АКАДЕМIЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАїНИ

Iнститут мікробіології і імунології ім.I.I.Мечникова АМН України

КРЕСТЕЦЬКА СВIТЛАНА ЛЕОНIДIВНА

УДК 579.61+547.835: 615.28’015.11(043)

ПротимIкробна активнIсть I фармакологIчНI ЕфектИ

четвертиННИх солей акридинУ ТА фенантридинУ

03.00.07 - мiкробiология

АВТОРЕФЕРАТ

дисертацiї на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Х а р к і в - 2 0 0 3

Дисертацією э рукопис.

Робота виконана в лабораторії протимікробних засобів Iнституту мікробіології і імунології ім. I.I.Мечникова АМН України

Науковий керівник: | доктор медичних наук, професор, заслужений діяч наукі і техніки України

Волянський Юрий Леонидович, Iнститут мікробіології і імунології ім. I.I.Мечникова АМН України, завідувач відділу мікробіології

Харківська медична академія післядипломної освіти, завідувач кафедри клінічної імунології та мікробіології

Офіційні опоненти | Доктор медичних наук, професор

Дикий Iгор Леонідович, Національний фармацевтичний університет МОЗ України, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології

доктор медичних наук, професор

Климнюк Сергій Iванович, Терніпільська державна медична академія ім. I.Я. Горбачевського МОЗ України, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології

Провідна установа | Iнститут епідеміології та інфекційних захворювань ім.Л.В.Громашевського АМН України, м.Київ

Захист дисертації відбудеться 30.05.2003 р. о 13-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д. 64.618.01 при Iнституті мікробіології і імунології ім. I.I.Мечникова АМН України за адресою: 61057, м.Харків, вул.Пушкінська, 14.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Iнституту мікробіології і імунології ім. I.I.Мечникова АМН України, 61057, м.Харків, вул.Пушкінська, 14

Автореферат розісланий 29.04.2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат медичних наук |

Брусник С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Надзвичайно висока пластичність властивостей та, відповідно, високий адаптаційний потенціал мікробних популяцій, а саме їх здатність пристосовуватись до дії широкого кола пошкоджуючих агентів, за існуючих терапевтичних підходів до лікування інфекційних та гнійно-запальних захворювань, робить антибактерійні препарати однією з найдинамічніших груп фармацевтичних заcобів. Хоч зараз і дискутується питання про доцільність використання етiотропних препаратiв в лікуванні деяких класичних інфекцій (Чеміч М.Д., Бутко В.А.,2001), але навряд чи ці погляди мають шанси на широку популярність у найближчому майбутньому. Екологічні проблеми та низький рівень соціального захисту більшості населення в Україні призвели до погіршення епідеміологічного стану щодо туберкульозу, СНIДу, дифтерії. З року в рік підвищується рівень захворюваності зоонозними інфекціями – туляремією, лептоспірозом, ієрсиніозами, сибірською виразкою та ін. (Москаленко В.Ф. та співавт., 2000). Певну актуальність надбає розробка ефективних та доступних за ціною заходів боротьби із збудниками особливо небезпечних інфекцій, тощо.

Обґрунтованість обрання в якості предмету дослідження похідних акридину та близько-спорідненої йому речовини – фенантридину, підтверджено чисельними дослідженнями останнього десятиріччя, в межах яких вивчалася біологічна активність (перш за все антибактерійна дія) інших гетероциклічних сполук: азот та залізовміщуючих похідних хіноліну з фероцинільнимі фрагментами (Перепічка М.П.,1990), азот- та сіркувміщуючих багаточленних гетероциклів із компонентами пірилія, піридинія і тиопірилия (Шульга Н.Н., 1992), хіноацетильованих цукрів, гетероциклічних похідних хіноліну і фероцену (Кучма І.Ю.,1995), гідразонів солей хінолінія (Молева В.І.,2001), метинових похідних хінолінія (Волянський А.Ю.,2002), тощо. Результати цих досліджень, накопичений масив даних з логіко-структурного аналізу зв’язку “структура-активність-токсичність”, в сукупності з результатами математичного моделювання та прогнозування антибактерійних властивостей гетероциклічних сполук, дозволяють вважати обрані речовини потенційно перспективним об’єктом. Серед похідних акридину, так саме як і серед похідних фенантридину, виявлено чимало активних сполук з антибактерійною, антипротозойною, фунгіцидною, противірусною та цитостатичною дією. Крім того, акридин та ряд його відомих похідних (профлавин, акрифлавин, ріванол та ін.) тропні до нуклеїнових кислот, наслідком чого є певні біологічні ефекти, що, в першу чергу, стосуються екстрахромосомних генетичних детермінант та, відповідно, мають вплив на адаптаційні процеси в мікробних популяціях. Саме для похідних акридину вперше продемонстровано здатність впливу на плазмідну та фагову ДНК, наслідком чого є ініціюючий вплив на процеси елімінації плазмідних факторів та пригнічування їх фагової трансдукції. Остання, доречі, поруч із кон'югацією, є найбільш універсальним шляхом швидкого розповсюдження резистентності до ліків. Таким чином, актуальність обраного напрямку визначається загальною тенденцією до загострення комплексу проблем, пов’язаних з еволюціонуванням патогенної та умовно-патогенної мікрофлори в напрямку пристосування до дії протимікробних засобів (широке розповсюдження шпитальних полірезистентних штамів мікроорганізмів, загальна тенденція до хронізації патології мікробного ґенеза, виникнення атипових клінічних форм перебігу інфекційних захворювань, зниження терапевтичної ефективності існуючих антибактерійних препаратів та постійна необхідність оновлення їх арсеналу).

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами і темами. Дисертаційна робота пов’язана з плановою науковою тематикою Інституту мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України “Вивчення молекулярних характеристик сполук, що мають антимікробну дію: скрининг і прогнозування” (шифр ЦФ.508, номер державної реєстрації 0194U20642); “Вивчення нових збудників опортуністичних інфекцій. Розробка методів і засобів лабораторної діагностики захворювань, обумовлених новими видами ентеробактерій” (шифр ЦФ.7.1.96, номер державної реєстрації 0197U01438); “Вивчення чутливості до сучасних антибіотиків та інших біологічних властивостей шпитальних штамів збудників гнійно-запальних захворювань” (шифр ЦФ.4.28.98, номер державної реєстрації 0199U003170); “Цілеспрямований пошук нових антибактерійних препаратів та вивчення їх протимікробної активності у відношенні до Corynebacterium diphtheriae” (ІН.4.36.2000 , № держреєстрації 0100U000406 ).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи – виявлення перспективних речовин серед сполук нового синтезу в рядах похідних акридину і фенантридину та мікробіологічне обґрунтування доцільності створення на їх основі нових протимікробних засобів .

Для досягнення означеної мети сформульовано і розв’язано такі основні задачі:

q провести первинний мікробіологічний скринінг 74 сполук нового синтезу з використанням стандартного набору референтних тест-культур;

q вивчити спектр та рівень активності відібраних в ході первинного скринінгу речовин щодо референтних та клінічних штамів мікроорганізмів - збудників інфекційних та гнійно-запальних захворювань;

q визначити вплив окремих похідних акридину та фенантридину на процеси, пов’язані з формуванням та розповсюдженням резистентності до ліків в мікробних популяціях;

q визначити основні показники токсичності, кумулятивність та подразнюючу дію окремих похідних акридину та фенантридину;

Об’єкт дослідження – інфекційні та гнійно-запальні захворювання.

Предмет дослідження – похідні акридину та фенантридину, патогенні та умовнопатогенні мікроорганізми.

Наукова новизна одержаних результатів. Серед сполук нового синтезу в рядах похідних четвертинних солей акридину та фенантридину виявлено речовини з високим рівнем та перспективним спектром протимікробної активності у відношенні, головним чином, грампозитивних клінічно значущих мікроорганізмів і грибів роду Canldida, прийнятними параметрами токсичності та низькими показниками швидкості формування резистентних форм мікроорганізмів. Обраний напрямок передбачав певне розширення традиційної схеми дослідження протимікробної дії: визначено здатність обраних речовин впливати на процеси формування хромосомної резистентності до антибіотиків, елімінації епісомних генетичних детермінант та їх фагову трансдукцію, що відображує певні закономірності впливу на адаптаційний потенціал бактерійних популяцій. Виявлено речовини, здатні суттєво уповільнювати процес формування резистентності до аміноглікозидів в культурі E.coli, потенціювати процеси елімінації плазмідних факторів резистентності та пригнічувати їх фагову трансдукцію.

Практичне значення одержаних результатів. Результати виконаних досліджень являють собою первинний етап вивчення біологічної дії хімічних сполук нового синтезу. Доведено виражену активність похідних акридину та фенантридину щодо стафілококів, стрептококів, коринебактерій, лістерій та кандід, що визначає їх перспективність в плані подальшого використання для створення протимікробних засобів певної спрямованості дії. Виявлено сполуки, що мають гальмуючий вплив на процеси формування та розповсюдження епісомних генетичних детермінант в бактерійній популяції, що доцільно використовувати для конструювання антисептиків і дезінфектантів.

Особистий внесок здобувача. Особисто здобувачем визначено спектр та рівні протимікробної дії нових хімічних сполук та препаратів порівняння, вивчено вплив на синтез макромолекул в клітинах грампозитивних та грамнегативних мікроорганізмів, виконані дослідження щодо формування стійких до хіміотерапевтичних препаратів та похідних акридину і фенантридину варіантів мікроорганізмів. Самостійно визначено вплив на процеси елімінації плазмідних факторів резистентності та їх фагову трансдукцію. Особисто виконані токсикологічні експерименти, означені кумулятивні ефекти, подразнююча дія. Сполуки синтезовані та охарактеризовані хіміками-синтетиками Шинкоренко С.В.( кафедра органічної хімії Буковинського державного університету ім. Ю.Федьковича) та Мельнік М.В. (кафедра органiчної хімії Iвано-Франкiвського інституту нафти і газу). Рівні чутливості похідних акридину щодо мікробів І-ІІ груп небезпечності виконані Петровим М.О. (лабораторія протимікробних засобів Іркутського протичумного інституту Сибіру та Далекого Сходу, Росія). Плазмідний профіль штаму S.aureus 658 Penr визначено в лабораторії нових та маловивчених інфекцій IМI ім.I.I.Мечникова.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідались і обговорювались на міжнародних наукових конференціях: “Идеи И.И. Мечникова и развитие современного естествознания”, Харьков, 1995; “Актуальные вопросы борьбы с инфекционными заболеваниями”, Харьков, 1997; “Стратегія і тактика боротьби з інфекційними захворюваннями”, Харків, 2001; “Конференція молодих вчених”, ХДМУ,2002.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 7 наукових робіт, серед них 3 – статті в наукових фахових журналах.

Структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 124 сторінках, містить вступ, огляд літератури, розділ матеріалів і методів досліджень, три розділи власних досліджень з 10 рисунками і 24 таблицями, розділ аналізу і узагальнення здобутих результатів, висновки, список використаної літератури, який налічує 201 джерело.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі проаналізовано стан проблеми пошуку нових протимікробних сполук і викладено сутність мети та наукових завдань, які розв’язувались при виконанні дисертаційної роботи, обґрунтовано актуальність теми дисертації, визначено зв’язок роботи з державними науковими програмами і темами, розкрито наукову новизну і практичне значення здобутих результатів, апробацію результатів дисертації, вказано її обсяг і структуру.

У першому розділі подано огляд літератури, в якому стисло викладено і проаналізовано відомості що до основних напрямків фармакологічного скринингу в рядах похідних акридину та фенантридину, їх протимікробної активності, механізмів реалізації біологічних ефектів відомих похідних акридину, пов’язаних з їх тропністю до ДНК. Крім того висвітлено деякі проблеми, пов’язані із резистентністю патогенної та умовно-патогенної мікрофлори до дії антибактерійних препаратів, існуючі напрямки їх вирішення. Доведено доцільність і перспективність пошуку нових високоефективних протимікробних сполук серед похідних акридину та фенантридину.

Матеріали, методи і обсяг досліджень наведено у другому розділі. Основний обсяг робіт виконано в лабораторії протимікробних засобів Інституту мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова та на кафедрі клінічної мікробіології та імунології ХМАПО на протязі 1993-2002рр.. Сполуки синтезовані та охарактеризовані хіміками-синтетиками С.В.Шинкоренко (кафедра органічної хімії Буковинського державного університету ім. Ю.Федьковича) та Мельнік М.В. (кафедра органiчної хімії Iвано-Франкiвського інституту нафти і газу) належать до наступних груп:

? хлорвміщуючі четвертинні солі акридину із залишком диметилетилену;

? четвертинні солі n-диметиламінобензилиденоксотетрагідроакридину;

? фенілгідразони четвертинних солей оксотетрагідроакридину;

? четвертинні солі тетрагідрофенантридину;

? четвертинні солі оксотетрагідрофенантридину;

? четвертинні солі n-диметиламінобензилиденоксотетрагідрофенантридину;

? четвертинні солі n-диметиламінофенилімінотетрагідрофенантридину;

? фенілгідразони четвертинних солей тетрагідрофенантридину.

Означені речовини являють собою дрібнокристалічні порошки з високою температурою плавлення (80-264оС), будову їх підтверджено даними елементного аналізу, мас-спектрометрії, ультрафіолетового, інфрачервоного та видимих спектрів. В якості препаратів порівняння використані: відомі антисептики (похідні четвертинного амонію) – декаметоксин (декаметилен – 1-10-біс/ N-диметил-карбментоксіметиламоній/дихлорид), декамін та етоній; антибіотики – бензилпеніцилін, ампіцилін, ТМП/СМК, еритроміцин кларитроміцин, гентаміцин, канаміцин, офлоксацин, ципрофлоксацин, руфлоксацин, ванкоміцин, тейкопланін, тетрациклін, блеоміцин; похідні акридину – дезінфектант риванол (2-етокси-6,9-діамінопохідне акридину), 3,6-діамінопохідні акридину – акрифлавін та акридин №38 (?-(9-акридил)-?-аланін-діхлоргідрат).

Протимікробна активність сполук щодо еталонних та клінічних штамів мікроорганізмів 4,5,17-20 груп, трьох сімейств та 90 родів вивчена відповідно методології і методів, яки відповідають вимогам Державного науково-експертного центру лікарських засобів МОЗ України (1995) щодо експериментального вивчення протимікробних препаратів. Стандартизація та врахування результатів виконувалися у відповідності з вимогами Наказу МЗСРСР №535 от 22.04.1985 “Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений”.

Вплив сполук на синтез макромолекул вивчалося радіоізотопним методом із використанням 14C- валіну, 14C- урацилу , 14C – тиміну. Швидкість формування резистентності вивчалася шляхом багаторазових пасажів культур мікроорганізмів на поживних середовищах із зростаючими концентраціями антибактерійних сполук. Вплив на епісомні генетичні фактори досліджувався на штамі S.aureus 658 Penr, плазмідний профіль якого визначено в лабораторії нових та маловивчених інфекцій IМI ім.I.I.Мечникова. Здатність сполук потенціювати процеси елімінації плазмідних факторів оцінювався по ступеню втрати ознаки, що кодується епісомною ДНК (а саме резистентність до пеніциліну) після інкубації в присутності суббактеріостатичних концентрацій досліджуваних речовин. Вплив на феномен фагової трансдукції епісомних факторів резистентності оцінювали на основі показників, що характеризують розмір частини популяції, що надбала вказану ознаку: частоту трансдукції (кількість трансдуктантів на одну фагову частку лізату), частоту трансдуктантів (кількість трансдуктантів на одну колонієутворюючу одиницю реципієнтного штаму), ступень трансдукції (відсоткове співвідношення частоти трансдукції при використанні досліджуваної сполуки до частоти трансдукції без додання препаратів в певній серії дослідів, прийнятої за 100%). Середні величини ступеню трансдукції статистично зіставляли із середньою ступінню трансдукції у контролі.

При визначенні гострої токсичності визначали максимально переносні дози (МПД), LD, LD5, LD9. Розрахунок параметрів токсичності (летальні дози та їх довірчі межі) робили за допомогою метода пробіт-аналізу Litchfield, Wilcoxon, описаного Біленьким М.Л., (1963). Кумулятивні властивості та зворотність токсичного ефекту вивчалися за методикою Саноцького Н.В., Уланової Н.П. (1995). Подразнюючу дію визначали за уніфікованою методикою О.О.Ієвлевої (1974). Тварини одержані з віварію Інституту мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова. Добір тварин і заплановані дослідження проведено згідно з Міжнародними рекомендаціями щодо проведення медико-біологічних досліджень з використанням тварин (Хроніка ВОЗ, 1985).

Результати експериментів проаналізовано за допомогою методів статистичної обробки за Урбахом В.Ю.,1963; Біленьким М.Л.,1963; Рокицьким П.В. , 1967 та з використанням стандартного програмного забезпечення “XL”.

Результати власних досліджень наведено у 3-му – 5-му розділах.

У третьому розділі наведено дані попереднього скринингу речовин нового синтезу,– охарактеризовано активність 74 похідних акридину та фенантридину щодо стандартного набору референтних штамів грампозитивних і грамнегативних тест-культур мікробів, яки представляють основні групи збудників інфекційних і гнійно-запальних захворювань. Встановлено, що активність похідних акридину та фенантридину по відношенню до стафілококів знаходилась у межах 0,065-31,2 мкг/мл, кишкової палички і псевдомонад 62,5-1000 мкг/мл, протею - 31,2-1000 мкг/мл, кандід – 0,5-62,5 мкг/мл. Для характеристики розподілу активності було умовно визначено три рівня останньої. Перший рівень активності у відношенні стафілококів прийнято МЗК?3,9 мкг/мл, кандід МЗК ? 7,8 мкг/мл, Гр- мікроорганізмів МЗК ? 15,6 мкг/мл; межі другого рівня: для стафілококів 3,9-15,6 мкг/мл, для кандід 7,8– 31,2 мкг/мл, для Гр- мікроорганізмів – 15,6 –62,5 мкг/мл. Речовини, МЗК яких виходить за межі другого рівня, вважалися неактивними.

Всі досліджувані групи містять сполуки, високоактивні у відношенні стафілококу. Найбільший відсоток (80 – 100%) речовин з активністю першого рівня спостерігався серед четвертинних солей акридину із залишком диметилетилену, четвертинних солей n-диметил-амінобензиліденоксотетрагідроакридину, n-диметиламінобензиліденоксотетрагідрофенантри-дину та четвертинних солей n-диметиламінофенілімінотетрагідрофенантридину. Інші групи містять від 11 до 44% сполук з МЗК ? 3,9 мкг/мл.

По відношенні до E.coli більшість сполук виявила активність на другому рівні (15,6-31,2 мкг/мл). Виняток складають похідні четвертинних солей тетрагідрофенантридину, серед яких не виявилося жодної активної речовини.

По відношенню до Proteus vulgaris більшість речовин відзначалась індиферентністю, виняток складають четвертинні солі n-диметиламінобензиліденоксотетрагідроакридину, 60% яких виявилися активними в концентраціях 31,2-62,4 мкг/мл та одне з похідних фенілгідразонів четвертинних солей оксотетрагідроакридину, МЗК якої у відношенні до даного мікроорганізму складає 62,4 мкг/мл.

Найнижчий рівень активності похідних акридину та фенантридину спостерігався по відношенню до P.aeruginosa, – лише дві сполуки, що належали до четвертинних солей n-диметиламінобензиліденоксотетрагідроакридину були активними в концентрації 62,4 мкг/мл.

В більшості з досліджуваних груп похідних виявлено речовини, високоактивнi у відношенні дріжджеподібного гриба Candida albicans. Найбільший відсоток сполук з активністю першого рівня мали хлорвміщуючі похідні четвертинних солей акридину із залишком диметилетилену, при цьому висока активність речовин у відношенні C.albicans та S.aureus у більшості випадків співпадала.

Охарактеризовано спектр протимікробної активності щодо еталонних та клінічних штамів мікроорганізмів 4,5,17-20 груп, трьох сімейств та 90 родів найбільш перспективних, на наш погляд, сполук 11, 15, 26, 55, 56, 72 (таб.1).

Для грамнегативних аеробів та мікроаерофільних паличок і коків, факультативно анаеробних грамнегативних паличок 4-5-ї груп активність досліджуваних сполук невисока: їх МЗК, в більшості випадків, складають 125-500 мкг/мл, а для деяких клінічних штамів P.aeruginosa цей показник сягав 1000 мкг/мл. Певний виняток складають мікроорганізми роду Neisseria, окремі представники якого виявилися чутливими до хлорвміщуючого похідного акридину (сполука 11), четвертинної солі парадиметиламінобензиліденоксотетрагідро-акридину (сполука 15) та четвертинних солей парадиметиламінобензиліденоксотетрагідро-фенантридину (сполуки 55,56) в концентраціях 3,9-15,6 мкг/мл. Представники роду Brucella були чутливі до впливу речовин в концентрацях 50-100 мкг/мл; у мікроорганізмів роду Bordetella та Rachnella дещо більш високий рівень чутливості спостерігався до фенілгідразонів четвертинних солей акридину та фенантридину (15,6-31,2 мкг/мл), але значно активнішим в обох випадках був декаметоксин, його МЗК у відношенні бордетел складала 0,25-7,8 мкг/мл, у відношенні R.аquatilis – 3,9 мкг/мл.

Активність досліджуваних сполук у відношенні грампозитивної мікрофлори, як і в більшості похідних хінолінового ряду, значно вище. Представники родів Mіcrococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Listeria, Corynebacterium виявили чутливість до дії обраних похідних в діапазоні доз 0,065-15,6 мкг/мл. Висока чутливість St.aureus (МЗК 0,065-3,9 мкг/мл) до дії обраних речовин, що була визначена ще в ході первинного скринингу, підтверджена результатами дослідження 79 клінічних (у тому числі 57 полірезистентних, тобто

Таблица 1 Антибактерійна та антикандидозна активність похідних акридину та фенантридину

Мікроорганізми | Кіль-кість штамів | Назва антисептика , шифр сполуки

Декаме-токсин | 11 | 15 | 26 | 55 | 56 | 72

Мінімальна концентрация що пригнічує ріст мікроорганизмів (МЗК) мкг/мл

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9

Brucella melitensis ATCC 23448 | 1 | 20,5 | 62,5 | 67,0 | 51,0 | 60,0 | 57,0 | 100,0

Вrucella abortus 564 | 1 | 25,5 | 68,0 | 50,0 | 50,0 | 61,0 | 58,0 | 86,5

Bordetella bronсhiseptica 214 | 1 | 3,9 | 62,5 | 62,5 | 15,6 | 62,5 | 62,5 | 15,6

Bordetella pertussis | 11 | 0,25-7,8 | 62,5-125,0 | 31,2-125,0 | 15,6-31,2 | 31,2-125 | 31,2-125 | 15,6-31,2

Neisseria subflava ATCC 14799 | 1 | 3,9 | 3,9 | 7,8 | 15,6 | 3,9 | 3,9 | 31,2

Neisseria gonorhoeae 1-В | 1 | 7,8 | 7,8 | 15,6 | 15,6 | 7,8 | 7,8 | 15,6

Neisseria meningitidis | 12 | 3,9-15,6 | 3,9-15,6 | 3,9-7,8 | 7,8-31,2 | 3,9-15,6 | 3,9-15,6 | 15,6-62,4

R. aquatilis 1-94 | 1 | 3,9 | 31,2 | 62,5 | 15,6 | 62,5 | 62,5 | 15,6

Micrococcus luteus | 13 | 1,0-15,6 | 3,9-7,8 | 3,9- 7,8 | 3,9- 7,8 | 1,0-3,9 | 1,0-3,9 | 3,9-7,8

Staphylococcus aureus | 82 | 0,12-15,6 | 0,5-3,9 | 1,0-3,9 | 1,0-3,9 | 0,12-1,0 | 0,25-1,0 | 1,0-3,9

Streptococcus pyogenes | 9 | 1,0-15,6 | 0,5-3,9 | 1,0-3,9 | 1,0-7,8 | 0,12-3,9 | 0,25-1,0 | 3,9-7,8

Streptococcus pneumoniae | 2 | 1,0-2,0 | 1,0-2,0 | 1,0-2,0 | 3,9-7,8 | 1,0-2,0 | 1,0-2,0 | 3,9-7,8

Streptococcus viridans | 6 | 3,9-15,6 | 0,5- 7,8 | 1,0-3,9 | 1,0- 7,8 | 0,12-3,9 | 0,25-7,8 | 1,0-7,8

Bacillus subtilis | 14 | 31,2 | 0,1-3,9 | 0,12-2,0 | 0,1-2,0 | 0,5-3,9 | 0,5-3,9 | 2,0-7,8

B. anthracis CTИ-325 (вегетативна форма) | 1 | 3,9 | 7,8 | 0,5 | 3,9 | 7,8 | 7,8 | 15,6

B. anthracis CTИ-325 (спорова форма) | 1 | 3,9 | 15,6 | 7,8 | 15,6 | 250,0 | 250,0 | 500,0

Listeria ivanovii | 42 | 0,5-1,0 | 3,9-15,6 | 3,9-7,8 | 3,9-5,0 | 7,8-15,6 | 7,8-15,6 | 7,8-31,2

Listeria monocytogenes | 75 | 0,25-1,0 | 3,9-7,8 | 3,9-15,6 | 3,9-7,8 | 7,8-31,2 | 7,8-31,2 | 7,8-31,2

Corynebacterium diphtheriae | 131 | 0,12-7,8 | 0,2-7,8 | 1,0-7,8 | 1,0-7,8 | 0,5-7,8 | 0,5-7,8 | 3,9-15,6

Candida albicans | 42 | 31,2-62,5 | 0,5-2,0 | 2,0-3,9 | 2,0-3,9 | 15,6-31,2 | 31,2-62,5 | 1,0-3,9

Candida parapsilosis 488\10 | 1 | 31,2 | 1,0 | 1,0 | 2,0 | 31,2 | 62,5 | 3,9

Candida tropicalis 3-г | 1 | 62,5 | 1,0 | 3,9 | 3,9 | 31,2 | 62,5 | 3,9

Candida kefyr 9-г | 1 | 31,2 | 0,5 | 2,0 | 3,9 | 31,2 | 31,2 | 3,9

Candida sp. 4-г | 1 | 31,2 | 1,0 | 2,0 | 2,0 | 31,2 | 62,5 | 3,9

таких, що мали стійкість до 3 або більше антибіотиків) штамів. Досить переконливий рівень активності у відношенні стафілококів був властивий похідним фенантридину: всі досліджені культури були чутливи до їх впливу в діапазоні концентрацій 0,065-1,0 мкг/мл.

Досить висока активність досліджуваних сполук у відношенні грампозитивних паличок. МЗК для мікроорганізмів роду Bacillus знаходиться на рівні 0,5- 31,2 мкг/мл. Певний інтерес викликає висока активність похідних парадиметиламінобензиліденоксотетра-гідроакридину та фенілгідразону четвертинної солі оксотетрагідроакридину у відношенні вегетативної форми вакцинного штаму B.anthracis СТИ-235 (МЗК 0,5 та 3,9 мкг/мл відповідно), спорова форма була чутлива до їх впливу в дозах 15,6 та 62,5мкг/мл, відповідно. Для лістерій МЗК більшості похідних акридину належала до діапазону 3,9-15,6 мкг/мл, похідні акридину, серед яких найвищі показники мала сполука 26 (фенілгідразон четвертинної солі оксотетрагідроакридину), для похідних фенантридину цей показник складав - 7,8-31,2 мкг/мл.

Поряд з високою активністю у відношенні стафілококів і лістерій, найбільше практичне значення має досить висока чутливість патогенних стрептококів (таких як S.pyogenes, S.pneumoniae, S.viridans), і коринебактерій (зокрема С.diphtheriae). По відношенню до стрептококів МЗК більшості досліджуваних речовин (за винятком фенілгідразонів) знаходилась в межах 0,5-3,9 мкг/мл, а четвертинні солі парадиметиламінобензиліденоксотетрагідрофенантридину (сполуки 55 та 56) були активні в концентраціях 0,12-1,0 мкг/мл. МЗК усіх сполук у відношенні референтних штамів коринебактерій належить до інтервалу 0,12-7,8 мкг/мл, серед 120 клінічних штамів (67 біовару mitis, 53 біовару gravis), виділених на території України за 1992-1999 рр., виявилися чутливими 78,3- 94,2% (МЗК ? 5,0 мкг/мл). Найбільш активними були сполуки 15 та 72.

Виявлена в ході первинного скринингу антикандидозна активність була підтверджена при дослідженні 41 клінічного штаму C.albicans і 4-х референтних штамів інших дріжджеподібних грибів (C.parapsilosis 488\10, C.tropicalis 3-г, C.kefyr 9-г, Candida sp. 4-г). Більш активними виявилися похідні, зокрема хлорвміщуюче похідне акридину з залишком диметилетилену (сполука 11), МЗК якого для жодної з досліджуваних культур дріжджеподібних грибів не перевищувала 2,0 мкг/мл. Активність похідних фенантридину , за винятком фенілгідразона четвертинної солі тетрагідрофенантридину (сполуки 72) була значно нижче (МЗК похідних парадиметиламінобензиліденоксотетрагідрофенантридину у більшості випадків складала 31,2 мкг/мл).

У четвертому розділі наведено дані, що стосуються питань впливу досліджуваних речовин на адаптаційні процеси в бактерійних популяціях.

При визначенні впливу окремих речовин на синтез макромолекул в бактеріальній клітині встановлено, що сполука 15 (четвертинна сіль парадиметиламінобензиліден-оксотетрагідроакридину) в бактеріостатичних концентраціях пригнічує процеси синтезу ДНК та РНК в культурах стафілококу та кишкової палички, практично не впливає на процеси білкового синтезу та не пошкоджує клітинну стінку бактерій. Сполука 55 (четвертина сіль n-диметиламінобензиліденоксотетрагидрофенантридину), незважаючи на структурну схожість зі сполукою 15, на синтез нуклеїнових кислот не впливала.

В умовах in vitro при багаторазових пересівах тест-культур на середовищах із зростаючими концентраціями речовин визначена швидкість формування стійкості до сполук 11, 15, 20, 55 і 72 в культурах стафілококу та кишкової палички. Крім того, вивчено вплив на швидкість формування стійкості до пеніциліну, гентаміцину та канаміцину в культурах стафілококу та кишкової палички.

Динаміка розвитку резистентності в культурах Staphylococcus aureus 209P і Esherihia coli 316 свідчить про досить повільне пристосування бактерійних популяцій до дії досліджуваних речовин. В культурі стафілококу спостерігалося зниження чутливості до більшості сполук в 2-4 рази на протязі перших 10 пасажів, та в 16-64 рази на протязі наступних 20, а до сполуки 26 на протязі 30 пересівів збереглася чутливість на рівні, що лише в 8 разів перебільшував вихідний. Чутливість кишкової палички знижувалася ще повільніше, – в 1,5-2, 2-4 і 8-16 разів після 10,20 і 30 пересівів відповідно. Кінцеві рівні стійкості в обох культурах були значно (на 2 - 3 порядки) нижчі, ніж у препаратів порівняння. При визначенні впливу на адаптаційні можливості популяції в умовах впливу інших антибактерійних агентів спостерігалося суттєве гальмування процесу формування резистентності в культурі E.coli до аміноглікозидів у присутності похідних n-диметил-амінобензиліденоксотетрагідроакридину й фенілгідразону тетрагідроакридину (сполуки 15, 20, 30). Похідні фенантридину на цей процес не впливали.

При визначенні впливу на екстрахромосомні генетичні детермінанти резистентності в бактерійних популяціях (а саме, здатності ініціювати елімінацію плазмідних факторів та пригнічувати їх фагову трансдукцію) продемонстровано, що ці властивості у досліджуваних похідних помірно виражені, не корелюють з їх антибактерійною активністю та є, скоріше функцією дози речовини. Присутність сполук 20 та 32 в концентраціях 50-100 мкг/мл достовірно (P<0,05; P<0,01) в 6-14 разів підвищувало процент елімінації пеніциліназних плазмід в культурі S.aureus та блокувало процес їх фагової трансдукції. Присутність цих речовин в концентраціях 25,0 ? 5,0 мкг/мл достовірно знижувало частоту трансдукції до 0,89-59,3 % від рівню контролю.

У п’ятому розділі наведено результати дослідження гострої та хронічної токсичності окремих похідних акридину та фенантридину в експерименті на тваринах. Доведено, що

Таблиця 4.4

Вплив похідних акридину та фенантридину на фагову трансдукцію пеніциліназної плазміди в культурі S. aureus

Шифр сполу-ки | Концен-трація

(мкг/мл) | Частота трансдукції* | Частота трансдуктантів** | Середня ступінь трансдукції (в %)

I серія | II серія | III серія | I серія | II серія | III серія | I серія | II серія | III серія | СтЇ | t | P

20 | 50,0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | - | -

25,0 | 4,3·10-75,1·10-76,4·10-70,02·10-80,02·10-80,02·10-81,54 | 1,16 | 0,79 | 1,2 | 5,74 | < 0,001

10,0 | 0,8·10-61,4·10-62,8·10-6 | 0,03·10-70,05·10-70,10·10-72,86 | 3,18 | 3,46 | 3,2 | 4,02 | < 0,001

5,0 | 1,2·10-53,1·10-56,5·10-50,50·10-61,00·10-62,24·10-642,84 | 70,47 | 80,25 | 64,5 | 1,72 | < 0,1

0,5 | 2,3·10-54,3·10-58·10-50,96·10-61,39·10-62,76·10-682,06 | 97,75 | 98,77 | 92,9 | 1,21> 0,1

26 | 0,5 | 1,3·10-52,9·10-53,9·10-50,54·10-60,94·10-61,34·10-646,38 | 65,93 | 48,15 | 53,5 | 1,91 | < 0,1

0,25 | 2,6·10-54,1·10-58,2·10-51,08·10-61,32·10-62,83·10-692,83 | 93,18 | 101,24 | 95,8 | 1,11< 0,5

32 | 50,0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 0 | 0 | 0 | ––

25,0 | 2,5·10-76,1·10-77,5·10-7 | 1·10-82·10-83·10-80,89 | 1,39 | 0,19 | 0,8 | 6,69 | < 0,001

10,0 | 6,9·10-69,9·10-61,2·10-52,5·10-73,2·10-74,2·10-72,12 | 2,25 | 2,72 | 2,4 | 5,24 | < 0,001

5,0 | 1,1·10-52,1·10-54,8·10-54,6·10-76,8·10-71,66·10-739,27 | 47,74 | 59,26 | 48,8 | 1,97 | < 0,05

0,5 | 2,7·10-54,3·10-58·10-51,13·10-61,39·10-62,76·10-696,40 | 97,75 | 98,77 | 97,6 | 1,07> 0,1

Акридин № 38 | 50,0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0  | 0 | 0 | 0 | 0-–-

25,0 | 0 | 0 | 1·10-70 | 0 | 0,3·10-80 | 0 | 0,12 | 0,04 | 9,39< 0,0001

10,0 | 0 | 2·10-71,7·10-60 | 0,65·10-85,8·10-80 | 0,45 | 2,1 | 0,8 | 6,70 | < 0,001

5,0 | 7·10-71,3·10-63,4·10-63·10-84·10-81,2·10-72,50 | 2,96 | 4,20 | 3,2 | 4,03 | < 0,001

1,0 | 9,6·10-61,7·10-53,7·10-54·10-75,5·10-71,28·10-634,28 | 38,65 | 45,68 | 39,5 | 3,87 | < 0,05

0,5 | 2,7·10-53,6·10-57,4·10-51,13·10-6 | 1,16·10-62,55·10-696,33 | 81,84 | 91,36 | 89,8 | 1,62> 0,1

Кон-троль | - | 2,8·10-54,4·10-58,1·10-51,17·10-61,42·10-62,79·10-6100 | 100 | 100 | – | –

* В I та II серії дослідів титр фага складав 10 –7 , в III - 10 –6

** В I серії кількість колонієутворюючих одиниць (КУО) реципиієнтного штаму –2,4? 10 8 в 1 мл, в II серії – 3,1? 10 8 ,

в III серии – 2,9? 10 8 в 1 мл.

більш високий рівень токсичності виявили похідні фенантридину (сполуки 32, 55 та 72), для яких характерні досить високі показники кумулятивності при парентеральному шляху введення та наявність подразнюючої дії. Найтоксичнішим виявився 2-2-диметіл-4-оксо-6-арил-1,2,3,4,-тетрагидробензо-[c]-фенантридин (сполука 55), – її LD10 при внутрішньовенному введенні складає 56 мг/кг, LD50 –150 мг/кг, коефіцієнт кумуляції –1,2-2,25, подразнююча дія на слизові оболонки та шкіру виникає після 1-2 кратного застосування в 1% концентрації. Узагальнюючи результати дослідження гострої і хронічної токсичності, враховуючи рівні кумулятивності та зворотність токсичних ефектів, більшість досліджених сполук слід віднести до помірно токсичних (IV-V клас шкідливих речовин згідно з класифікацією Заугольникова С.Д.)

ВИСНОВКИ

1. Первинний мікробіологічний скринінг 74 речовин нового синтезу в рядах похідних акридину і фенантридину дозволив виявити перспективні сполуки з високим рівнем антибактерійної і антикандидозної активності.

2. Визначення спектру протимікробної дії обраних речовин у відношенні широкого кола збудників інфекційних та гнійно-запальних захворювань в умовах in vitro свідчить про перспективність їх подальшого використання для створення нових протимікробних препаратів, ефективних у відношенні цілого ряду клінічно значущих та епідеміологічно-актуальних патогенних видів мікроорганізмів.

3. Похідні акридину та фенантридину в умовах in vitro характеризуються повільністю процесів формування до них резистентності та депресивним впливом на адаптаційні можливості бактерійної популяції: за певних умов знижують швидкість формування стійких до хіміотерапевтичних препаратів варіантів збудників інфекційних та гнійно-запальних захворювань, сприяють елімінації плазмідних факторів резистентності та пригнічують їх фагову трансдукцію.

4. Результати дослідження параметрів токсичності, ефектів кумуляції, подразнюючої та сенсибілізуючої дії, дозволяють віднести більшість похідних акридину та фенантридину до IV-V класу токсичних речовин.

5. Спектр протимікробної активності, низька швидкість формування резистентних варіантів мікроорганізмів, депресивний вплив на деяки ланки адаптаційних процесів, в сукупності з помірною токсичністю та низькою кумулятивністю, дозволяють рахувати за доцільне розробку лікарських форм сполук 11 та 15.

Перелік публікацій ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Крестецька С.Л., Драч М.I., Муамар Ківан Ахмед. Спектр антимікробної активності гетероциклічних сполук нового синтезую. //Вісник Вінницького державного медичного університету.- 2002.- №2.- С.297-298.

2. Крестецкая С.Л. Антифагова активність нових похідних акридину та фенантридину //Буковинський медичний вісник.- 2002.- Т.6, №4 – С.183-185.

3. Волянский Ю.Л., Крестецкая С.Л. Перспективы создания противомикробных препаратов на основе производных акридина и фенантридина (обзор литературы) //Вісник наукових дослиджень. – 2002. - №4. – С.5-8.

4. Крестецкая С.Л. Влияние производных акридина и фенантридина на элиминацию пенициллиназных плазмид в культуре S.aureus //Анали Мечниковського інституту, 2001.- №1.-С.7-9.

5. Вивчення біологічних властивостей стафілококів, виділених від медичного персоналу пологових будинків м.Харкова .Стегній Т.П., Зуб Л.І., Крестецька С.Л., Кучма І.Ю.//Тези доповідей ч.І:ХІІ Український республіканський з’їзд мікробіологів, епідеміологів і паразитологів. Харків-Київ, 25-27 вересня, 1991р..

6. Крестецкая С.Л. Противомикробная активность четвертичных солей парадиметиламино-бензилиденоксотетрагидроакридина //Мат.м/н конф., посвященной 150-летию содня рождения И.И.Мечникова и 100-летию со дня рождения В.М.Жаботинского. Харьков, 28-30 ноября 1995 г..- С.171.

7. Крестецкая С.Л. Чувствительность дрожжеподобных грибов рода Candida к новым производным акридина и фенантридина //Тез.конф. молодых ученых (ХМУ), Харьков, 23-25 декабря,2002.- С.79.

АНОТАЦIЯ

Крестецька С.Л. Протимікробна активність і фармакологічні ефекти четвертинних солей акридину та фенантридину. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Iнститут мікробіології і імунології ім I.I.Мечникова АМН України, Харків, 2003.

Дисертація присвячена проблемі пошуку нових протимікробних сполук та визначенню перспективності певних напрямків синтезу в рядах похідних акридину та фенантридину. Проведено мікробіологічний скрининг 74 нових хімічних сполук, виявлено речовини високоактивні у відношенні мікроорганізмів родів Neisseria, Micrococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Listeria, Corynebacterium та широкого кола дріжджеподібних грибів роду Candida. Вивчено вплив на процеси, пов’язані з формуванням та розповсюдженням резистентності до ліків в бактерійній популяції, досліджено токсичність, ефекти кумуляції та подразнюючу дію найбільш активних речовин.

Ключові слова: похідні акридину та фенантридину, антимікробні препарати, протимікробна активність, токсичність, резистентність, плазміди.

АННОТАЦИЯ

Крестецкая С.Л. Противомикробная активность и фармакологические эффекты производных акридина и фенантридина.- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 03.00.07 – микробиология. – Институт микробиологии и иммунологшш им. И.И.Мечникова АМН Украины , Харьков, 2002.

Диссертационная работа посвящена проблеме борьбы с инфекционными и гнойно-воспалительными заболеваниями и поиску новых эффективных противомикробных средств. Целью работы является микробиологическое обоснование целесообразности разработки новых профилактических и лечебных препаратов антибактериальной направленности на основе соединений нового синтеза в рядах акридина и фенантридина. Первичный микробиологический скрининг проведен на пяти тест культурах микроорганизмов, представляющих наиболее распространенные категории возбудителей инфекционных и гнойно-воспалительных заболеваний. Для наиболее активных соединений проведена углубленная оценка спектра антибактериального действия, определены параметры токсичности и кумулятивности. Изучено влияние отдельных соединений на процесс формирования резистентности в бактериальных популяциях, воздействие на эписомные генетические детерминанты и их фаговую трансдукцию. Спектр противомикробной активности изученных соединений включает клинически значимые и эпидемиологически актуальные бактерии родов Neisseria, Micrococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Listeria, Corynebacterium дрожжеподобные грибы рода Candida. В опытах in vitro продемонстрирована способность ряда соединений снижать скорость формирования резистентности микроорганизмов к антибиотикам, инициировать процессы элиминации плазмидных факторов резистентности и препятствовать их фаговой трансдукции. Выявлены соединения, обладающие наряду с высоким уровнем противомикробного действия приемлемыми параметрами токсичности и являющиеся потенциально перспективными объектами для разработки на их основе новых противомикробных препаратов.

Ключевые слова: производные акридина и фенантридина, противомикробная активность, токсичность, лекарственная резистентность, плазмиды.

ANNOTATION

Krestetskaya S. Antimicrobial activity and pharmacological effect of acridine and phenantridine derivatives. - Manuscript.

Thesis for scientific degree of candidate of medical sciences by specialty 03.00.07 - microbiology. Metchnicov Insitute of microbiology and immunology of Ukrainian MCA, Kharkiv, 2003.

Investigation is devoted to a new antimicrobial compounds search. Biological action of 74 new acridine and phenantridine derivatives has been characterized. It’d been found an agents with high activity to Neisseria, Micrococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Listeria, Corynebacterium and yeast-like fungi Candida. In addition it was study an ability of single substance to influence on episomal genetic elements circulation. It was shown the action in respect to the transducing particles of donor lysate of some paradimethilaminobenziliden-oxotetrahidroacridine and tetrahydrophenantridine derivatives. It had been studied the speed of drug resistance forming, toxity and cumulating effects in potential antimicrobial remedies.

Kay words: acridine and phenantridine derivatives, drug resistance, plasmides, antimicrobial compounds, antimicrobial activity, toxicity.