МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

ОДЕСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

КОТЮЖИНСЬКА

Світлана Георгіївна

УДК 612.127.4

РОЛЬ ОКСИДУ АЗОТУ В РЕГУЛЯЦІЇ АГРЕГАТНОГО СТАНУ КРОВІ

(експериментальне дослідження)

14.03.04 – патологічна фізіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук

Одеса – 2003

Дисертація є рукопис

Робота виконана в Одеському державному медичному університеті МОЗ України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки та техніки України, ГОЖЕНКО Анатолій Іванович, Одеський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри загальної та клінічної патологічної фізіології

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор СУКМАНСЬКИЙ Олег Іванович, Інститут стоматології АМН України, завідувач лабораторії патофізіології

доктор медичних наук, професор СЕРВЕЦЬКИЙ Костянтин Леонідович, Одеський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри інфекційних хвороб з курсом епідеміології

Провідна установа: Донецький державний медичний університет ім. М.Горького, кафедра патологічної фізіології, МОЗ України, м. Донецьк

Захист дисертації відбудеться “17” грудня 2003 року о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.600.01 у Одеському державному медичному університеті (65026, м. Одеса, пров. Валіховський, 2).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Одеського державного медичного університету (65026, м. Одеса, пров. Валіховський, 2).

Автореферат розісланий “ 15 ” листопада 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

к.мед.н., доцент Годован В.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Нітрати і нітрити є звичними та розповсюдженими елементами кругообігу азоту в природі, які потрапляють до внутрішнього середовища людини практично всіма каналами зв’язку живого організму з зовнішнім середовищем – їжа, вода і повітря. Широке використання цих сполук в промисловості, сільському господарстві, фармакології призвело до забруднення довкілля неорганічними окислами азоту і їх хронічної токсичної дії на організм людини, що створило велику медико-біологічну проблему (Ильицкий А.П., 1991; Ажипа Я.И. и др., 1990; Тиунов Л.А. и соавт. 1991; Гоженко А.И. и соавт., 2002). Це обумовлено тим, що в еволюції людини інтенсивність надходження неорганічних окислів азоту до організму була значно меншою, а та кількість, яка потрапляє з зовні в теперішній час, суттєво її перевищує.

Відомо, що токсична дія нітратів та нітритів полягає в здатності активувати вільнорадикальні процеси окислення, які призводять до розвитку пухлинних процесів (Шугалей И.В. и соавт., 1991; Сорокин Д.Ю., 1991; Меньшиков Е.Б. и соавт., 1993; Ванин А.Ф., 1998), інгібування синтезу ДНК (Salvelini D. et al., 1993; Маеда Х. и соавт., 1998), порушення функції ферментних систем (Nathan C. et al., 1994; Горрен А.К.Ф. и соавт. 1998). Окрім того, при гострих і важких отруєннях розвивається гемічна гіпоксія внаслідок переходу оксігемоглобіну в метгемоглобін (Середенко М.М. и соавт, 1987; Бутров А.В., 1992; Малышев И.Ю. и соавт., 2000), що раніше вважалося головним наслідком нітритної інтоксикації. При цьому в організмі людини та тварин виникають ураження практично всіх органів та тканин.

Незважаючи на великий спектр токсичних ефектів, нітрати та нітрити відносяться до помірно токсичних речовин (Knowles R.G., Moncada S., 1994; Реутов В.П., 1995). Однак, публікації останніх років показують, що неорганічні окисли азоту, окрім токсичної дії, можуть чинити регуляторний та фармакологічний вплив як на рівні цілого організму, так і окремих органів, клітин та молекул (Gardiner S.M. et al., 1992; Bordeaux A., 1993; Kroencke K. et al., 1995; Гоженко А.И. и соавт., 1993-2003).

Доведено, що ці речовини постійно присутні і ендогенно синтезуються в організмі людини (Снайдер С.Х., Бред Д.С., 1992; Малышев И.Ю., 1997; Реутов В.П., 1995; Moncada S., 1994). Одним з головних джерел їх в організмі, за сучасними уявленнями, є оксид азоту, який утворюється з L-аргініну (Fіrstermann U., 1994; Kubes P., 1996).

Досліди останніх років показали, що NO є важливим фізіологічним медіатором, і, в тому ж числі, бере активну участь в стабілізації реологічних властивостей крові за рахунок вазорелаксуючих ефектів та одночасної регуляції процесів агрегації і адгезії тромбоцитів та лейкоцитів (Sakuma I. et al., 1988; Schmidt H.H.W., 1988). В той же час в роботах В.П.Реутова показана можливість відновлення нітратів до оксиду азоту, що дозволило авторові сформулювати концепцію функціювання циклу оксиду азоту в організмі ссавців (Реутов В.П. и др., 1993; 1998; 2000). Це дозволяє об’єднати проблему нітрит-нітратних інтоксикацій з обміном ендогенного оксиду азоту.

Разом з тим відомо, що однією з найбільш чутливих систем до дії токсичних хімічних факторів є система регуляції агрегатного стану крові, яка забезпечує підтримання рідкого стану крові в організмі та перешкоджає крововтраті (Гаврилов О.К. и др., 1981; Горизонтов П.Д., 1981). Дані вітчизняної та закордонної літератури відносно складних реакцій системи гемостазу в умовах нітратної інтоксикації суперечні. За даними деяких авторів (Рафибеков А.Д., 1993;
Шевченко Ю.Л. и др., 2000), в цих умовах в організмі тварин і людини спостерігається гіпокоагуляційний зсув гемостатичного потенціалу, а інші дослідники вказують на гіперкоагуляцію (Исабаева В.А., 1983; Рачков А.Г., 1998).

На даний час в літературі відсутній достатній аналіз змін з боку тромбоцитарно-судинної та коагуляційної ланок системи гемостазу і фібринолізу при різноманітних ступенях й формах нітритної інтоксикації. Відсутні дані щодо патогенезу порушень гемостазу при нітритній інтоксикації, тоді як забруднення довкілля неорганічними окислами азоту все більш зростає, а кількість випадків отруєння цими сполуками з розвитком важкої патології збільшується.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження виконувались в межах планової НДР Одеського державного медичного університету МОЗ України “Патогенетичні механізми розвитку захворювань репродуктивної системи в умовах дії агресивних факторів середовища та шляхи їх корекції” (№ держреєстарції 0199U004330).

Мета і завдання дослідження. Метою дисертаційної роботи було вивчення ролі оксиду азоту в зміні агрегатного стану крові при гострій та хронічний нітритній інтоксикації in vivo та in vitro.

Для досягнення вказаної мети були поставлені такі задачі:

1) вивчити стан системи гемостазу при гострій нітритній інтоксикації легкого ступеня у щурів in vivo;

2) дослідити динаміку змін системи гемостазу у щурів in vivo при хронічній нітритній інтоксикації легкого ступеня;

3) оцінити ступінь і характер змін усіх ланок системи гемостазу при одноразовому введенні щурам інгібітора NO-синтази – Nw-нітро-L-аргініну;

4) з’ясувати стан системи гемостазу у щурів при хронічній дії блокатора NO-синтази in vivo;

5) дослідити динаміку змін системи гемостазу у щурів при гострій та хронічній нітритній інтоксикації легкого ступеня на тлі введення блокатора NO-синтази in vivo;

6) з’ясувати характер безпосереднього впливу донора й блокатора синтезу оксиду азоту на функціональний стан системи гемостазу in vitro у людей та оцінити роль тромбоцитів в процесі зміни зсідання крові.

Об’єкт дослідження – патогенетичні механізми зміни функціонального стану системи гемостазу in vivo та in vitro при дії донора і блокатора синтезу оксиду азоту.

Предмет дослідження – система гемостазу білих щурів та людини.

Методи дослідження. Для досягнення висунутої в роботі мети використовували патофізіологічні моделі (гостра та хронічна нітритна інтоксикація середнього ступеня, гостра та хронічна блокади NO-синтази), біохімічні (спектрофотометричні, клініко-лабораторні) та інструментальні (тромбоеластографія, п’єзовіскозіметрія) методи дослідження системи гемостазу, а також методи комп’ютерної математичної статистики для аналізу отриманих результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено дослідження впливу нітриту натрію як донора оксиду азоту на систему гемостазу шляхом його одноразового та хронічного введення щурам, а також блокатора NO-синтази – Nw-нітро-L-аргиніну окремо та сумісно з нітритом натрію.

Уточнено та доповнено відомості щодо фізіологічних ефектів ендогенного оксиду азоту. Показано, що екзогенне індуковане надходження нітриту натрію до організму щурів супроводжується збільшенням пулу NO2– в крові тварин, що обумовлює виникнення антикоагуляційних ефектів здебільш внаслідок блокади тромбоцитарно-судинного гемостазу.

Вперше виявлена різниця в реакції системи гемостазу при гострій та хронічній нітритній інтоксикації. Показано, що екзогенне додаткове надходження NaNO2 підвищує функціональну активність системи фібринолізу, причому збільшення відбувається за рахунок неферментативної ланки фібринолізу, а при хронічній дії – за рахунок обох її компонентів. Тривале введення блокатора NO-синтази також призводить до збільшення фібринолітичної активності, але за рахунок ферментативної ланки.

Вперше встановлено, що активація неферментативного фібринолізу, яка спостерігається in vivo не пов’язана зі змінами в клітинах крові, оскільки не відтворюється в дослідах in vitro.

Науково-практичне значення роботи. Одержані в роботі результати допомагають конкретизувати патогенез порушень системи гемостазу при гострій та хронічній нітритній інтоксикації. Виходячи з експериментальних даних, що нітрит натрію володіє значним антикоагуляційним ефектом завдяки гальмуванню агрегації та адгезії тромбоцитів і активації фібринолітичної системи, слід це неодмінно враховувати при лікуванні гострої та хронічної нітритної інтоксикації, при призначенні ліків, які є донорами оксиду азоту, а також використовувати ці ефекти при корекції порушень гемостазу.

Результати роботи використовуються у навчальному процесі на кафедрах патологічної фізіології Запорізького державного медичного університету, Одеського державного медичного університету, Харківського державного медичного університету, Буковинської державної медичної академії.

Особистий внесок здобувача. Автором проведено патентно-інформаційний пошук, обґрунтування схем дослідження, налагоджування експериментальних моделей, вибір обсягів та методів дослідження. Дисертант самостійно здійснював біохімічні й інструментальні дослідження, статистичну обробку, аналіз і узагальнення отриманих результатів, сформулював основні положення та висновки дисертації.

Апробація результатів дисертаційної роботи. Основні положення дисертації були представлені у вигляді доповідей та отримали позитивні оцінки фахівців на
ІІ Українській міжнародній конференції “Актуальные проблемы морской медицины” (м. Одеса, 1997), на III Національному конгресі патофізіологів України з міжнародною участю (м. Одеса, 2000), на ювілейній 70-ій науковій конференції студентів та молодих вчених, присвяченій 10-річчю незалежності України (м. Одеса, 2001), на VI Всеукраїнському з’їзді товариства лікарів (м. Чернівці, 2001).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 11 наукових робіт, з них 5 – наукові статті в провідних фахових виданнях ВАК України, 2 – в закордонних журналах, 4 – тези доповідей на наукових конференціях і з’їздах.

Структура та обсяг дисертації. Роботу викладено на 145 сторінках машинописного тексту. Вона складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, трьох розділів власних досліджень, аналізу і узагальнення результатів і висновків. Текст дисертації ілюстровано 44 таблицями і 21 рисунком. Список літератури містить 257 джерел, з них 102 – іноземні.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Експериментальні дослідження були проведені на 188 білих статевозрілих щурах-самцях вагою 130-200 г та цільній крові 49 донорів-чоловіків віком 20-35 років.

Стан тромбоцитарно-судинного гемостазу оцінювали за процентом адгезивных тромбоцитів (ПАТ), який визначали за методом В.П.Мищенко (1971), а також за індексом спонтанної агрегації тромбоцитів (ІСАТ) методом A.Taccola (1973).

Поряд з показниками первинного гемостазу, вивчали стан коагуляційної ланки зсідання крові з використанням традиційних методів: час рекальцифікації плазми (ЧР), який визначали за методом Howell (1961); протромбіновий час (ПТЧ) – за Qulck (1958); тромбіновий час (ТЧ) – за Biggs і Macforlane (1963), активований парціальний тромбопластиновий час (АПТЧ) – за Caen et al., (1968).

Визначали кількість фібриногену (ФГ) за методом Clauss и Puar (1954); розчинні фібрин-мономірні комплекси (РФМК) і продукти деградації фібриногену (ПДФ) – за З.С.Баркаганом (1988); активність фібрин стабілізуючого фактору – за В.П.Балудою (1965); Хагеман-залежний фібриноліз (ХЗФ) – за Kowalski, Kopec (1967); потенціальну активність плазміногену (ПАП) – за И.К.Слобожинской (1973); сумарну фібринолітичну активність (СФА) і неферментативну фібринолітичну активність (НФА) – за Б.А.Кудряшовой і Л.А.Ляпиной (1979) та ферментативну фібринолітичну активність (ФФА).

Протеолітичну ланку системи гемостаза оцінювали за вмістом антитромбіну ІІІ (Hensen, Loeliger в модифікації К.М.Бишевского, 1985) і за протеолітичною активністю плазми крові (Shick і Castellino, 1978).

Для оцінки ступеня нітратної інтоксикації у піддослідних тварин спектрофотометричним методом визначали концентрацію MetHb крові (А.М.Горячковский, К.В.Моисеева, 1989) і концентрацію іонів NO2– та NO3– в плазмі крові, використовуючи реактив Грисса (Green L.C. et al., 1982).

Для біохімічних досліджень застосовували набори науково-виробничої фірми “Simko Ltd” і фірми “Біомарк” (м. Львів).

Для дослідження реологічних характеристик крові людей (in vitro) був використаний медичний п’єзокристалічний віскозиметричний аналізатор АПР-01 “МЕДНОРД” (Росія), а у щурів in vivo – метод тромбоеластограми цільної крові (H.Hartert, 1967). В обох випадках враховували такі показники: час реакції (r), константу тромбіну (К), константу коагуляції (r+K), константу використання протромбіну (r/K), константу зсідання крові (t), константу тотального зсідання крові (Т), константу синерезису (стискання) згустку (S), вуглову константу (?), максимальну амплітуду (Аm), тромбоеластографічний показник синерезису (Am/S), еластичність утворення згустку (Е), модуль пружності згустку крові (Q) та індекс гіперкоагуляції (Сі).

Експериментальні моделі. Вивчення впливу екзогенного донору оксиду азоту на систему гемостазу проводили в двох серіях дослідів. Ефекти тимчасової дії донору вивчали на тваринах (21 щур), яким одноразово внутрішньочеревно вводили 1% водний розчин нітриту натрію в дозі 30 мг/кг маси тіла. Пролонговану дію донору NO на гемокоагуляційний потенціал крові оцінювали у тварин (22 щура), яким протягом 21 доби давали пити 0,3% водний розчин NaNO2 замість води.

Такій вибір доз був обумовлений тим, що дана кількість NaNO2 викликає легкий ступінь інтоксикації з вмістом MetHb до 20%, при якій значних змін з боку гемодинаміки і кисневого гомеостазу не спостерігається, і, як наслідок, гемостаз в меншому ступеню залежить від вторинних факторів (Трахтенберг И.М., 1987; Иваницкая Н.Ф., 1986; Симоненков А.П., 1999).

З метою порівняльного аналізу впливу блокатора синтезу NO на активність системи гемостазу були створені 4 експериментальні моделі. В першій тваринам (22 щура) одноразово внутрішньочеревно вводили 1% водний розчин Nw-нітро-L-аргінін (NwNLA) в дозі 15 мг/кг від маси тіла. В другій групі тварини (20 щурів) протягом 21 доби отримували NwNLA в дозі 3 мг/кг від маси тіла у вигляді 1% водного розчину. Третя група тварин (20 щурів) після одноразового введення NwNLA отримувала разову дозу NaNO2. Четверту групу складали тварини (22 щури), які на тлі пиття 0,3% водного розчину NaNO2 отримували 3 мг/кг NwNLA протягом 21 доби, у всіх дослідах інгібітор вводили внутрішньочеревно.

Для блокування синтезу ендогенного NO в дослідах використовували інгібітор NO-синтази – Nw-нітро-L-аргінін (фірма “Sigma”, США). Обрана доза NwNLA відповідає діапазону добових доз як інгібітора NO-синтази (15-50 мг/кг), а також діапазону його ефективних доз (3-30 мг/кг) у дослідних тварин на підставі літературних даних (Сагач В.Ф, 1998; Абакумов М.М., 1998).

Контрольні тварини отримували 0,9% розчин хлориду натрію в обсязі доз експериментальних груп.

Для вивчення ефектів NO in vitro було створено дві моделі: в першій до пробірки з цільною кров’ю людини додавали 0,02 мкмоль 10% розчину NaNO2, в другій – 0,1 мкмоль інгібітору конституційної NO-синтази – NwNLA – в концентрації 0,2 мкмоль/л і регістрували зміни агрегатного стану крові на аналізаторі АПР-01 “МЕДНОРД” (Росія). Дози препаратів обрані на підставі літературних даних щодо діапазону їх фармакологічної активності (Паунов С.С., 2000; Зозуля Ю.А., 2000).

Статистичну обробку результатів дослідження проводили за загальноприйнятими в експериментальній медицині методами. Вірогідність відмін між середніми значеннями визначали за критерієм Стьюдента, оцінюючи імовірність отриманих результатів на рівні значимості не менш ніж 95% (р?0,05). Математичні розрахунки робили за допомогою пакету прикладних статистичних програм “Exсel” на IBM PC – PII.

Результати досліджень та їх обговорення. Зміни системи гемостазу при одноразовій та хронічній дії нітриту натрію. Встановлено, що як при одноразовому введенні NaNO2 в дозі 30 мг/кг від маси тіла, так і при тривалому його надходженню (0,3% водний розчин NaNO2 для пиття замість води, 21 доба), розвивається гемічна гіпоксія легкого ступеня, про що свідчить збільшення кількості MetHb в плазмі крові від 3,46±0,43 до 19,71±1,31 і 12,44±2,45 % відповідно. При цьому на висоті інтоксикації при одноразовому надходженні в плазмі крові підвищується кількість нітратів з 5,610,17 до 122,7515,24 мкмоль/л (р<0,05) та нітритів з 7,830,71 до 98,2217,15 мкмоль/л (р<0,05), при хронічній дії рівень нітратів і нітритів також збільшується відносно контролю, але концентрація нітратів становила 37,185,41, а нітритів 43,495,27 мкмоль/л. Отже, виявляються прояви гемічної гіпоксії, які пов’язані зі збільшенням в крові неорганічних закисів азоту. За даними автопсії явищ геморагічного синдрому виявлено не було, однак, визначено вірогідне подовження часу кровотечі від 342,53±41,35 до 591,00±28,75 с, що слід розглядати як прояви гіпокоагуляції.

Агрегаційна здатність тромбоцитів в обох випадках була знижена, про що свідчило зменшення ІСАТ і ПАТ відносно інтактних тварин, але при хронічній дії ці зміни були більш вираженими (табл.).

Таблиця

Зміни тромбоцитарно-судинного гемостазу при гострій та хронічній дії нітриту натрію (Mm) |

Серія експериментів

Показники | контроль,
n=10 | одноразове введення NaNO2, n=20 | тривале введення NaNO2, n=22

ІСАТ, % | 6,251,77 | 2,070,81* | 1,790,58*

ПАТ, % | 26,086,12 | 7,584,75* | 20,887,94**

Примітки: * – Р ? 0,05 відносно контрольної групи;

** – Р ? 0,05 відносно одноразового введення NaNO2

Дещо іншу відповідь коагуляційної ланки системи гемостазу спостерігали при тривалій дії нітриту натрію. Так, зменшувався час рекальціфікації з 202,6524,42 до 112,6017,65 с, протромбіновий час з 103,3017,86 до 22,531,81 с, тромбіновий час з 66,0416,04 до 18,571,38 с (р?0,05) відносно групи одноразової дії, але ці показники були вірогідно високими в порівнянні з контрольною групою 81,786,97, 17,351,16 і 15,080,74 с відповідно. В той же час зростали активований парціальний тромбопластиновий час з 22,352,34 до 37,693,93 хв, при цьому показники були вищі за контрольні 32,963,33 хв.

По відношенню до одноразового введення NaNO2 при тривалій його дії спостерігалось подовження часу реакції, збільшення в 2,5 рази константи протромбіну і константи зсідання крові на 26,25%. Подовжувалась і константа тотального зсідання крові на 43,45%. Зведений індекс коагуляції вірогідно збільшувався (р?0,05).

Відносно фібринолітичної системи відмічалась тенденція зниження активності, як її самої, так і всіх її складових при тривалій дії NaNO2 відносно гострої дії, зменшувався Хагеман-залежний фібриноліз, але величини все рівно були значно вищі за контрольні.

Сумарна фібринолітична активність плазми крові вірогідно (р?0,05) збільшувалась в обох випадках відносно контрольної групи. При цьому при гострій дії NaNO2 збільшення СФА відбувалось за рахунок частки неферментативної фібринолітичної активності, яка підвищувалась майже в 4 рази, а при хронічній дії донору NO збільшення здійснялось за рахунок обох компонентів в однаковій мірі (рис. 1).

Протеолітична активність плазми крові вірогідно зростала більш ніж в
5 разів при хронічній дії NaNO2 в порівняні з одноразовим введенням, а активність антитромбіну ІІІ підвищувалась незначно від 70,30±5,29 до 74,60±6,08 %.

При тривалому надходженні до організму піддослідних тварин NaNO2 зміни системи гемостазу виявлялись в стабілізації деяких показників коагуляційної ланки і фібринолізу. Про це свідчить тенденція наближення до контрольних величин часу рекальціфікації, протромбінового і тромбінового часу, а з боку фібринолізу – активності плазміногену і фактору ХІІІ.

Рис. 1. Порівняльна характеристика змін фібринолітичної активності плазми крові при гострій та хронічній дії NaNO2.

* – Р<0,05 відносно контрольної групи;

** – Р<0,05 відносно одноразового введення NaNO2.

Таким чином, слід зазначити, що надходження до організму нітриту натрію як одноразово, так і тривало, призводить до явищ гіпокоагуляції, які проявляються в зниженні агрегаційної активності тромбоцитів, підвищенні активності компонентів зсідання крові та збільшенні функціональної активності фібринолітичної та протеолітичної систем.

Функціональний стан системи гемостазу при однократній та хронічній дії блокатора NO-синтази. Після однократного і хронічного введення NwNLA, в разі блокування NO-синтази, було відмічено в обох випадках незначне зменшення в плазмі крові кількості нітритів від 5,61±0,83 до 5,07±0,63 і 4,63±0,65 мкмоль/л відповідно, та нітратів від 7,83±0,51 до 6,67±0,84 і 7,02±0,57 мкмоль/л в плазмі крові.

Порівняння отриманих результатів показало, що інгібітор NwNLA викликає зростання агрегаційної активності тромбоцитів в обох випадках. Однак, при тривалій дії блокатору ІСАТ продовжував збільшуватись від 19,223,64 до 41,429,07 % (р<0,05), а ПАТ вірогідно знижувалась з 53,1112,04 до 16,293,62 %.

З боку коагуляційної ланки системи гемостазу спостерігалось зниження функціональної активності, яке в більшій мірі було виражено після одноразового введення блокатора NO-синтази (рис. 2). При хронічній дії ступінь змін був меншим в порівнянні з контролем і відзначалось підвищення всіх показників в порівнянні з гострим експериментом.

Рис. 2. Динаміка змін коагуляційної ланки системи гемостазу при гострому і хронічному блокуванні NO-синтази.

* – Р 0,05 відносно контрольної групи;

** – Р 0,05 відносно одноразового введення NwNLA

Динаміка змін показників фібринолізу в цих двох групах відносно один одного мала такий характер: тільки кількість фібриногену вірогідно зменшувалась при тривалому введенні NwNLA з 3,890,19 до 3,230,18 г/л (р?0,05), інші показники зростали відповідно однократної дії і наближувались до контрольних величин.

Відносно фібринолітичної активності відмічалась тенденція збільшення сумарної фібринолітичної активності в обох випадках 3,380,13 і 3,900,18 %, але в першому – частка ферментативної активності була більшою (2,990,25 та 2,630,52 %, відповідно), а в другому – неферментативної активності (0,380,11 і 0,870,28 %, відповідно).

Протизсідаючий потенціал системи гемостазу також вірогідно зростав в цих двох експериментальних моделях, але значної різниці відносно один одного не спостерігалось. Так, активність антитромбіну ІІІ зменшувалась від 102,30±6,82 % в контролі до 86,70±7,01 % в гострому експерименті та до 85,11±3,5 % в хронічному; протеолітична активність плазми крові збільшувалась до 0,46±0,12 та 0,44±0,43 ум.од. відповідно.

Все вищезазначене дозволяє констатувати, що введення щурам блокатора NO-синтази викликає гіперкоагуляційний зсув гемостатичного потенціалу крові, при цьому на тривалий вплив блокатора система гемостазу відповідає менш вираженими змінами.

Зміни системи гемостазу при введенні донора NO на тлі блокування NO-синтази. Порівнюючи динаміку показників гемостазу при сумісному надходженні NaNO2 і NwNLA (гострому і хронічному), відмітили збільшення агрегаційної здатності тромбоцитів в обох випадках: ІСАТ вірогідно збільшувався відносно контрольних величин 6,251,77 %, але незначно коливався відносно один одного 16,453,14 та 15,573,51 % відповідно (р?0,05), а ПАТ при цьому зменшувався в
3 рази при хронічній дії відносно гострої і був нижчим за контрольні величини.

Відповідь коагуляційної ланки системи гемостазу визначалась в вірогідному подовженню часу рекальціфікації до 143,0623,91 і 108,1314,01 с (р<0,05) відповідно, протромбінового та тромбінового часу, який найбільш виражений при разовому сумісному надходженні NaNO2 і NwNLA.

З боку фібринолізу тільки ПАП зменшувався при хронічному введенні NaNO2 на тлі надходження інгібітора NO-синтази відносно гострого експерименту, а кількість фібриногену, ПДФ та активність фактору Хагеману зростали.

Для фібринолітичної активності плазми крові було характерним різке підвищення її активності при одноразовій сумісній дії блокатора NO-синтази й донора оксиду азоту та незначне – при тривалій. При тривалому надходженні цих речовин неферментативна ланка збільшувалась, а ферментативна зменшувалась по відношенню до гострого експерименту (рис. 3).

Рис 3. Динаміка зміни фібринолітичної активності при дії донора NO на тлі блокади NO-синтази.

* – Р 0,05 відносно контрольної групи;

** – Р 0,05 відносно одноразового введення.

В цілому, отримані дані свідчать про гіпокоагуляційний стан системи гемостазу в обох випадках. Підтвердження цьому – зниження адгезивих властивостей тромбоцитів, підвищення коагуляційного потенціалу і збільшення функціональної активності фібринолітичної системи. Слід підкреслити, що при цьому ступінь гіпокоагуляції був сильніше виражений при одноразовому сумісному введенні NaNO2 і NwNLA, незважаючи на підвищену агрегаційно-адгезивну активність тромбоцитів в даному випадку.

Вплив донора оксиду азоту на систему гемостазу in vitro. В разі проведення досліджень реологічних властивостей цільної крові людини на медичному п’єзо-віскозиметричному аналізаторі „МЕДНОРД” (при внесенні в інкубаційну суміш
0,02 мкмоль 10% розчину NaNO2) було зазначено підвищення інтенсивності спонтанної агрегації тромбоцитів у порівнянні з контролем (-1,83±0,02 відн.од. і
0,00 відн. од. відповідно), що дозволило судити про збільшення функціональної активності тромбоцитів. При цьому їх кількісні і якісні характеристики були в межах норми, про що свідчили значення початкового показника агрегації тромбоцитів – 112,00±9,67 й 113,21±10,43 відн. од. відповідно.

Прокоагуляційна ланка системи гемостазу характеризувалась подовженням періоду реакції, що в свою чергу відповідало збільшенням протромбинового і активованого парціального тромбопластинового часу по відношенню до контрольної групи. На цьому фоні відзначалось різке зменшення константи тромбіну в 1,5 рази, вірогідне збільшення показника тромбінової активності (р<0,05) і зменшення константи коагуляції.

Для фібринолітичної ланки при разовому введенні в інкубаційне середовище донора NO було характерним вірогідне збільшення фібрин-тромбоцитарної константи крові, різке зменшення константи тотального зсідання крові і вірогідне зменшення сумарного показника рефракції й спонтанного лізису згустку. Фібринолітична активність крові була зниженою.

Це дало підстави заключити, що система гемостазу в даному випадку знаходилась в стані гіперкоагуляції, що наочно відтворювалось на графічному запису АПР-01 (рис. 4).

Рис. 4. Графічний запис зміни агрегатного стану крові in vitro при введенні NaNO2.

Вплив інгібіторa NO-синтази на систему гемостазу in vitro. В результаті одноразового введення блокатора NO-синтази NwNLA не було зареєстровано ніяких змін з боку спонтанної агрегації тромбоцитів по відношенню до контрольної групи. Початковий показник агрегації тромбоцитів також змінювався незначно (119,24±9,43 й 113,21±10,43 відн. од. відповідно) і був в межах норми.

Коагуляційна ланка системи гемостазу характеризувалась подовженням часу реакції, вірогідним збільшенням констант тромбіну і коагуляції (р?0,05). Водночас з цим відмічалось і збільшення констант зсідання і згущення згустку. При цьому спостерігалось зниження показника тромбінової активності в 2 рази. Така динаміка показників дозволяє констатувати гіпокоагуляційний зсув системи гемостазу.

В фібринолітичній ланці системи зсідання крові спостерігались зміни, які також вказували на гіпокоагуляційну динаміку. Фібрин-тромбоцитарна константа крові зменшувалась майже в 2 рази, а сумарний показник рефракції і спонтанного лізису згустку теж зменшувались, але незначно. В той же час константа тотального зсідання крові збільшувалась в 2 рази, що свідчило про підвищення активності антикоагуляційної ланки.

Аналізуючи динаміку показників системи гемостазу in vitro при одноразовому введенні блокатора синтезу NO, відзначили виражений гіпокоагуляційний зсув гемостатичного потенціалу крові по відношенню до контрольної групи. Слід зазначити, що при цьому тромбоцитарно-судинна ланка системи гемостазу не зазнавала ніяких змін. Гіпокоагуляційний характер змін підтверджував й загальний вигляд графічного запису процесу на АПР-01 (рис. 5).

Рис. 5. Графічний запис зміни агрегатного стану крові in vitro при введенні NwNLA.

Таким чином, гостра і хронічна інтоксикація нітритом натрію супроводжується гіпокоагуляційним зсувом системи гемостазу, що пов’язано з функціонуванням в організмі тварин та людей циклу оксиду азоту, де NO2 перетворюється в NO з переважним пригніченням під його дією тромбоцитарно-судинного гемостазу й активацією фібринолітичної системи. В той же час до хронічної дії донора NO спостерігається деяка адаптація зі зниженням гіпокоагуляційного ефекту.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведені теоретичні узагальнення і нове вирішення наукової проблеми, що виявляється у дослідженні патогенетичних механізмів порушень функціонального стану системи гемостазу при дії донора та блокатора синтезу оксиду азоту in vivo та in vitro. Проведено експериментальне вивчення NO-залежних механізмів патогенезу змін гемостазу в умовах нітритної інтоксикації легкого ступеня.

1. Введення нітриту натрію (одноразове та хронічне) супроводжується збільшенням кількості нітритних іонів та нітратних іонів у плазмі крові, що дозволяє розглядати виникаючі в організмі тварин зміни як наслідок ефектів цих речовин і продуктів їх метаболізму. Нітрит натрію в малих дозах не виявляє патогенної дії на систему гемостаза, а, навпаки, значно стимулює її основні функціональні ланки.

2. Одноразове введення нітриту натрію пригнічує тромбоцитарно-судинну ланку гемостазу в разі зниження агрегаційної активності тромбоцитів, підвищення активності компонентів коагуляційної ланки і активації фібринолізу, насамперед за рахунок неферментативної ланки.

3. При тривалому надходженні нітриту натрію до організму тварин (пиття 0,3% розчину NaNO2) в цілому переважає гіпокоагуляційний зсув системи гемостазу за рахунок пригнічення функціональної активності тромбоцитів майже в 4 рази і активації фібринолізу в 2,5 рази, хоча при цьому відмічається стабілізація деяких показників коагуляційної ланки (час рекальцифікації, протромбіновий і тромбіновий час) і фібринолізу (активація плазміногегу і фактору ХІІІ).

4. Введення in vivo щурам блокатора NO-синтази Nw-нітро-L-аргініну супроводжується ефектом гіперкоагуляції, однак після одноразового надходження явища більш виражені, ніж при хронічній дії.

5. Надходження нітриту натрію на тлі введення блокатора NwNLA призводить до гіпокоагуляції; відповідь системи гемостазу на одноразову дію більш інтенсивна, ніж при хронічній сумісній дії цих речовин.

6. Одноразове введення нітриту натрію in vitro супроводжується гіперкоагуляційним станом системи гемостазу, однак одноразове додавання до середовища інкубації блокатора NO-синтази NwNLA призводило до гіпокоагуляційного ефекту.

7. Доведено, що основні ефекти нітриту натрію на систему гемостазу є результатом біохімічних реакцій внаслідок перетворення NO2– в NO завдяки циклу оксиду азоту, що і призводить до зниження функціональної активності тромбоцитів, а в поєднанні з активацією неферментативного фібринолізу визначає гіпокоагуляційний зсув системи гемостазу.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Оксид азота и свертывающая система крови // Вісник морської медицини. – 1999. – № 3. – С. 153-154 (соав. Николаевская И.В., Котюжинский А.Л.,
Федорук А.С.; внесок автора – відтворення експериментальних моделей, аналіз результатів та написання розділу і висновків).

2. Роль оксида азота в регуляции микроциркуляции и агрегатного состояния крови (обзор) // Український медичний альманах. – 2000. – Т. 3, № 1. – С. 197-200 (соав. Гоженко А.И., Котюжинский А.Л., Савицкий И.В., Бабий В.П.; внесок автора – написання розділу роботи).

3. Вплив гострої нітритної інтоксикації на гемостаз // Медична хімія. – 2000. – Т. 2, № 4. – С. 50-53 (співав. Гоженко А.І., Котюжинський А.Л.; внесок автора – проведення експериментів, аналіз результатів, написання висновків)

4. Порівняльна характеристика впливу нітриту натрію на систему гемостазу in vivo та in vitro // Вісник наукових досліджень. – 2002. - № 1. – С.108-109.

5. Изменения функции почек при острой интоксикации нитритом натрия в эксперименте // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. – 2003. - № 1. – С. 28-30 (соав. Гоженко А.И., Федорук А.С., Кузьменко И.А.; внесок автора – постановка і проведення експерименту).

6. Причины и механизмы интоксикации нитратами и нитритами (обзор литературы) //Медицина труда и промышленная экология. – 1996. - № 4. –
С. 15-21 (соав. Гоженко А.И., Доренский В.С., Рудина Е.И., Котюжинский А.Л., Славина Н.Г.; внесок автора – проведення експериментів та аналіз результатів).

7. Методика определения нитрит-нитратной экологической нагрузки на организм человека // Медицина труда и промышленная экология. – 2001. – № 3. – С. 38-39 (соав. Гоженко А.И., Славина Н.Г., Котюжинский А.Л., Федорук А.С.; внесок автора – участь у проведенні експериментів, статистичний аналіз, написання вступу і висновків).

8. Роль оксида азота в физиологии и патологии. Определение нитратной экологической нагрузки на организм человека // Вісник морської медицини (Материалы ІІ Украинской международной конференции “Актуальные проблемы морской медицины”). – 1997. - № 1. – С. 14-15 (соав. Гоженко А.И., Славина Н.Г., Федорук А.С., Котюжинский А.Л.; внесок автора – статистична обробка і аналіз результатів).

9. Вплив оксиду азоту на фібринолітичну систему // Фізіологічний журнал (Матеріали ІІІ Національного конгресу патофізіологів України з міжнародною участю). – 2000. – Т. 46, № 2(а). – С. 8-9 (співав. Котюжинський А.Л.; внесок автора – аналіз результатів і написання роботи).

10. Система гемостазу при гострій дії нітриту натрію // Українські медичні вісті (Матеріали VI з’їзду Всеукраїнського лікарського товариства). – 2001. – Т.4,
№ 1. – С. 31.

11. Стан системи гемостазу при інгібуванні NO-синтази // Ювілейна 70-та наук. конф. студ. та молодих вчених: Тези доповід. – Одеса: Одес. держ. мед. ун-т, 2001. – С. 92-93.

АНОТАЦІЯ

Котюжинська С.Г. Роль оксиду азоту в регуляції агрегатного стану крові (експериментальне дослідження). – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.04 – патологічна фізіологія. – Одеський державний медичний університет МОЗ України, Одеса, 2003.

В дисертації досліджується функціональний стан системи гемостазу при дії донора та блокатора утворення оксиду азоту in vivo та in vitro. Вперше проведено експериментальне вивчення NO-залежних механізмів патогенезу змін зсідання крові при нітритній інтоксикації.

Показано, що при створенні моделі гемічної гіпоксії легкого ступеня в разі введення NaNO2 in vivo збільшується концентрація нітратних та нітритних іонів в плазмі крові, що дозволяє розглядати зміни в системі гемостазу як наслідок ефектів цих речовин і продуктів їх метаболізму, а саме оксиду азоту. При екзогенному надходженні NaNO2 пригнічується тромбоцитарно-судинна ланка гемостазу в разі зниження агрегаційної активності тромбоцитів, підвищується активність компонентів коагуляційної ланки й активується фібриноліз, насамперед, за рахунок неферментативного його компоненту. Введення in vivo щурам блокатора NO-синтази NwNLA як одноразово, так і тривало призводить до гіперкоагуляційних ефектів. Сумісне надходження NaNO2 і NwNLA викликає гіпокоагуляцію в обох випадках, але відповідь системи гемостазу на одноразову дію більш інтенсивна, ніж при хронічній дії цих речовин.

Встановлено, що активація неферментативного фібринолізу, яка спостерігається in vivo, не пов’язана зі змінами в клітинах крові, так як не відтворюється в дослідах in vitro.

Ключові слова: система гемостазу, нітрит натрію, оксид азоту, гіпoкоагуляція.

АННОТАЦИЯ

Котюжинская С.Г. Роль оксида азота в регуляции агрегатного состояния крови (экспериментальное исследование). – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.04 – патологическая физиология. – Одесский государственный медицинский университет МЗ Украины, Одесса, 2003.

В диссертации исследуется функциональное состояние системы гемостаза при действии донора оксида азота и блокатора его образования в отдельности и при совместном их введении in vivo и in vitro. В работе проведено экспериментальное изучение NO-зависимых механизмов патогенеза нарушений системы гемостаза при нитритной интоксикации.

Исследования выполнялись in vivo на 188 белых беспородных крысах-самцах с использованием моделей острой и хронической нитритной интоксикации. Исследования реологических характеристик in vitro проводились на цельной крови 49 доноров-добровольцев с применением медицинского пьезокристаллического вискози-метри-ческого анализатора АПР-01 “МЕДНОРД” (Россия).

Показано, что экзогенное индуцированное поступление нитрита натрия, как однократно, так и хронически, сопровождается увеличением концентрации нитритных и нитратных ионов в плазме крови, а также MetHb, что свидетельствует о развитии гемической гипоксии легкой степени, развивающейся в результате увеличения в крови количества неорганических окислов азота.

При однократном и хроническом введении NaNO2 в организме подопытных животных наблюдались явления гипокоагуляции, что выражалось в снижении агрегационной активности тромбоцитов, о чем свидетельствовало уменьшение индекса спонтанной агрегации тромбоцитов и снижение потенциальной их активности почти в 4 раза. Повышалась активность компонентов свертывания – уменьшалось время рекальцификации, протромбиновое и тромбиновое время, в то же время возрастало активированное парциальное тромбопластиновое время. Увеличение функциональной активности выражалось в повышение суммарной фибринолитической активности (в 2,5 раза) в основном за счет неферментативного звена. При длительном поступлении в организм животных NaNO2 изменения системы гемостаза выражались в стабилизации времени рекальцификации, протромбинового и тромбинового времени относительно однократного введения, что можно рассматривать как явления компенсации.

Анализируя динамику показателей системы гемостаза при введении крысам блокатора NO-синтазы – Nw-нитро-L-аргинина, как однократно (15 мг/кг, внутрибрюшинно), так и в течение 21 дня (3 мг/кг), отмечали выраженный гиперкоагуляционный сдвиг гемостатического потенциала крови. Он выражался в повышении агрегационной активности тромбоцитов, снижении коагуляционной активности и снижении функциональной активности фибринолиза на фоне увеличения протеолитической активности плазмы крови.

При совместном действии блокатора NO-синтазы и донора NO в остром и хроническом эксперименте у крыс наблюдались явления гипокоагуляции, и при этом ответ системы гемостаза на однократное воздействие был более интенсивным, чем при длительном совместном действии этих веществ, несмотря та повышенную агрегационно-адгезивную активность тромбоцитов в данном случае.

Представляют интерес отличия в реакции системы гемостаза при острой и хронической нитритной интоксикации. Показано, что однократное введение NaNO2 повышает функциональную активность системы фибринолиза, причем увеличение происходит за счет неферментативного звена фибринолиза. Длительное введение блокатора NO-синтазы также приводит к увеличению фибринолитической активности, но за счет ферментативного звена.

Впервые установлено, что активация неферментативного фибринолиза, наблюдающаяся in vivo, не связана с прямыми изменениями в крови, так как не воспроизводится в опытах in vitro.

Представленные данные позволяют заключить, что основные эффекты нитрита натрия на систему гемостаза являются результатом биохимических реакций вследствие превращения NO2– в NO через цикл оксида азота, который понижает функциональную активность тромбоцитов, что в сочетании с активацией неферментативного фибринолиза определяет гипокоагуля-ционный сдвиг гемостатического потенциала крови.

Исходя из экспериментальных данных о том, что NaNO2 обладает мощным антикоагуляционным эффектом, необходимо это учитывать при лечении острой и хронической нитритной интоксикации, при назначении препаратов, являющихся донорами NO, а также использовать такие эффекты при коррекции нарушений системы гемостаза.

Ключевые слова: система гемостаза, нитрит натрия, оксид азота, гипокоагуляция.

SUMMARY

Kotjuzhinskaja S.G. The role of nitric oxide in regulation of aggregate condition of blood (experimental investigation). – Manuscript.

Thesis for a scientific degree of kandidat of medical