняльний аналіз особливостей будови мієлінових оболонок у ЦНС інтактних тварин та у культурі клітин мозочка.
3. Вивчити і порівняти особливості розвитку структурних змін мієлінових оболонок під впливом сироваток крові хворих на РС у культурі клітин мозочка та у ЦНС тварин, хворих на ЕАЕ.
4. Провести порівняльний аналіз процесів структурних змін мієлінових оболонок під впливом сироваток крові хворих на РС у стадії загострення та ремісії in vitro.
5. Вивчити вплив екстракту H. erinaceus на процес мієлінізації у культурі клітин мозочка.
6. Провести аналіз впливу екстракту H. erinaceus на культуру клітин мозочка у разі дії сироваток крові хворих на РС різного ступеня тяжкості.
Об'єкт і предмет дослідження. Об'єктом дослідження були мієлінові оболонки аксонів і клітинні елементи мозочка та спинного мозку щурів. Предметом дослідження були структурні особливості мієлінових оболонок протягом мієліногенезу та зміни структури мієлінових оболонок і клітин нервової тканини під впливом сироваток крові хворих на РС, а також у присутності екстракту H. erinaceus.
Методи дослідження. Для досягнення мети даної роботи був використаний метод культивування дисоційованої тканини мозочка, за допомогою якого були вивчені процеси мієлінізації і демієлінізації in vitro, а також вплив екстракту H. erinaceus на нервову тканину. Імуноцито- та гістохімічні методи дозволили провести структурний аналіз мієлінових оболонок і клітин. Ультраструктурні характеристики тканини мозочка у процесі мієліногенезу, а також під впливом демієлінізуючих факторів і екстракту H. erinaceus були досліджені за допомогою методів електронної мікроскопії.
Наукова новизна одержаних результатів. У результаті проведених досліджень охарактеризовано етапи формування мієлінових оболонок in vitro. Зрілі мієлінізовані відростки спостерігалися протягом 4-го тижня культивування, а на початку 5-го тижня культура мала ознаки старіння. Встановлено, що вплив сироваток крові хворих на РС викликав демієлінізацію аксонів, олігодендроцити (ОЛ) мали структурні зміни, а астроцити демонстрували фагоцитарні властивості. Вперше виявлено, що на фоні подібності структурних змін, викликаних дією сироваток, вплив сироватки хворих у стадії загострення був кількісно більш інтенсивним, ніж вплив сироватки хворих у ремісії. Вперше виявлено регулювальну дію екстракту H. erinaceus щодо процесу мієлінізації нервових відростків, який проходив і завершувався швидше у присутності екстракту. Вперше встановлено, що екстракт H. erinaceus виявляв захисні властивості щодо мієлінових оболонок та зменшував ступінь демієлінізації під впливом сироваток крові хворих на РС.
Теоретичне та практичне значення роботи. Отримані результати суттєво доповнюють сучасні уявлення про зміни елементів нервової тканини під впливом сироваток крові хворих на РС та про структурні особливості розвитку процесів мієлінізації та демієлінізації на різних етапах. Крім того, отримані дані підтверджують, що культура клітин мозочку може бути успішно використана як адекватна модель РС in vitro. Встановлені відмінності дії сироваток крові хворих на РС у різних стадіях поглиблюють отримані раніше дані про механізми структурних змін при РС. Виявлення регулювальних та захисних властивостей екстракту H. erinaceus щодо процесів мієлінізації та демієлінізації має важливе загальнотеоретичне значення, а також практичну цінність для клінічної медицини. Отриманні результати припускають можливість використання даного екстракту чи його компонентів для профілактики і терапії РС та дозволяють рекомендувати екстракт H. erinaceus для подальшого дослідження у клінічних умовах.
Особистий внесок здобувача. Дисертантом було самостійно виконано аналіз наукової літератури та розроблено методологію дослідів. Дисертантом особисто проведені експериментальні дослідження і виконана статистична обробка отриманих результатів. Культивування клітин проводилося за участю ст.н.с. Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України, к.б.н. Півнєвої Т.А. та мол.н.с. цього закладу, к.б.н. Вороніна К.Ю. Сироватки крові хворих на РС були надані за сприяння доцента кафедри нервових хвороб Національного медичного університету ім.О.О.Богомольця МОЗ України, д.м.н. Соколовой Л.І. Обговорення результатів та формулювання висновків проводилися спільно з науковим керівником, завідувачем відділом цитології Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України, д.м.н., проф. Скибо Г.Г., пров.н.с. цього закладу, д.б.н. Василенко Д.А. та ст.н.с. цього закладу, к.б.н. Молдаваном М.Г.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені на Форумі європейської нейронауки (Велика Британія, 2000), II конференції Українського товариства нейронаук (Донецьк, 2001), Міжнародному мікологічному конгресі (Київ, 2001), IV Міжнародній конференції по функціональній нейроморфології (Росія, 2002).
Публікації. Результати досліджень представлені у 5 статтях та 4 тезах, які опубліковані у провідних вітчизняних журналах і матеріалах з'їздів та конференцій.
Структура та об'єм дисертації. Дисертація викладена на 187 сторінках і містить список скорочень, вступ, огляд літератури, розділ матеріалів і методів досліджень, розділ результатів досліджень, обговорення отриманих результатів, висновки та список використаних джерел. Робота ілюстрована 12 таблицями та 33 рисунками. Перелік використаної літератури включає 246 посилань.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Приготування культури клітин. Новонароджених щурів лінії Вістар декапітували, вилучали головний мозок і виділяли мозочок. Після промивання у мінімальному середовищі DMEM мозочок механічно дисоціювали за допомогою Пастерівських піпеток різного діаметру. Отриману клітинну суспензію висаджували на стерильний пластик аклар, який був вкритий 1% розчином полі-L-лізину, і переносили у чашки Петрі. Клітини мозочка культивували протягом 21-ої, 26-ти і 31-ої доби при температурі 370С у мінімальному середовищі DMEM із додаванням 10% сироватки коня, 10% ембріональної сироватки теля, глюкози (6г/л) та антибіотиків в атмосфері, що містила CO2 (5%). Для вивчення дії екстракту H. erinaceus, крім згаданих речовин, до поживного середовища додавали 10% згаданого екстракту.
Світлооптичний аналіз культури клітин. Для виявлення мієлінових оболонок у використаній культурі 26-денні клітини фіксували 4% розчином формальдегіду та 1% розчином OsO4, дегідратували по висхідній батареї спиртів, фарбували 0.5% розчином судану чорного, просвітляли у 70% спирті, регідратували і вміщували у суміш гліцерин-желатину. Для виявлення ОЛ у використаній культурі 26-денні клітини фіксували 4% розчином формальдегіду, інкубували в 0.05% розчині Тритону Х-100, блокували неспецифічність зв'язування 5% розчином сироватки козла і 5% розчином сироваткового альбуміну бика, мітили спочатку моноклональними антитілами до основного білку мієліну щурів (ОБМ, маркерного білку зрілих ОЛ) і потім вторинними біотинільованими анти-щурячими антитілами, після чого мітили отриманий кон'югат комплексом авідін-Alexa-568 і вміщували у суміш гліцерину та Мовіолу. Аналіз препаратів проводили за допомогою фазово-контрастного та флуоресцентного мікроскопів (об'єктиви х10, х20, х40; окуляри х12.5).
Моделювання процесу демієлінізації in vitro. Демієлінізацію аксонів у культурі клітин мозочка викликали заміною сироватки коня еквівалентною кількістю сироватки крові хворих на РС у стадії загострення або ремісії із додаванням комплементу білків людини (10%). Як контроль використовували сироватку людей без ознак неврологічних хвороб.
Електронномікроскопічний (ЕМ) аналіз культури клітин. Для дослідження ультраструктури культивованих клітин мозочка 21-, 26- і 31-денні культури фіксували 1.5% розчином глутаральдегіду і 1% OsO4, дегідратували по висхідній батареї спиртів, вміщували в епоксидні смоли і полімеризували при температурі 560С протягом 48 годин. Отримані за допомогою ультратома ультратонкі зрізи фарбували 2% розчином уранілацетату та розчином нітрату свинцю (за методом Рейнольдса) і вивчали за допомогою електронного мікроскопа (Jeol-100, Японія).
Моделювання процесу демієлінізації in vivo. Як модель демієлінізації in vivo використовували відтворення ЕАЕ у щурів лінії Вістар. Для цього 2-місячним щурам робили ін'єкцію енцефалітогеної емульсії, яка містила мієлін-олігодендроцитарний глікопротеїн і повний ад'ютант Фрейнда (0.4 мл на тварину) і додатково вводили суміш коклюшного токсину (0.3 мл на тварину). Протягом наступних 3 тижнів спостерігали появу у щурів симптомів ЕАЕ. Хворою вважалася тварина, що мала симптоми ЕАЕ не менше 3 днів.
ЕМ аналіз нервової тканини у нормі та при ЕАЕ. Для дослідження ультраструктури клітин мозочка та спинного мозку in vivo здорових та хворих на ЕАЕ щурів фіксували сумішшю 2% розчину формальдегіду та 2% розчину глутаральдегіду методом внутрішньо-серцевої перфузії, після чого згадані структури ЦНС розрізали на шматочки 0.5 мм, додатково фіксували у 1% OsO4, дегідратували по висхідній батареї спиртів, вміщували в епоксидні смоли і полімеризували при температурі 560С протягом 48 годин. Отримані за допомогою ультратома ультратонкі зрізи фарбували 2% розчином уранілацетату та розчином нітрату свинцю (за методом Рейнольдса) і вивчали за допомогою електронного мікроскопа (Jeol-100, Японія).
Обробка одержаних результатів. Дані оброблені статистично за допомогою методів варіаційної статистики (за методом Колмогорова-Смирнова) із застосуванням програми STATISTICA 5.0 (StatSoft, США). Вірогідною вважали різницю між показниками при р<0.05.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Світлооптичний аналіз клітин in vitro. Прикріплення клітин відбувалося протягом перших 6-10-ти годин. В цей час спостерігались округлі клітинні соми, які не мали відростків. Останні відновлювалися протягом наступних 2-ох діб. Частина дисоційованих клітин під час висаджування не відновлювалась і гинула. Внаслідок цього, протягом перших 2-ох діб у культурі спостерігалися макрофаги, що фагоцитували продукти розпаду таких клітин і поступово перетворювались у великі зернисті кулі. Останні легко видалялися промиванням у поживному середовищі. В перші дні культивування попереднє визначення клітинних типів було ускладнене. Пізніше зрілі нейрони можна було відрізнити від гліальних клітин за розмірами та формами їх сом, а також за різницею у променезаломленні. Ідентифікувалася більшість морфологічних типів нейронів мозочка: мультиполярні з короткими розгалуженими або довгими та прямими відростками, а також з одним товстим відростком, що розгалужувався на деякій відстані від соми. Протягом 1-2-го тижнів культивування клітинні відростки формували щільну переплетену сітку на поверхні субстрату. У клітинній масі зустрічалися невеликі агрегати, що залишалися під час дисоціації чи утворювалися внаслідок наступної агрегації клітин. Протягом культивування вони декілька зменшувались у розмірі і зв'язувалися між собою окремими відростками та їх пучками. Така картина спостерігалася до 28-ої доби in vitro без змін, за винятком збільшення клітинної маси за рахунок проліферації глії, росту клітинних відростків і формування нервових пучків. На 31-шу добу культура мала ознаки старіння (збільшення кількості мертвих клітин і зменшення клітинної маси).
Імуноцитохімічний та гістохімічний аналіз клітин in vitro. Для мієлінізації аксонів необхідна наявність диференційованих ОЛ. Первинна ідентифікація цих клітин була зроблена за допомогою світлового мікроскопа. Для вірогідного визначення присутності ОЛ у культурі було проведене мічення 26-денних клітин антитілами до ОБМ. Згідно до отриманих результатів, у культурі було виявлено зрілі інтактні ОЛ з численними тонкими розгалуженими відростками. Більшість ОЛ розташовувалась у “товщі” культивованої клітинної маси, хоча ОЛ також можна було побачити і на поверхні культури.
Виявлення клітин, що мієлінізують нервові відростки, дозволило припустити наявність мієлінових оболонок у аксонів in vitro. Проведене фарбування 26-денних клітин суданом чорним підтвердило це припущення. Згідно одержаних даних, у культурі були виявлені поодинокі та невелика кількість згрупованих мієлінізованих відростків. Ці структури розташовувались як на поверхні шару клітин, так і заглиблювались у клітинну масу.
ЕМ аналіз мієлінових оболонок in vitro. Для характеристики процесу мієлінізації на ультраструктурному рівні було проаналізовано три строки культивування клітин мозочка: 21, 26 і 31 день. Згідно отриманих результатів, мієлінові оболонки визначалися вже на 21-шу добу. Ламели, що їх складали, легко розпізнавалися та нараховували, у середньому, 5.72±0.21. Ламели формували цілісні концентричні структури та розташовувалися відносно вільно, некомпактно. Між ламелами, а також між ними та аксоплазмою спостерігався тонкий шар цитоплазми. Таким чином, мієлінові оболонки більшості аксонів ще не були компактними, що свідчило про їх фізіологічну незрілість. На 26-ту добу оболонки виглядали більш щільними, компактними та збільшувались у розмірі. У середньому, оболонки містили 8.27±0.24 ламел, схожих за ультраструктурою з такими in vivo. Аксолема примикала до внутрішньої поверхні оболонки. Аксоплазма містила нейрофіламенти та подекуди мікротрубочки, поодинокі цистерни ендоплазматичного ретикулуму (ЕР) та мембранні тільця. Отже, 26-денна культура містила зрілі компактні мієлінові оболонки. Аналіз культур, що розвивалися протягом 31-ої доби, виявив численні мієлінізовані аксони, оболонки яких мали вигляд щільно закручених структур і нараховували, у середньому, 10.7±0.25 ламел. Ці дані свідчать, що процес мієлінізації тривав протягом всього строку культивування, що призводило до появи “вторинних” і навіть “третинних” мієлінових оболонок, які огортали один чи декілька аксонів і були відокремлені одна від одної світлим простором. Крім того, цей строк характеризувався деградацією деяких аксонів, зменшенням кількості органел в аксоплазмі, а також появою невеликої кількості порожнин між мієліновими ламелами чи ламелами та аксолемою.
ЕМ аналіз клітин in vitro. На 26-ту добу культивування ОЛ мали електроннощільний вигляд. Округле ядро було розташовано ексцентрично. Хроматин розподілявся відносно гомогенно із характерними скупченнями по периферії ядра. У цитоплазмі були присутні гранулярний ЕР, рибосоми, апарат Гольджі, мітохондрії, гранули та щільні тільця. На 31-шу добу in vitro спостерігалася поява вакуолей. Астроцити мали ядро неправильної форми, каріоплазма якого була гомогенною чи містила невеликі ділянки конденсованого хроматину біля ядерної оболонки. В цитоплазмі виявлялися цистерни ЕР та апарату Гольджі, рибосоми, лізосоми, небагато мітохондрій та мікротрубочок, а також велика кількість філаментів. Нейрони мали великі овальні ядра, каріоплазма яких була гомогенною чи гетерогенною. Електроннопрозора цитоплазма містила рибосоми, цистерни ЕР та апарату Гольджі, мітохондрії, лізосоми, ліпофусцинові гранули, нейрофіламенти та микротрубочки.
Таким чином, порівняльний аналіз трьох строків культивування виявив, що максимальна кількість інтактних та повноцінних мієлінізованих відростків спостерігається на 26-ий день in vitro. Більш тривале культивування призводило до старіння клітин та оболонок, ознаки якого були аналогічні таким, виявленим у ЦНС здорових тварин протягом старіння (зміна форми цілих та компактних оболонок, іноді локальне ушкодження та поява порожнин чи вакуолей між ламелами).
ЕМ аналіз мієлінових оболонок in vivo. Аналіз особливостей будови мієлінових оболонок та клітин щурів віком 2 місяці виявив, що їх структура in vivo подібна до такої in vitro. Мієлінові оболонки мозочка та спинного мозку щурів мали цілісну компактну структуру, спірально закручувалися навколо відростків та примикали до аксолеми. Концентричні ламели легко відрізнялись одна від одної. У середньому, оболонки містили 14.09±0.16 ламел у мозочку і 14.21±0.16 ламел у спинному мозку.
ЕМ аналіз клітин in vivo. Аналіз структурних особливостей клітинних елементів мозочка та спинного мозку 2-місячних щурів (ОЛ, астроцитів та нейронів) виявив схожість їх структури до такої in vitro. Кожен з вказаних типів клітин мав характерні для цього типу будову та цитоплазматичні органели.
Таким чином, встановлена схожість процесів мієліногенезу нервової тканини in vitro та нативної тканини ЦНС дозволяє використовувати культуру клітин мозочка як модель для вивчення мієлінізації, а також демієлінізації, яка спостерігається при певних захворюваннях нервової системи in vivo.
ЕМ аналіз мієлінових оболонок in vitro під впливом сироваток крові хворих на РС. Для проведення порівняльного аналізу структурних змін нервової тканини під впливом демієлінізуючих факторів на 26-ту добу in vitro у поживне середовище додавали сироватку крові хворих на РС у стадії загострення (Сз) та ремісії (Ср) (10%) на 3, 6 та 24 години. У цілому, під дією сироваток у культурі спостерігалося часткове чи повне порушення компактності та цілісності мієлінових оболонок. Оболонки виглядали розмитими та втрачали концентричність. Більшість ламел ставали хвилеподібними та відокремлювались одна від одної, внаслідок чого у межах таких розщеплених оболонок з'являлися світлі порожнини. Навколо поперечного переріза відростків вигнуті ламели укладалися в паралельно розташовані цистерни. Створена таким чином цистерна мала вигляд “шапки” навколо аксону. Ширина цистерноподібних структур коливалася від 15 до 50 нм, проте в деяких місцях цистерни формували розширення різного розміру. Крім того, навколо поперечного переріза відростків спостерігалася поява везикулоподібних структур розміром від 15 до 100 нм. Вони формували скупчення у межах структурно зміненої оболонки, а також у просторі між аксолемою та першою внутрішньою ламелою. Цистерни та везикули могли зустрічатися як водночас в тих самих ділянках, так і окремо в різних місцях. Інтактні оболонки чи оболонки, які містили порожнини, не виявлялися. Внаслідок інвагінації аксолеми поперечні перерізи певної кількості відростків втрачали овальну форму. Ідентифікувалася більшість органел, присутніх в аксоплазмі, проте зустрічались аксони з гомогенною цитоплазмою.
Кількісний аналіз виявив, що через 3 години після додавання сироваток мієлінові оболонки 29% (дія Сз) та 8% (дія Ср) аксонів містили невеликі компактні ділянки (до 5 ламел). 100% мієлінових оболонок зазнавало повне чи часткове розщеплення. 68% (дія Сз) та 87% (дія Ср) оболонок мали хвилеподібні ламели. 64% (дія Сз) та 80% (дія Ср) оболонок виглядали розмитими. 27% (дія Сз) та 35% (дія Ср) оболонок містили везикулоподібні структури, а 20% (дія Сз) та 29% (дія Ср) – цистерноподібні утворення, які формували від 3 до 12 рядків. 38% (дія Сз) та 44% (дія Ср) аксонів втрачали овальний контур і мали змінену аксолему, окремі ділянки якої характеризувалися хвилястою формою.
Через 6 годин кількісні показники декілька змінилися. Тепер хвилясту форму мали ламели 62% (дія Сз) та 81% (дія Ср) оболонок, а розмитий вигляд був притаманний 60% (дія Сз) та 77% (дія Ср) оболонкам. 22% (дія Сз) та 6% (дія Ср) оболонок містили компактні ділянки (до 4 ламел). Аксолема 28% (дія Сз) та 32% (дія Ср) аксонів характеризувалася зміненою формою та гомогенною аксоплазмою. 11% (дія Сз) та 23% (дія Ср) оболонок містили невеликі скупчення везикул, а 14% (дія Сз) та 28% (дія Ср) – до 6 рядків цистерноподібних утворень.
Через 24 години 13% (дія Сз) та 2% (дія Ср) оболонок все ще містили невеликі компактні ділянки (кількість ламел в них не перевищувала 2-3). 59% (дія Сз) та 75% (дія Ср) оболонок мали хвилеподібні ламели, а 52% (дія Сз) та 70% (дія Ср) оболонок виглядали розмитими. Контур 25% (дія Сз) та 27% (дія Ср) аксонів втрачав овальну форму. Везикули зустрічались у вигляді коротеньких ланцюжків в межах 4% (дія Сз) та 8% (дія Ср) оболонок. 1% (дія Сз) та 3% (дія Ср) оболонок містили цистерни, які тепер формували 2-3 рядки.
Статистичний аналіз кількості збережених ламел виявив, що через 3 години виявлялося 3.07±0.10 та 3.97±0.15 ламел під впливом Сз та Ср, відповідно; через 6 годин – 2.71±0.09 та 3.49±0.15 ламел; через 24 години – 2.23±0.11 та 2.81±0.13 ламел. Тобто, розмір поперечного переріза оболонок зменшувався приблизно на 60% (через 3 години), 64% (через 6 годин) та 70% (через 24 години) (рис. 1).
Таким чином, в перші декілька годин після додавання Сз та Ср до культури мієлінові оболонки втрачали цілісність та компактну організацію внаслідок руйнування контакту між ламелами. Ламели набували хвилястої форми, що, можливо, було причиною утворення везикул та цистерн. З часом описані зміни зберігалися, зменшуючись у кількості. Дія обох сироваток характеризувалася подібними типами морфологічних змін, але у кількісному відношенні Сз справляла більш інтенсивний вплив і викликала більш виражену демієлінізацію, порівняно із Ср.
Рис. 1. Порівняльний статистичний аналіз кількості ламел у мієлінових оболонках аксонів під впливом сироваток крові хворих на РС у стадії загострення та ремісії у культурі клітин мозочка щурів (n=200, р<0.001).
ЕМ аналіз клітин in vitro під впливом сироваток крові хворих на РС. Вплив сироваток на нейрони та макроглію був різним. Соми та немієлінізовані відростки нервових клітин, у цілому, не мали структурних змін і не відрізнялися від інтактних нейронів, за винятком набрякання мітохондрій. Реакція ОЛ у відповідь на дію сироваток, навпаки, характеризувалася появою структурних змін. У цитоплазмі ОЛ виявлялася збільшена кількість лізосом та поява вакуолей різного розміру, які містили залишки зруйнованих внутрішньоклітинних структур. Також у цитоплазмі ОЛ були присутні темні мієліноподібні утворення, різного розміру порожнини та численні полісоми. Каріоплазма деяких ОЛ виглядала більш прозорою, ніж у інтактних клітин. Розмір та кількість “островків” конденсованого хроматину зменшувалися. Цитоплазматичні органели набрякали. Кількість таких ОЛ збільшувалася протягом доби присутності сироваток у культурі. Структура астроцитів виглядала непошкодженою. Проте у цитоплазмі цих клітин спостерігалася поява численних крупних лізосом та вакуолей, які містили клітинний матеріал, в тому числі, й залишки мієлінізованих аксонів та зруйнованого мієліну.
Таким чином, дія сироваток крові хворих на РС викликала демієлінізацію нервових відростків та зміни у структурі ОЛ, а також прояв фагоцитарних властивостей у астроцитів.
ЕМ аналіз мієлінових оболонок при ЕАЕ. Аналіз тканини мозочка та спинного мозку тварин, хворих на ЕАЕ, виявив, що більшість мієлінових оболонок зберігали концентричну організацію, але частково чи повністю втрачали цілісність та компактність. Ламели були локально розщеплені, між ними спостерігалися світлі порожнини різного розміру. Оболонки могли містити як 1-2, так і багато таких порожнин. Ділянки розщеплених ламел чергувалися з компактними зонами, але зустрічалися й повністю розщеплені оболонки. Як відокремлені поодинокі ламели, так і групи компактних ламел могли набувати хвилястої форми. В межах оболонок та між оболонкою та аксолемою спостерігалася поява везикул діаметром від 20 до 100 нм. Структура аксоплазми, у цілому, не змінювалася. Характерні для неї органели (мікротрубочки, нейрофіламенти, мітохондрії) легко ідентифікувались. Однак кристи певної кількості мітохондрій могли втрачати паралельну організацію, перетворюватись із щілиноподібних в округлі або бути частково чи повністю відсутні. Контури осьових циліндрів залишалися безперервними. Їх форма не змінювалася, за винятком невеликих хвилеподібних ділянок аксолеми.
Статистичний аналіз кількості ламел в мієлінових оболонках виявив, що оболонки у мозочку містили, у середньому, 12.00±0.17 ламел, а оболонки у спинному мозку – 12.17±0.14 ламел.
ЕМ аналіз клітин при ЕАЕ. Аналіз будови ОЛ виявив, що структура більшості цих клітин мала певні зміни, проте зустрічалися й незмінені ОЛ. Цитоплазма ОЛ виглядала зернистою і містила мієліноподібні утворення, пусті вакуолі та пухирці. Цистерни апарату Гольджі та ЕР були розширені. Багато мітохондрій набрякали, деякі з них не містили крист. Каріоплазма ставала світлішою, а хроматин потроху “розчинявся” і був розташований нерівномірно. Спостерігалася поява численних наповнених лізосом. Цитоплазма астроцитів, крім характерних органел, містила залишки мієлінових оболонок, які також могли бути розташовані і у середині темних лізосом. Структура нейронів не мала значних змін, за винятком збільшення кількості лізосом та набрякання мітохондрій.
Таким чином, структурні зміни мієлінових оболонок і клітин, які спостерігалися під впливом сироваток крові хворих на РС та у ЦНС щурів, хворих на ЕАЕ, у цілому, мають подібний характер. Це дозволяє використовувати культуру клітин мозочку як модель для відтворення умов, за яких відбувається процес демієлінізації при таких захворюваннях як РС і ЕАЕ.
Світлооптичний аналіз клітин, культивованих у присутності H. erinaceus. Дисоційовані клітини прикріплювалися до субстрату протягом 4-6 годин і вкривали практично всю його поверхню. У клітинній масі часто спостерігалися компактні скупчення клітин, які протягом культивування сплощувалися за рахунок клітинної міграції або загибелі клітин. На початку культивування у культурі розрізнялися дрібні та крупні клітини, але більш детальне визначення було ускладнене. Пізніше можна було ідентифікувати крупні та середні нейрони, що мали декілька відростків. Напевне визначити дрібні нейрони, а також ОЛ та астроцити у клітинній масі вдавалося не завжди через їх невеликий розмір. Паралельно процесам диференціації та росту культивованих клітин, відбувалась і загибель певної кількості клітинних елементів. Їх поява активізувала макрофаги, що фагоцитували продукти клітинного розпаду. Протягом розвитку культури спостерігалось інтенсивне розростання нервових та гліальних відростків. Завдяки цьому до кінця 3-го тижня утворювалося нейрон-гліальне сплетіння, між відростками якого розташовувалися клітини. Подібна картина виявлялася протягом 4-х тижнів культивування. Протягом 5-го тижня розвитку у клітинній масі з'являлися невеликі проміжки та збільшувалася кількість загиблих клітин. Отже, культура демонструвала ознаки старіння.
Таким чином, екстракт H. erinaceus сприяв нормальному розвитку культивованих клітин і не виявляв щодо них токсичної дії.
ЕМ аналіз мієлінових оболонок, сформованих in vitro у присутності H. erinaceus. Для вивчення впливу екстракту H. erinaceus на процес мієлінізації та розвиток клітин у культурі було проаналізовано три строки культивування клітин мозочка: 21, 26 і 31 день. Згідно отриманих результатів, на 21-шу добу in vitro виявлялися мієлінізовані відростки, мієлінові оболонки яких мали спіральну структуру та примикали до аксоплазми. У середньому, оболонки нараховували 6.44±0.13 ламел (рис. 2).
У цілому, оболонки мали вигляд компактних структур, однак вони містили тонкий шар цитоплазми між ламелами, що розташовувалися досить вільно. У 26-денній культурі оболонки мали більш зрілий вигляд. Ламели щільно примикали одна до одної та формували концентричну компактну структуру. Проміжків між оболонкою та аксоплазмою не виявлялося. Кількість ламел збільшувалась, у середньому, до 10.03±0.15. Така ж картина спостерігалась і на 31-ий день in vitro. Винятком була поява невеликих локальних проміжків між оболонкою та аксоплазмою, внаслідок старіння культури. Кількість ламел суттєво не змінювалась (у середньому, 10.37±0.19). Додаткові оболонки не виявлялися. Це свідчить про те, що мієлінізація у присутності екстракту припиняється приблизно до 26-ої доби in vitro.
Рис. 2. Порівняльний статистичний аналіз кількості ламел в мієлінових оболонках аксонів клітин мозочка, культивованих у присутності і відсутності екстракту H. erinaceus (n=200, р<0.01)
ЕМ аналіз клітин, культивованих у присутності H. erinaceus. Аналіз культивованих клітин виявив, що їх загальний розвиток у присутності екстракту суттєво не відрізнявся від такого без додавання екстракту. Кожен з вивчених клітинних типів мав притаманну йому структуру та характерний набір органел на 21-шу, 26-ту та 31-шу добу in vitro. Останній строк додатково характеризувався появою вікових змін у деяких клітин. Їх цитоплазма мала зернистий вигляд і містила темні гранули та вакуолі різного розміру. Аксоплазма зрідка локально відходила від аксолеми.
Таким чином, екстракт H. erinaceus сприяв нормальному процесу мієлінізації і виявив регулювальну дію щодо швидкості та тривалості цього процесу.
ЕМ аналіз мієлінових оболонок, сформованих in vitro у присутності H. erinaceus, під впливом сироваток крові хворих на РС. Для вивчення процесу демієлінізації у культурі на 26-ий день in vitro у поживне середовище на 3 години додавали сироватку крові хворих на РС у стадії загострення (Сз) та ремісії (Ср) (10%). Згідно до результатів, під впливом сироваток 17% (дія Сз) та 8% (дія Ср) мієлінових оболонок виглядали незміненими. 79% (дія Сз) і 66% (дія Ср) оболонок зберігали компактну структуру, але втрачали цілісність через появу різного розміру щілин між ламелами. 31% (дія Сз) та 42% (дія Ср) оболонок зазнавали розщеплення, а 19% (дія Сз) та 28% (дія Ср) – виглядали розмитими. Хвилясту форму придбали ламели 16% (дія Сз) та 27% (дія Ср) оболонок. Появи везикул чи цистерн відмічено не було. 34% (дія Сз) та 40% (дія Ср) аксонів мали видозмінену аксолему.
Статистичний аналіз кількості збережених ламел виявив, що через 3 години виявлялося 7.62±0.11 та 8.13±0.15 ламел під впливом Сз та Ср, відповідно. Тобто, розмір поперечного переріза оболонок зменшувався приблизно на 30% (рис. 3).
Рис. 3. Порівняльний статистичний аналіз кількості ламел в мієлінових оболонках аксонів під впливом сироваток крові хворих на РС у стадії загострення та ремісії. Культура клітин мозочка щурів, що були культивовані у присутності і відсутності екстракту H. erinaceus (n=200, р<0.001).
ЕМ аналіз клітин, культивованих у присутності H. erinaceus, під впливом сироваток крові хворих на РС. Протягом дії сироваток структура нейронів практично не змінювалась і була схожа до такої інтактних клітин. Більшість ОЛ залишались електроннощільними, проте деякі з них мали більш прозору каріоплазму. У цитоплазмі, крім характерних для ОЛ органел, спостерігалася поява невеликих прозорих вакуолей. Структурні особливості астроцитів не зазнавали змін, за винятком збільшення кількості лізосом та появи пустих та наповнених вакуолей різної щільності. У цитоплазмі та лізосомах спостерігалися залишки мієлінових оболонок та аксонів, що зазнали демієлінізації. Це свідчить про те, що астроцити виявляли фагоцитарні властивості.
Таким чином, культивовані у присутності екстракту H. erinaceus клітини мозочка демонстрували помітну стійкість до дії сироваток хворих на РС. Це дозволяє припустити, що екстракт сприяє більш вираженій дії захисних механізмів нервової тканини.
ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
У представленій роботі було охарактеризовано етапи мієлінізації та експериментально викликаної демієлінізації аксонів, а також вивчено вплив екстракту гриба H. erinaceus на ці процеси у культурі клітин мозочку щурів.
Протягом нормального онтогенезу мієлінізація аксонів у мозочку щурів починається в перші постнатальні дні (Божкова и др., 1988). Тому використана для культивування тканина мозочку новонароджених щурів ще не містила мієлінізованих відростків. Таким чином, процес формування мієлінових оболонок проходив повністю в умовах культивування.
Згідно отриманих результатів, у процесі культивування певна кількість вже мієлінізованих аксонів групувалась у пучки, навколо яких формувалася загальна мієлінова оболонка. Тобто, у використаній культурі були присутні структури, схожі на нервові волокна in vivo. Цей факт можна пояснити, по-перше, агрегацією дисоційованих клітин на початку і протягом культивування, внаслідок чого сусідні відростки були здатні формувати пучки під час росту в одному напрямку. По-друге, відростки могли об'єднуватися пізніше при формуванні нейро-гліальної сітки.
Відомо (Notterpek et al., 1993), що в органотиповій культурі ОБМ виявляється на 17-18-ту добу in vitro, а зрілі мієлінізовані відростки у такій культурі спостерігаються на 26-28-му добу. Ці літературні дані співвідносяться з результатами, отриманими у представленій роботі. Згідно до них, у 19-денній культурі було виявлено відростки ОЛ, які тільки починали обгортати аксони-мішені, а на 30-31-шу добу культура переходила до стадії старіння і зазнавала вікових дегенеративних змін. Тому для виявлення цілісної картини процесу мієлінізації та визначення етапу формування зрілих мієлінових оболонок у використаній системі in vitro найбільш оптимальним був аналіз 21-, 26- та 31-денної культури.
Виявлені на 21-шу добу in vitro мієлінові оболонки мали концентричну цілісну структуру. Проте вони не могли вважатися компактними внаслідок того, що містили тонкий шар цитоплазми між ламелами. У 26-денній культурі спостерігалися компактні зрілі інтактні мієлінові оболонки, кількість ламел в яких була більша, порівняно із такою на 21-шу добу in vitro. Це дало підставу заключити, що саме цей строк культивування був найбільш придатним для отримання сформованих мієлінізованих відростків у культурі. Поява у 31-денній культурі “вторинних” та “третинних” компактних мієлінових оболонок пояснювалася продовженням мієлінізації, можливо, внаслідок відсутності у поживному середовищу факторів, які контролюють тривалість цього процесу. Виявлення на 31-шу добу in vitro окремих оболонок, що містили невеликі локальні проміжки, свідчило про те, що на початку 5-го тижня культивування клітини та мієлінізовані відростки демонстрували ознаки старіння. Ці результати співвідносяться з даними літератури (Feldman and Peters, 1998) про появу подібних проміжків в мієлінових оболонках у мозку старих тварин.
Порівняльний структурний аналіз мієлінових оболонок, сформованих у культурі та у мозку щурів, виявив схожість їх будови. Це дозволило припустити, що морфологічні та функціональні характеристики мієлінових оболонок і процесу мієлінізації in vitro, у цілому, відповідають таким у нервовій системі тварин.
Додавання сироваток крові хворих на РС до культури викликало розвиток структурних змін, відповідних процесу демієлінізації. Вже протягом перших 3-х годин дії сироваток для більшості аксонів були притаманні: втрата цілісності і компактності мієлінових оболонок та їх розшарування, набування ламелами хвилястої форми, а також утворення везикул та цистерн у межах видозмінених оболонок. Зміна структури оболонок, можливо, пов'язана, по-перше, з присутністю у сироватках антитіл, які здатні атакувати мієлінові білки та притягати до них клітини-фагоцити. По-друге, з дією запальних та протеолітичних молекул (цитокинів, металопротеїназ та ін.), які були присутні у сироватках, а також синтезувалися культивованими гліальними клітинами у відповідь на дію сироваток. Поява везикул і цистерн, можливо, була наслідком контактів видозмінених хвилеподібних ламел та аксолеми між собою. Зменшення кількості аксонів, що зазнавали всіх перелічених змін, протягом доби дії сироваток свідчило про активний фагоцитоз та ліквідування змінених структур.
Звертає на себе увагу виявлення оболонок навколо невеликої кількості аксонів через 24 години дії сироваток. Ці оболонки містили 2-3 некомпактні ламели, проте характеризувалися спіральною та цілісною формою. За даними літератури (Ройтбак, 1993), астроцити спроможні у
