АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕПІДЕМІОЛОГІЇ ТА ІНФЕКЦІЙНИХ ХВОРОБ ім. Л.В. ГРОМАШЕВСЬКОГО

КОБРИН ТЕТЯНА ІВАНІВНА

УДК 616.36-002.17-07: 362.147

ХРОНІЧНА HС - ВІРУСНА ІНФЕКЦІЯ: ОСОБЛИВОСТІ ДІАГНОСТИКИ ТА ДИСПАНСЕРНОГО СПОСТЕРЕЖЕННЯ В АМБУЛАТОРНО-ПОЛІКЛІНІЧНИХ УМОВАХ

14.01.13 – інфекційні хвороби

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ - 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Львівському державному медичному університеті імені Данила Галицького МОЗ України

Науковий керівник:

доктор медичних наук, професор СКЛЯРОВ ЄВГЕН ЯКОВИЧ, завідувач кафедри поліклінічної справи Львівського державного медичного університету імені Данила Галицького.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор ВОВК АЛЛА ДМИТРІВНА, Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України, завідувач відділу вірусних гепатитів і СНІДу;

доктор медичних наук, професор НІКІТІН ЄВГЕН ВАСИЛЬОВИЧ, Одеський державний медичний університет, професор кафедри інфекційних хвороб.

Провідна установа: Івано-Франківська державна медична академія МОЗ України

Захист відбудеться “ 30 ” вересня 2003 р. о 11 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.614.01 при Інституті епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В.Громашевського АМН України за адресою:

01015, м. Київ, вул. Січневого повстання, 23

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України (03038, м. Київ, узвіз Протасів Яр, 4)

Автореферат розісланий 25.08. 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат медичних наук В.В. Кононенко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Вірусом гепатиту С (HCV) у світі інфіковано близько 3% популяції NIH Consensus 2002), частка анти-HCV позитивних донорів крові в Україні становить 2,3%, відсоток, характерний для регіонів з високим рівнем інфікованості вірусом гепатиту С (Марієвський В.Ф., 1998; Шахгільдян І.В., 1998; Гураль А.Л., 2001; Naoumov N.V.).

Значна частота хронізації гострого гепатиту С (до 60-80%), належність вірусу гепатиту С до основних етіологічних факторів розвитку хронічного гепатиту, цирозу печінки та гепатоцелюлярної карциноми, низька ефективність етіотропної терапії та відсутність засобів специфічної профілактики обумовлює актуальність HCV-інфекції у сучасній гепатології (Возіанова Ж.І., 1997; Майер К.П., 1999; Шерлок Ш. та співавт., 1999; Андрейчин М.А., 2001; Marcellin P. et al., 1999; Di Bisceglie A.M., 2000; Alter M.J., 2002; Seeff.B., Hoofnagle.H., 2002).

Враховуючи результати епідеміологічних досліджень, що проводяться в Україні (Гураль А.Л., 2001; Мороз Л.В., 2001; Севальнев А.И., 2001), особливу увагу слід звернути на своєчасну діагностику HCV-інфекції в амбулаторних умовах, а також особливості динамічного спостереження за різними групами інфікованих осіб (Грищенко В.І., 2001; Мороз Л.В., 2001), оскільки система диспансерного нагляду при гепатиті С не регламентована інструктивними матеріалами, а тому часто відсутня. Поза увагою залишаються anti-HCV-позитивні особи без клінічних та біохімічних ознак патологічного процесу, у яких хвороба маніфестується через 5-10 років ознаками декомпенсованого цирозу печінки чи гепатоцелюлярного раку. Результати спостережень щодо тактики ведення хворих на ХГ С із нормальною активністю амінотрансфераз, проведені різними дослідниками є неоднозначними та часто суперечливими (Вовк А.Д., 1998; Громашевська Л.Л., Татьянко Н.В., 1998; Соринсон С.Н., 1999; Stanley A.J.et al., 1996; Persico M. et al., 2000; Garcia G. et al., 2001), що обумовлює доцільність вивчення епідеміологічних, біохімічних та імунологічних особливостей HCV_інфекції у хворих із нормальною та підвищеною активністю АлАТ, а також оцінку перебігу ХГ з різною клініко-біохімічною активністю за умов тривалого спостереження.

Розвиток патологічних змін в печінці при хронічній HCV-інфекції пов’язують саме з імунно-опосередкованим пошкодженням гепатоцитів (Вовк А.Д., Татьянко Н.В., 1998; Дикий Б.М., 1999; Барштейн Ю.А., Федорченко С.В., 2001; Козько В.Н., 2002; Маммаев С.Н., Лукина Е.А., 2002; Ferrari C. et al., 1999; Bertolino P. et al., 2000), тоді як питання прямої цитопатичної дії вірусу гепатиту С досі залишається відкритим (Чумак А.А., 2000; Cerny A. et al., 1999). Дослідження клітинної (субпопуляційного складу Т-лімфоцитів), гуморальної (визначення антитіл до структурних та неструктурних антигенів вірусу) імунної відповіді, взаємозв’язку між ними та вираженістю цитолізу при ХГ С та HCV-цирозі – залишається недостатньо вивченою ланкою патогенезу цієї патології.

Зважаючи на довготривалість, коштовність та побічні ефекти противірусної терапії (Горбаков В.В., 2000; Возіанова Ж.І., Корчинский Н.Ч., 2001; Poynard. et al., 1999), а також враховуючи низький рівень стійкої відповіді організму на лікування (Ивашкин В.Т., 1997; Iacono.Lo, 2000), особливої ваги набувають дослідження можливостей раннього прогнозування ефективності терапії (Мороз Л.В., 1999; Neumann A.U. et al., 1998; Civeira.P., 1999; Zeuzem S. et al., 2000; Hu.Q. et al., 2001). З іншого боку, сучасні уявлення про механізми елімінації інфікованих вірусами клітин (Галицький А.І., 2001; Barber.N., 2001; Orynchak., 2001) шляхом індукції апоптозу спричинили до з’ясування значення програмованої смерті клітин в звільненні організму від вірусу гепатиту С (Castelli J.C. et al., 1997; Patel T. et al., 1998). Таким чином, визначення ознак апоптозу HCV-інфікованих клітин у перші три тижні терапії інтерфероном дозволить спрогнозувати ефективність відповіді організму на лікування у хворих на ХГ С.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відповідності з планом науково-дослідних робіт Львівського державного медичного університету імені Данила Галицького і є фрагментом планової науково-дослідної роботи “Клініко-імунологічні особливості вірусних гепатитів з парентеральним шляхом передачі при їх одночасному перебігу”, шифр теми ІН.12.13.0001.99, номер державної реєстрації 0199U003674.

Мета дослідження. Вивчення особливостей імунопатогенезу та перебігу хронічного гепатиту С, HCV-цирозу печінки (за умов довготривалого спостереження), встановлення критеріїв та методики диспансерного нагляду різних груп інфікованих осіб в амбулаторно-поліклінічних умовах; вивчення механізмів індукції апоптозу в периферичних мононуклеарах крові хворих на ХГ С в динаміці терапії інтерфероном-альфа та їх взаємозв’язку із ефективністю противірусної терапії.

Завдання дослідження

1. На основі аналізу даних епідеміологічного анамнезу в anti-HCV-серопозитивних осіб з’ясувати основні групи ризику та шляхи інфікування вірусом гепатиту С з метою розробки та вдосконалення заходів неспецифічної профілактики інфекції.

2. Дослідити закономірності клініко-біохімічного перебігу різних форм HCV_інфекції в умовах тривалого (від 1 до 5 років) динамічного спостереження, на основі чого розробити критерії диспансерного нагляду за особами, інфікованими вірусом гепатиту С залежно від cтадії та активності вірусного процесу.

3. Оцінити зміни клітинної та гуморальної ланок імунної відповіді при різних формах хронічної HCV-інфекції, їх взаємозв’язок між собою та з біохімічною активністю хвороби.

4. Дослідити механізми регуляції апоптозу (рівень туморнекротичного фактора-альфа (ТНФ-альфа), розчинні форми рецепторів ТНФ-альфа, активацію каспаз у периферичних мононуклеарних клітинах крові, фрагментацію ДНК) до лікування та в початковій фазі інтерферонотерапії у хворих на ХГ С та їх зв’язок із ефективністю противірусної терапії.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше вивчено рівень ТНФ_альфа та розчинних форм його рецепторів в сироватці крові у хворих на ХГ С в динаміці інтерферонотерапії. Досліджено вплив препаратів ІФН-альфа на індукцію апоптозу в периферичних мононуклеарах крові (ПМКК) в хворих на ХГ С у початковій фазі лікування, визначено механізми, за участю яких здійснюється елімінація інфікованих вірусом клітин. Встановлено залежність між ефективністю противірусної терапії та наявністю ознак програмованої загибелі ПМКК у хворих на ХГ С.

Визначено групи та запропоновано схему диспансерного спостереження за окремими категоріями хворих із хронічною HCV-інфекцією, на основі вивчення морфофункціональних особливостей клітин та субпопуляційного складу лімфоцитів периферичної крові при ХГ С та HCV_обумовленому цирозі печінки встановлено залежність між окремим показниками імунної відповіді та клінічними варіантами перебігу хвороби.

Практичне значення та впровадження результатів роботи. Отримані результати дозволяють виділити основні групи ризику та шляхи передачі вірусу гепатиту С, що обумовлює необхідність впровадження заходів неспецифічної профілактики інфекції.

Розроблена схема активного кількаступеневого диспансерного нагляду за групами хворих на ХГ С із різними клінічними варіантами перебігу хронічної HCV-інфекції дозволяє вчасно виявляти клініко-біохімічну активацію інфекційного процесу і буде мати позитивний економічний ефект через запобігання прогресуванню хвороби та розвитку її ускладнень. Запропонована методика диспансерного спостереження запроваджена в клінічну практику 2-ої та 5-ої поліклінік м. Львова, поліклінічного відділення дорожної клінічної лікарні (м. Одеса). Теоретичні положення дисертації - механізми противірусної дії інтерферону-альфа впроваджено в навчальний процес кафедри поліклінічної справи та сімейної медицини Львівського державного медичного університету ім. Данила Галицького, кафедри сімейної медицини та поліклінічної терапії Луганського медичного університету.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем проаналізовано та узагальнено сучасний стан проблеми ХГ С, самостійно виконане клінічне та епідеміологічне обстеження хворих, опрацьовано історії хвороб та амбулаторні картки. При виконанні роботи автором освоєно та виконано основні методики досліджень: імуноферментний аналіз (ІФА), визначення субпопуляцій лімфоцитів за допомогою FACS-аналізатора, метод імуноблоту. Здобувачем проаналізовані дані лабораторних та інструментальних досліджень, створено базу даних, проведена статистична обробка отриманих результатів, розроблені таблиці та рисунки, сформульовані висновки та практичні рекомендації.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи викладені на Міжнародному Фальк-Симпозіумі (Львів, 25-28.10.1997 р.), на міжнародній конференції студентів та молодих вчених (Львів, 7-9.10.1999 р.), на 36-ому конгресі Європейської Асоціації з досліджень хвороб печінки (Прага, 18_.04.2001 р.), на 9-ому Об’єднаному європейському гастроентерологічному тижні (Амстердам, 6-10.10.2001 р.), на 52 конгресі Американської асоціації з досліджень хвороб печінки (Даллас, 23-26.11.2001 р.), на ІІ Львівсько-Люблінській конференції з експериментальної та клінічної біохімії (Люблін, 23-25.05.2002р.), на IV Всеукраїнській науково-практичній конференції “Новое в клинической фармакологии и фармакотерапии заболеваний внутренних органов” (Харків, 30_.05.2002 р.). Апробація дисертації проведена на спільному засіданні кафедр інфекційних хвороб, поліклінічної справи і сімейної медицини Львівського державного медичного університету ім. Данила Галицького МОЗ України та Львівського обласного науково-практичного товариства лікарів-інфекціоністів 17 квітня 2003 року.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 наукових праць, з них чотири у фахових наукових виданнях, що відповідають вимогам Вищої Атестаційної комісії України до публікацій основних результатів дисертацій.

Структура та об’єм дисертації. Робота викладена на 149 сторінках машинописного тексту, складається з вступу, огляду літератури, розділу клінічних та лабораторних методів дослідження, 3 розділів власних досліджень, підсумків досліджень та їх обговорення, висновків, практичних рекомендацій та списку літератури (249 найменувань). Робота ілюстрована 17 таблицями та 28 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Протягом 1997-2001 років обстежено 643 особи, більшість із яких (51,5 %) – хворі з клінічними та/або біохімічними ознаками гострої або хронічної печінкової патології, решта -312 осіб – практично здорові люди, в яких антитіла до вірусу гепатиту С було вперше виявлено при проведенні профілактичного медичного огляду. Серед обстежених антитіла до вірусу гепатиту С виявлено у 127 осіб. Основна кількість обстежених належала до вікової групи 18_років (69,4%), середній вік – 41,39±1,49 роки.

Маркери вірусних гепатитів В (HBsAg) та С: anti-HCV (сумарні) - для скринінгового дослідження, anti-HCVcor22, anti-HCVNS3,NS4,NS5, - для конфіматорного обстеження, а також anti-HCV IgM визначалися методом ІФА та імуноблоту за допомогою діагностичних систем виробництва “Deciscan HCV Plus” (Sanofi Diagnostics Pasteur) на базі лабораторії клінічної імунології Львівського НДІ патології крові та трансфузійної медицини, НВО “Диагностические системы” (Росія) лабораторії Львівського обласного діагностичного центру і “Вектор-Бест” (Росія) вірусологічної лабораторії інфекційної клінічної лікарні м. Львова. Оцінювалася напруженість (за величиною коефіцієнта оптичної густини) (М.И. Михайлов та співавт., 1997) та спрямованість (до окремих антигенних детермінант вірусу) антитільної відповіді. Діагноз встановлювався на основі класифікації хронічних гепатитів, прийнятої на Міжнародному конгресі гастроентерологів (1994 р., м. Лос-Анджелес, США), з урахуванням результатів епідеміологічних, клініко-біохімічних та інструментальних досліджень. На основі зазначених даних визначено наступні групи обстежених осіб: практично здорові люди, у яких виявлено антитіла до вірусу гепатиту С (n=15), хворі на гострий ВГ С (n=14), хворі на ХГ С (n=78), хворі на цироз печінки, спричинений вірусом гепатиту С (n=20).

Визначення в сироватці інфікованих вірусом гепатиту С лише антитіл до вірусу, на противагу до вірусного гепатиту В, де існує змога ідентифікувати антигени збудника, обумовила необхідність виділяти групу осіб (практично здорових людей), у яких присутність антитіл може бути або наслідком контакту із вірусом у минулому з наступною повною елімінацією збудника з організму, або таких, у яких можлива латентна персистенція вірусу. Зважаючи на це проводилося динамічне спостереження за окремими групами інфікованих осіб (хворі на ХГ С, ЦП, anti-HCV-серопозитивні особи) з частотою 2 рази на рік (огляд, біохімічне дослідження крові з визначенням концентрації загального білірубіну та фракцій, активності АлАТ та АсАТ, кількості загального білку та білкових фракцій, визначалася активність ЛФ та ГГТП, за показами - РНК вірусу гепатиту С (HCV_РНК) методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), за необхідністю, проводилася біопсія печінки), 1 раз на рік - УЗД органів черевної порожнини. У хворих на ХГ С з визначеною клініко-біохімічною (гістологічною в окремих випадках) активністю процесу з урахуванням показань та за відсутністю протипоказань до лікування призначалася противірусна терапія - монотерапія препаратами інтерферону-альфа (ІФН-альфа: “Віаферон”, “Лаферон”, “Intron A”).

Морфофункціональні показники клітин та субпопуляційний склад лімфоцитів периферичної крові визначалися у 52 хворих з хронічними формами інфекції (36 на ХГ С та 16 – на ЦП) за умов відсутності противірусної терапії на час обстеження та в анамнезі. Кількісні та морфологічні параметри клітин крові (середній об’єм еритроцитів та тромбоцитів, MCH- середній вміст гемоглобіну в еритроцитах, MCHC- середня концентрація гемоглобіну в еритроцитарній масі, PDW- процент відхилення тромбоцитів від нормального об’єму) визначали на гематологічному аналізаторі Coulter JT (США). Фенотипування мічених за допомогою моноклональних антитіл (CD3, CD4, CD8, CD3/16, CD16/56) клітин проводилося на проточному цитометрі FACScan (“Becton Dickinson”).

У дослідження також включено 23 хворих на ХГ С (генотип 1 a/b), які брали участь у проспективному дослідженні ефективності комбінованої терапії інтерфероном-a2b (“Intron A”, Schering-Plough) та рибавірином (“Rebetol”, Schering-Plough) на базі відділення гепатології клініки внутрішніх хвороб IV Віденського медичного університету, яке проводилося під керівництвом проф. P. Ferenci та проф. M.Radosavljevic. Дослідженням передбачалася наступна схема лікування: монотерапія ІФН-?2b (“Intron A”, Schering-Plough, США) протягом перших трьох тижнів (10 МО ІФН-? в першу добу, через 7 діб 5 МО ІФН-?2b щоденно або 180 мкг пегільованого ІФН-?2b (“Pegintron”) на тиждень з наступним (з 21-ої доби) комбінованим лікуванням (3 МО ІФН-?2b тричі на тиждень або 180 мкг пегільованого ІФН-?2b (“Pegintron”) 1 раз на тиждень та 1000-1200 мг рибавірину щоденно). Перед початком монотерапії (доба 0) та в початковій фазі лікування (до початку комбінованої терапії: 1, 7, 8, 11, 14, 21-а доба) проводилося вивчення динаміки HCV-віремії, визначення рівня ТНФ-альфа, розчинних форм його рецепторів (рТНФ РІ та РІІ), а також наявність ознак апоптозу (фрагментація ДНК, експресія каспаз-3, -8, -9) периферичних мононуклеарних клітин крові хворих. Контрольну групу склали 10 здорових осіб віком від 25 до 41 року (5 чол, 5 жін).

ТНФ-альфа та розчинні форми рецепторів ТНФ-альфа І та ІІ типів визначалися в сироватці крові хворих методом ІФА (“R&D Systems”, Abingdon, UK), кількість оліго- та мононуклеосом (фрагментація ДНК) в крові за допомогою тест-системи “Cell Death Detection ЕLISAPLUS” (ІФА) (“Roche Diagnostics GmbH”, Germany).

Виділення периферичних мононуклеарних клітин крові (ПМКК) проводилося шляхом відмивання гемолізованих еритроцитів, після чого отриманий клітинний осад ПМКК лізувався у 150 мкл RIPA- буферу. Визначення експресії необхідних білків (каспази-3, -8, -9) проводилося методом імуноблоту отриманих лізатів клітин (аналіз 30,0 мкг білку) із використанням відповідних антитіл.

Якісне визначення РНК вірусу в сироватці крові проводилося методом ПЛР із використанням ПЛР-тест-системи “АмплиСенс HCV-240/ВКО-440” (Росія) та тест-системи для визначення РНК вірусу гепатиту С (“Медбіосервіс”, м. Київ). Кількісне визначення РНК вірусу, генотипу збудника в сироватці та ПМКК проводилося на базі вірусологічної лабораторії клініки інфекційних хвороб Віденського медичного університету за допомогою Cobas Amplicor MonitorTM HCV 2,0 Assay (Roche Diagnostic System, NY) за участю д-ра T. Watkins-Riedel.

Усі дані вносилися у базу даних, створену в програмі “Microsoft Excel”, за допомогою якої проводився комплексний аналіз отриманих показників. Статистична обробка результатів проводилася за допомогою комп’ютерної програми STATISTICA (p<0,05 визначено як статистично достовірне, r – коефіцієнт кореляції Спірмана).

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

За результатами вивчення епідеміологічного анамнезу в 114 осіб із наявними маркерами HCV- інфекції основними були нозокоміальні шляхи інфікування (68,4%), серед яких найвищий відсоток (35,96% обстежених) становили хірургічні втручання (найчастіше це операції, пов’язані з патолоґією травного каналу (апендектомії, хірурґічні втручання з приводу ускладень виразкової хвороби (ВХ) шлунка або 12 –палої кишки, холецистектомії, пахові грижі тощо) та втручання з приводу патолоґії жіночих статевих органів (фіброміома матки, позаматкова вагітність, апоплексія або киста яєчника). Наступну групу (15,79%) склали хворі, у яких в анамнезі було переливання крові та її препаратів, у 5 осіб гемотрансфузії проводилися після 1995 року, тобто після запровадження обов’язкового тестування донорської крові на наявність anti-HCV; 9,65% обстежених вказували на часті лікувально-діагностичні маніпуляції, в тому числі фібробронхо- та гастродуоденоскопії, близько 7% пов’язували інфікування з лікуванням у стоматолога. Серед медичних працівників хронічні форми гепатиту С частіше спостерігалися у лікарів хірургічного профілю – 7 хворих (6,2%) (стоматологи, хірурґи, лікарі відділення гемодіалізу) та середнього медичного персоналу – 6 осіб (5,2%) (медичні сестри, лаборанти). У групі інфікованих осіб (12,28%), у яких при детальному зборі анамнезу не вдалося з’ясувати ймовірні шляхи зараження, інфікування можливе або, так званим, непарентеральним шляхом (передача при статевих зносинах, перинатальне інфікування, побутові контакти та ін.), або ж під час голкотерапії, татуювання, манікюру тощо. У загальній групі anti-HCV-серопозитивних осіб внутрішньовенне введення наркотичних речовин як можливий шлях інфікування визначено у 5,26% осіб, що обумовлено меншою частотою виявлення ін’єкційних наркоманів у західних областях порівняно із південно-східним регіоном України (Івасюк В.П., 1997; Марієвський В.Ф., Гураль А.Л., 1998). Проте аналіз, проведений в окремих вікових групах дозволив встановити значний відсоток інфікування вірусом внаслідок ін’єкцій наркотичних речовин у осіб віком 17-29 років (16,1%), який відображає загальну світову тенденцію зменшення значення нозокоміальної передачі вірусу та зростання частки ін’єкційних наркоманів серед хворих на ВГ С (Возіанова Ж.І., Чуба П.С., 2001; Гураль А.Л., 2001; Trepo С., Pradat., 1999).

Дослідження клінічного перебігу хвороби підтвердили дані про переважно малосимптомний, латентний характер HCV-інфекції у більшості хворих (Громашевська Л.Л., 1998; Чумак А.А., 2000; Di Bisceglie.M., 2000), який спостерігався у 80,7% обстежених, проте у 11,5% визначено маніфестні форми хронічного гепатиту із вираженою клініко-біохімічною картиною хвороби. У близько 30% хворих клінічний перебіг характеризувався переважанням позапечінкових проявів, які часто були єдиними та/або першими ознаками хвороби (9% хворих) (артралгії, прояви васкуліту, шкірної порфірії, гломерулонефриту).

Клінічні та/або біохімічні ознаки холестатичного синдрому виявлено у 38 (31,6%) хворих на ХГ С, причому свербіж шкіри, один із основних клінічних симптомів холестазу (Върбанов Г., 1994; Громашевська Л.Л., Татьянко Н.В., 1998), спостерігався у 33 (27,5%) осіб, жовтяниця (рівень білірубіну вище 20,8 мкмоль/л) - у 50 хворих (41,6%) на ХГ С. У групі хворих, які скаржилися на свербіж шкіри, достовірно вищою була активність лужної фосфатази (3,32±0,4 ммоль/г·л) та рівень загального холестерину (6,65±0,39 ммоль/л) порівняно із хворими, в яких свербежу не було (ЛФ-2,17±0,26 ммоль/г·л), загальний холестерин - 5,18±0,22 ммоль/л, р<0,05 та р<0,01 відповідно). За даними клінічного та УЗ обстеження органів черевної порожнини, у 29 хворих (24,1%) виявлялася супутня патологія жовчевивідних шляхів та підшлункової залози (хронічний холецистит, панкреатит, виразка 12-палої кишки тощо), яка може бути причиною позапечінкового холестазу та відповідних змін біохімічних показників сироватки крові (Возіанова Ж.І., Шкурба А.В., 1994; Сорінсон С.Н., 1998). Дослідження взаємозв’язку “маркерів холестазу” (активності ЛФ, ГГТП) із біохімічними показниками цитолізу (АлАТ) дозволили встановити пряму кореляційну залежність між активністю ГГТП та АлАТ у хворих на ХГ С (r=0,7, p<0,05). Таким чином, ГГТП може використовуватися як ознака власне внутрішньопечінкового генезу холестазу, який при хронічній HCV–інфекції виникає внаслідок навколопротокової інфільтрації жовчевих канальців лімфоїдними клітинами (Chia S. et al., 1998; Dienes.P., 1999) та визначає як перебіг хвороби, так і тактику лікування (Вовк А.Д., Матяш В.І., 2000; Сіткін С.І., Масевич Ц.Г., 2000).

Порівняльний аналіз епідеміологічних, клініко-біохімічних та імунологічних показників у хворих на ХГ С із різною вираженістю цитолізу, дозволив виявити певні особливості перебігу хвороби відповідно до активності АлАТ. Так, у хворих, у яких інфікування вірусом, ймовірно, пов’язане із професійною діяльністю, частіше гепатит перебігав без вираженого цитолізу (25% проти 6%, p<0,05). У обстежених із підвищеною активністю АлАТ достовірно вираженішою була спленомегалія (p<0,01), частіше виявлялися ознаки геморагічного синдрому (17,5% проти 0%, p<0,05) та помітнішими були порушення пігментного обміну (загальний білірубін 27,34±3,85 мкмоль/л проти 46,03±8,08 мкмоль/л, р<0,05).

У порівнюваних групах з різною частотою визначалися як клінічні (жовтяниця - 6% проти 27% в хворих з підвищеною активністю АлАТ, p<0,05; свербіж), так і біохімічні ознаки холестатичного синдрому (лужна фосфатаза - 1,61±0,26 ммоль/г л проти 2,57±0,39 ммоль/г л, р<0,05; ГГТП -25,33±4,0 ОД/л та, відповідно, 57,33±11,29 ОД/л, р<0,05).

При диспансеризації хворих на ХГ С із початково нормальним рівнем АлАТ сироватки крові (n=27), вже протягом першого року спостерігалося підвищення активності ферменту у 5 осіб (18,5%), у 4 із них біохімічна активація хвороби не супроводжувалася суб’єктивними змінами загального стану. Активне амбулаторне спостереження протягом другого та третього років дозволило встановити помірний цитоліз (збільшення активності АлАТ більше, ніж вдвічі) ще у двох хворих (одного на другому році спостереження, другого протягом третього року), у яких на час включення в дослідження рівень ферменту не перевищував норму. Таким чином, при регулярному активному обстеженні хворих на ХГ С із вихідною концентрацією АлАТ в межах норми біохімічну активацію хронічного гепатиту С встановлено у 7 (25,9%) хворих, що узгоджується з результатами проспективних досліджень (Громашевська Л.Л., Татьянко Н.В., 1998; Persico. et al., 2000; Martinot-Peignoux M. et al., 2001). У групі anti-HCV–серопозитивних осіб (n=15) підвищення активності АлАТ протягом трирічного спостереження встановлено у 1 хворого (6,6%), через 1 рік після включення в дослідження. На основі наведених результатів розроблено методику активного диспансерного спостереження за anti-HCV-серопозитивними особами з урахуванням, насамперед, активності цитолізу, вираженості мезенхімально-запального синдрому та реплікативної активності вірусу.

Аналізуючи вплив вірусу гепатиту С на кількісний склад та морфофункціональні властивості форменних елементів крові, з’ясовано достовірне зниження кількості тромбоцитів (180,43±12,5х109/л) та збільшення їх середнього об’єму (16,94±0,14%) у загальній групі обстежених хворих (хронічні форми HCV-інфекції) порівняно із нормою (p<0,05), причому вираженішою була тромбоцитопенія у хворих на цироз печінки HCV-генезу в порівнянні із хворими на ХГ С (210,32±15,04х109/л проти 110,9±17,19х109/л, p<0,01). Визначено також залежність змін тромбоцитарної ланки від реплікативної активності вірусу: у хворих із наявною HCV-РНК відмічено зниження абсолютної кількості тромбоцитів (185,2±24,08 х109/л) порівняно із групою хворих з нереплікативним варіантом інфекції (229,0±37,0 х109/л), проте через значні коливання цих показників у обох групах різниця не була статистично достовірною. У HCV-РНК (+) хворих на ХГ С спостерігався достовірно вищий ступінь відхилення об’єму тромбоцитів від нормального порівняно із таким показником у хворих, у яких HCV-РНК методом ПЛР в сироватці крові не визначалася (17,1±0,09 % проти 16,4±0,10%, p<0,01). Ці результати підтверджують дані інших дослідників (Bordin G. et al., 1995, Garcia-Suarez J. et al., 2000), які засвідчують розвиток тромбоцитопенії при інфікуванні вірусом гепатиту С, що пов’язаний із можливим мієлосупресивним впливом вірусу на клітини-попередники тромбопоезу та наявністю вірус-індукованих автоантитіл до тромбоцитів. У хворих із хронічною HCV- інфекцією встановлено також достовірне зниження гематокриту (39,20±1,15%, p<0,01 порівняно з нормою); середнього об’єму еритроцитів (MCV) (92,95±1,85, p<0,05) поряд із збільшенням середньої концентрації гемоглобіну в еритроцитарній масі (MCHC) (31,73±0,47% проти 25,58±0,83% в нормі, p<0,01).

Кількісна оцінка факторів клітинного (Т-клітинної ланки) імунітету в хворих на ХГ С та ЦП (табл. 1) дозволила встановити достовірне переважання CD8+-клітин-Т-лімфоцитів (28,11±0,95%) при ХГ С порівняно із ЦП HCV генезу (22,28±1,83%; p=0,002). Ці зміни поряд із зменшенням кількості CD4+-клітин (40,43±1,22% при ХГ та 45,64±2,79% при ЦП, p=0,041) спричинили відповідні зміни імунореґуляторного індексу (співвідношення CD4+ до CD8+-клітин) (табл. ). Вірогідно більшою була субпопуляція CD4+- клітин у групі хворих із нормальною активністю АлАТ (43,83±1,82%) на противагу до хворих із вираженим цитолізом (37,15±1,73%, p=0,016). Окрім зазначених особливостей Т-клітинної відповіді у хворих з різними стадіями хронічної HCV-інфекції, встановлено також різний ступінь вираженості антитільної відповіді до структурних (Cor-22) білків вірусу гепатиту С, яка була потужнішою у хворих на HCV-ЦП (12,41±2,39 проти 8,27±1,29 при ХГ С, p<0,05).

Таблиця 1

Імунофенотипічна характеристика лімфоцитів периферичної крові та антитільної відповіді у хворих на ХГ С та НСV-цироз печінки

Показник | ХГ С | ЦП HCV | p

n= 36 | n= 16 | (ХГ С ~ ЦП)

Лімфоцити, % | 28,85 ± 2,03* | 20,6 ± 1,59 | p<0,05

CD3+, % | 72,08 ± 1,08 | 72,71 ± 2,95 | p>0,05

CD4+, % | 40,43 ± 1,22* | 45,64 ± 2,79 | p<0,05

CD8+, % | 28,11 ± 0,95* | 22,28 ± 1,83 | p<0,01

CD4+/CD8+ | 1,46 ± 0,09* | 2,19 ± 0,32 | p<0,01

СD 16/56+, % | 10,55 ± 0,86 | 9,28 ± 1,16 | p>0,05

CD3/16, % | 6,55 ± 1,0v | 3,86 ± 0,62 | p>0,05

Примітка: v - різниця статистично вірогідна порівняно з нормою

* - різниця статистично вірогідна порівняно з цирозом печінки

З іншого боку, реплікативна активність вірусу обумовлювала зміни популяцій клітин, які забезпечують в макроорганізмі механізми природної цитотоксичності (CD16/56+, CD3/16+) (табл. 2), кількість яких також зворотно корелювала із антитільною відповіддю до вірусних антигенів. Достовірне збільшення цих клітин спостерігалося у хворих на ХГ С за умов реплікації вірусу (12,91±1,71% проти 6,2±0,85% у HCV-РНК(-)-осіб), що, очевидно, пов’язане із збільшенням кількості інфікованих вірусом клітин, які є, відповідно, мішенями для CD16/56+-лімфоцитів (Corado J., 1997).

Таблиця 2

Показники Т-клітинної ланки у хворих на ХГ С (HCV-РНК(+) та HCV-РНК(-)) |

CD3+,% | CD4+,% | CD8+,% | CD16/56+,% | CD3/16+,% | CD4/CD8

HCV-РНК+

n=21 | 69,4±1,84 | 40,5±1,95 | 25,17±0,6 | 12,91±1,71* | 7,5±1,37v | 1,51±0,07

HCV-РНК-

n=7 | 70,8±3,49 | 41,4±5,38 | 24,8±3,44 | 6,2±0,85* | 3,8±0,8v | 1,95±0,55

Примітка: * - p<0,05 у групі HCV-РНК+/-

v - p<0,05 порівняно з нормою

Кількість NK- клітин (CD16/56+) у хворих на ХГ С зворотньо корелювала із вираженістю специфічної антитільної відповіді до вірусу (anti-HCV сумарні) (r=_,669, p=0,0088), що обумовлено участю NK-клітин в елімінації вірусу на ранніх стадіях інфікування, з наступною активацією антигенспецифічної Т_цитотоксичності та, відповідно, секрецією специфічних антитіл. В обох групах спостерігалося вірогідне збільшення відносної кількості CD3/16+Т-лімфоцитів (p<0,05) (табл.2).

Доцільність вивчення білків-регуляторів апоптозу, якими є ТНФ-?, рТНФ-РI, рТНФ-РII та каспази, в початковій фазі лікування, обумовлена дослідженнями про можливу участь апоптозу в елімінації інфікованих клітин, що і спричинює відповідне зниження кількості HCV-РНК у цій фазі (Neumann., 1998). До лікування середній рівень ТНФ-? в сироватці крові хворих становив 3,5 пг/мл (1,5_,9 пг/мл), що не перевищувало норми. У контрольній групі медіана ТНФ-? становила 4,0 (3,0-6,8 пг/мл), що вірогідно не відрізнялося від показника у групі хворих на ХГ С (p>0,05). Після введення 10 МО ІФН-?2b спостерігалося достовірне підвищення рівня ТНФ-? до 5,4 пг/мл (1,7- 10,2; p<0,01 порівняно з вихідним значенням (ТНФ-? 0)) та істотне зниження на 7-у добу спостереження до 4,3 пг/мл (1,3-7,4; p<0,01) (рис. 1, А). Регулярне введення ІФНу-? (з 8-ої доби) спричинювало повторне збільшення рівня ТНФ-? до 5,4 пг/мл (2,5- 9,2) пг/мл; p<0,01 порівняно із значенням на 7-у добу) та утримувалося на цьому рівні до 21-ої доби. Помітних коливань ТНФ-? з 8-ої доби терапії, незважаючи на повторні ін’єкції ІФН-?2b, не було (рис. 1). На відміну від ТНФ-?, вихідний рівень якого не перевищував норми, до лікування визначалося незначне збільшення концентрації розчинних рецепторів туморнекротизуючого фактора І (ТНФ-РI): медіана- 1332 (549-1922 пг/мл) та ІІ (ТНФ РII): медіана - 3137 пг/мл (2090-6676 пг/мл) типів. Істотне збільшення рівня рецепторів обох типів спостерігалося після першої ін’єкції ІФН-?2b (10 МО) (ТНФ-? РІ (46%); p<0,01; ТНФ-? РІІ (44%); p<0,01) (рис. , В). Подібно до ТНФ-? рівень розчинних рецепторів І типу знижувався через тиждень без лікування, проте залишався вищим від рівня, отриманого до початку терапії (p<0,05), після повторного введення ІФН-? концентрація рецепторів істотно не збільшувалася і утримувалася на цьому рівні до 21-ої доби лікування.

А В

Рис. 1. Вміст ТНФ-? (A) та розчинних форм рецепторів ТНФ-? І та ІІ типів (B) в сироватці крові хворих на ХГ С (генотип 1a/b) в динаміці лікування ІФН-?.

Як видно з рис. 1, В, істотніших коливань, порівняно із рецепторами І типу зазнавав рівень ТНФ РII: на 7-у добу визначалося повернення концентрації до початкового рівня (p>0,05), а після чергової дози ІФН-?2b - достовірне зростання їх кількості (p<0,01), рис. , В. До кінця другого тижня регулярного лікування не відмічено наступного підвищення рівня ТНФ РII у порівнянні із 1-ою та 8-ою добами (p>0,05), проте цей показник був помітно вищим, аніж вихідний рівень (доба-0 проти доби-21 – p<0,01). Встановлено позитивний кореляційний зв’язок усіх досліджуваних показників між собою (r=0,43-0,89, p<0,05).

На основі наявності або відсутності РНК вірусу гепатиту С в сироватці крові через три місяці після початку лікування (Civeira1999) 6 хворих (респонденти) було визначено як таких, що позитивно відповіли на терапію (HCV_РНК (-)) та 17 (не-респонденти) – як такі, у яких, ймовірно, комбінована терапія не приведе до повної елімінації збудника. HCV-РНК визначалася також і у ПМКК, причому її кількість корелювала із концентрацією РНК в сироватці крові (r=0,9; p<0,01).

Істотної різниці у кількості ТНФ-? та розчинних форм його рецепторів І типу у хворих вірусологічних респондентів (3,1 (1,6-7,9) пг/мл) та не-респондентів (3,5 (1,5-5,5) пг/мл) до початку лікування та на завершенні початкової фази терапії визначено не було (p>0,05). Кількість HCV-РНК в сироватці крові достовірно корелювала лише з рівнем рТНФ-альфа ІІ типу (r=0,48; p<0,05) на 21-у добу лікування, істотного зв’язку між іншими параметрами не визначено протягом усього періоду спостереження.

Досліджуючи лізати ПМКК (методом імуноблоту) в динаміці терапії вдалося визначити лише проензим (каспазу-8, ~55kDa) за відсутністю протеїнів масою ~20 kDa, що дозволяє заперечити активацію каспази-8 у хворих на ХГ С. Слід зауважити, що подібна картина спостерігалася, як у респондентів, так і у тих, у яких ІФН-терапія не дала бажаного результату.

На відміну від каспази-8, вже після першої високої (10 МО) дози інтерферону (1-а доба лікування) спостерігається поява субодиниці каспази-9: протеїну масою 35kDa (рис. 2, А). Наявність цієї субодиниці свідчить про розщеплення та, відповідно, активацію каспази-9, стимульовану інтерфероном. Подібна активація спостерігалася у хворих на ХГ С, які визначені на основі відсутності HCV-віремії, як такі, що мають сприятливий прогноз щодо ефективності лікування (рис.2, А), і не визначається у хворих – не-респондентів до терапії (рис.2, В).

А В

Рис. 2. Аналіз експресії каспази-9 у ПМКК хворих на ХГ С методом імуноблоту до та в початковій фазі лікування ІФН-альфа.

Рядки 0-21: дні лікування, коли проводився забір крові, А- протеїновий маркер, B- контроль. А. Хворий H., респондент до лікування, В. Хворий P., не-респондент.

Подібна картина активації ферменту під впливом інтерферонотерапії (рис.3, А) спостерігалася і при дослідженні лізатів ПМКК із антитілами до каспази-3 (аналіз каспази-3 у респондентів до терапії – рис.3, А, у не-респондентів – рис. 3, В).

Рис. 3. Аналіз експресії каспази-3 у хворих на ХГ С у відповідь на ІФН-терапію.

Рядки 0-21: дні лікування, коли проводився забір крові, А- протеїновий маркер, B- контроль.

А. Підвищена експресія та наступна активація каспази-3 у хворого із сприятливим прогнозом щодо результату лікування.

В. Відсутня активація прокаспази-3 у хворих, у яких HCV-РНК виявлялася через 3, 6 міс. після початку терапії.

Аналіз кількості моно- та олігонуклеосом - фрагментів ДНК, засвідчив достовірне значне збільшення кількості нуклеосом порівняно із вихідним значенням (до лікування-доба-0, яке ми умовно прийняли за 100%) у хворих, у яких очікується сприятливий ефект лікування (рис.3,А). Ступінь фрагментації ДНК після першої дози ІФН достовірно відрізнявся у хворих респондентів та не-респондентів до лікування (p<0,05).

З рис.4, А видно, що із зниженням вмісту HCV-РНК в сироватці крові збільшується кількість нуклеосом у хворих-респондентів до лікування, причому коефіцієнт зворотної кореляції Спірмана становить r=-0,55 (p=0,098). У хворих з несприятливим прогнозом щодо ефективності противірусної терапії не визначалося збільшення кількості ДНК-фрагментів попри зниження віремії у крові (рис. 4, В) у перший тиждень лікування, проте в динаміці спостерігалося характерне зниження рівня апоптозу ПМКК поряд із збереженням/наростанням кількості РНК вірусу.

A B

Рис. 4. Концентрація HCV-РНК в сироватці крові та кількість моно-/олігонуклеосом в крові хворих з сприятливим прогнозом щодо ефективності інтерферонотерапії (А) та у хворих – не-респондентів (В) у початковій фазі лікування.

Ці результати підтверджують припущення A.n (1998) щодо зв’язку між зниженням віремії та імуно-опосередкованим зменшенням кількості інфікованих клітин у початковій фазі лікування, про що свідчить певний ступінь зв’язку між динамікою віремії та кількістю оліго- та мононуклеосом, які визначалися протягом обох фаз терапії. На основі цих даних, індукцію апоптозу у ПМКК (активація каспаз-9 і –3 та збільшення кількості нуклеосом в периферичній крові) слід вважати раннім чинником, який дозволяє визначати ефективність терапії IFN-a2b у хворих на ХГ С вже у перші 2-3 тижні лікування.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведене теоретичне узагальнення та нове вирішення наукової задачі особливостей імунопатогенезу та перебігу хронічної HCV-інфекції, визначено критерії та методику диспансерного нагляду за різними групами інфікованих осіб в амбулаторних умовах, встановлено можливість елімінації вірусу гепатиту С шляхом апоптозу, індукованого інтерфероном-альфа, що може служити додатковим критерієм ефективності лікування у його початковій фазі.

1. Малосимптомний, латентний перебіг хронічної HCV-інфекції спостерігався у більшості хворих (80,7%), маніфестні форми ХГ С діагностовано у 11,5% обстежених, у 9% єдиними та/або першими ознаками хвороби були позапечінкові прояви. Холестатичний синдром при хронічній HCV-інфекції діагностований у третини хворих і обумовлений як внутрішньопечінковим, так і позапечінковим компонентами, внаслідок супутнього ураження органів гепатопанкреатичної зони.

2. Хронічний гепатит С характеризується хвилеподібним перебігом із періодичною біохімічною активацією процесу, визначеною у 25% хворих протягом 3-х років спостереження. Таким чином, збільшення термінів спостереження дозволяє з більшою частотою виявляти клініко-лабораторні зміни, з чим пов’язана необхідність довготривалого активного нагляду за anti-HCV-серопозитивними особами та хворими на ХГ С із початково нормальними показниками функціональних проб печінки.

3. Поряд з існуючими визначеними групами ризику щодо інфікування вірусом гепатиту С доцільним вважаємо також скринінг медичних працівників хірургічних спеціальностей, а також тих людей, які мають контакт з кров’ю; та усіх осіб, які отримували кров та препарати крові, незалежно від часу гемотрансфузії. Значний відсоток інфікування вірусом гепатиту С внаслідок ін’єкцій наркотичних речовин у осіб молодого віку відображає загальну світову тенденцію зменшення значення нозокоміальної передачі вірусу та зростання частки ін’єкційних наркоманів серед хворих ВГ С.

4. Серед морфофункціональних показників периферичної крові у хворих із хронічною HCV-інфекцією найбільш виражені зміни, які залежали від стадії хвороби (ХГ С та HCV-цироз) та реплікативної активності вірусу, визначено у тромбоцитарній ланці.

5. Зміни гелперно-супресорного складу лімфоцитів периферичної крові визначалися, насамперед, стадією хвороби та біохімічною активністю процесу, що свідчить про участь цих клітин у патогенезі хвороби. Встановлено вплив реплікативної активності вірусу переважно на популяції цитотоксичних клітин (CD16/56+, CD3/16+), кількість яких також зворотно корелювала із антитільною відповіддю до антигенів вірусу.

6. Рецепторний (ТНФ-? опосередкований) механізм регуляції апоптозу не відіграє вирішальної ролі в елімінації вірусу та прогнозуванні відповіді на терапію, через недостовірність різниці у кількості ТНФ-?, розчинних форм рецепторів ТНФ-? у вірусологічних респондентів та не-респондентів, а також відсутність корелятивного зв’язку із HCV-РНК в перші три тижні лікування.

7. Одним із механізмів противірусної дії інтерферону є індукція апоптозу інфікованих вірусом клітин, визначена на основі дослідження активації каспазного каскаду із переважним залученням мітохондріального (внутрішнього) шляху (активація прокаспази-9 за відсутності розщеплення прокаспази-8). Активація каспази-9 та -3 в ПМКК та збільшення в крові оліго- та мононуклеосом корелює із позитивною відповіддю на інтерферонотерапію у хворих на ХГ С (генотип 1а/b), визначеною на основі віремії, що робить можливим прогнозування ефективності лікування у його початковій фазі.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. На підставі визначеного переважання нозокоміальної передачі вірусу гепатиту С рекомендується широке впровадження заходів неспецифічної профілактики: суворе дотримання стандартної процедури дезінфекції та стерилізації медичного обладнання з обов’язковим попереднім очищенням, особливо ендоскопічного обладнання, де неможлива термічна дезінфекція, використання засобів захисту при роботі з біологічними рідинами, особливо кров’ю (рукавички, окуляри та ін.), обмеженням мануальних маніпуляцій ріжучими та колючими предметами, застосуванням контейнерів для зберігання використаного інструментарію (одноразові голки, скальпелі тощо) та періодичним проведенням відповідної освітньої роботи серед медичного персоналу.

2. Для своєчасного виявлення активації процесу у anti-HCV-серопозитивних осіб та хворих на хронічний гепатит С запропонована методика активного диспансерного спостереження в амбулаторних умовах, яка полягає у періодичному (2