НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ІМЕНІ О.В.ПАЛЛАДІНА

КОРОБОВ В’ЯЧЕСЛАВ МИКОЛАЙОВИЧ

УДК 577.1:612.015.348:

616-001.8:612.6.03.

МЕХАНІЗМИ АДАПТАЦІЇ ССАВЦІВ ДО ГІПОКСІЇ

ЗА УЧАСТЮ ДИХАЛЬНИХ ГЕМОПРОТЕЇНІВ

03.00.04-біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Львівському національному університеті імені Івана Франка.

Науковий консультант - доктор біологічних наук, професор

Стародуб Микола Федорович,

завідувач відділу біохімії сенсорних та регуляторних

систем Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна

НАН України;

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Дмитренко Микола Петрович,

завідувач лабораторії біохімії Інституту екогігієни

та токсикології ім. Л.І.Медведя МОЗ України;

доктор біологічних наук, професор

Матишевська Ольга Павлівна,

професор кафедри біохімії Київського національного

університету імені Тараса Шевченка;

доктор медичних наук, професор

Середенко Михайло Михайлович,

завідувач відділу по вивченню гіпоксичних станів

Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України.

Провідна установа - Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, НДІ біології, відділ молекулярної біології та біотехнології.

Захист відбудеться “21” квітня 2003 р. о 1400 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії імені О.В. Палладіна НАН України за адресою: 01601, м. Київ-30, вул. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України за адресою: м. Київ-30, вул. Леонтовича, 9.

Автореферат розісланий 21.03.2003 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук ______________ Кірсенко О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальнiсть теми. З’ясування впливу гіпоксії на органiзм людини i тварин є важливою проблемою в бiологiї i медицині, яка набуває особливої актуальності з огляду на те, що гіпоксичний стан супроводжує багато захворювань, а також у зв’зку з необхідністю урахування цього феномену при науково обгрунтованому цілеспрямованому пошуку ефективних антигіпоксантів.

Iнтерес до гiпоксiї i необхiднiсть чiткої характеристики її прояву з'явилися давно, але при усiх наявних досягненнях наука просунулася в розумiннi механiзмiв розвитку гiпоксiї недостатньо глибоко i досi не вирiшенi проблеми адаптацiї органiзму до нестачi кисню, а також попередження гiпоксичного стану тканин та органiв.

Вiдомо, що кисневий гомеостаз реалiзується комплексом систем органiзму, де кисневотранспортна система має вирiшальне значення (Дударев В.П., 1979, Колчинська А.З., 1980, Стародуб М.Ф., 1987, Середенко М.М., 1988). Очевидно, структурно-функцiональна органiзацiя дихальних бiлкiв кровi та м'язiв гемоглобiну (Нb) та мiоглобiну (Мb) в значнiй мiрi визначає адаптивнi можливостi органiзму до нестачi кисню. Встановлення ролi цих бiлкiв в адаптацiї до гiпоксiї може бути реалiзоване шляхом вивчення особливостей їх структурно-функцiональної органiзацiї у тварин, якi здатнi зберiгати життя i високу працездатнiсть за умов тривалого припинення зовнiшнього дихання (бобер, ондатра, видра, нутрiя), а також в модельних експериментах, створюючи умови нестачi кисню у тканинах i повiтрi (гiпоксична, гемiчна гiпоксiя ).

З'ясування молекулярних механiзмiв адаптацiї тварин до нестачi кисню сприятиме цiлеспрямованому пошуку ефективних засобiв попередження та корекцiї гiпоксичних станiв, якi виникають при рядi патологiй, при перебуваннi людей в екстремальних умовах. Цим визначається актуальнiсть проблеми.

Проблема адаптації до нестачі кисню до цього часу розроблялась переважно на основі модельних експериментів з використанням традиційних об'єктів дослідження - лабораторних тварин. Майже не використовуються представники тваринного світу, природньо адаптовані до гіпоксії. Дослідження механізмів адаптації у порівняльно-еволюційному аспекті дає можливість з'ясувати, за рахунок яких механізмів неадаптований організм набуває властивості адаптованого. Для з'ясування механізмів адаптації організму до гіпоксії багато можуть дати дослідження на природньо адаптованих до дефіциту кисню тваринах, у тому числі на пірнаючих ссавцях, здатних затримувати зовнішнє дихання на значний період, підтримуючи при цьому високу працездатність.

Обмеженість знань пpо тонкі механізми змін кисневотpанспоpтної та антиоксидантної систем, індукованих кисневим голодуванням, є пpичиною дефіциту теpапевтичних засобів коpекції метаболічних поpушень в оpганізмі людини. Перспективним у цьому відношенні може бути каpнозин (-аланiн-L-гістидин), оскільки цей дипептид не є токсичним, має шиpокий спектp позитивної біологічної дії.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є частиною фундаментальних дослiджень кафедри біохімії та науково-дослiдної лабораторiї молекулярної та радіаційної біохімії Львiвського національного унiверситету iмені Iвана Франка за темами: “Вивчення молекулярних механізмів адаптації до нестачі кисню і розробка способів корекції систем транспорту газів з метою попередження гіпоксії тканин” (№ держ. реєстрації 0193U024093, термін виконання: 1.01.1992-31.12.1994), “Дослідження механізму дії карнозину на метаболічні реакції в умовах гіпоксії різної етіології” (№ держ. реєстрації 0193U024089, термін виконання: 1.01.1992-31.12.1995), “Дослідження механізму дії низькомолекулярних природних метаболітів” (№ держ. реєстрації 0195U026232, термін виконання: 1.01.1995-31.12.1997), “Дослідження механізму дії карнозину в корекції метаболічних порушень при гемічній та гіпоксичній гіпоксії” (№ держ. реєстрації 0193U024090, термін виконання: 1.01.1992-31.12.1995), “Низькомолекулярнi природнi метаболiти в корекцiї гiпоксичних станiв органiзму” (№ держ. реєстрації 0197U018113, термін виконання: 1.01.1997-31.12.1999), та “Регуляторна дія НАД та гістидинвмісних дипептидів в корекції метаболічних порушень при гіпоксії” (№ держ. реєстрації 0100U001443, термін виконання: 1.01.2000-31.12.2002).

Мета та завдання дослiдження. Провести порівняльні дослідження дихальних гемопротеїнів вторинноводних амніот і наземних ссавців та вивчити механізми адаптації організму до гіпоксії за участю цих білків. Розробити способи корекції функціональних порушень систем транспорту та утилізації кисню за умов гіпоксії.

Відповідно до поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

Наукова новизна одержаних результатів. У результатi проведених дослiджень вперше встановленi особливостi структурної органiзацiї Mb i Hb тварин, якi здатнi зберiгати життя i високу працездатнiсть в умовах періодичного припинення зовнiшнього дихання, що пов'язане з занурюванням у воду. Сформульовано положення про те, що вирiшальне значення у проявi функцiональних особливостей Mb мають заміщення амінокислот, локалiзованих на поверхнi молекули i не залучених у формування гiдрофобного ядра глобули. Досліджено, що в процесi еволюцiйного пристосування тварин до середовища iснування шляхом перiодичного занурення у воду, в гемопротеїнах кровi i м'язiв відбувались такі заміщення амінокислот, якi привели до пiдвищення розчинностi цих бiлкiв. Це забезпечувало збiльшення кисневої ємностi за рахунок можливого пiдвищення локальної концентрацiї гемопротеїнів в червоних клiтинах кровi та м'язiв без загрози їх кристалізації. Показано, що гiпоксична і гемічна гіпоксія індукують компенсаторні змiни кисневозв'язуючих, аутоокислювальних, пероксидазних і нітритредуктазних властивостей Hb. Цi змiни менше вираженi у тварин, природно адаптованих до нестачі O2 у зовнішньому середовищі, порiвняно з наземними ссавцями, що свiдчить про закрiплення природним добором предетермiнованих властивостей дихальних бiлкiв, якi забезпечують видову резистентнiсть до гіпоксії. Порівняльним експериментальним аналізом встановлено, що між спорідненістю Hb до О2 і кількістю продуктів ПОЛ у крові є прямий зв’язок, що дає можливість розглядати гемічну компоненту системи транспорту газів як резервну ланку антиоксидантного захисту і важливий фактор стабілізації прооксидантно-антиоксидантної рівноваги організму під час гіпоксичних стресів.

Показано, що корекцiя гiпоксичного стану органiзму може здiйснюватись м’язовим дипептидом карнозином, який співлокалізований із Mb і стимулює процеси окисного фосфорилювання в мітохондріях печінки щурів та пригнічує вільнорадикальні і перекисні процеси. Встановлено, що карнозин впливає на процеси утворення нiтрозо-Hb, змiнюючи iнтенсивність сигналiв Hb(FeIII)- та Hb(FeII)-комплексiв, а також активує нітритредуктазну компоненту циклу оксиду азоту (цNO) і гальмує дисоціацію комплексів NO з дихальними гемопротеїнами, чим збільшує потужність мобільного ендогенного депо NO і запобігає негативній дії оксиду азоту за умови його надлишкового утворення в разі гіпоксичних стресів.

Практичне значення отриманих результатів. Отриманi данi щодо структурно-функцiональних особливостей дихальних бiлкiв кровi та м'язiв тварин, еволюцiйно пристосованих до нестачi О2, можуть бути основою для цiлеспрямованого пошуку способів попередження розвитку гіпоксичних станів організму. Експериментально обгрунтовано доцільність використання як антигіпоксанта м’язового дипептиду карнозину і його комплексу з цинком.

Отриманi препарати Mb використані в науково-дослiдних роботах при створенні iмуносенсора для визначення концентрації Mb в кровi при iнфарктах мiокарда; моделюванні систем полегшеної дифузiї кисню (Інститут бiохiмiї НАН України, Київ; Інститут бiохiмiї НАН Білорусi, Гродно); вивченні бiофiзичних характеристик бiлкiв, опромiнених ультрафiолетом (Воронезький унiверситет, Росія); з’ясуванні функцiональних характеристик гемопротеїнiв у модельних системах (Медичний iнститут, Гродно). Виявленi антигiпоксичнi властивостi карнозину стали основою для проведення комплексних дослiджень по вивченню механiзмів дiї цього дипептиду на базi Московського державного унiверситету ім. М.В. Ломоносова, та Інституту нейрохірургії ім. А.П. Ромоданова АМН України.

Результати роботи використовуються під час читання курсу лекцій "Молекулярна бiологiя", “Біохімія”, “Біоорганічна хімія”, спецкурсів: "Структура та функцiї бiлкiв", “Біохімія крові” на біологічному факультеті Львiвського нацiонального унiверситету iменi Iвана Франка. Окремi положення, що витiкають із результатiв проведених дослiджень, включенi в опублiковану спільно зі Стародубом М.Ф. та Назаренком В.I. монографiю "Миоглобин: структура, свойства, синтез, биологическая роль" (К.: Наук. думка, 1992, 281с.).

Особистий внесок здобувача. Ідея та постановка завдання належать автору. Ним самостійно проаналiзовано значний об'єм вiтчизняної та іноземної лiтератури для планування та коректного виконання наукових експериментiв. Дослідження структурно-функціональних параметрiв Нb i Мb ссавцiв, визначення активностi ферментiв, вмісту окремих метаболітів в еритроцитах та плазмі крові, а також вивчення впливу карнозину на фiзико-хiмiчні і функціональні властивостi гемвмiсних бiлкiв проведено автором. Дослiдження параметрiв дихання та окисного фосфорилювання мiтохондрiй печiнки в нормі та в динаміці адаптації до гіпоксії виконані спiльно зi спiвробiтниками науково-дослідної лабораторії кафедри фiзiологiї людини i тварин Львiвського нацiонального унiверситету iменi Iвана Франка. Реєстрацiя спектрiв ЕПР проведена спільно з кандидатом фiзичних наук Падляком Б.В. В роботі використано результати досліджень первинної структури Mb напівводних амніот, встановлені спільно з аспiрантами кафедри бiохiмiї Дробот Л.Б., Сергієнко Л.М., Васильєвою В.О., Горчаковою Г.І. Рентгеноструктурний аналiз кристалiчних препаратiв Mb бобра i миші здiйснено спільно зі спiвробiтником Інституту бiофiзики АН Росiї (м.Пущiно) Шелестовим В.М. Молекулярну гібридизацію к-ДНК і міоглобінових м-РНК проведено у відділі біосинтезу нуклеїнових кислот Інституту молекулярної біології і генетики НАН України спільно з кандидатами біологічних наук Петренком О.І. та Дмитренком В.В.

Апробацiя результатiв дисертацiї. Матеріали дисертації доповідались на Республіканській конференції молодих вчених (Київ, 1975), ІІІ-ому Українському біохімічному з’їзді (Донецьк, 1977), Всесоюзній конференції "Эволюционная биохимия и происхождение жизни" (Єреван, 1978), Всесоюзній конференції з механізмів регуляції в системі крові (Красноярськ, 1978), ІV-ому Українському біохімічному з’їзді (Київ, 1982), Всесоюзній нараді "Надежность биологических систем" (Київ, 1985), V-ому Всесоюзному біохімічному з’їзді (Москва, 1986), V-ому Українському біохімічному з’їзді (Київ, 1987), Всесоюзній нараді "Транспорт кислорода и антиоксидантная система организма" (Гродно, 1989), ІV-ому Всесоюзному симпозіумі "Кровообращение в условиях высокогорной и экспериментальной гипоксии" (Душанбе, 1990), ІІ-й Всесоюзній конференції "Система микроциркуляции и гемокоагуляции в экстремальных условиях (Фрунзе, 1990), Всесоюзній конференції "Фармакологическая коррекция гипоксических состояний" (Гродно, 1991), VI-ому Українському біохімічному зїзді (Київ, 1992), Радіобіологічному з’їзді (Київ, 1993), I-му конгресі федерації Українських фармакологічних товариств (Львів, 1994), Міжнародному симпозіумі "Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов (Воронеж, 1996), Міжнародному симпозіумі "Кислород и свободные радикалы" (Гродно, 1996), Мiжнародному симпозiумi "Аминокислоты и их производные" (Гродно, 1996), VII-му Українському бiохiмiчному з’їздi (Київ, 1997), European Society for Clinical Investigations - 32-nd Annual Meeting (Kracov, 1998), 2-й Мiжнароднiй Парнасiвськiй конференцiї (Гданськ, 1998); V-й Мiжнароднiй конференцiї "Биоантиоксидант" (Москва, 1998), Мiжнародній конференцiї "Гипоксия: деструктивное и конструктивное действие" (Київ - Терскол, 1998), 18-й Конференції з питань магнітного резонансу (Познань, 1999), Міжнародній конференції "Свободнорадикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты" (Санкт-Петербург, 1999), 3-nd Parnas Conf. “Mechanisms of cellul. signal transduct. and communications” (Lviv, 2000), Междунар. конф. “Олигомеры VII” (Пермь, 2000), Ювілейна наукова конференція “Наукова спадщина академіка І.М. Буланкіна та її розвиток в сучасній біохімії” (Харків, 2001), International Symposium "Intracellular Signalling in Plant and Animal Systems (ISPAS)" (Kyiv, 2001), наук.-практ. конференція "Проблеми винахідництва та раціоналізаторства в Україні" (Львів, 2001), International meeting "Paraopt - 2001" (Lviv, 2001), Междунар. конф. "Биоантиоксидант" (Москва, 2002), 4-th Parnas Conf. “Molecular mechanisms of cell activation: biological signals and their target enzymes” (Wroclaw, 2002).

Публiкацiї. Результати дисертацiї представлені у 1 монографії, 59 статтях у наукових фахових журналах, 102 тезах у збiрниках матерiалiв з’їздiв, конференцiй та симпозіумiв і 3 патентах на винаходи.

Структура та обсяг роботи. Дисертацiя складається зі вступу, трьох роздiлiв (огляд лiтератури, матерiали i методи дослiджень, результати та їхнє обговорення), висновку та списку використаних джерел, який мiстить 453 найменування. Обсяг роботи становить 322 сторiнки. Дисертацiя проiлюстрована 58 таблицями та 50 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМIСТ РОБОТИ

ОГЛЯД ЛIТЕРАТУРИ

Систематизовано дані літератури щодо структурно-функціональних особливостей дихальних гемопротеїнів крові та м’язів ссавців, природно адаптованих до нестачі кисню в повітрі, що вдихається. Узагальнено результати досліджень про систему транспорту O2 при короткотривалій і довготривалій адаптації до гіпоксії. Проаналізовано молекулярні механізми взаємодії кисневотранспортної і NO-синтазної систем за умов гіпоксичних стресів. Опрацьовано дані літератури щодо фізіологічної та біохімічної ролі дипептиду карнозину, локалізованого в міоцитах разом з міоглобіном.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Експерименти проводилися на статевозрілих безпоpодних білих щуpах масою 170-200 г, які утpимувались в умовах стандаpтного хаpчового pаціону. Досліди проводили також на ссавцях, якi здатнi припиняти зовнiшне дихання на тривалий перiод, занурюючись під воду: бобр (Castor fiber L.), ондатра (Ondatra zibethica L.), видра (Lutra lutra L.), нутрія (Myocastor coypus L). При порівняльних структурних дослiдженнях використовували Hb людини (Homo sapiens L.) та миші (Мus musculus L), як попередньо охарактеризовані стандарти.

Гіпоксичний стан у досліджуваних тварин спричиняли, витримуючи їх у проточній барокамері, де створювали парціальний тиск кисню 56, 32, 28 mm Hg, що відповідає висоті над рівнем моря 7000, 9000, 11500 м відповідно. Гемічну гіпоксію моделювали шляхом внутрішньочеревного введення NaNO2 в дозі 50 мг/кг маси. Карнозин вводили щурам перорально у водному розчині об’ємом 1 мл у дозi 70 мг/кг маси тварини протягом дев’яти днiв і за 24 год до декапітації. Комплекс каpнозину з Zn був отpиманий сумісно з доцентом Зегждою Г.Д. з ацетату Zn на кафедpі неоpганічної хімії Дніпpопетpовського унівеpситету.

Mb виділяли із заморожених м'язів шляхом висолювання білків з водних екстpактів тканин за допомогою (NH4)2SO4 (Троицкая О.В, 1966). Кристалiчнi препарати Mb очищали за допомогою iонообмiнної хроматографiї, використовуючи ДЕАЕ-целюлозу, ДЕАЕ-сефадекс А-50, СМ-целюлозу-32. Розчиність Mb і Hb визначали за методом ступеневого висолювання (NH4)2SO4 (Березовский В.А., 1968). Мажорнi хроматографiчнi компоненти Mb використовували для отримання кристалiчних препаратiв за таких умов: вихiдна концентрацiя бiлка-6%, концентрацiя (NH4)2SO4 - 90%, буфер К-Na-фосфатний 0.1М, рН 7.0. Рентгенографiчно дослiджували кристалiчні препарати Mb за допомогою установки "УРС-60", дотримуючи такі умови: V=38 кВ, I=17 мА, експозицiя опромiнення – 7 год. Профiлі гiдрофобностi полiпептидних ланцюгiв Mb розраховували враховуючи вiльну енергiю переносу амiнокислотних залишкiв з фази конденсованої водної пари в фазу рiдкої води. Розрахунок здiйснювали для сегментiв з семи залишкiв, починаючи з N-, змiщуючи до С-кiнця молекули на один залишок. Популяції еритроцитів розділяли у градієнті густини сахарози за Сизовою та співавт. (Сизова И.А. и др., 1980). Hb отримували, гемолізуючи еpитpоцити К-Na-фосфатним буфеpом (33 мМ, pН 7.3). Концентрацію Нb визначали метціангідpиновим методом (Кушаковский М.С., 1968). Хроматографiчне фракцiонування НbО2 здiйснювали, використовуючи iонообмiнний сефадекс СМ-С-50. Градiєнтне вiдщеплення гему проводили за Квiном i Персоном (Quinn J.R., Pearson A.M., 1964). Дактилографiчний аналiз глобінів, здiйснювали за Інгремом (Ingram V., 1993). Пеpоксидазну активность Hb i Mb визначали викоpистовуючи гваякол і Н2О2 за методом Починок Х.Н. (1977) у модифiкацiї Гончара М.В. (1984). Електpофоpетичний аналіз Hb здійснювали методом електpофоpезу в поліакpиламідному гелі. Конфоpмаційні зміни Hb оцінювали використовуючи антитіла до окремих хроматографічних компонентів Hb, а також барвник – кумасi яскраво-блакитний G-250 (Ройтруб Б.А, 1975). Концентрацію вільного і мембранозв'язаного 2.3-БФГ вимірювали по pеакції з хpомотpоповою кислотою (Benesch R.E., Benesch E., 1969). Концентpації вільного кpеатину в еpитpоцитах визначення в безбілкових гемолізатах, викоpистовуючи кольоpову pеакцію з діацетилом за наявності -нафтолу (Виноградова И.Л., Багрянцева С.Ю, 1983). Активнiсть супероксиддисмутази (СОД) оцінювали за Чевари С. (1991), каталази - за Королюком М.А. (1988). Вмiст дiєнових кон'югатiв визначали по iнтенсивності поглинання кон'югованих дiєнових структур (Гаврилов М.И., 1983). Рiвень ТБК-позитивних продуктiв - за (Тимурбулатов Р.А., 1981). Концентрацію білка визначали за методом (Lowry O.H., et al., 1951). Оцінку кисневотpанспоpтної функції та киснево-лужної pівноваги кpові проводили за допомогою мікpоаналізатоpа АП-330 (Radiometr). Показник р50 оцінювали під час змішування та коpигування (Severinghaus J.W., 1966). Кисневозв’язуючi властивостi Hb гемолiзатiв еритроцитів периферичної кровi визначали спектрофотометрично в модифiкацiї Струбицького І.В. та ін. (1988). Динаміку синтезу Мb вивчали спектpофотометpичним методом, слідкуючи за pівнем експpесії міоглобінового гена за допомогою гібpидизації кДНК міоглобінового гена з полі-А-вмісними РНК. Тотальну РНК виділяли із заморожених тканин гуанідинізотіоціанатним методом (Chirgwin et al., 1979). Полі-А-РНК отримували фракціонуванням тотальної РНК на оліго-(dT)-целюлозі (Маниатис Т. и др., 1994). Дихання і окисне фосфорилювання в мітохондріях (MX) реєстрували полярографічним методом (Chance B. and Williams G.R., 1955). Середовище інкубації для МХ печінки містило 150мМ сахарозу, 50 мМ KCI, 1 мM KH2PO4, 3 мM трис-HCI буфер, pH=7.4. Утворення нiтрозильних комплексiв Hb фiксували методом електронного парамагнiтного резонансу (ЕПР) з використанням радiоспектрометра типу RADIOPAN SE/X-2544 (Польща). Генерацiю NO здійснювали за (Krхncke K.D., 1996). За ступенем переходу дезоксиHb у нiтрозоHb слiдкували за допомогою спектрофотометра Specord UV VIS M40 (Німеччина). Нiтритредуктазну активнiсть Нb i Мb реєстрували спектрофотометрично при =480 нм. Мембранозв’язаний Нb отримували з відмитих тіней еритроцитів (Назаренко В.І. та співавт., 1998). Дослідження кінетики дисоціації NO від нітрозоHb проводили за (Sharma V.S. et al., 1978).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Порівняльний аналіз просторової організації міоглобінів напівводних амніот і наземних тварин Профілі гідрофобності.

Аналiз розподiлу гiдрофобних кластерiв у лiнiйному ланцюгу Mb напiвводних ссавцiв у порiвняннi з Mb еволюцiйно вiддалених видiв дає змогу з’ясувати загальнi закономiрностi i особливостi структурної органiзацiї дослiджуваних гемопротеїдiв. Поданi на рисунку 1 профiлi гiдрофобностi свiдчать про те, що вони є ідентичні в ділянках найбiльшої гiдрофобностi з центрами локалiзацiї, розмiщеними над залишками 109Е i в ділянці дистального гiстидину Е7 (64) з максимумом над залишками 69I (в Mb бобра i ондатри) i 71А (в Mb бобра i видри).

Рис. 1. Профілі гідрофобності міоглобінів кашалота (1), бобра (2), ондатри (3) і миші (4).

Профiлi гідрофобності Mb пірнаючих і наземних ссавців зберiгають максимальний ступiнь гiдрофобностi в ділянці дистального гiстидину Е7(64), що свiдчить про однозначний характер просторової укладки полiпептидного ланцюга в ділянці гемового оточення. Незважаючи на нерівнозначність заміщеннь у позиції 87 (ліз асп) Mb миші, його профіль гідрофобності мало відрізняється від інших. Високий консерватизм у кластерному розподілі гідрофобних залишків супроводжується аналогією у b-закрутах і розміщенні a-спіралевих ділянок (рис. 2).

Рис. 2. a-спіралеві ділянки (a) та b-закрути (б) у міоглобінах бобра (1), ондатри (2) порівняно з міоглобінами кашалота (3) і миші (4).

Встановлено міжплощинні відстані дебаєвських ліній дебаєграм та параметри кристалічних решіток: a=5.98; b=2.79; c=3.23 і a=5.71; b=2.85; c=3.30 моноклінної сингонії Mb бобра і миші відповідно. Сукупність результатів рентгеноструктурного аналізу, розрахованих профілів гідрофобності, a-спіралевості та b-закрутів дає підставу стверджувати, що незважаючи на значну кількість амінокислотних заміщень, закріплених природним добором, має місце збереження загальної картини просторової організації Mb еволюційно віддалених тварин.

Отже, закріплені природним відбором амінокислотні заміщення на поверхні білкової матриці, що забезпечує формування сольватної оболонки, не порушують консервативного розподілу гідрофобного скефолда, що є необхідною умовою збереження функціонально-оптимальної просторової організації Mb.

Порівняльний аналіз фізико-хімічних і функціональних властивостей досліджуваних міоглобінів

Розчинність міоглобінів. Порівняльний аналіз заміщень амінокислотних залишків, розміщених на поверхні глобули Mb, що контактують з молекулами води, засвідчив, що сумарна величина доступності бокових груп амінокислот розчиннику зростає у ряді Mb мишібобраондатривидри і становить 1384.3; 1424.1; 1424.1 і 1419.9 відповідно, що визначає відносно високу розчинність Mb пірнаючих ссавців. Висока розчинність Mb вторинноводних амніот забезпечує насичення клітинного цитозолю гемопротеїном без загрози кристалізації у міоцитах, і є передумовою збільшення потужності NO-редуктазної ланки цNO та депонування О2.

Вплив pH на стабільність міоглобінів. Встановлено, що Mb резистентних до нестачі O2 тварин зберігають нативність при підкисленні середовища до pH 4.5. Для Mb миші і щура це значення досягає 5.1, що свідчить про відносно низьку резистентність Мb нестійких до дефіциту О2 тварин за умов ацидозу. Mb вторинноводних амніот зберігають нативну конфігурацію при більш кислому середовищі, ніж Mb миші.

Сп (значення pH, при якому в рівноважній системі денатуруючих молекул половина з них знаходиться у розгорнутому стані) у 0.1М фосфатному буфері для Mb миші становить 5.10±0.10, для Mb ондатри – 4.54±0.15, бобра і видри – 4.45±0.10 відповідно. Сумарний вклад гідрофобності у С-кінцевому домені Mb бобра, ондатри, миші, становить 7800, 7650 і 1950 відповідно. Отже, висока резистентність Mb вторинноводних амніот порівнянно з наземними тваринами визначається низьким ступенем експонованості на воду амінокислотних залишків, локалізованих у С-кінцевому домені білкової матриці.

Кисневозв'язуючi властивостi. Напiвнасичення киснем Mb, отриманих з м'язiв піддослідних тварин, вiдбувається при рО2 в iнтервалах 0.50-0.52; 0.62-0.67; i 3.2-3.5 мм рт. ст. при температурi 15, 20, 37С вiдповiдно. Встановлені особливості оксигенації Mb в залежності від температури є важливим фактором формування механізмів адаптації пірнаючих ссавців до нестачі О2. Оскільки занурення під воду супроводжується зниженням температури тіла, лівосторонній зсув КДК Mb забезпечує збільшення потужності О2-депонуючої компоненти системи транспорту газів.

Пероксидазна активнiсть. Показано, що пероксидазна активність Mb досліджуваних екологiчних груп ссавцiв зменшується у рядi: бобер (0.697±0.020 мкМ/сек)видра (0.586±0.020)щур (0.371±0.020)миша (0.298±0.010). Аналiз амiнокислотних замiщень в області “активного центру” Mb свiдчить про те, що два з них стосуються областi контакту з гемом: Thr- 67(10Е) Mb миші замiщено на Val у Mb бобра та Ile-99 (FG) також замiщено на Val у Mb видри. Внаслiдок вказаних замiщень у Mb вторинноводних амніот сумарна гiдрофобнiсть залишкiв, якi формують гемове оточення i безпосередньо контактують із гемом з дистальної сторони, збiльшується порiвняно із Mb наземних ссавців. Оскiльки залишок Val має бiльший об’єм порiвняно з Thr, то таке замiщення приводить до зменшення вiльного простору у гiдрофобному кластерi з дистальної сторони гему, що визначає високу пероксидазну активнiсть Mb тварин адаптованих до нестачі О2.

Порівняльний аналіз структурно-функціональної організації гемоглобінів резистентних і нерезистентних до гіпоксії тварин

Структура консерватиних ділянок гемоглобінів напівводних амніот. За кількістю трипсинових і хімотрипсинових пептидів, характером їх розподілу на фінгерпринтах, прямою детекцією окремих амінокислотних залишків і аналізом амінокислотного складу встановлена гомологія в структурній організації -ланцюгів досліджуваних Нb у наступних ділянках: (8-11), (12-16), (41-56), (57-61), (91-99), (140-141); -ланцюгів: (8-17), (31-40), (61-65), (95-103), (144-145). Консерватизм у відмічених ділянках забезпечує специфіку молекулярної морфології і функцій Нb. Встановлено, що сумарна доступність амінокислотних залишків для розчинника збільшується в ряді Hb: щуравидринутріїондатрибобра і становить відповідно 19991.0, 20211.0, 20274.0, 20504.2, 20650.0. Це вказує на відносно високу розчинність Hb напівводних амніот, і є передумовою досягнення високої концентрації гемопротеїну в еритроцитах, і як наслідок, підвищення кисневої ємності крові.

Кисневозв’язуючі та квазіферментативні властивості гемоглобінів. У процесi еволюцiйного розвитку в людини i тварин становився окиснювальний тип обмiну речовин. Необхiдною умовою пiдтримки вiдповiдного рiвня такого метаболiзму є безперервне i адекватне надходження О2 у тканини, що забезпечується кисневозв’язуючими властивостями Нb.

Для кривих оксигенації Hb напівводних амніот характерний зсув в ділянці верхньої інфлексії вліво і вверх. Значення р50 знаходиться в межах 23.5 - 26.9 mm Hg. Екстраполяція експериментальних значень log р50 на криву залежності спорідненості Hb до О2 від логарифму маси тіла тварини свідчить про те, що Hb пірнаючих має відносно більшу спорідненість до О2, ніж Hb наземних ссавців. Це забезпечує максимальне насичення крові киснем при енергійному диханні тварин перед зануренням у воду і сприяє рівномірній віддачі О2 тканинам під час тривалого перебування під водою.

Структурно-функціональна організація хроматографічних фракцій гемоглобінів. Хроматографічні фракції Hb вторинноводних амніот і наземних тварин відрізняються за амінокислотним складом, дактилограмами трипсинових і хімотрипсинових гідролізатів глобінів, значеннями еквівалентних точок преципітації, міцністю порфірин-глобінових зв’язків. Встановлено, що хроматографічні компоненти порівнювальних Hb відрізняються за швидкістю перетворення нітрит-аніона до NO (табл.).

Таблиця

Швидкість перетворення дезоксигемоглобіна

в нітрозогемоглобін (10-4 М с-1)

Тварини | Хроматографічні фракції гемоглобіна

I | II | III | IV | V

Щури | 2.35±0.08 | 2.80±0.05 | 3.36±0.12 | 3.91±0.21 | 3.75±0.19

Ондатри | 2.05±0.08 | 2.26±0.05 | 2.58±0.12 | - | -

Показано, що афінність мінорних компонентів досліджуваних Hb до кисню є вищою у порівнянні з мажорними. Установлені особливості функцій компонентів гетерогенної системи Hb складають основу формування мультипараметричних режимів постачання газів у дихаючі тканини згідно регіонарних запитів та функціонування певних ланок цNO за умов системних зсувів у кровоплині при транзиторній гіпоксії.

Вплив гіпоксичної гіпоксії на систему

транспорту і депонування кисню

Популяційний спектр еритроцитів периферичної крові за умов гіпоксичної гіпоксії. При порівнянні К4/6 (К4/6 – відносний вміст клітин 4-ї та 6-ї фракцій, які розміщуються в зонах 18- і 10% сахарози відповідно) у динамiцi адаптації тварин до гіпоксичної гiпоксiї виявляється неоднозначнiсть вiдповiдi за цим показником у пiддослiдних групах тварин. У крові ондатр К4/6 досягає максимального значення 2.06 на п’ятий день адаптацiї до гiпоксiї, різко знижується на 7-й день тренування до гiпоксiї і наближається до вихiдних значень на 40-й день адаптації, тоді, як у нормі, в крові щурів К4/6 становить 0.67. В процесі тренування тварин до гіпоксії К4/6 зростає і досягає максимуму після другого дня адаптації та зменшується до 0.27 на сьомий день дії гіпоксичного фактору. На 27-му добу адаптації цей коефіцієнт досягає значення 0.51 і залишається в цих межах включно до 40-го дня впливу гіпоксичного фактора. Зміни співвідношення 4-ї і 6-ї фракцій еритроцитів певною мірою зумовлені віковими особливостями популяційного складу червоних клітин. Різке збільшення К4/6 в перші дні впливу гіпоксії на тваринний організм, очевидно, зумовлене вивільненням депонованих еритроцитів, а також незрілих форм клітин кісткового мозку під дією стресового фактора. Зменшення К4/6, зумовлене виходом у периферійну кров молодих клітин, що підтверджується даними про вміст креатину в еритроцитах, який відображає ступінь омолодження клітин. На третю і дванадцяту доби адаптації до гіпоксії вміст креатину в еритроцитах зростає до 2.060.24 і 4.630.44 відповідно, порівняно з контролем 1.660.33 мкмоль/100 мл еритроцитів.

Гетерогенна система гемоглобіну за умов гіпоксії. Тривала дія гіпоксичного фактора супроводжується стабільним зростанням вмісту електрофоретичних фракцій Hb, які мають здатність асоціюватись з мембраною еритроцита і характеризуються відносно високою афінністю до О2 (р50 22.00.1 mm Hg), низьким коефіцієнтом Хілла (n=1.500.8) і за пероксидазною активністю перевищують цитозольний Hb у 2.4 рази. Встановлено, що в процесі адаптації кількісні зміни компонент гетерогенної системи Hb супроводжуються також змінами їх фізико-хімічних властивостей. Отримані дані узгоджуються з результатами інших дослідників (Стародуб, 1982), щодо впливу ряду фізико-хімічних факторів на систему Hb. Індукована гіпоксичним фактором гемоглобінізація еритроцитів онтогенетично ранніми формами Hb сприяє переходу від короткотермінової до довготривалої фази адаптації організму до гіпоксії, оскільки для фетальних форм Hb характерна відносно низька спорідненість до ендогенного NO, генерація якого посилюється в разі гіпоксичних станів організму. Спорідненість дезоксиHb до NO в 1.4 рази менша для мінорних компонент Hb щура, які представлені тетрамером типу 2 2с (Стародуб М.Ф. та співавт.,1979, Стародуб М.Ф.,1982), в порівнянні з нефракціонованим Hb. Показано, що гіпоксія ініціює функціональні зміни компонент Hb. На фоні загального пригнічення нітритредуктазної активності Hb за умов гіпоксичного стресу має місце зменшення її інтенсивності для мажорних і тенденція до збільшення її для мінорних компонентів Hb. Установлені особливості функцій компонентів гетерогенної системи Hb складають основу формування мультипараметричних режимів функціонування певних ланок цNO за умов системних зсувів у кровоплині при транзиторній гіпоксії.

Кисневозв’язуючі властивості гемоглобіну за умов гіпоксії. Одноразове перебування тварин в умовах нестачі О2 в повітрі, що вдихається, індукує лівосторонній зсув КДК і збільшення спорідненості Hb до О2 (рис. 3).

Встановлена видова специфічність в інтенсивності збільшення спорідненості Hb до О2 і в характері розміщення КДК в ділянці верхньої та нижньої інфлексії. Для Hb вторинноводних амніот характерно відносно менше зміщення р50 в бік низьких рО2 порівняно з наземними тваринами. Особливістю Hb у тварин стійких до нестачі О2 є більш виражене зміщення КДК вправо в ділянці як нижньої, так і верхньої інфлексії кривої оксигенації. На короткотривалу нестачу О2 наземні тварини відповідають зміщенням КДК вліво і вверх у ділянці верхньої і вправо в ділянці нижньої інфлексії.

Рис. 3. Усереднені КДК Hb щурів у нормі (1) при одноразовому впливові гіпоксії (2), при адаптації до гіпоксії (3); 1*, 2*, 3* – відповідно для гемоглобінів ондатр (А), криві Літарчика (Б).

Лівосторонній зсув КДК Hb зумовлений модифікацією його оксидом азоту, генерація якого збільшується за умов гіпоксичних стресів, про що свідчить зменшення вмісту попередника NO – L-аргініну у плазмі крові з 11.710.849 нмоль/0.1 мл у контролі до 6.6340.591 нмоль/0.1 мл при гіпоксії, а також прямі експерименти по дослідженню генерованого in vitro NO на КДК Hb. Встановлено, що при pNO 1.5 mm Hg у сатураторі, де міститься Hb, р50 зсувається у бік низьких рО2. Показано, що інкубація Hb з МДА приводить до зменшення р50 з 25.000.9 до19.050.8 mm Hg. Отже, за умов гіпоксичного стресу в результаті активації ПОЛ малоновий діальдегід ініціює лівосторонній зсув КДК оксиHb в область низьких рО2, підвищення спорідненості Hb до кисню.

Пероксидазна і нітритредуктазна активність гемолізатів еритроцитів периферичної крові щурів у динаміці адаптації до гіпоксії. Встановлено, що одноразовий вплив гіпоксичного фактора супроводжується незначним зниженням пероксидазної активності Hb гемолізатів отриманих із фракції старіючих еритроцитів. Для Hb з гемолізатів нефракціонованих і фракцій молодих червонокрівців характерне різке пригнічення пероксидазної активності на другу добу періодичного переривчастого впливу гіпоксії. Така тенденція простежується до сьомої доби адаптації. На дев’яту добу у фракції старіючих еритроцитів пероксидазна активність досягає найвищого значення і далі залишається без змін протягом усіх досліджуваних термінів адаптації. Аналогічна закономірність простежується для Hb нефракціонованих і популяції “молодих” еритроцитів до дев’тої доби адаптації. Зміни пероксидазної активності в процесі адаптації до нестачі О2 узгоджуються з результатами нітритредуктазної активністі Hb, яка зменшувалася під впливом гіпоксичного фактора з 3.81±0.08 до 3.15±0.05 (Hb щура) та 2.32±0.310-4с-1 (Hb ондатри).

Вплив гіпоксії на біосинтез міоглобіну у тканинах різних органів. Із радіоавтографів (рис. 4) видно, що у м'язах на другий день перебування щурів у барокамері, де створювався рО2, що відповідає 7000 м н.р.м., кількість Mb мРНК зменшується.

Рис. 4. Радіоавтографи гібридів кДНК міоглобінового гена з сумарними полі-А-РНК мозку (1), скелетних м’язів задніх кінцівок (2), печінки (3) та нирок (4) щурів.

Тривалий вплив гіпоксичного фактора ініціює збільшення Mb мРНК у м'язах. Ці дані корелюють із вмістом Mb у міоцитах. Так, якщо у інтактних тварин концентрація Mb становить 0.30.02 мг/г сухого м’язу, то в при короткотривалому періоді адаптації до гіпоксії його кількість зменшується до 0.180.05 мг/г сухої тканини. На 55-й день тренування до нестачі О2 вміст Mb у м’язах зростає до 0.610.02 мг/г. У мозку 55-денне тренування до гіпоксії спричиняє стабільне збільшення Mb мРНК, навпаки, в печінці і нирках кількість Mb мРНК на 55-ту добу адаптації до гіпоксії дещо менша порівняно з нормою. Інтенсивність радіоактивного сигналу зменшена у гібридизаційному матеріалі з концентрацією полі-А-РНК від 0.1 до 10мкг, а починаючи з 0.01 до 0.001мкг радіоактивний сигнал зникає повністю. Виявлені органні відмінності синтезу Mb мРНК, у різні фази формування адаптивної реактивності організму до гіпоксичної гіпоксії, відображають особливості характеру направленого розподілу О2 індукованого гіпоксією між органами і тканинами.

Отже, експресія Mb генів у процесі адаптації тварин до гіпоксії відбувається згідно з органоспецифічними потребами в О2 і сприяє компенсації гіпоксичного стану.

Вплив гіпоксичної гіпоксії на енергетичний обмін у мітохондріях печінки. Показано, що швидкість нефосфорильованого дихання (V2) при окисненні екзогенного сукцинату МХ печінки щурів зростає з 18.3±1.0 до 24.2±1.4 нг-атом О на мг білка, дихальний контроль (ДК) за Чансом після першого сеансу гіпоксії збільшується з 3.30 до 4.40. У той же час при окисненні ?-кетоглутарату (?-КГ) швидкість нефосфорилюючого дихання майже не змінюється. Разом з тим у МХ печінки ондатр не спостерігали збільшення V2 при окисненні сукцинату. ДК збільшувався з 1.57 у нормі до 2.15 при гіпоксії. Подібно до МХ щурів у органелах ондатр, починаючи з третього дня адаптації, простежується поступове збільшення використання ?-КГ.

Отже, тривала дія гіпоксичного фактора супроводжується зниженням активності сукцинатоксидазного шляху окиснення і переключенням МХ на використання ?-КГ.

Перекисне окиснення ліпідів і антиоксидантна система за умов гіпоксичної гіпоксії. Чотирьохгодинне перебування щурів у барокамері з низьким рО2 ініціює збільшення вмісту ТБК-позитивних продуктів в еритроцитах на 35% порівняно з контролем. Стимульована гіпоксією ліпопероксидація відбувається на фоні зниження активності антиоксидантних ферментів СОД і каталази – на 50 та 25% відповідно. Через 24 години після одноразового впливу гіпоксичного фактора активність СОД наближається до норми, а активність каталази збільшується на 17%. На третій день адаптації тварин до гіпоксичної гіпоксії рівень ТБК-позитивних продуктів нормалізується. Протилежні зміни були простежені в еритроцитах ондатри: активність каталази зростає на 21%, а кількість МДА зменшується на 16% у терміновий період адаптації. Встановлена неоднозначність відповіді у досліджуваних системах на гіпоксичний фактор у представників різних екологічних груп свідчить про наявність в організмі вторинноводних амніот генетично закріпленого комплексу механізмів адаптації, у тому числі можливості отримання енергії за рахунок додаткового О2, що вивільняється в результаті активації ферментативних ланок антиоксидантного захисту і насамперед каталази.

Динаміка вмісту метаболітів NO в процесі адаптації до гіпоксії. Закономірності екскреції кінцевих метаболітів NO (NO2- + NO3-) у сечі в динаміці адаптації до гіпоксії мають видоспецифічний характер і відображають особливості функціонального стану L-аргінін – NO системи (рис. 5).

На відміну від щурів у сечі природно резистентних до гіпоксії ондатр, після одноразового перебування у гіпобаричних умовах кількість стабільних продуктів NO зменшується у порівнянні до вихідних значень. Цей факт свідчить про те, що у пірнаючих ссавців розвинуті механізми швидкого використання ендогенного NO через активацію NO2-/NO3- – редуктазних реакцій. Важливо, що у нормі в ондатр NOx виділяється в шість разів більше, ніж у щурів. У перехідний період адаптації концентрація NOx у сечі ондатр зростає і набуває максимальних значень на 15–й день дії переривчастого гіпоксичного фактора. Використання інгібітора ксантиноксидази – алопуринолу – засвідчило, що головний внесок у генерацію NO в організмі щурів за умов гіпоксії має нітритредуктазна ланка цNO.

Рис. 5. Вміст NOx (NO2- + NO3-) в сечі щурів (заштриховано) та ондатр в динаміці адаптації до гіпобаричної гіпоксії; к – контроль.

Отже, у системі швидкого реагування організмів на гіпоксичний стрес першорядну адаптивну роль відіграє NO, що утворюється кисневонезалежним шляхом відновлення ендогенних нітрит- та нітрат-аніонів гемічою компонентою системи транспорту газів і молібденвмісною NADH-залежною ксантиноксидазою.

Взаємозв’язок між кисневотранспортною, кисневоутилізуючою і антиоксидантними системами організму за умов гіпоксії

Результати досліджень структурно-функціональних перебудов у антиоксидантній та кисневотранспортній системах у динаміці адаптації до гіпобаричної гіпоксії свідчить про те, що у ранній період адаптації збільшення спорідненості Hb до О2 передує зменшенню продуктів ПОЛ і відновленню активності ферментів АОС (рис. 6).

Хід кривих, які відображають динаміку змін у функціональному стані кисневотранспортної та антиоксидантної систем у динаміці адаптації до гіпоксії, свідчить про те, що гіпоксичний стрес спричиняє збільшення спорідненості Hb до О2, пригніченню ферментів АОС, збільшенню ТБК-позитивних продуктів.

Рис. 6. Зміни p50 HbO2 (1); активності каталази (2); COД (3); ТБК-позитивних продуктів (4) у