УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК
Українська Академія Аграрних Наук
Інститут Експериментальної і клінічної ветеринарної медицини
КУЧЕРЯВЕНКО РОМАН ОЛЕКСІЙОВИЧ
УДК 619:616.98:578.825.15
ІНФЕКЦІЙНИЙ РИНОТРАХЕЇТ ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ (ЕПІЗООТОЛОГІЯ, ДІАГНОСТИКА ТА СПЕЦИФІЧНА ПРОФІЛАКТИКА)
16.00.03- ветеринарна мікробіологія та вірусологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата ветеринарних наук
Харків – 2003
Дисертацією є рукопис.
Роботу виконано в Інституті експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН.
Науковий керівник: доктор ветеринарних наук, професор, академік УААН
Бусол Володимир Олександрович,
Національний аграрний університет Кабінету міністрів
України, завідувач кафедри організації, економіки,
менеджменту і маркетингу у ветеринарній медицині
Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор
Білокінь Віктор Степанович,
Інститут експериментальної і клінічної
ветеринарної медицини УААН, головний науковий
співробітник лабораторії біотехнології;
доктор ветеринарних наук, член-кореспондент УААН
Мандигра Микола Станіславович
Інститут епізоотології УААН, директор
Провідна установа: Харківська державна зооветеринарна академія,
кафедра епізоотології, Міністерства аграрної політики
України, м. Харків.
Захист відбудеться “ 16 ” вересня 2003 р. о годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.359.01 в Інституті експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.
Автореферат розісланий “ 14 ” серпня 2003р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
доктор ветеринарних наук А.Ф. Бабкін
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Інфекційний ринотрахеїт великої рогатої худоби (ІРТ) є проблемою світового масштабу, яка обумовлена широким розповсюдженням збудника інфекції та значними економічними збитками, які завдає це захворювання галузі тваринництва (Андрєєв Е.В і співавт., 1990; Сюрін В.Н. і співавт., 1998; Straub O.C., 2001)
Вивченню етіології та епізоотології інфекції було приділено велику увагу як в США, де в 50-х роках вперше її виявлено (Wiseman A. at al. 1980), так і в країнах Європи (Akermann M. at al., 1986; Tekes L. at al., 1999), Азії (Kargar M.R., 1999; Sugiura T., 1983) й Африки (Nafie E.K. at al., 1991).
В Україні розв'язанням проблеми ІРТ займається невелика когорта науковців. Вони концентрували свої зусилля переважно на вивченні епізоотології, клінічного перебігу інфекції (Андрєєв Є.В., Білокінь В.С., Кучерявенко О.О., 1975; Атамась В.А. 1986; Бусол В.О. і співавт. 1997; Голуб Ю.С. і співавт. 2003), розробці методів діагностики (Дудник О.Д., 1987; Чечоткiна Н.П. і співавт. 1999) та специфічної і неспецифічної профілактики (Бакуменко М.Д. 1991; Кучерявенко Л.I., Стеценко В.I. 2000; Фукс П.П., Бочаров О.А., 1999; Волосянко Е.В. 2001).
Важливою патогенетичною характеристикою інфекції є особливість клінічного прояву: вірус може вражати слизові оболонки респіраторного тракту, очей, ротової порожнини, шлунково-кишкового тракту (Штрауб О.Х., 1984), центральну нервову систему (Collins J.K. at al., 1993; Сascio K.E at al., 1999), шкіру (Woods J.A. at al., 1996; Guy J.S. at al., 1984), репродуктивні органи тварин попри їхній вік та стать (Чечоткина Н.П., 1990). Це зумовлено пантропністю та генетичною різновидністю збудника ІРТ (Collins J.K. at al., 1993; Belak S., Ros C. 1999). Залежно від особливостей взаємовідносин між мікро- та макроорганізмом інфекція перебігає або персистентно, або з вираженими клінічними ознаками (Атамась та співавт., 1986; Сюрін В.Н. та співавт., 1998).
Незважаючи на певні досягнення у вивченні ІРТ та здійсненні протиепізоотичних заходів, залишається багато невирішених проблем щодо з'ясування закономірностей епізоотичного й інфекційного процесів, розробці ранньої, високоспецифічної та економічно виваженої діагностики, а також специфічної профілактики інфекції (Noordegraaf A. V. at al., 2000).
Епізоотична ситуація з ІРТ великої рогатої худоби в Україні залишається напруженою, а система профілактичних та оздоровчих заходів недосконала через відсутність чітко визначеної системи діагностичних та специфічних методів лікування й профілактики інфекції з використанням вітчизняних препаратів.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до плану НДР ІЕКВМ УААН за завданнями: 05.01 (1996-2000 рр.) "Розробити технологію виробництва і системи застосування інактивованої вакцини проти інфекційного ринотрахеїту і парагрипу-3 великої рогатої худоби (номер державної реєстрації 0197 V000758) і 05 (2001-2005 рр.) „Розробити та впровадити комплексну систему діагностики, терапії та профілактики інфекційних та незаразних хвороб жуйних тварин (номер державної реєстрації 0101U001610).
Мета і завдання досліджень. Мета роботи - вивчити епізоотологічні особливості та клінічний прояв інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби, вплив імунізації тварин на перебіг епізоотичного й інфекційного процесів інфекційного ринотрахеїту, розробити технологію виготовлення компонентів набору для діагностики цієї хвороби в реакції імунофлуоресценції (РІФ). Основні завдання досліджень:
- здійснити порівняльну оцінку епізоотологічного моніторингу з інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби у світі та Україні за 1996-2001 роки;
- вивчити епізоотологічні особливості та клінічний прояв ІРТ у різновікових групах великої рогатої худоби ;
- розробити методичні підходи щодо конструювання набору компонентів (специфічного ФІТЦ-імуноглобуліну до вірусу ІРТ, специфічної та негативної сироватки) для індикації збудника в РІФ, а також виготовлення і контролю діагностикуму для забезпечення потреб лабораторій ветеринарної медицини України;
- вивчити вплив імунізації вакциною ”Рипавак” на перебіг епізоотичного й інфекційного процесів ІРТ ВРХ;
- оцінити імуно-гормональну залежність у тварин при формуванні поствакцинального імунітету;
- розробити настанову із застосування набору для діагностики ІРТ, надати пропозиції щодо використання інактивованої вакцини проти ІРТ та парагрипу-3 та удосконалення системи протиепізоотичних заходів при герпесвірусній-1 інфекції.
Об?єкт дослідження: здорова та хвора на інфекційний ринотрахеїт велика рогата худоба, вірус ІРТ, клітинні культури.
Предмет дослідження: епізоотичний процес, методи і засоби діагностики та специфічної профілактики інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби.
Методи дослідження: епізоотологічний, клінічний, вірусологічний, серологічний та статистичний.
Наукова новизна отриманих результатів. Вперше здійснено порівняльний епізоотологічний моніторинг ІРТ великої рогатої худоби в країнах різних континентів, в тому числі й в Україні.
Вперше розроблено технологію виготовлення компонентів набору для діагностики ІРТ в реакції імунофлуоресценції та налагоджено їх промислове виробництво.
Вперше в Україні встановлено етіологічну роль герпесвірусу-1 у спричиненні нервової форми ІРТ: виділено збудника з головного мозку, проведено його ідентифікацію, визначено ступінь ураження різних ділянок головного мозку.
Визначено за допомогою реакції імунофлуоресценції локалізацію антигену вірусу ІРТ в різних органах і тканинах хворої великої рогатої худоби.
Вивчено вплив вакцини "Рипавак" на зміни імуно-гормональних показників у лабораторних тварин. Новизна підтверджена рішенням про видачу деклараційного патенту на винахід "Спосіб визначення резервів імуногенезу" за № 2002 1210247 Україна, G 01N 33/48.
Практичне значення отриманих результатів. Розроблена нормативна документація (технічні умови, інструкція з виготовлення і контролю, настанова з використання) на ”Набір для діагностики інфекційного ринотрахеїту-пустульозного вульвовагініту (баланопоститу) в реакції імунофлуоресценції” (ТУ У 46.15.547-2000), яка затверджена Державним департаментом ветеринарної медицини України.
Результати досліджень використані при розробці настанови по використанню ”Вакцини інактивованої проти інфекційного ринотрахеїту та парагриппу-3 великої рогатої худоби” (ТУ У 46.15. 387-99).
Матеріали досліджень щодо діагностики та профілактики ІРТ ВРХ увійшли, як складові, до “Інструкції про заходи профілактики та боротьби з інфекційним ринотрахеїтом - пустульозним вульвовагінітом (баланопоститом) великої рогатої худоби” (наказ ДДВМ № 47 від 10.10.2000).
Запропонований метод очищення вірусу ІРТ дозволяє отримати високоочищений і концентрований імуноген для виготовлення діагностичних і вакцинних препаратів.
Особистий внесок здобувача. Експериментальні дослідження, аналіз отриманих даних та їх узагальнення виконано дисертантом особисто. Відпрацювання технології очищення та концентрації біомаси вірусу ІРТ методом ультрацентрифугування здійснено в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАНУ. Гістологічні дослідження головного мозку загиблих тварин проведені академіком УААН Г.А. Красніковим.
Апробація результатів дисертації. Основні розділи дисертації апробовані на:
- засіданнях вченої ради і методичної комісії ІЕКВМ УААН в 1997-2002 рр.;
- міжнародній науково-практичній конференції молодих учених ”Стан та перспективи розвитку ветеринарної науки” (м. Харків, 1999 р.)
- першій міжвузівській науковій конференції молодих вчених та аспірантів ”Інфекційна патологія молодняку сільськогосподарських тварин і птиці” (м. Суми, 1999р.);
- міжнародній конференції ”Ветеринарная наука на пороге XXI века” (м. Харків, 2000 р.);
- 1st ESVV Veterinary Herpesvirus Symposium (Швейцарія, 2001 р.);
- міжнародній науково-практичній конференціїї "Актуальні проблеми ветеринарної медицини в умовах сучасного ведення тваринництва" (м. Феодосія, 2003 р.).
- на двох науково-практичних семінарах лікарів ветмедицини вірусологічних відділів обласних державних лабораторій ветеринарної медицини.
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано дванадцять наукових праць, з них десять - у фахових виданнях, одна – в матеріалах конференцій, одна – в зарубіжному виданні.
Структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 167 сторінках комп’ютерного тексту і складається з таких розділів: вступ, огляд літератури, матеріали та методи досліджень, результати власних досліджень, аналіз та узагальнення одержаних результатів, висновки, список використаної літератури, додатки. Робота ілюстрована 28 таблицями, 17 рисунками. Список використаної літератури включає 283 найменувань, в тому числі 162 іноземних.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Дисертаційну роботу виконували у період з 1996 по 2002 рік на базі лабораторії вірусології ІЕКВМ УААН та 20 тваринницьких господарствах України. Для проведення епізоотологічного моніторингу та вивчення епізоотологічних особливостей ІРТ використовували результати власних досліджень, статистичні дані МЕБ, Державного департаменту ветеринарної медицини України, Центральної державної лабораторії ветмедицини, лабораторії вірусології ІЕКВМ. Серологічні та імунологічні дослідження проводили на 1224 головах ВРХ, лабораторних тваринах (30 кролях масою 3,5-4 кг, 16 півнях масою 1,5-2,0 кг, 4 козах масою 55-60 кг).
В лабораторних дослідах використовували: перещеплювані культури клітин нирки вівці (НВ), нирки теляти (НТ), трахеї теляти (ТрТ); штам вірусу інфекційного ринотрахеїту "Молдавський"; гіперімунні сироватки до вірусу ІРТ, а також польові сироватки крові від ВРХ з досліджуваних господарств.
Специфічні антитіла до вірусу ІРТ в сироватці крові досліджуваних тварин визначали в реакції нейтралізації (РН) за загальноприйнятим методом (Сюрин В.Н., 1986) та в реакції непрямої гемаглютинації (РНГА, Красочко П.А., 1996). Виділення вірусу інфекційного ринотрахеїту та визначення локалізації специфічного антигену в пробах патологічного матеріалу в РІФ проводили за методичними рекомендаціями (Андрєєв Е.В. і співавт. 1990).
Для отримання вірусу ІРТ використовували ролерне культивування, а концентрування здійснювали шляхом одержання внутрішньоклітинного антигену (Кучерявенко Ол-р.О., 1978), на апаратах для ультрафільтрації (АР-02) (Цимбал В.І. і співавт., 1988), 50%-го розчину ПЕГ-6000 (Гридин А.С., Титов И.Н., 1971), а також методом високошвидкісного центрифугування в градієнті щільності сахарози (Гридин А.С., Титов И.Н., 1971).
Імуноглобуліни сироватки крові виділяли за чотирма методами: риванольно-сульфатним (Gordon M. A. at al., 1962), сульфатно-іонообмінним (Фримель Г., 1987), хлороформно-сульфатним (Cebra J.J., Goldstein G., 1965) та осадженням ПЕГ-6000 (Гольдин Р.Б. і співавт., 1977). Кон'югацію отриманих імуноглобулінів з флуоресцеїна ізотіацианатом (ФІТЦ) проводили за методикою Ю.Ф. Кубица (1967).
Ефективність вакцини "Рипавак" в господарствах з різними формами перебігу ІРТ у великої рогатої худоби оцінювали на телятах та коровах. Препарат вводили внутрішньом'язово, двічі, з інтервалом у 14 діб, в дозі 5 см3 та 10 см3, відповідно.
Активність гормонів системи гіпофіз-щитовидна залоза та глюкокортикоїдну функцію гіпоталамо-гіпофізарно-адренокортикальної системи (ГГАКС) в динаміці процесу формування поствакцинального імунітету визначали методом радіоімунологічного аналізу реактивів виробництва "ІБОХ" АН Білорусі.
Обчислення та статистичну обробку результатів досліджень проводили за допомогою персонального комп'ютера в електронних таблицях Microsoft Excel XP professional, які входять до програмного пакету MS Office XP Professional.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Епізоотологічний моніторинг інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби
Епізоотологічний моніторинг, проведений в 122 країнах 5 континентів світу, свідчить, що інфекційний ринотрахеїт великої рогатої худоби має значне і нерівномірне поширення (рис. 1).
Рис. 1. Поширення ІРТ у країнах світу (1996-2001 рр.)
- вільні від інфекції - неблагополучні - епізоотична ситуація невідома
Із 41 аналізованої країни Європи в 1996-2001 рр. були неблагополучними 33 країни (80,48%), на Американському континенті - відповідно 25 і 20 (80,0%), на Азіатському - 24 і 16 (66,6%), Африканському - 21 і 12 (57,1%), в Австралії і Океанії 11 і 9 (81,0%). Після тривалого неблагополуччя тваринництва з ІРТ наприкінці минулого та на початку XXI століття Швейцарія, Швеція, Данія, Австрія та Фінляндія, завдяки ретельному виконанню спеціальних державних програм, стали вільними від вказаної інфекції. А в Італії були оголошені вільними від інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби лише окремі регіони.
Україна є стаціонарно неблагополучною країною щодо ІРТ. Епізоотологічні дослідження показали, що інфекція має набагато більше поширення, ніж подає офіційна ветеринарна статистика. Про це свідчать дані вимушеної вакцинації великої рогатої худоби проти ІРТ в господарствах, неблагополучних щодо інфекції. Зокрема, з 1999 по 2001 рік було вакциновано 3576630 тварин. Проведені нами скринінгові дослідження у 44 господарствах 12 областей України показали, що в кожному із обстежених господарств встановлено циркуляцію збудника інфекції з періодичним клінічним проявом захворювання. Виявлено сероконверсію до вірусу ІРТ у межах від 20,0 до 100% тварин. При вірусологічних дослідженнях матеріалу, відібраного від хворих тварин з ознаками ІРТ, виявляли збудника інфекції: в Харківської області в 57,29%, Полтавській - 76,92%, Одеській - 55,73%, Миколаївській - 56,25%, Кіровоградській - 37,50%, Донецькій - 50,0%, Дніпропетровській - 40,0%, Луганській - 34,14%, Хмельницькій - 54,28%, Черкаській - 28,57%, Херсонській - 29,3% проб. При дослідженні в РІФ 1235 проб сперми бугаїв-плідників з 24 племоб'єднань 7 областей України встановлено наявність антигену вірусу ІРТ (Харківській - 9,1%, Полтавській - 7,1% , Сумській - 5,1, Хмельницькій - 2,5%). 165 проб сперми, які надійшли із 4 підприємств Дніпропетровської, Луганської та Одеської областей, були вільними від вірусу ІРТ.
Отримані дані свідчать, що вірус ІРТ має значне і нерівномірне поширення в Україні, а епізоотична ситуація є більш напруженою, ніж це визначено офіційною статистикою.
Епізоотологічні особливості інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби
Дослідження, які проведені в 44 господарствах на поголів'ї 1224 тварин, показали, що вірус ІРТ викликає інфекційний процес у великої рогатої худоби різних вікових груп. Ураження герпесвірусом-1 виявлено у 91,4% корів, 84,9% нетелів, 84,8% молодняку 6-12-місячного віку, телят 3-6-місячного віку - 60,4%, 1,5-3-місячного віку - 51,4%. Серед бугаїв-плідників окремих неблагополучних господарств показник серопозитивності сягав 96,0%. Отримані дані свідчать, що інфекція розвивається в організмі тварин незалежно від їхнього віку, але з менш інтенсивним ураженням телят 5 - 6-місячного віку, що зумовлено періодом перебування тварин в неблагополучному стаді. Бугаї-плідники в товарних господарствах становлять найбільшу загрозу в поширенні інфекції за природного осіменіння. Вивчення частоти ураження статевих органів (слизової оболонки піхви) у різновікових групах показує, що частота виявлення пустульозного вульвовагініту у телят 10-30-денного віку становить 20,5%, 2-3-місячного віку - 30%, серед корів і нетелей - 65,4%.
Якщо серопозитивність і клінічний прояв інфекційного вульвовагініту, спричиненого герпесвірусом-1, переважали у тварин старших вікових груп, то ІРТ в респіраторній, кон'юнктивальній і менінгоенцефалітній формі проявлявся у молодих тварин після профілакторного періоду (переважно до 6-місячного віку). Крім цього, нервова форма інфекції в неблагополучних стадах може проявлятися у телят до 10-денного віку, що, на нашу думку, зумовлено внутрішньоутробним зараженням.
Найбільш гостро перебігає інфекційний процес у тварин, завезених в неблагополучні господарства. Дані епізоотологічних досліджень узгоджуються з літературними даними в тому, що джерелом збудника інфекції є заражені тварини з клінічним і прихованим перебігом інфекції, а механізм передачі – аерогенний і через сперму та шляхом безпосереднього контакту.
Спалахи клінічного прояву інфекційного ринотрахеїту діагностували протягом всього року, що зумовлено дією певних стрес-факторів: в одних господарствах пік частоти захворювання припадав на травень-червень (перехід на літньо-табірне утримання та різке підвищення температури навколишнього середовища); в других - в осінній період, при переведенні на зимове утримання, в третіх – в зимово-стійловий період. В усі періоди року серед хворих тварин реєстрували летальні випадки, здебільшого у телят 1-3-місячного віку. Частота спалахів епізоотичного процесу залежала не лише від сезону року, а й від форми клінічного прояву. Приміром, кон'юнктивальну форму клінічного прояву інфекції діагностували в усі пори року.
Клінічний прояв інфекційного ринотрахеїту ВРХ
Інфекційний ринотрахеїт залежно від локалізації патологічного процесу клінічно проявляється в різних формах: респіраторній, кон'юнктивальній (переважно у телят) та генітальній – у корів та бугаїв, нервовій – у телят і молодняку. Кожну з цих клінічних форм в досліджуваних господарствах виявляли окремо або у двох, трьох і навіть чотирьох формах одночасно (табл. 1).
Із 20 обстежених господарств одночасний прояв респіраторної, кон'юнктивальної та генітальної форм спостерігали в 30,0% стад, респіраторної і кон'юнктивальної - у 20%, респіраторної, нервової і генітальної – у 15%, респіраторної, кон'юнктивальної, генітальної та нервової – у 5%, респіраторної та нервової – у 5%, а моноінфекції респіраторної форми – у 20%, нервової – у 5,0%.
Таблиця 1
Клінічний прояв ІРТ великої рогатої худоби в різних регіонах України
Клінічний прояв ІРТ | Області, господарства
Харківська
(n=11) | Полтавська
(n=5) | Донецька, Київська, Чернігівська
(n=4)
Моноінфекція | Респіраторна - 2
Нервова - 1 | Респіратор-
на - 1 | Респіратор-
на-1
Респіраторна+кон'юнктивальна | 3 | 1 | -
Респіраторна+нервова | 1 | - | -
Респіраторна+геніальна+ нервова | 2 | - | 1
Респіраторна+кон'юнктивальна
+генітальна | 2 | 1 | 1
Респіраторна+кон'юнктивальна
+нервова+генітальна | 1 | - | -
Для вивчення причин різноманітності прояву клінічних ознак інфекції визначали локалізацію антигену вірусу ІРТ в органах і тканинах великої рогатої худоби (рис. 2).
Найчастіше вірусний антиген виявляли в системі органів дихання. Друге, третє і четверте місце за цим показником посідають відповідно нирки, слизова оболонка піхви, печінка. За локалізацією вірусу тканини серця, селезінки та лімфовузлів займають останнє місце. У стадах, де були відсутні ознаки ураження центральної нервової системи, вірус ІРТ в мозку тварин не виявляли. Це свідчить про те, що при виникненні епізоотії ІРТ у 18 господарствах із 20 досліджених виявили ознаки ураження герпесвірусом-1 органів дихання, а в одному інфекція проявлялась лише в менінгоенцефалітній формі.
Підтвердженням етіологічної ролі герпесвірусу-1 у виникненні менінгоенцефаліт-ної форми прояву ІРТ є дані клінічних, патологоанатомічних, гістологічних та вірусологічних досліджень. В зв'язку з незначним терміном (3-4 години рідко до 20 годин) клінічного прояву інфекції характерних ознак ураження органів дихання не відмічали. У хворих телят відзначали, крім підвищення температури на 1-20С, ознаки болю в животі, скрегіт зубами, рух по колу, раптове виникнення судом, закидання голови назад, тремтіння, падіння на землю, змикання щелеп. При патологоанатомічному розтині загиблих тварин встановлювали: гнійний риніт, ларинготрахеїт, ураження слизових оболонок носових раковин та придаткових порожнин, серозно-гнійну бронхопневмонію. Селезінка була збільшена, з крововиливами. Портальні лімфовузли також збільшені, судини кори головного мозку кровонаповнені. При гістологічних дослідженнях виявляли розпушення мозкової речовини продовгуватого мозку та мозочку, інтенсивну гіперемію кровоносних судин, велику кількість клітин глії. Вірусологічними дослідженнями різних ділянок головного мозку (кори, мозочка, продовгуватого мозку, варолієвого моста) виявлено наявність вірусу лише в корі головного мозку. Дані вірусологічних досліджень показали, що вірус ІРТ є пантропним в організмі тварин, а неоднорідність частоти його виявлення у різних органах і тканинах хворих тварин є підставою стверджувати, що різноманітність клінічного прояву інфекції обумовлює переважно локалізація збудника.
Методичні підходи до конструювання компонентів набору для діагностики ІРТ в РІФ та технології його виробництва
Однією з причин відсутності достовірної інформації щодо поширення ІРТ в Україні залишається недосконалість методів диференційної діагностики хвороб системи дихання, органів відтворення, менінгоенцефалітів тощо. Реакція імунофлуоресценціїї (РІФ) є однією з найбільш інформативних та експресних, яку в Україні не використовували для діагностики ІРТ в зв'язку з відсутністю на озброєнні лабораторій ветеринарної медицини вітчизняного набору для постановки цієї реакції.
Із трьох біологічних компонентів набору найбільш вагомим в результативності РІФ є специфічний флуоресціюючий імуноглобулін (ФІТЦ-кон'югат). Вивчення ефективності виробництва ФІТЦ-кон'югатів за допомогою існуючих технологій (Ю.Ф. Кубица, 1967; Г. Фримель, 1987) показує, що в технологічному ланцюгу є ланки, які не забезпечують отримання високоочищеного концентрованого вірусу та специфічних ?-глобулінів з високим ступенем афінності та авідності на стадії концентрації та очищення вірусної біомаси і отримання ?-глобулінової фракції (рис. 3).
При розробці технології отримання ФІТЦ-кон'югатів культивування вірусу ІРТ здійснювали в культуральних флаконах з використанням ролерного апарату. Збір вірусної біомаси проводили на стадії внутрішньоклітинної локалізації (1 метод) та повного циклу репродукції вірусу (2 метод). За першим методом вірус концентрували шляхом збільшення концентрації клітин в одиниці об'єму та їх лізису, другим – за допомогою розподільної колонки АР-02 та ПЕГ-6000. Всі отримані зразки піддавали додатковому концентруванню та очищенню за допомогою градієнтного ультрацентрифугування.
Рис. 3. Схема технологічного процесу отримання ФІТЦ-конюгатів
В дослідах з вірусом ІРТ штаму „Молдавський” показано, що метод внутрішньоклітинного накопичення та ультрацентрифугування в градієнті щільності сахарози (15-53%) дозволяє отримати високо очищений і концентрований антиген для імунізації тварин, а також підтвердити таксономічне положення цього штаму, визначивши його плавучу щільність. Встановлено, що плавуча щільність дослідженого вірусу ІРТ становить 1,212 г/см3 , що характерно для сімейства герпесвірусів (рис. 4).
Рис. 4. Ультрацентрифугування вірусу ІРТ штаму "Молдавський" в градієнті щільності сахарози
Дослідження показали, що найбільшу концентрацію вірусного білку (0,60,03 мг/см3) без зниження інфекційної активності вірусу (8,5 lg ТЦД 50/см3) отримано з культури клітин вирощених за першою методикою. Таку вірусну біомасу використовували для гіперімунізації тварин. Для одержання високоактивних сироваток крові досліджено ефективність п’яти ад’ювантів (табл. 2).
Експериментально встановлено, що оптимальним для імунізації дослідних тварин є антиген на основі комбінованого ад’юванта (гідроокису алюмінію, емульсії КЄ 10-01 та імуностимулятору К), який забезпечував отримання сироваток з найвищим титром антитіл в реакції нейтралізації (8,70,12 log2) та максимальною ад'ювантною ефективністю – 4,1.
Таблиця 2
Результати вивчення активності імунних сироваток з
використанням різних ад?ювантів, n= 4
Імуноген | Титри антитіл в сироватці
крові (РН), log2 | Ад’ювантна ефективність
(одиниці)
антиген без ад?юванту | 4,60,14 | -
з гідроокисом алюмінію | 5,80,16 | 1,2
з повним ад?ювантом Фрейда | 6,30,23 | 1,7
з емульсією КЕ 10-01 | 6,80,21 | 2,2
з гідроокисом алюмінію + емульсією КЕ 10-01 | 7,60,17 | 3
з комбінованим ад’ювантом (ГОА + емульсія КЕ-10-01+ імуностимулятор К) | 8,7±0,12 | 4,1
Для визначення найбільш ефективної технології отримання ?-глобулінової фракції гіперімунної сироватки використовували чотири методи (табл. 3 ).
Таблиця 3
Порівняльна оцінка методів виділення імуноглобулінів з сироватки крові
Матеріал | Метод виділення | Об’єм
(см3) | Кількість
білку
(мг/см3) | Активність
імуноглобулінів
в РН (log2) | Титр
кон'югата
(фарбуючий)
Сироватка | - | 120,0 | 54,01,7 | 8,7±0,1 | -
Імуногло- булін |
Сульфатно-іонообмінний* | 24,0 | 11,00,21 | 8,00,1 | 1:32
Риванольно-сульфатний | 22,0 | 9,20,2 | 7,60,2 | 1:16
Хлороформно-сульфатний | 21,0 | 8,10,15 | 6,80,17 | 1:8
Метод
осадження
ПЕГ-6000 | 20,0 | 7,60,3 | 6,20,22 | 1:8
* - в нашій модифікації
Встановлено, що сульфатно-іонообмінний метод одержання ФІТЦ-кон’югатів має перевагу перед іншими. Активність кон?югатів, виготовлених на основі цих імуноглобулінів, була вдвічі вище, ніж у флуоресціюючих антитіл, отриманих риванольно-сульфатним методом та в 4 рази – ніж хлороформно-сульфатним чи методом осадження ПЕГ-6000. Такий кон’югат мав мінімальну ступінь неспецифічної флуоресценції досліджуваних об'єктів, що зумовлено виділенням чистої фракції Ig G, яка знаходиться в першому піку білку (рис. 5). Білки другої фракції вміщували всі інші компоненти вихідного матеріалу.
Рис. 5. Іонообмінна хроматографія Ig G кроля
На підставі отриманих результатів щодо визначення методичних підходів по виготовленню високоактивних і специфічних реагентів було розроблено "Набір для діагностики інфекційного ринотрахеїту-пустульозного вульвовагініту в реакції імунофлуоресценції", який затверджено Державним департаментом ветеринарної медицини України (ТУ У 46.15. 547-2000). За даною технологією налагоджено його виробництво в ІЕКВМ. Діагностикум широко використовується в діагностичних лабораторіях України.
Вплив вакцинації тварин на перебіг епізоотичного процесу при інфекційному ринотрахеїті великої рогатої худоби
Вивчення впливу вакцини “Рипавак” на перебіг епізоотичного процесу при ІРТ проводили в 9 неблагополучних господарствах. В двох із них було поставлено експеримент на коровах, нетелях і телятах (табл. 4).
Таблиця 4
Профілактична ефективність вакцини “Рипавак”
Господарство | Вікова
група | Дослід | Контроль
Вакциновано
(гол) | Одержано телят
(гол) | Захв.телят
ГРХ
(гол) | Леталь ність
(%) | Не вакциновано (гол) | Одержано телят (гол.) | Захв. телят
ГРХ
(гол) | Леталь
ність
(%)
1 | корови | 277 | 247 | 10 | 20,0 | 256 | 201 | 104 | 35,5
нетелі | 232 | 224 | 12 | 33,3 | 60 | 60 | 46 | 39,1
телята | 153 | - | 8 | - | 35 | - | 22 | 27,2
всього | 662 | 624 | 30 | 20,0 | 351 | 296 | 112 | 35,4
2 | корови | 557 | 545 | 28 | 14,2 | 600 | 558 | 453 | 52,0
нетелі | 107 | 107 | 12 | 25,0 | 74 | 74 | 59 | 67,7
телята | 564 | - | 24 | 16,6 | 305 | - | 106 | 39,6
всього | 1228 | 1216 | 64 | 17,1 | 979 | 937 | 618 | 51,4
Дослідження впродовж року свідчать, що гострі респіраторні хвороби (ГРХ) в цих господарствах реєстрували серед телят до 6-місячного віку. Зокрема, серед телят від вакцинованих корів захворюваність складала 16,1% (господарство 1) і 18,8% (господарство 2), а від нетелів 9,3 і 29,9%, в той же час як серед телят від невакцинованого маточного поголів'я вона складала 51,7 і 79,7% та 76,6 і 79,7%, відповідно. Захворюваність телят, яких вакцинували в 1,5-2-х місячному віці, становила 4,4% в дослідній групі і 37,6% в контрольній. Збереженість поголів'я в дослідній групі (в двох господарствах) складала 97,8%.
Отримані дані показують, що в однакових умовах утримання і годівлі тварин і при аналогічній епізоотичній ситуації вакцина “Рипавак” змінює напруженість епізоотичної ситуації в сторону її покращення. Отже, використання вакцини “Рипавак” дозволяє ефективно управляти епізоотичним процесом, знижуючи до мінімуму захворюваність і економічні збитки.
В 3 господарствах, де інфекційний процес перебігав в менінгоенцефалітній формі в поєднанні з іншими клінічними проявами інфекції, застосування вакцини приводило до ліквідації зверхгострого прояву інфекції та більш доброякісного перебігу захворювання при інших клінічних формах. Імунізація сприяє підвищенню титру віруснейтралізуючих антитіл на 2,1-2,9 log2. Регулярне застосування вакцини в стадах з генітальною формою прояву ІРТ впливає на ефективність осіменіння корів, збільшує вихід телят (з 67,5 до 97,0%), зменшує частоту абортів і мертвонароджуваність (з 10,0 до 1%).
Введення вакцини створює напружений імунітет. Так, у тільних корів з початковим імунним фоном 8,5 log2 (в середньому по групі) через 42 дні після вакцинації титр антитіл в РНГА досягав 12 log2 у 10% тварин, 11 log2 - у 40 % , 10 log2 - у 40% та 9 log2 - у 10%, що позитивно вливало на утворення колострального імунітету у новонароджених телят.
Отримані дані дозволяють рекомендувати програму вакцинації великої рогатої худоби, згідно якої імунізуючий препарат вводять телицям за два місяці до запліднення, глибокотільним коровам за два місяці до отелення та телятам, починаючи з 1-1,5-місячного віку.
Імуногормональна залежність при формуванні поствакцинального імунітету
В дослідах на кролях вивчали взаємозв'язок специфічної імунної відповіді та функціонування системи гіпофіз-щитовидна залоза, а також гіпоталамо-гіпофізарно- адренокортикальної системи на дворазове введення вакцини “Рипавак”. Препарат вводили з інтервалом 14 діб. Визначення показників специфічного гуморального імунітету та таких гормонів, як тиреотропіну (ТТГ), тироксину (Т4), трийодтироніну (Т3) та кортизолу проводили через 2 години, 14 і 28 діб після першого введення. У тварин, щеплених вакциною “Рипавак”, уже через 2 години після введення імуногену (індуктивна фаза імуногенезу) система гіпофіз-щитовидна залоза та наднирники змінювали свою функціональну активність. На фоні збільшення концентрації в сироватці крові тиреотропіну, трийодтироніну зменшувалась концентрація тироксину та кортизолу. Через 14 діб титр антитіл в сироватці крові за даними реакції нейтралізації сягав 3,33±0,33 log2, збільшувалась концентрація тиреотропіну, тироксину та зменшувалась кількість трийодтироніну й кортизолу. Через 28 діб рівень антитіл порівняно з попереднім дослідженням підвищився з 3,33±0,33 до 5,50±0,29 log2, збільшилась також концентрація гормонів: тиреотропіну – з 0,094±0,003 до 0,097±0,004 мМЕ/л (Р<0,001), тироксину – з 44,15±1,06 до 57,19±8,10 нмоль/л (Р<0,05), кортизолу – з 183,75±2,88 до 307,99±9,31 нмоль/л (Р<0,01). В той же час показники трийодтироніну після повторного введення вакцини зменшилися з 2,91±0,03 до 2,67±0,06 нмоль/л (Р<0,05). Вказані зміни гормональних показників свідчать про взаємозв'язок гормональної системи з процесом формування специфічного імунітету. В цей період функція гіпофіза за показниками тиреотропіну залишається підвищеною. Наднирники реагували по іншому на повторне введення вакцини. Якщо через 14 діб після першого щеплення концентрація кортизолу в сироватці крові зменшилась в 1,4 рази, то за такий же наступний період його показник збільшився в 1,6 рази, тобто підвищився порівняно з контролем на 60,2 нмоль/л.
Таким чином, виявлений взаємозв'язок між показниками гормонального та імунного статусу вакцинованих тварин свідчить про активну участь гормональної системи в формуванні специфічного імунітету проти ІРТ та можливість використання гормональних показників у визначенні імуногенної активності вакцини проти ІРТ.
ВИСНОВКИ
1. Вивчено епізоотологічні особливості та перебіг інфекційного процесу при інфекційному ринотрахеїті великої рогатої худоби, розроблено та впроваджено в практику діагностичний набір для виявлення антигену вірусу ІРТ методом імунофлуоресценції, а також пакет нормативно-технічної документації по виробництву і використанню діагностикуму; вивчено ефективність вакцини "Рипавак" в управлінні епізоотичним та інфекційним процесом при ІРТ, визначено роль гормональної ланки в формуванні поствакцинального імунітету.
2. Інфекційний ринотрахеїт великої рогатої худоби є значно поширеною інфекцією в світі: із 122 аналізованих країн (1996-2001 рр) щорічно реєстрували хворобу в 68,8-73,7% адміністративних регіонів; найвища інфікованість виявлялась в країнах Австралії і Океанії та Американському континенті, найменша – в Азії і Африці. В Європі 5 із 41 країни оздоровлено від цієї інфекції.
3. Україна є стаціонарно неблагополучною щодо ІРТ. Епізоотологічними особливостями інфекції є стаціонарність, поширеність в різних природо-кліматичних зонах, висока сприйнятливість до герпесвірусу тварин різновікових та статевих груп, переважний прояв клінічного перебігу інфекції серед тварин віком до одного року в перехідні періоди – зима-весна і літо-осінь та при дії на організм інфікованих тварин різних стрес-факторів.
4. Перебіг інфекційного процесу при ІРТ характеризується зміною стадійності та поліморфізмом клінічних форм залежно від локалізації патологічного процесу: респіраторної, генітальної, кон'юнктивальної і нервової. В одних стадах інфекція перебігає в скритій формі, в других – проявляться різноманітністю клінічних форм, або з переважаючим проявом однієї з них, в третіх - чітко виражений моноклінічний прояв інфекції.
5. Встановлено етіологічну роль герпесвірусу-1 у виникненні нервової форми ІРТ ВРХ в господарствах України. Епізоотологічна особливість цієї форми хвороби полягає в тому, що вона виникає після тривалого періоду неблагополуччя (3-6 років) господарств щодо герпесвірусу-1, виявляється у телят переважно в перші дні життя і рідше в 1-6 - місячному віці, може проявлятися одночасно з іншими клінічними формами перебігу ІРТ (респіраторною, генітальною та кон'юнктивальною). Виникнення менінгоенцефалітів обумовлено реплікацією вірусу в корі головного мозку.
6. Вперше розроблено, налагоджено та впроваджено в лабораторну практику "Набір для діагностики інфекційного ринотрахеїту-пустульозного вульвовагініту (баланопоститу) в реакції імунофлуоресценції", який включає: специфічний флуоресціюючий імуноглобулін, специфічну та негативну сироватки. За допомогою набору досліджено 1063 проб патологічного матеріалу з 11 областей України; з яких в 45,2% проб виявлено антиген вірусу інфекційного ринотрахеїту. При дослідженні в РІФ 1235 проб сперми з 24 племпідприємств штучного запліднення антиген вірусу ІРТ виявлено в 5,9%, що свідчить про широке розповсюдження і стаціонарне неблагополуччя України щодо цього захворювання.
7. Методом високошвидкісного ультрацентрифугування в градієнті щільності сахарози та інструментальної графічної реєстрації піків білків за допомогою проточного спектрофотометра й потенціометра виділено очищену та концентровану фракцію вірусу ІРТ з метою отримання активних та специфічних сироваток. Визначено плавучу щільність вірусу ІРТ штаму „Молдавський” в сахарозному градієнті, яка становить 1,212 г/см3, що характерно для герпесвірусів.
8. За допомогою модифікованого сульфатно-іонообмінного методу виділення імуноглобулінів, в порівнянні з сульфатно-хлороформним, сульфатно-риванольним та методом очищення за допомогою ПЕГ одержано чисту фракцію імуноглобуліну класу G і ФІТЦ-кон’югат з більшою в 2-4 рази активністю.
9. Використання вакцини "Рипавак" в неблагополучних щодо інфекційного ринотрахеїту господарствах приводить до зменшення клінічного прояву ІРТ у всіх його формах, сприяє утворенню колострального імунітету та забезпечує збереженість телят від 91,5 до 97,8%.
10. Формування специфічного імунітету у тварин, імунізованих вакциною „Рипавак”, супроводжується змінами функції системи гіпофіз-щитовидна залоза та глюкокортикоїдної функції гіпаталамо-гіпофізарно-адренокортикальної системи, які виявляються уже через 2 години після введення імуногену.
ПРАКТИЧНІ ПРОПОЗИЦІЇ
1. Запропоновану технологію виробництва компонентів набору для діагностики ІРТ слід впровадити на біофабриках у біотехнологічне виробництво відповідно з розробленою і затвердженою Державним департаментом ветеринарної медицини України нормативною документацією: (технічні умови, інструкція по виготовленню і контролю, настанова по використанню).
2. Запровадити широкомасштабну систему протиепізоотичних заходів в Україні у відповідності до розробленої “Інструкції про заходи профілактики та боротьби з інфекційним ринотрахеїтом - пустульозним вульвовагінітом (баланопоститом) великої рогатої худоби” (наказ ДДВМ № 47 від 10.10.2000).
Список основних праць, опублікованих за темою дисертації
1. До сторiччя вiдкриття хвороботворних вiрусiв тварин. Сучасний стан класифiкацiї номенклатури вiрусiв хребетних /В.О.Бусол, Н.П. Чечоткiна, В.I.Стеценко, Р.О.Кучерявенко// Розвиток вет. науки в Українi: здобутки та проблеми: Зб. матерiалiв мiжнар. наук.-практ. конф., 24-26 верес. 1997 р., м.Харкiв/ IЕКВМ.- Х., 1997.- С.88-89.
2. Кучерявенко Р.А., Бусол В.А. Эпизоотологические особенности и клиническое проявление инфекционного ринотрахеита – пустулезного вульвовагинита крупного рогатого скота // Вет. медицина: Мiжвiд. тематич. наук. зб.- Х., 1998.- Вип.74.- С.55-60.
3. Кучерявенко Р.А., Бусол В.А. Менингоэнцефалит у телят, вызываемый вирусом инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота // Вет. медицина: Мiжвiд. темат. наук. зб.- Х., 1999.- Вип.76.- С.48-53.
4. Чечоткiна Н.П., Кучерявенко Р.О., Стеценко О.В. Результати комiсiйних випробувань наборiв дiагностикумiв для реакцiї iмунофлуоресценцiї при iнфекцiйному ринотрахеїтi та вiруснiй дiареї великої рогатої худоби// Вiсн. Сумського ДАУ: Наук.-метод. журн.- 1999.- Вип.4.- С.197-1999.
5. Кучерявенко Р.О., Бусол В.О., Семенченко О.Ю. Концентрування, очистка та визначення плавучої щiльностi вiрусу iнфекцiйного ринотрахеїту великої рогатої худоби за допомогою iнструментального методу// Вет. медицина: Мiжвiд. темат. наук. зб.- Х., 2000.- Т.1, Вип.78.- С.197-202.
6. Стеценко В.І., Кучерявенко Л.І., Кучерявенко Р.О. Пневмоентерити великої рогатої худоби: діагностика та специфічна профілактика // Наук. вісник Нац. аграр. ун-ту. К., 2000. -Вип. 28. - С. 72-73
7. Віруси інфекційного ринотрахеїту та вірусної діареї як этіологічні агенти енцефалітів великої рогатої худоби. / Р.О. Кучерявенко, О.В. Годовский, Л.І. Кучерявенко, О.В. Стеценко //Пробл. зооінжинерії та ветеринарної медицини: Зб. наук. праць ХЗВІ.- Х., 2001. - С. 35-36.
8. IBR-viral meningoencephalitis of calves in Ukraine./ R. Kucheryavenko, P. Fooks, V. Bousol, V. Stetsenko, I. Avdosieva // 1st ESVV Veterinary Herpesvirus Symposium. Zurich, Switzerland, 22-23 March 2001. Zurich, 2001 - p. 52.
9. Стеценко В.І., Симиренко Л.Л., Кучерявенко Р.О., Бабкін М.В. //Тиреоїдний статус кролів при формуванні поствакцинального імунітету Вет. медицина: Мiжвiд. темат. наук. зб.- Х., 2002.- Т. 2, Вип.79.- С. 133-142.
10. Глюкокортикоїдний статус кролів в умовах антигенного навантаження вакциною "Рипавак"/ М.В. Бабкін, Р.О. Кучерявенко, Л.Л. Симиренко, В. І. Стеценко, // Вет. медицина: Мiжвiд. темат. наук. зб.- Х., 2002.- Т. 1, Вип.79.- С. 3-11.
11. Епізоотологічний моніторинг інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби./ В. Бусол, В. Стеценко, Р. Кучерявенко, Л. Кучерявенко, З. Троценко. // Вет. медицина України., 2002. - №5. – С. 7-9.
12. Епізоотична ситуація щодо інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби в Україні./ Стеценко В.І., Кучерявенко Л.І., Чечоткіна Н.П., Кучерявенко Р.О., та інш. // Вет. медицина: Мiжвiд. темат. наук. зб.- Х., 2003.- Т. 1, Вип.82.- С. 585-589.
13. Рішення про видачу деклараційного патенту на винахід за № 2002 1210247 Україна, G 01N 33/48. Спосіб визначення резервів імуногенезу // М.В. Бабкін, Б.Т. Стегній, Л.Л. Симиренко, В.І. Стеценко, Р.О. Кучерявенко / ІЕКВМ УААН.
Кучерявенко Р.О. Інфекційний ринотрахеїт великої рогатої худоби (епізоотологія, діагностика та специфічна профілактика). – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.03 – ветеринарна мікробіологія та вірусологія. Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, Харків, 2003.
Дисертація присвячена вивченню епізоотологічних особливостей інфекційного ринотрахеїту (ІРТ) великої рогатої худоби та створенню й оцінці засобів діагностики та специфічної профілактики цієї інфекції. Проведено порівняльний епізоотологічний моніторинг ІРТ великої рогатої худоби в країнах різних континентів світу, в тому числі й в Україні. Визначено епізоотологічні особливості захворювання та встановлено ступінь розповсюдження герпесвірусу-1 в товарних та племінних господарствах. Вивчено форми клінічного прояву захворювання та локалізацію збудника інфекції в різних органах і тканинах хворої на ІРТ великої
