КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

КОМАРЕНКО Віктор Іванович

УДК 612.43/45:612.351.5

РОЛЬ ЕНДОТЕЛІЙЗАЛЕЖНИХ ФАКТОРІВ У РЕГУЛЯЦІЇ ВОРІТНОГО КРОВООБІГУ

03.00.13 – фізіологія людини і тварин

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі фізіології людини і тварин

Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, професор

Цибенко Всеволод Олексійович

кафедра фізіології людини і тварин Київського

національного університету імені Тараса Шевченка, професор

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Шаповал Людмила Миколаївна

Інститут фізіології імені О.О.Богомольця НАН України,

провідний науковий співробітник відділу фізіології кровообігу

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Соловйов Анатолій Іванович

Інститут фармакології і токсикології АМН України, завідуючий

міжвідомчою лабораторією АМН та МОЗ України

доклінічного вивчення лікарських засобів

Провідна установа:

Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П.Комісаренка,

лабораторія нейрогормональної регуляції кровообігу, м. Київ

Захист відбудеться 27 жовтня 2003 року о 16 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Київського національного

університету імені Тараса Шевченка (Київ, пр. акад. Глушкова, 2,

біологічний факультет, ауд. 215)

Поштова адреса: 01033, Київ – 33 , вул. Володимирська, 64

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського

національного університету імені Тараса Шевченка

(01033, Київ – 33, вул. Володимирська, 58)

Автореферат розісланий 25 вересня 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Цимбалюк О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Печінка – найбільша залоза травної системи, яка бере участь у процесах травлення, обміну речовин, кровообігу, секреції, екскреції, кровотворення, знешкодження отруйних речовин, тощо. Важко переоцінити роль кровопостачаня у функціонуванні печінки. Кров у цьому випадку не лише забезпечує життєдіяльність органу, але і є, крім цього, своєрідним субстратом, на якому печінка виконує свої функції. Така “субстратна” кров потрапляє у печінку через особливе судинне русло – ворітну систему, яка збирає кров із венозних судин шлунково-кишкового тракту та селезінки.

Тому так важливо знати особливості регуляції судин ворітної системи. Особливу увагу дослідників привертає гуморальна регуляція цього русла печінки. Адже по ворітній вені (vena portae) тече кров від усіх ділянок шлунково-кишкового тракту, де утворюється і діє значна кількість фізіологічно актвних речовин: гормонів, метаболітів, тощо.

Ацетилхоліну (АХ), як гуморальному фактору, у ворітних судинах печінки притаманний специфічний судиноруховий ефект. Якщо у більшості судинних русел АХ виявляє виражену судинорозширювальну дію, то у портальних судинах цей нейромедіатор проявляє властивості вазоконстриктора [Condorelli S. et al., 1961]. Незважаючи на нетиповість відповіді ворітних судин на дію АХ цей факт не привернув уваги дослідників, а, отже, механізм цих вазомоторних реакцій і досі залишається нез’ясованим.

На сьогоднішній день немає чітких уявлень щодо причин судинозвужувальної дії АХ у портальних судинах. Адже згідно сучасних даних АХ у переважній більшості судинних русел, взаємодіючи із М-холінорецепторами ендотеліоцитів, активує фермент NO-синтазу. Остання, використовуючи амінокислоту L-аргінін, синтезує провідний ендотелійзалежний розширювальний фактор (ЕЗРФ) – оксид азоту (NO), який дифундує до м’язевих клітин судин і розслаблює їх [Furchgott R. F., Zawadski J. V., 1980; Calver A., et al., 1993; Plane F., et al., 1995 і ін.].

M. Feletou, U. Hoeffner, P.M. Vanhoutte [1989] вважають, що м’язеві клітини ворітної вени не реагують розслабленням на АХ і ЕЗРФ тому, що їх гуанілатциклаза має нижчу чутливість у порівнянні із артеріями. А S.N. Joshi і співавтори [1991], опираючись на результати своїх дослідів, вважають, що АХ викликає звуження ворітної вени взагалі не діючи через ендотеліальний шар судини. Адже на кільцях з портальної вени собак АХ у їхніх експериментах викликав скорочення препарату цієї судини, яке не усувалося видаленням ендотелію ворітної вени.

У зв’язку із вищенаведеним подальше дослідження механізмів здійснення судинозвужувальної дії ацетилхоліну у ворітній системі печінки та встановлення ролі ендотелійзалежних факторів регуляції судинного тонусу в перебігу вазомоторних реакцій є актуальним.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась згідно з плановими науковими темами відділу фізіології і фармакології травлення Науково-дослідного інституту фізіології імені академіка Петра Богача Київського національного університету імені Тараса Шевченка (реєстраційний номер № 0197U003104) “Периферичні механізми нейрогуморальної регуляції функцій проксимального відділу шлунково-кишкового тракту та печінки” керівник – доктор біологічних наук, професор, В.О. Цибенко та (реєстраційний номер № 0101U002485) “Дослідження ролі нехолінергічних факторів (гістамін, мотилін, ендотеліальні фактори) у регуляції функціонального стану шлунково-кишкового тракту і печінки” керівник – доктор біологічних наук Т.В. Берегова.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи полягала у з’ясуванні механізмів здійснення судинозвужувальної реакції ацетилхоліну у ворітній системі печінки. Для досягнення мети дослідження були поставлені наступні задачі:

вивчити вплив ацетилхоліну та L-аргініну на ворітний кровообіг;

дослідити роль ендотелію у реакціях ворітних судин на ацетилхолін та L-аргінін;

порівняти ефекти ендотелійзалежних (ацетилхолін, L-аргінін) і незалежних (нітропрусид натрію) вазодилататорів на судини басейну ворітної вени щурів;

з’ясувати роль М- і Н-холіно та ?-адренорецепторів у реалізації ацетилхоліном вазоконстрикторного впиву на ворітну систему печінки;

дослідити участь різних ендотеліальних факторів звуження у вазомоторних реакціях ворітних судин на дію ацетилхоліну.

Об'єкт дослідження – ворітний кровообіг печінки щурів.

Предмет дослідження – механізми ендотелійзалежної гуморальної регуляції ворітного кровообігу.

Методи дослідження – ворітний та артеріальний тиски реєстрували безпосередньо у ворітній вені та сонній артерії після їх катетеризації, реєстрацію кровонаповнення печінки вивчали за допомогою реографічного метода у модифікації В.О. Цибенка та П.І.Янчука, локальний кровотік в печінці реєстрували застосовуючи кліренсний метод з електро-хімічною генерацією водню.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано, що L-аргінін у ворітних судинах печінки виявляє судинозвужувальні властивості. Вперше встановлено, що судинозвужувальний вплив АХ та L-аргініну на ворітні судини здійснюється через ендотелій цих судин. Проведено порівняння впливу ацетилхоліну, L-аргініну та нітропрусиду натрію на портальне русло. Вперше показано, що констрикторний вплив АХ у портальній системі печінки не супроводжується виділенням із ендотелію ворітних судин простагландинів Н2 і F2б та тромбоксанів А2 і В2. Проведено дослідження ролі Н-холінорецепторів у розвитку вазоконстрикторної відповіді ворітних судин на АХ. Показано, що даний тип холінергічних рецепторів не бере участі у здійсненні судинозвужувального впливу АХ у басейні ворітної вени. Вперше показано, що блокада ?-адренорецепторів пригнічує пресорні реакції ворітних судин на дію ендотеліну-1 (ЕТ-1), що свідчить про принаймні часткове залучення ?-адренорецепторів до звужувальних реакцій ворітних судин на ЕТ-1. Інформація про специфічну дію на ворітні судини гуморальних факторів, які проявляють свій вплив через судинний ендотелій і виділення останнім ендотеліальних факторів розширення і звуження, має суттєве теоретичне значення, адже розширює уявлення про участь ендотелію у гуморальній регуляції судин та функціональні особливості ворітних судин печінки.

Практичне значення одержаних результатів. З’ясування мезханізмів дії ендотелійзалежних гуморальних факторів на гладенькі м’язи ворітних судин має певне практичне значення для гепатології, адже таке захворювання печінки як цироз завжди супроводжується паталогічними змінами ворітного кровотоку, що є причиною розвитку портальної гіпертензії. Головним фактором розвитку портальної гіпертензії є звуження ворітних судин печінки [Логинов А.С., Аруин Л.И. 1985; Парин В.В., Меерсон Ф.З., 1960]. Згідно сучасних уявлень одним із чинників, що провокує генез цієї патології, є дисфункція ендотелію судин ворітної системи. Тому отримані у даній роботі результати можуть бути важливими для патофізіологів, фармакологів, які створюють нові фармакологічні препарати, направлені на лікування чи профілактику портальної гіпертензії.

Результати роботи впроваджено в навчальний процес на кафедрі фізіолгії людини і тварин біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Особистий внесок здобувача. Весь обсяг роботи з першоджерелами, планування окремих етапів експерименту, безпосереднє проведення експериментальних досліджень та статистична обробка і аналіз отриманих результатів виконані здобувачем самостійно. Наукова оцінка отриманих даних зроблена спільно з науковим керівником професором В.О. Цибенком.

Апробація результатів дисертації. Результати, наведені у дисертації, доповідались на засіданнях кафедри фізіології людини і тварин біологічного факультету та Вченої ради Науково-дослідного інституту фізіології імені академіка Петра Богача Київського національного університету імені Тараса Шевченка (1999 – 2001 р. р.), на Falk симпозіумі (Львів, 1997 р.), на XV з’їзді Українського фізіологічного товариства (Донецьк, 1998 р.), на Міжнародній конференції, присвяченій 150-річчю академіка І. П. Павлова (Санкт-Петербург, 1999 р.), на 6 Міжнародному симпозиумі “Biology of Nitric Oxide” (Стокгольм, 1999 р.), на Всеукраїнській науковій конференції “Актуальні проблеми гастроентерології” (Київ, 2001 р.), на конференції “Механізми фізіологічних фунукцій в експерименті та клініці”, присвяченій 100-річчю з дня народження заслуженого діяча науки професора Я.П. Склярова (Львів, 2001 р.), на XVI з’їзді Українського фізіологічного товариства (Вінниця, 2002 р.), на Всеукраїнській науковій конференції “Психофізіологічні та вісцеральні функції в нормі і патології”, присвяченій 160-річчю кафедри фізіології людини і тварин Київського національного університету імені Тараса Шевченка (Київ, 2002 р.), на Міжнародній конференції, присвяченій пам’яті професора І.В. Шостаковської (Львів, 2002 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 5 статей і тези 9 доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел із 202 наіменувань. Робота викладена на 123 сторінках, ілюстрована 19 рисунками, містить 17 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень

Робота виконана в гострих дослідах на 212 білих лабораторних щурах, обох статей масою 200 – 300 г. Тварин наркотизували шляхом внутрішньоочеревинного введення розчину уретану (1 г/кг) чи нембуталу (40 мг/кг).

У дослідах реєстрували системний артеріальний та ворітний тиск. Для цього проводили катетеризацію однієї із загальних сонних артерій та ворітної вени. Останній катетер використовували також і для внутрішньопортального введення досліджуваних препаратів. Вільні кінці катетерів, за допомогою яких вимірювали тиск у ворітній вені та сонній артерії, під’єднували до датчиків електроманометра ЕМТ-31 (“Elema – Schonander”, Швеція). Показники записували на шлейфному реєстраторі H.071.6M.

Кровонаповнення печінки (КНП) реєстрували методом імпедансної плетизмографії у модифікації В.О. Цибенка та П.І. Янчука [1984]. Для цього використовували модифікований реограф РГ 4-01, сигнал з якого через посилювач УБП 2-03 та інтегруючий ланцюг подавався на шлейф реєстратора H.071.6M. Для реєстрації КНП застосовували електроди, що мали форму круглих платівок з латуні чи міді, анодованої сріблом, діаметром 10 мм. Два електроди накладали на протилежні поверхні частки печінки і фіксували тонкою ниткою, яка проходила крізь товщу печінки і отвори в центрі електродів. На зовнішню поверхню кожного електрода накладали поролонову прокладку та целюлоїдну платівку для забезпечення постійного і надійного контакту електродів із печінкою при змінах її об’єму. Кількісне калібрування системи (в мм запису на мл об’єму) здійснювали in situ після закінчення досліду. Для цього перетискали всі судини печінки, вводили в орган через ворітну вену відомі об’єми фізіологічного розчину. Амплітуда змін електричного опору печінки була прямо пропорційна змінам об’єму крові в ній. Зміни КНП перераховували на 100 г маси органу.

Об’єм крові (), що знаходився в печінці, визначали після закінчення експерименту, використовуючи метод кількісного визначення гемоглобіну крові за допомогою фотоелектроколориметра [Бернштейн, 1964]. Перетискали всі судини печінки, видаляли орган та переносили в ємність. Потім через катетер у ворітній вені перфузували печінку відомим об’ємом фізіологічного розчину. За допомогою фотоколориметра КФК-3 визначали концентрацію гемоглобіну в крові, яка знаходилась в печінці до перфузії, і його концентрацію в перфузаті. Знаючи співвідношення між вмістом гемоглобіну в крові () і в перфузаті (), а також кількість перфузату (), визначали об’єм крові в печінці () за формулою:

Локальний кровотік (ЛК) в печінці реєстрували методом водневого кліренсу з електрохімічною генерацією водню. Для цього використовували платинові електроди відкритого типу діаметром 100 мкм (реєструючий електрод) та 200 мкм (генеруючий електрод), розташовані на відстані 200-300 мкм один від одного. Генерацію водню здійснювали струмом 5-10 мкА від спеціальної приставки. В якості індиферентних електродів використовували: для кола генерації водню – срібні пластинчасті електроди з площею поверхні 1 см2 вкриті шаром хлорного срібла, а для кола реєстрації водню - стандартний каломельний електрод. Значення ЛК обчислювали за формулою:

ЛК = 69,3 / t1/2 заг. – 69,3 / t1/2 дифуз. (мл / 100 г хв) [2],

де t1/2 заг. - час напіввиведення водню, отриманий в експерименті при наявності кровотоку;

t1/2 дифуз. - те саме, але при зупинці серця.

Деендотелізацію ворітних судин печінки здійснювали хімічним шляхом використовуючи сапонін (1 – 2 мг/кг), який вводили внутрішньопортально під час 1 – 1,5 хвилинного перетискання ворітної вени та печінкової артерії.

У дослідженнях використовували препарати, які вводили внутрішньопортально через гілку однієї із брижових вен чи безпосередньо у ворітну вену, в дозах: ацетилхолін (ФО “Мосмедпрепараты”, Москва) – 0,8 - 1,2 мкг/кг, L-аргінін (“Sigma”, США) – 20 - 40 мг/кг; нітропрусид натрію (“Pharmachim”, Болгарія) – 20 - 80 мкг/кг, сапонін (“Sigma”, США) – 1 - 2 мг/кг, N--нітро-L-аргінін та NG - метил - L-аргінін (“Sigma”, США) – 10 - 20 мг/кг, індометацин (“Sigma”, США) - 3 мг/кг, ендотелін-1 (“Sigma”, США) – 0,2 - 0,8 мкг/кг, норадреналін (ВАТ “Здоров’я”, Харків) – 5 мкг/кг, дитилін (“Воронежский химфармзавод”, Росія) – 2 мг/кг, фентоламін (“Гугужес пирмойи”, Литва) – 2 - 4 мг/кг, атропін (“Воронежский химфармзавод”, Росія) – 0,5 - 2 мг/кг.

Статистична обробка отриманих результатів. Результати, отримані у дослідженнях, представляли у вигляді середніх значень (М) та помилок середнього ( m). Статистичну обробку результатів проводили за допомогою аналітичного пакета STATISTICA використовуючи t-критерій Ст’юдента для результатів, що мали нормальний розподіл, та критерій Вілкоксона для отриманих даних, які не мали нормального розподілу. Вірогідними вважали результати із рівнем значущості p < 0,05.

Результати досліджень та їх обговорення

Вплив ацетилхоліну на ворітні судини печінки. У наших експериментах внутрішньопортальне (в/п) введення ацетилхоліну (АХ, 0,8 – 1,2 мкг/кг) спричиняло зниження системного артеріального тиску (САТ) на 32,9 ± 2,6 % (p < 0,001), та підвищення тиску у ворітних судинах печінки на 31,9 ± 3,8 % (p < 0,001) відносно вихідного рівня (табл. 1).

Поряд із змінами артеріального і ворітного тисків у відповідь на в/п введення АХ зменшувалось кровонаповнення печінки на 20,4 ± 2,7 % (p < 0,01) та локальний кровотік печінки на 23,0 ± 3,6 % (p < 0,001).

Такі зміни показників ворітного кровообігу у відповідь на дію ацетилхоліну дозволяють зробити висновок про судинозвужувальний ефект цього нейромедіатора у портальному руслі печінки щурів.

Для з’ясування участі ендотелію у звужувальних реакціях портальних судин на дію АХ була проведена їх деендотелізація. Хімічне пошкодження ендотелію ворітного русла сапоніном (1 – 2 мг/кг) усувало звужувальний ефект АХ у цій ділянці печінкової циркуляції (рис. 1).

Таблиця 1

Зміни системного артеріального (САТ) і ворітного (Твв) тисків, кровонаповнення печінки (КНП) та локального кровотоку в печінці (ЛК) на внутрішньопортальне введення ацетилхоліну (0,8 – 1,2 мкг/кг)

Згідно з даними літератури [Samata K., et al.,1986; Graser T.,et al., 1988] сапонін при введенні у судинне русло пошкоджує його ендотелій. Щоб перевірити чи не пошкодив сапонін разом із ендотелієм ворітної вени і її гладенькі м'язи, в/п вводили норадреналін (НА, 5 мкг/кг), який діє на м'язи судин безпосередньо, а не через ендотелій. У наших дослідах реакції підвищення ворітного тиску на НА до та після дії сапоніну у портальному руслі не відрізнялися одна від одної і становили 24,3 ± 1,3 % (р < 0,01) та 24,0 ± 2,7 % (р < 0,05) відповідно.

Отже, збереження пресорної відповіді ворітних судин на НА після хімічного пошкодження їх ендотелію є свідченням того, що сапонін у використаній нами дозі не пошкоджував м'язовий шар судин печінки.

Судинорозширювальний ефект АХ здійснюється за рахунок синтезу та виділення ендотеліального NO і значно пригнічується під час зниження активності NO-синтази (NOS) [Федоров В. И. 1998; Calver A., et al., 1993]. У наших експериментах реакції ворітних судин на АХ також значно пригнічувались під час блокади ферменту NOS N-?-нітро-L-аргініном (10 – 20 мг/кг) (рис. 2).

Таким чином, усунення впливу ацетилхоліну на ворітну вену після її деендотелізації та на фоні блокади NOS вказує на те, що АХ діє на гладенькі м'язи судин портального русла печінки, так само, як і в артеріях органів, через їх ендотелій, залучаючи фермент NO-синтазу.

Вплив L-аргініну на ворітний кровообіг. Єдиним джерелом біохімічного синтезу NO у ссавців є амінокислота L-аргінін. Як гуморальний фактор L-аргінін проявляє судинорозширювальний вплив, опосередкований судинним ендотелієм. Адже NO – результат ферментативного окиснення аміногрупи L-аргініну NO-синтазами, зокрема ендотеліальною NOS [Зенков Н. К., и соавт., 2000; Проскуряков С. Я. и соавт., 1999 і ін.]. Тому було вирішено порівняти судинорухові ефекти L-аргініну та АХ у ворітному руслі печінки.

Виявилось, що L-аргінін (20 – 40 мг/кг) спричиняв підвищення ворітного тиску на 24,1 ± 2,8 % (р < 0,05). Після болюсного в/п введення L-аргініну в найбільшій дозі 40 мг/кг, одночасно із зростанням Твв спостерігали зниження локального тканинного кровотоку печінки на 28,5 ± 1,4 % (p<0,01).

Пресорні ефекти L-аргініну у ворітному руслі були суттєво пригнічені після в/п введення сапоніну. А під час дії у судинах басейну ворітної вени блокатора NO-синтази NG-метил-L-аргініну (10 – 20 мг/кг) реакції Твв на L-аргінін повністю усувались.

Отже, з одного боку L-аргінін у ворітних судинах печінки, як і у інших ділянках серцево-судинної системи, діє через їхній ендотелій за рахунок активації NO-синтази. А з іншого боку зміни показників гемодинаміки у ворітних судинах у відповідь на дію L-аргініну вказують на звуження портальних судин.

Результати експериментів із застосуванням АХ і L-аргініну дозволили зробити досить неочікувані і сміливі припущення щодо можливої судинозвужувальної дії NO у ворітній системі, які потребували ретельної перевірки. Зокрема, було вирішено дослідити безпосередній, незалежний від участі судинного ендотелію, вплив NO на гладеньком’язові клітини ворітних судин та співставити їх із ефектами АХ і L-аргініну.

Реакції показників системного та ворітного кровообігу на дію нітропрусиду натрію. Для вирішення поставленого завдання використовували ендотелій незалежний вазодилататор нітропрусид натрію (НН). Ця сполука не може проходити через клітинні мембрани, але здатна у водному середовищі відщеплювати NO, який дифундує безпосередньо до м’язевих клітин судин і розслаблює їх [Уразаев А. Х., Зефиров А. Л., 1999].

НН (20 – 80 мкг/кг) у ворітному руслі спричиняв депресорні реакції (Твв в середньому знижувався на 17,1 ± 1,3 % (p < 0,001), які не усувались деендотелізацією ворітних судин.

Таким чином, нітропрусид натрію у ворітній системі печінки демонструє типовий для цієї сполуки судинорозширювальний ефект, який не залежить від цілісності судинного ендотелію. А, отже, NO у портальному руслі, так само як у інших ділянках серцево-судинної системи, виступає у ролі вазодилататора.

Реакції артеріальних та ворітних судин, спричинені в/п введенням АХ, суттєво відрізнялися між собою часовими параметрами. А саме, латентний період пресорної відповіді ворітних судин тривав 14,3 ± 2,3 с, в той час як латентний період депресорних реакцій в артеріях – 5,0 ± 0,6 с (табл. 2). Така різниця часових характеристик судинорухових реакцій, на нашу думку, ймовірно зумовлена тим, що у ворітній системі печінки у відповідь на дію АХ ендотелій синтезує та виділяє судинозвужувальний(і) фактор(и). Зокрема, такими факторами можуть бути простаноїди – продукти циклооксигеназного окиснення арахідонової кислоти.

Таблиця 2

Значення латентних періодів (с) реакцій зниження системного артеріального тиску (САТ), підвищення тиску у ворітній вені (Твв) та зменшення кровонаповнення печінки (КНП) у відповідь на внутрішньопортальне введення ацетилхоліну (0,8 – 1,2 мкг/кг)

* - р < 0,05 – рівень значущості різниці латентних періодів реакцій зниження САТ та підвищення Твв.

Вплив блокади синтезу простаноїдів на індуковані ацетилхоліном реакції печінкового кровообігу.

Внутрішньопортальне введення АХ (0,8 – 1,2 мкг/кг) спричиняло підвищення Твв на 29,1 ± 5,4 % (p < 0,001) та зниження кровонаповнення печінки на 23,5 ± 3,3 % (p < 0,01). Інгібітор циклооксигенази індометацин (3 мг/кг), введений у ворітне русло, не змінював характер реакцій досліджуваних показників кровообігу. І у цьому випадку АХ підвищував Твв на 37,5 ± 7,5 % (p < 0,01). Фактично одночасно із зростанням Твв зменшувалось КНП на 27,5 ± 6,2 % (p < 0,01).

Таким чином, є підстави вважати, що простаноїди (простагландини Н2, F2б та тромбоксани А2 і В2), які виступають у ролі ендотелійзалежних звужувальних факторів, не беруть участі у вазоконстрикторних реакціях ворітних судин печінки, спричинених ацетилхоліном.

Особливості судинорухових реакцій ворітного русла печінки на внутрішньопортальне введення ендотеліну-1. Найбільш потужними ендотеліальними факторами звуження судин являються пептиди із родини ендотелінів, до складу якої входять ендотелін-1 (ЕТ-1), ендотелін-2 та ендотелін-3. Взаємодіючи із специфічними ендотеліновими рецепторами (ЕТА-рецепторами) вони викликають вазоконстрикторні реакції. Найбільшу спорідненість до ЕТА-рецепторів має ЕТ-1.

В результаті внутрішньопортального введення ЕТ-1 (0,2 – 0,8 мкг/кг) виникали пресорні реакції ворітних судин печінки, величина яких становила від 17,1 % до 26,4 % (p < 0,01).

Активація ЕТА-рецепторів завжди зумовлює судинозвужувальні реакції. Відомо, що одним із типів рецепторів, активація яких також завжди спричиняє звуження судин, є ?-адренорецептори. Тому було вирішено перевірити можливу участь ?-адренорецепторів ворітних судин печінки у веноконстрикторних реакціях на дію ЕТ-1.

Виявилось, що амплітуда реакцій Твв на ЕТ-1 (0,8 мкг/кг) під час блокади ?-адренорецепторів фентоламіном (2 – 4 мг/кг) знижується вдвічі порівняно із контролем. Якщо до в/п введення фентоламіну Твв у відповідь на дію ЕТ-1 зростав на 22,3 ± 2,9 % (p < 0,001), то після введення блокатора ?-адренорецепторів у портальне русло ворітний тиск на ЕТ-1 підвищувався лише на 11,6 ± 4,5 % (рис. 3). Свідченням блокади ?-адренорецепторів ворітних судин служило послаблення їх пресорної відповіді на норадреналін під час дії фентоламіну (рис. 4).

Таким чином, пригнічення реакції підвищення Твв на ЕТ-1 фентоламіном свідчить про те, що судинозвужувальний ефект ендотеліну-1 у ворітній частині печінкової циркуляції принаймні частково здійснюється через ?-адренорецептори цих судин.

Участь холіно- та ?-адренорецепторів у реакціях ворітних судин печінки, зумовлених ацетилхоліном. У переважній більшості судинних русел АХ викликає їх розширення активуючи фермент NO-синтазу, а отже і підвищуючи синтез та виділення ендотелієм NO, за рахунок взаємодії із мускариновими (М) холінорецепторами, розташованими на мембранах ендотеліоцитів судин [Walch L., et. аl., 2000; Ceballos G., Rubio R., 1998 і ін.].

Однак, у ворітному руслі печінки АХ демонструє нетипову судинозвужувальну дію. Такий ефект ацетилхоліну у портальній вені щурів, як показали попередні наші досліди, є ендотелійзалежним, пригнічується під час блокади NO-синтази але, швидше за все, не опосередковується ендотеліальним NO. Деякі автори [Манухин Б. Н. и соавт., 1991; Reilly F. D. et al., 1982] вважають, що у перебіг пресорної реакції ворітної вени у відповідь на дію АХ можуть бути залучені ?-адренорецептори, активація котрих викликає судинозвужувальні реакції.

Завданням даного етапу дослідження було встановити роль М-холінорецепторів системи ворітних судин печінки щурів у здійсненні пресорної реакції на АХ.

Як і в попередній серії дослідів в/п введення АХ (0,8 – 1,2 мкг/кг) підвищувало Твв на 32,3 ± 3,2 % (p < 0,001) і знижувало САТ на 29,4 ± 3,0 % (p < 0,001) від вихідного рівня. Крім пресорних реакцій ворітної вени реєстрували зниження локального кровотоку печінки на 23,0 ± 3,6 % (p < 0,05). Блокада М-холінорецепторів атропіном (0,5 – 2 мг/кг) пригнічувала депресорні реакції артеріальних судин на АХ, проте не впливала на перебіг пресорних реакцій у ворітному руслі. Тиск крові у цій ділянці печінкової циркуляції зростав майже так само, як і до введення атропіну (рис. 5). Реакції локального кровотоку на АХ теж не змінилися під час дії атропіну, цей показник знижувався на 25,7 ± 5,8 % (p < 0,05).

Виникає питання, а чи не беруть участь у пресорних реакціях ворітних судин на АХ адренорецептори, як це має місце у випадку з їхніми реакціями на ЕТ-1?

Як ми й гадали, під час дії фентоламіну реакції системного артеріального тиску у відповідь на АХ не змінились, проте пресорні реакції ворітних судин на АХ значно пригнічувались (рис. 6).

Враховуючи тривалість розвитку реакцій звуження ворітних судин на АХ, можна припустити, що ці відповіді зумовлені активацією б-?дренорецепторів гладеньком’язових клітин судин ворітної системи під впливом якогось посередника, виділюваного ендотеліальними клітинами внаслідок дії АХ.

Деякі автори [F. D. Reilly et al., 1982; Rothe C. F., Maas-Moreno R. 1998] вважають, що АХ може здійснювати непряму активацію мебранних адренорецепторів ворітних судин за рахунок залучення Н-холінорецепторів внутрішньопечінкових адренергічних нейронів.

Аби перевірити це припущення була проведена серія дослідів, в якій порівнювали пресорні ефекти АХ у портальному руслі до і під час блокади Н-холінорецепторів дитиліном (2 мг/кг).

На фоні блокади Н-холінорецепторів (свідченням того, що дитілін заблокував нікотинові холінорецептори було припинення власного дихання у тварин, яких переводили на штучне дихання) реакції досліджуваних показників гемодинаміки на АХ зберігалися. А саме: САТ знижувався на 38,9 ± 5,2 % (p < 0,001), Твв зростав на 35,8 ± 5,9 % (p < 0,01), а кровонаповнення зменшувалось на 14,6 ± 3,8 % (p < 0,05). Отже, нікотинові холінорецептори не опосередковують вазоконстрикторний вплив АХ на ворітні судини печінки.

Таким чином, отримані результати дають підставу вважати, що констрикторна реакція ворітних судин на ацетилхолін здійснюється під впливом судинозвужувального фактора(ів), який синтезується ендотеліоцитами під час активації специфічних атропінрезистивних ендотеліальних холінорецепторів і діє через ?-адренорецептори.

ВИСНОВКИ

Ацетилхолін та L-аргінін у ворітному руслі печінки виявляють судинозвужувальний ефект, який супроводжується підвищенням ворітного тиску, зниженням локального кровотоку та кровонаповнення печінки.

У ворітній ділянці печінкової циркуляції вазоконстрикторна дія ацетилхоліну і L-аргініну є ендотелійзалежна та пригнічується блокадою NO-синтази і не залежить від циклооксигеназного метаболізму арахідонової кислоти.

В судинах басейну ворітної вени нітропрусид натрію спричиняє судинорозширювальні реакції, які не усуваються деендотелізацією ворітної вени.

Судинозвужувальний вплив ацетилхоліну у ворітних судинах не усувається блокадою М- чи Н- холінорецепторів відповідно атропіном та дитиліном.

Неспецифічний антагоніст ?-адренорецепторів фентоламін пригнічує констрикторні реакції портальних судин на ацетилхолін та ендотелін-1.

Отримані результати дозволяють припустити, що судинозвужувальна реакція ворітних судин на ацетилхолін здійснюється під впливом вазоконстрикторного фактора, який синтезується ендотеліоцитами цих судин під час активації ацетилхоліном специфічних атропінрезистивних ендотеліальних холінорецепторів і діє через ?-адренорецептори.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Комаренко В. Специфічний вплив ацетилхоліну на судини печінки // Вісник Київського університету імені Тараса Шевченка. Біологія. – 1999. – Вип. 29. – С. 34 – 36.

Tsybenko V., Pasichnichenko O., Yanchuk P., Komarenko V. Portal venous constriction to acetylcholine and L-arginine is endothelium dependent // The Biology of Nitric Oxide, part 7. London, Portland Press. – 2000. – Р. 59.

(Здобувачем виконана частина експериментальних досліджень, та статистична обробка результатів).

Комаренко В.І., Янчук П.І., Цибенко В.О. Вплив L-аргініну на ворітні судини печінки // Доповіді Національної академії наук України. – 2000. - № 5. – С. 166 – 168.

(Здобувачем виконано експериментальні дослідження, та обробку отриманих результатів).

Цибенко В.О., Янчук П.І., Комаренко В.І., Пасічніченко О.М. Участь оксиду азоту в регуляції печінкового кровообігу // Вісник Київського національного університету. Фізіологія. Проблеми регуляції фізіологічних функцій. – 2000. – Вип. 6. – С. 13 – 16.

(Здобувачем виконано експериментальні дослідження в умовах in vivo, брав участь в обробці та аналізуванні отриманих результатів).

Цибенко В.О., Янчук П.І., Комаренко В.І. Участь рецепторів ендотелію у пресорних реакціях ворітної вени щурів на дію ацетилхоліну // Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології. – 2002. – Вип. 2, № 41. – С. 52 – 58.

(Здобувачем виконано експериментальні дослідження, статистична обробка, брав участь в обговоренні отриманих результатів).

Tsybenko V.A., Yanchuk P.I., Komarenko V.I. The role of nitric oxide (NO) in portal hypertension // Abstracts of Falk Symposium “New trends in Diagnosis and Treatment of Liver and Colonic Diseases”. – Lviv (Ukraine). – 1997.- P.245.

Цибенко В.О., Комаренко В.І., Янчук П.І. Участь оксиду азоту у вазомоторних реакціях ворітної системи печінки // Фізіологічнний журнал. – 1998. – Т. 44, № 3. – C. 125 – 126.

Цыбенко В.А., Янчук П.И., Комаренко В.И. Эндотелий-зависимая констрикция воротных сосудов печени на введение ацетилхолина и L-аргинина // Тезисы докладов Международной конференции, посвященной 150-летию И.П.Павлова “Механизмы функционирования висцеральных систем”. – Санкт-Петербург (Россия). – 1999. – С. 389 –390.

Tsybenko V., Komarenko V., Yanchuk P., Pasichnichenko O. Does nitric oxide constrict hepatic portal veins? // Acta Physiologica Scandinavica. – 1999. – Vol. 167, Suppl. 645. – Р. 30.

Янчук П.І., Комаренко В.І., Чистов М.Л., Гриценко І.М. З’ясування механізму вазоконстрикторної дії ацетилхоліну у ворітній системі печінки // Тези доповідей конференції, присвяченої 100-річчю з дня народження заслуженгого діяча науки України професора Я.П.Склярова “Механізми фізіологічних функцій в експерименті і клініці”. – Львів (Україна). – 2001. – С. 50.

Пасічніченко О.М., Комаренко В.І., Цибенко В.О. Дослідження вазоконстрикторної реакції ворітної вени щурів на ацетилхолін // Тези доповідей Всеукраїнської наукової конференції “Актуальні проблеми гастроентерології”. – Київ (Україна). – 2001. – С. 34.

Янчук П.І., Комаренко В.І. Участь ендотеліальних факторів у вазомоторних реакціях ворітних судин печінки на ацетилхолін // Матеріали Міжнародної конференції, присвяченої пам’яті професора Шостакової І.В. – Львів (Україна). – 2002. – С. 91.

Пасічніченко О.М., Комаренко В.І., Цибенко В.О. Аналіз вазоконстрикторної реакції ворітної вени щурів на ацетилхолін in vivo та in vitro // Фізіологічний журнал. – 2002. - Т.48, № 2. – С.76 – 77.

Цибенко В.О., Янчук П.І., Пасічніченко О.М., Комаренко В.І. Дослідження механізму звужувальної дії ацетилхоліну на ворітні судини печінки // Тези доповідей всеукраїнської наукової конференції, присвяченої 160-річчю кафедри фізіології людини і тварин Київського національного університету імені Тараса Шевченка “Психофізіологічні та вісцеральні функції в нормі і патології”. – Київ (Україна). – 2002. – С. 117.

АНОТАЦІЇ

Комаренко В.І. Роль ендотелійзалежних факторів у регуляції ворітного кровообігу. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.13 – фізіологія людини і тварин. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2003.

Дисертація присвячена з’ясуванню участі ендотеліальних факторів регуляції тонусу судин у гуморальній регуляції ворітного кровообігу та вивченню механізму здійснення судинозвужувального впливу ацетилхоліну (АХ) на ворітні судини печінки. Дослідження виконані на білих лабораторних щурах, наркотизованих шляхом внутрішньоочеревинного введення розчину уретану (1 г/кг) чи нембуталу (40 мг/кг). Встановлено, що відомим вазодилататорам ацетилхоліну (АХ) та попереднику синтезу оксиду азоту (NO) L-аргініну у ворітному руслі печінки притаманна ендотелійзалежна судинозвужувальна дія, для якої характерний значний латентний період. Такий вазомоторний ефект досліджуваних речовин не опосередковувався дією NO чи такими ендотеліальними факторами звуження судин, як продукти циклооксигеназного окиснення арахідонової кислоти. Показано, що ендотелін-1 принаймні, частково здійснює свій звужувальний вплив у портальному руслі печінки шляхом активації ?-адренорецепторів. Блокада ?-адренорецепторів усувала і звужувальні реакції ворітних судин на АХ. І навпаки, атропін не впливав на констрикторний ефект АХ у цих судинах.

Таким чином, на підставі отриманих результатів можна вважати, що констрикторна реакція ворітних судин на ацетилхолін здійснюється під впливом судинозвужувального фактора(ів), який синтезується ендотеліоцитами під час активації специфічних атропінрезистивних ендотеліальних холінорецепторів і діє через ?-адренорецептори.

Ключові слова: ворітні судини, ацетилхолін, L-аргінін, ендотеліальні фактори (NO, ендотелін-1, простаноїди), М-холінорецептори, ?-адренорецептори.

Комаренко В.И. Роль эндотелийзависимых факторов в регуляции воротного кровообращения. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13 – физиология человека и животных. - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2003.

Диссертация посвящена изучению участия эндотелиальных факторов регуляции тонуса сосудов в гуморальной регуляции воротного кровообращения и выяснению механизма сосудосуживающего влияния ацетилхолина (АХ) в воротной части печеночного кровообращения. Исследования проводились в условиях острого опыта на белых лабораторных крысах, наркотизированных путем внутрибрюшного введения раствора уретана (1 г/кг) или нембутала (40 мг/кг).

Показано, что известные вазодилататоры АХ и предшественник синтеза окиси азота (NO) L-аргинин при внутрипортальном введении оказывают в воротном сосудистом русле констрикторный эффект. Такое действие АХ и L-аргинина является эндотелий зависимым и существенно угнетается блокадой фермента NO-синтазы эндотелиоцитов воротных сосудов. Но так как нитропруссид натрия – эндотелий независимый донор NO, вызывал сосудорасширяющий ответ в воротных сосудах, то сосудосуживающее действие АХ и L-аргинина в венозной системе печени, по-видимому, не связано с действием NO.

Несмотря на то, что АХ вводили непосредственно в портальную систему печени, прессорный эффект АХ в воротных сосудах этого органа проявлялся почти в три раза медленнее чем депрессорные реакции артериальных сосудов. Предположительно, что такое медленное развитие реакции повышения воротного давления связано с процессами синтеза и выделения эндотелиального вазоконстрикторного фактора(ов), который опосредует действие АХ в этих сосудах. Показано, что такие эндотелиальные сосудосуживающие факторы, как продукты циклооксигеназного окисления арахидоновой кислоты (простагландины Н2, F2б, тромбоксаны А2 и В2), не принимают участия в АХ-индуцированном суживании воротных сосудов.

Установлено, что в констрикторных реакциях воротных сосудов в ответ на действие эндотелина-1 (ЕТ-1) принимает участие адренергический фактор: ЕТ-1, по крайней мере, частично осуществляет свой сосудосуживающий эффект в портальном русле печени путем активации ?-адренорецепторов.

Констрикторные реакции воротных сосудов на АХ существенно угнетаются блокадой ?-адренорецепторов фентоламином. В то время, как неспецифический антагонист М-холинорецепторов атропин не влияет на прессорный эффект АХ в этих сосудах. Возможное участие интрамуральных нервных элементов в вызванном ацетилхолином суживании сосудов воротной системы печени не подтвердилось в опытах с блокатором Н-холинорецепторов дитилином. Его внутрипортальное введение не устраняло вазоконстрикторный эффект АХ в этом сосудистом русле.

Таким образом, на основе полученных результатов можно считать, что констрикторная реакция воротных сосудов на ацетилхолин осуществляется сосудосуживающим фактором, который синтезируется эндотелиоцитами вследствии активации специфических атропинрезистивных эндотелиальных холинорецепторов и действует через ?-адренорецепторы.

Ключевые слова: воротные сосуды, ацетилхолин, L-аргинин, нитропруссид натрия, эндотелиальные факторы (NO, эндотелин-1, простаноиды), М-холинорецепторы, ?-адренорецепторы.

Komarenko V.I. The role of endothelium-dependent factors in regulation of portal circulation. – Manuscript.

Dissertation for scientific degree of candidate of biological sciences on speciality 03.00.13 – physiology of human and animals. - Taras Shevchenko Kyiv National University, Kyiv, 2003.

Objectives of dissertation is to study the role endothelium-dependent factors of vessel tone control in humoral regulation of portal circulation and to investigate the mechanisms of acetylcholine-induced vasoconstriction in liver portal system.

It is proved that acetylсholine (Ach) and L-arginine, the precursor of nitric oxide synthesis, cause vasoconstriction in liver portal vessels. But in the remaining part of circulation its act as vasodilatators. It is demonstrated that this action of Ach and L-arginine is endothelium-dependent but is NO-independent. Endothelium-dependent constriction factors, such as products of cyclooxigenas oxidation, don’t take part in Ach-induced pressor effect of portal vessel.

For the first time it is demonstrated that ET-1, the strongest endothelium-derived vasoconstrictor, causes constriction in portal vessels partly by activation of б-adrenoreceptors.

Blocade of M-cholinoreceptors have no influence Ach-induced vasoconstriction in portal vessels. The б-adrenoreceptors blocade completely eliminates Ach-induced constractile effects in portal vessels.

Thus, this data shows that Ach-induced constriction of portal vessels evokes under the action of vasoconstrictor factors, wich synthesized by endothelium as a result of activation of specific atropin-resistant endothelial M-cholinoreceptors and acts through б-adrenoreceptors.

Kay words: portal vessels, acetylcholine, L-arginine, endothelial factors (endothelin-1, NO), M-cholinoreceptors, б-adrenoreceptors.