НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут фізіології рослин і генетики

лужецький Андрій миколайович

УДК 575.224+577.21

система клонування генів у штамах актиноміцетів – продуцентах канаміцину streptomyces kanamyceticus та ландоміцину е streptomyces globisporus 1912

03.00.15 – генетика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Львівському національному університеті імені Івана Франка

Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: кандидат біологічних наук, доцент

Федоренко Віктор Олександрович,

Львіський національний університет імені Івана Франка

завідувач кафедри генетики та біотехнології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

член-кореспондент НАН України

Мацелюх Богдан Павлович

Інститут мікробіології і вірусології ім.Д.К. Заболотного НАН

України

завідувач відділу генетики мікроорганізмів

кандидат біологічних наук

Кухаренко Олександр Петрович

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України

старший науковий співробітник відділу молекулярної

генетики

Провідна установа: Інститут біології клітини, НАН України, м.Львів

Захист дисертації відбудеться “16” жовтня 2003 р. о 12 годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.212.01 Інституту фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: м. Київ, вул. Васильківська, 31/17.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології рослин і генетики НАН України, м. Київ, вул. Васильківська, 31/17.

Автореферат розісланий “ 10 ” вересня 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізовної вченої ради, ________________ Труханов В.А

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Актиноміцети – прокаріотичні міцеліальні грампозитивні мікроорганізми, які продукують більше половини описаних та понад 90% промислово важливих антибіотиків [Kieser T. et al., 2000]. Streptomyces globisporus 1912 та Streptomyces kanamyceticus 1 є продуцентами канаміцинів та ландоміцинів, відповідно. Канаміцин А є представником 2-дезоксистрептамінових антибіотиків, які широко використовуються у лікуванні різних інфекційних захворювань, зокрема туберкульозу [Маланичева И.А. та ін., 1992]. Ландоміцин Е належить до групи ангуциклічних полікетидних антибіотиків, які володіють потужною протипухлинною активністю, вперше описаний у 1994 р. [Мацелюх Б.П. та ін., 1998]. З огляду на те, що у світі постійно зростає число людей хворих на рак чи туберкульоз, вивчення біосинтезу канаміцинів і ландоміцинів набуває важливого значення. Необхідно вивчити механізми синтезу цих антибіотиків та стійкості до них, розробити підходи для генетичного та генно-інженерного конструювання продуцентів цих антибіотиків.

Для успішного використання сучасних методів генетичної інженерії у вивченні штамів актиноміцетів необхідно володіти ефективними способами введення рекомбінантних ДНК в їхні клітини. Проте дуже часто наявні методики перенесення рекомбінантних плазмід в клітини актиноміцетів не є достатньо ефективними [Kieser T. et al., 2000]. Особливо це стосується промислових штамів актиноміцетів та слабо вивчених нещодавно відкритих видів [Гловер Д., 1988., Kieser Т. et al., 2000]. Такі труднощі є серйозною перешкодою як у вивченні генетичного контролю біосинтезу антибіотиків, так і їхньому генно-інженерному конструюванні, а отже і у безпосередньому використанні у медичній практиці. Розвязання цих проблем дозволило б у повному обсязі використовувати сучасні генно-інженерні методи з метою конструювання штамів актиноміцетів, що відкриває широкі перспективи для отримання рекомбінантних штамів з підвищеним біосинтезом антибіотиків, дозволяє отримувати штами - продуценти нових гібридних сполук. Тому пошук нових підходів до створення ефективних систем клонування в штамах актиноміцетів – продуцентів антибіотиків є завданням першочергової ваги.

Зв’язок роботи з науковими програмами організації, де виконувалась дисертація. Дана робота виконувалась у науково-дослідній лабораторії генетики, селекції та генетичної інженерії продуцентів антибіотиків (НДЛ-45) при кафедрі генетики та селекції Львіського національного університету імені Івана Франка в рамках науково-дослідних тем БГ-621Д "Кло-нування і вивчення генів актиноміцетів, які контролюють біосин-тез антибіотика канаміцину з метою конструювання його продуцен-тів" (номер державної реєстрації - 0193V033289), БГ-162Б "Вивчення генетичного контролю біо-синтезу канаміцину та одержання промислових штамів-продуцентів канаміцину з підвищеною активністю (номер державної реєстрації – 0193U009889), Бг-12б “Розробка методів генетичного та генно-інженерного конструювання штамів-продуцентів протиракових антибіотиків” (2000-2002, номер держреєстрації – 0197U018080), Бг-117б „Генетичний контроль біосинтезу протипухлинних антибіотиків ландоміцинової групи”(2003-2005, номер держреєстрації - 0197U011132). Ці дослідження також були підтримані міжнародним грантом INTAS-Україна 95-20 “Біотехнологічне вдосконалення продуцента нового потенційного протипухлинного антибіотика” (1997-2000), ВМВF 0311308 „Резистентність до власних антибіотиків у продуцентів антибіотиків” (1996-1998) та індивідульним грантом для молодих науковців INTAS-YSF 00-186 (2001-2003 рр.).

Мета та завдання дослідження. Метою цієї роботи є створення ефективних систем клонування в штамах S. globisporus 1912 i S. kanamyceticus 1. Для досягнення цієї мети були поставлені такі зав-дання:

- розробити методику введення реплікативних та інтегративних рекомбінантних плазмід у досліджувані штами;

- охарактеризувати стабільність успадкування реплікативних та інтегративних плазмід та їхній вплив на біосинтез антибіотиків та стійкість до них досліджуваними штамами;

- вивчити характер інтеграції плазмід, сконструйованих на основі фага С31;

- дослідити придатність розробленої методики для перенесення плазмідних ДНК в ряд штамів актиноміцетів;

- показати можливість вивчення генів біосинтезу ландоміцинів шляхом їхнього спрямованого руйнування та гетерологічної експресії в інших штамах продуцентах;

Об’єкт дослідження: штами Streptomyces kanamyceticus та Streрtomyces globisporus.

Предмет дослідження: система клонування генів у цих штамів.

Методи дослідження: генетичні (міжродова кон‘югація, спрямоване руйнування генів, гетерологічна експресія генів); мікробіологічні (визначення атибіотичної продуктивності штамів та стійкості до антибіотиків), молекулярно-біологічні (виділення плазмідних та сумарних ДНК, обробка ендонуклеазами рестрикції, Т4 ДНК лігазою, фрагментом Кленова, ДНК-ДНК гібридизація); хімічні (тонкошарова хроматографія, мас-спектральний аналіз, високоефективна рідинна хроматографія) та біоінформатичні (порівняльний аналіз нуклеотидних та амінокислотних послідовностей).

Наукова новизна отриманих результатів. В результаті виконаної роботи вперше створено ефективну методику перенесення плазмідних ДНК в штами S. globisporus 1912 i S. kanamyceticus 1. Показано ефективність використання цієї методики для цілого ряду штамів актиноміцетів - продуцентів антибіотиків, для яких до цього часу інших шляхів перенесення рекомбінантних ДНК описано не було. Охарактеризовано вплив реплікативних та інтегративних плазмід на біосинтез ландоміцинів та канаміцинів, стабільність їхнього успадкування в досліджуваних штамах. З допомогою ДНК-ДНК гібридизації досліджено характер інтеграції плазміди pSET152 в хромосоми штамів S. globisporus 1912, S. kanamyceticus 1, S.fradiae Tu2717 і S.cyanogenus S136. Вперше клоновано та секвеновано ділянки хромосоми штаму S. kanamyceticus 1, в які проходить інтеграція плазміди pSET152. Сконструйовано конюгативну плазміду із здатністю інтегруватися з використанням інтегративної системи фага VWB. Показано перспективність використання нової інтегративної системи для отримання стабільних рекомбінантих штамів S. globisporus 1912 та S. kanamyceticus 1. В результаті спрямованого руйнування гена отримано докази, що lnd-гени контролюють біосинтез ландоміцину Е, і показано перспективність використання цього методу для вивчення інших генів біосинтезу.

Вперше показано перспективність використання lnd-генів для їхньої гетерологічної експресії в штамі S.fradiae Tu2717. Також в ході вивчення ефективності проходження гомологічної рекомбінації в штамі S.cyanogenus S136, вперше отримано ряд нових ландоміцинів у цьому штамі. В результаті мас-спектрального аналізу виявлено, що у цих сполук змінений як аглікон, так і глікозидна частина.

Практичне значення отриманих результатів полягає в можливості використання створеної методики перенесення рекомбінантних ДНК в штами актиноміцетів у експериментах з комбінаторного біосинтезу нових біологічно активних сполук. Створені вектори можуть бути використані для отримання стабільних рекомбінантних штамів актиноміцетів. Отримані штами ексконюгантів можуть використовуватися як реципієнти для гетерологічної експресії генів. Нові ландоміцини та урдаміцини, що їх продукують ексконюганти штамів S.cyanogenus S136 та S.fradiae Tu2717, можуть мати новий спектр цінних біологічних активностей.

Особистий внесок здобувача. Під час виконання дисертаційної роботи автором особисто виконано весь обсяг експериментальних досліджень. Для конструювання плазмід, що несуть гени біосинтезу ландоміцинів, використані клони з бібліотек, які містять lan- та lnd- кластери, клоновані і секвеновані співробітниками НДЛ-45 Ю.Демидчук, К.Панькевич та співробітниками Фрайбурзького університету (ФРН). Аналіз та інтерпретація отриманих результатів проведені за участю наукового керівника та співавторів.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що включені до дисертації, оприлюднені на Конференціях німецького мікробіологічного товариства (VAAM) “Біологія актиноміцетів” (Дрезден, ФРН, 26-28 вересня, 1999), “Біологія природніх продуктів бактерійного походження” (Фрайбург, ФРН, 29 вересня - 1 жовтня 2002 ), ІІ З’їзді Українського мікробіологічного товариства (Чернігів, 2000), Міжнародній конференції з молекулярної біології та генетики для студентів, аспірантів та молодих вчених, присвяченій 100-річчю генетики (Львів, 20-22 квітня, 2000), 2 Міжнародній медичній конференції для студентів та молодих вчених (Люблін, 28-30 квітня, Польща, 2000), Всепольському мікробіологічному симпозіумі (Краків, 6-8 вересня, 2001), 12 Міжнародному симпозіумі з біології актиноміцетів (Ванкувер, Канада, 5-9 серпня, 2001), Всеукраїнській конференції студентів та аспірантів „Біологічні дослідження молодих вчених на Україні” (Київ, 1-3 жовтня, 2001), 8 міжнародній науковій конференції аспірантів та молодих науковців (Гданськ, Польща, 4-6 травня, 2000), 7 Конференції молодих вчених “Біологія – наука XXI століття” (Пущино, 12 квітня 2003), Всеукраїнській науково-практичній конференції „Біотехнологія. Освіта. Наука”(Киів, 10-11 лютого, 2003), на звітних наукових конференціях Львіського національного університету імені Івана Франка (2001-2003).

Публікації. Результати дисертації опубліковані 25 роботах, з них 9 статей у провідних фахових виданнях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, експериментальної частини (Матеріалів та методів досліджень, результатів та їхнього обговорення), висновків, списку використаних джерел, що охоплює 161 найменувань та одного Додатку. Роботу викладено на 164 сторінках машинописного тексту і проілюстровано 49 рисунками та 6 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

Штами бактерій та плазміди. У роботі використані штами S.globisporus 1912 S.kanamyceticus 1 , S.fradiae Tu2717, S.cyanogenus S136, S.coelicolor А(3)2, S.lividans TK54, та їхні ексконюганти, отримані автором у цій роботі, E.coli DH5б, E.coli ET12567 (pUB307). Як вектори для клонування ДНК та перенесення в штами актиноміцетів використали плазміди pSOK101, pSOK201, pCHZ101, pWA1, pSET152, pOJ260, в E.coli – pUC18/19, pBluescript 2KS+/SK+, pMun2.

Середовища. Для отримання спор актиноміцетів та виконання міжродових схрещувань використовували вівсяне середовище, склад якого запропонований автором [Лужецький і ін., 2000], для регенерації протопластів - R2YE, рідкі середовища YEME, TSB, SG використовували для продукції антибіотиків, отримання біомаси штамів та протопластів [Kieser et al., 2000].

Міжродову кон’югацію проводили за методикою, розробленою автором[Лужецький і ін., 2000].

Визначення стійкості штамів до антибіотиків виконували як описано [Демидчук Ю.О., 1998].

Тонкошарову та високофективну рідинну хроматографію метаболітів, спектральний аналіз ландоміцинів та урдаміцинів виконували згідно [Мацелюх Б.П. та ін., 1999; Fernandez-Moreno M. et al., 2001; Hoffmeister D. et al., 2000]

Генно-інженерні маніпуляції з ДНК (виділення ДНК, секвенування, конструювання та аналіз рекомбінантних молекул ДНК, ПЛР, ДНК-ДНК гібридизація) виконували згідно cтандартних методик [Kieser et al., 2000, Sambrook et. al, 1989).

Аналіз нуклеотидних та імовірних амінокислотних послідовностей виконували за допомогою програм REFLECTION, BLAST 2.0, BOXSHADE, DNASIS, NEBCUTTER, CLUSTAL W [Altschul, S. F. et. al, 1997, Genetic Computer Croup, Wisconsin, USA]

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХНЄ ОБГОВОРЕННЯ

1. Генетична трансформація протопластів штамів S. globisporus 1912 та S.kanamyceticus 1.

Метою даного етапу роботи був пошук умов, за яких можна було б успішно використати цей процес для штамів S. globisporus 1912 i S. kanamyceticus 1.

Протопласти S. globisporus 1912 i S. kanamyceticus 1 отримували в титрі від 107 до 108 протопластів на 1 мл. Титр регенерантів становив від 106 до 107 клітин/мл. Однак спроби трансформувати протопласти S. kanamyceticus 1 плазмідами pIJ702, pWHM4, pTO1 та pSET152 за допомогою стандартної методики [Kieser et al., 2000] виявились неуспішними. Нам не вдалося отримати трансформантів штаму S. kanamyceticus 1 з частотою вищою, ніж 1 10-8 трансформантів/мл. Частота отримання pSET152+ та pIJ702Ermr+ трансформантів штаму S.globisporus 1912 становила 3-18 клонів на 1 мкг ДНК. Така низька частота трансформантів штаму S.globisporus 1912 є недостатньою для використання цього методу з метою генно-інженерного конструювання продуцента ландоміцину Е шляхом спрямованого руйнування генів. Для порівняння частота отримання трансформантів модельного штаму S.lividans TK64 становить близько 105 трансформантів на 1 мкг плазмідної ДНК pIJ702 [Kieser et al., 2000]. З літератури відомо, що після виділення плазмід pCNB4001, pGM160, pWHM4 з штаму S.globisporus 1912 та наступної їхньої ретрансформації у цей самий штам, частота трансформації значно зростає [Мацелюх А.Б., 2001]. Проте, використовуючи подібну ретрансформацію, неможливо здійснити спрямоване руйнування генів у штамі S.globisporus 1912, а цей метод є одним з найпоширеніших і найточніших способів вивчення функціонування генів. Зважаючи на це, ми були змушені шукати нові способи введення рекомбінантних ДНК в штами S. globisporus 1912 i S. kanamyceticus 1.

2. Ефективність проходження кон’югації в системі E.coli–Streptomyces під контролем плазмід різних груп несумісності.

Альтернативним шляхом введення плазмідної ДНК в штами актиноміцетів є міжродова кон`югація в системі E.coli–Actinomycetales [Mazodier et al., 1989]. Ми дослідили, як приналежність плазмід до груп несумісності IncPб, IncI1, IncFII та IncQ відображається на ефективності проходження кон`югації між E.coli та штамами Streptomyces. Як донор в схрещуваннях використовували штам E.coli BW103, який несе кон‘югативні плазміди різних груп несумісності: pUB307 (IncPб), pLG221 (IncI1), pOX38-Km (IncFII). Реципієнтом був обраний штам S.lividans TK54, який є модельним об’єктом генетики актиноміцетів. Для порівняння ефективності кон‘югаційного перенесення, яке забезпечується плазмідами різних груп несумісності, ми сконструювали вектори pSFT606 і pSIT87, які містять oriT плазмід різних груп несумісності IncFII та IncI1, відповідно (рис.1). Вектори pSET152 і RSF1010, містять oriT з плазмід груп несумісності IncPб та IncQ, відповідно.

Найвища частота екскон‘югантів (2,7 0,2) 10-2 спостерігалася при використанні пари плазмід pUB307 і pSET152 IncPб-групи несумісності. Оскільки в інших 9 варіантах екскон‘юганти не виникали, принаймні з частотою <10-8, то можна зробити висновок, що продукти генів, які відповідають за перенесення молекул плазмідної ДНК однієї групи несумісності, не можуть бути замінені продуктами генів плазмід інших груп несумісності.

Бактерії, які несуть кон?югаційні плазміди різних груп несумісності, мають відмінні Mpf- (mating-pair formation) системи формування міжклітинного контакту між донором і реципієнтом [Bates S et al., 1998]. Щоб перевірити, за рахунок чого плазміди IncPб-групи несумісності ефективного перенсяться в штами актиноміцетів, ми використали плазміду RSF1010, яка містить власну специфічну ділянку oriT, а також білки Mob, які відповідають за процес перенесення ДНК під час кон?югації. Тому ефективність перенесення цієї плазміди з клітин E.coli в S.lividans в основному залежить від Mpf-системи донорної tra-плазміди. Провівши наступні схрещування - E.coli BW103 (pUB307 RSF1010) S.lividans TK54, E.coli BW103 (pLG221 RSF1010) S.lividans TK54 i E.coli BW103 (pOX-Km RSF1010) S.lividans TK54, ми отримали екскон?юганти штаму S.lividans TK54 (RSF1010) тільки після кон‘югації, де була використана плазміда pUB307 IncPб-групи несумісності. Цей факт вказує на те, що саме Mpf-система плазмід IncPб групи несумісності головним чином відповідає за здатність штамів E.coli до перенесення ДНК під час міжродової кон?югації.

3. Динаміка проходження міжродової кон'югації між E.coli – Streptomyces lividans

Наступним етапом роботи було дослідження динаміки міжродового кон'югаційного процесу в системі E.coli – Streptomyces. Експерименти проводилися з метою з'ясування мінімального часу схрещування, за який можна отримати екскон’югантів та максимальну кількість екскон?югантів.

Схрещування проводили між E.coli ET12567(pUB307 pSET152) та S.lividans TK54. Для цього зібрані спори S.lividans TK54 піддавали термічній обробці при 70?С протягом 7 хвилин (міцелій в таких умовах гине) і змішували з донором. Переривали проходження схрещування заливаючи чашки Петрі розчинами антибіотиків апраміцину та налідиксової кислоти в кінцевих концентраціях 50 мкг/мл та 200 мкг/мл, відповідно. Як видно з рисунку 2, екскон?юганти виникали вже через годину після початку схрещування, під час збільшення часу схрещування кількість екскон’югантів зростає експоненціально. Максимальна частота отримання екскон?югантів відмічена на сьому годину від початку схрещування, і після цього вона не зростала. Враховуючи те, що спори актиноміцетів проростають на 3-4 годину, а екскон’югантів ми отримали вже на першій годині після початку схрещування, можна зробити висновок, що кон’югація може відбуватися зі спорами S.lividans TK54.

3. Перенесення плазмідної ДНК в клітини штамів S. kanamyceticus 1 i S. globisporus 1912 за допомогою конюгації з E.coli

Виходячи з високої ефективності проходження міжродової кон?югації під контролем плазмід групи несумісності IncPб, було вирішено використати цей спосіб для введення плазмідної ДНК в клітини штамів S. globisporus 1912 i S. kanamyceticus 1. Як донор брали штам E.coli ET12567(pUB037), що несе кон`югативну плазміду pSET152. Ця плазміда містить attP - сайт і ген int актинофага С31, що надає їй здатності до сайт-специфічної інтеграції в хромосому реціпієнтного штаму актиноміцетів, і ген стійкості до апраміцину aac(3)IV який використовували як селективний маркер.

Відтворення методики кон'югації E.coli - Streptomyces на LB-агарі, описаної Мазодієром у 1989 році, не дало позитивних результатів в дослідах із S.globisporus 1912 та S.kanamyceticus 1. Ефективною виявилась модифікована методика кон'югації E.coli - Streptomyces, в якій для проведення схрещування і селекції екскон'югантів використали вівсяне середовище, на якому спостерігається найкращий ріст і спороутворення штамів S.globisporus 1912 та S.kanamyceticus 1. Вівсяне середовище забезпечує переваги для розвитку реципієнтної культури, а слабкий ріст газону донора дозволяє виключити етап його механічного видалення, яке звичайно супроводжується частковим, або майже повним змиванням клітин реципієнтного штаму актиноміцетів. В кінцевому варіанті ми розробили методику схрещування, яка успішно використана в подальшій роботі і наведена нижче.

Донорний штам E.coli ET12567 (pUB307) вирощували до середини логарифмічної фази росту (OD600 – 0,65), осаджували центрифугуванням при 3000 об/хв. Отриманий осад ресуспендували в 100 мкл фізіологічного розчину до концентрації клітин близько 108кл/мл. Суспензію спор штаму реціпієнта в концентрації ~ 107спор/мл піддавали тепловому шоку при 50С протягом 10 хв, після чого спори інкубували на качалці (120 об/хв) протягом 3 год при температурі 37С. Кон`югаційну суміш (100 мкл суспензії спор реціпієнта і 200 мкл суспензії клітин донора у титрах, вказаних вище) розподіляли на поверхні чашок з вівсяним середовищем. Інкубували протягом 14-16 год при температурі 28С і заливали 1 мл водного розчину, що містив антибіотики апраміцин для селекції стрептоміцетів і налідиксову кислоту для пригнічення кишкової палички, в кінцевих концентраціях 50 мкг/мл і 200 мкг/мл, відповідно. Колонії екскон`югантів зазвичай з`являлися через 3-4 дні. Частота виникнення екскон'югантів по відношенню до кількості взятих в схрещування спор реціпієнта для S.globisporus 1912 в середньому становила (4,70,3) 10-4, а для S. kanamyceticus 1 (2,50,3) 10-4. В таких умовах не виявлено спонтанних мутантів, стійких до апраміцину в кінцевій концентрації 50мкг/мл (принаймні з частотою вищою, ніж 1 10-8).

Ми також використали вектори pSOK101, pSOK201 і pCHZ101, які мають різні реплікони, що походять з плазмід pIJ101, pSG5 та pHZ1375 відповідно, для їхнього перенесення в штами S.globisporus 1912 i S.kanamyceticus 1. Селекцію плазмід проводили за стійкістю до апраміцину. Частота появи екскон?югантів S.globisporus 1912, який містить плазміди pSOK101, pSOK201 становила (3,2 0,3) 10-4 і (2,5 0,2) 10-4 відповідно. Не вдалося отримати екскон?югантів S.globisporus 1912 з плазмідою pCHZ101. У той же час всі три реплікативні плазміди pSOK101, pSOK201 і pCHZ101 були перенесені в штам S.kanamyceticus 1 з частотами (3,1 0,3) 10-5, (2,2 0,2) 10-5 і (4,60,3) 10-5, відповідно.

Отже, відпрацьована методика дозволяє подолати бар'єр для введення чужорідної генетичної інформації в штами S.globisporus 1912 i S.kanamyceticus 1, що відкриває широкі можливості для вивчення генетичного контролю біосинтезу ландоміцину Е та канаміцину, функціонування генів стійкості в цих продуцентах. Цей метод є дешевшим і простішим у застосуванні, оскільки не вимагає отримання протопластів актиноміцетних штамів, він дозволяє використати широкий спектр як реплікативних, так і інтегративних плазмід для отримання рекомбінантних штамів.

4. Вивчення характеру інтеграції плазміди pSET152 в хромосому штамів S.globisporus 1912 i S.kanamyceticus 1

Для підтвердження інтеграції кон'югативної плазміди pSET152 у хромосоми екскон?югантів S.globisporus 1912 i S.kanamyceticus 1 були проведені експерименти з ДНК-ДНК гібридизації. Сумарні ДНК цих штамів і їх незалежних екскон'югантів розщеплювали ендонуклеазою рестрикції BamHІ. Як зонд використовували мічений дігоксигеніновою міткою PstI-фрагмент плазміди pSET152 розміром 800 п.н., який несе ділянку oriT. З результатів гібридизації DIG-міченого зонда з BamHI-фрагментами сумарної ДНК дев?яти незалежних клонів екскон'югантів S.globisporus 1912 видно pSET152+, що у всіх випадках (доріжки 2-10) зонд гібридизується з трьома фрагментами сумарної ДНК розмірами біля 3.4, 5.5 і 8 т.п.н. (рис.3). Результати гібридизації BamHI-фрагментів сумарної ДНК екскон?югантів S.kanamyceticus 1 представлені на рисунку 4. Зонд oriT гібридизується з трьома фрагментами сумарної ДНК розмірами 3; 5,5; і 9,5 т.п.н. На контрольних доріжках, де фракціоновані фрагменти сумарної ДНК вихідних штамів S.globisporus 1912 i S.kanamyceticus 1, позитивних сигналів немає.

В плазміді pSET152 сайт BamHІ є унікальним, і він розміщений за межами ділянки вектора, використаної як зонд. Це дозволяє нам стверджувати про те, що в клітинах екскон?югантів S.globisporus 1912 і S.kanamyceticus 1 знаходяться як мінімум три копії плазміди pSET152. В результаті трансформації клітин E.coli сумарними ДНК екскон‘югантів S.globisporus 1912 і S.kanamyceticus було доведено наявність автономної копії pSET152 в досліджуваних штамах стрептоміцетів. Рестрикційне картування усіх виділених плазмідних ДНК підтвердило їх ідентичність з pSET152.

Отримані дані вказують на наявність в геномах S.globisporus 1912 і S.kanamyceticus 1 як мінімум двох attB-сайтів, трьох копій плазміди і можливість існування плазміди pSET152 як в інтегрованому, так і в автономному станах.

5. Стабільність успадкування кон?югативних плазмід екскон?югантами та їх вплив на продукцію антибіотиків у екскон'югантів S.globisporus 1912 i S.kanamyceticus 1

Фенотип Apmr, який забезпечується плазмідою pSET152, успадковувався з 100%-ною частотою у 723 досліджуваних клонів екскон?югантів S.globisporus 1912 i 564 клонів S.kanamyceticus 1 після трьох пересівів цих штамів у рідкому середовищі TSB. Рівень успадкування автономних плазмід становив менше 20% під час вирощування в неселективних умовах.

У екскон?югантів S.globisporus 1912 pSET152+ продукція ландоміцину Е була знижена на 50-90%, порівняно з вихідним штамом S.globisporus 1912. Екскон‘юганти S.kanamyceticus pSET152+ не продукували канаміцину взагалі. Екскон‘юганти обидвох штамів, які містять автономні плазміди, продукують антибіотик на рівні вихідного штаму.

Інгібуючий ефект інтеграції pSET152 на продукцію антибіотиків екскон?югантами штамів S.globisporus 1912 і S.kanamyceticus 1 створює певні труднощі у використанні цієї плазміди як вектора. Тому ми вирішили сконструювати кон?югативну плазміду, яка може інтегруватися сайт-специфічно в хромосому стрептоміцетів, використовуючи системи інтеграції фагів відмінних від цС31. Для цього була сконструйована плазміда pVWB розміром 9.3 т.п.н., яка інтегрується в attВ сайт хромосоми актиноміцетів, використовуючи систему інтеграції фага VWB.

Екскон?юганти S.globisporus pVWB+ з?являлися з частотою (4,1 0,2) 10-5, а S.kanamyceticus pVWB+ - (2,1 0,2) 10-4. При перевірці 317 клонів ексконюгантів S.globisporus pVWB+ та 342 S.kanamyceticus pVWB+ на здатність до біосинтезу антибіотиків, ми виявили, що інтеграція плазміди pVWB в хромосоми досліджуваних штамів не пригнічує продукцію ландоміцину Е та канаміцину. Рівень успадкування плазмід pVWB в неселективних умовах становив 100% для обидвох штамів. Використання pVWB дозволяє створювати стабільні рекомбінантні штами S.globisporus 1912 i S.kanamyceticus 1 і уникнути проблем, повязаних з пригніченням біосинтезу антибіотиків, які є результатом інтеграції плазмід, створених на основі інтегративної системи фага ц?31.

6. Клонування ділянок хромосоми штаму S.kanamyceticus 1, які містять сайти інтеграції плазміди pSET152

З метою вивчення стану плазміди в клітинах ексконюгантів, механізму інтеграції та причин пригнічення продукції канаміцину внаслідок інтеграції pSET152, було проведене клонування сайтів інтеграції цієї плазміди та ділянок, що їх оточують, з штаму S.kanamyceticus 1 (рис.6).

В плазміді pSET152 відсутні сайти впізнавання для ендонуклеази рестрикції KpnI, тому сумарну ДНК, виділену з екскон‘югантів S.kanamyceticus pSET152+, розщеплювали цим ферментом. В результаті такого розщеплення ми отримали KpnI-фрагменти, які містять pSET152 і ділянки хромосоми S.kanamyceticus 1, куди ця плазміда попередньо інтегрувалася. Ми отримали дві групи плазмід і позначили їх як pATTB1 (22,5 т.п.н.) та pATTB2 (11,0 т.п.н). Далі субклонували та секвенували фрагменти, прилеглі до сайтів attR1, attL1 (з плазміди pATTB1) та attR2, attL2 (з плазміди pATTB1).

В результаті секвенування виявили чотири ORF, які оточують сайти attB1 та attB2. Провівши аналіз нуклеотидних та амінокислотних послідовностей показали, що ORF1 проявляє високу гомологію (93%) до білка, який контролює конденсацію хромосоми; ORF2 є подібною (62%) до мембранного білка, функція якого невідома; ORF3 має високий ступінь гомології (81%) до пептидил тРНК-гідролази; ORF4 має два консервативні домени, один з яких містить послідовності нуклеотидів, характерні для бактерійних протеїнкіназ, а другий є подібним до фосфодіестерази штаму S.coelicolor A(3)2. Інтеграція pSET152 зумовлює руйнування ORF1, а інші ORF залишаються інтактними.

З отриманих нами результатів видно, що плазміда pSET152 не інтегрується в структурні гені біосинтезу канаміцину. Інтеграція цієї плазміди проходить в ділянки ДНК біля генів, задіяних в глобальній регуляції метаболізму клітини. Можливо інтеграція плазміди pSET152 в ділянки біля таких генів впливає на рівень їхньої експресії, і це, в свою чергу, може призводити до пригнічення біосинтезу канаміцину.

7. Векторна система для вивчення генів біосинтезу ландоміцину Е шляхом заміщення та спрямованої інактивації.

Метою даного етапу роботи було створення рекомбінантних кон'югативних плазмід, які можуть бути використані для вивчення генетичного контролю біосинтезу антибіотиків, стійкості до них у штамів S.globisporus 1912 i S.kanamyceticus 1, шляхом спрямованого руйнування генів. На основі плазміди pSET152 було створено вектор pJWH19 з делецією внутрішнього HindIII-фрагменту гена int розміром 800 п.н. (рис. 7). В результаті пошкодження функції інтегрази плазміда pJWH19 не повинна включатися в attB-сайт, а інтегруватися в хромосому актиноміцетів за рахунок гомологічної рекомбінації.

Для перевірки функціонування розробленої системи була створена плазміда pSP15 на основі вектора pJWH19, в якому клоновано внутрішній фрагмент гена lndA (розміром 250 п.н.), який кодує -кетоацилсинтазу. Ця плазміда була кон?югативно перенесена в S.globisporus 1912. Частота утворення екскон?югантів становила 1,3 10-7, що на три порядки менше від частоти утворення екскон?югантів при використанні плазміди pSET152.

Проте дані тонкошарової хроматографії показали, що всі 12 екскон?югантів S.globisporus 1912, які містять pSP15, продукують ландоміцин Е. Ми провели ДНК-ДНК гібридизацію рестриктів сумарної ДНК цих екскон?югантів з oriT-зондом. Отримана картина відповідає тій, яку можна очікувати при сайт-специфічній рекомбінації, а не при гомологічній інтеграції в lnd-кластер. Таким чином, плазміда pSP15, не дивлячись на делецію частини гена int, інтегрувалася в хромосому шляхом сайт-специфічної рекомбінації.

Для того, щоб перевірити чи приведе до кросинговеру присутність в pJWH19 більших ділянок гомології, ми сконструювали плазміду pJN5. Для цього в плазміду pJWH19 було клоновано фрагмент lnd-кластера розміром 7.2 т.п.н. Проте інтеграція pJN5 в хромосому проходить як по гомології, так і сайт-специфічно. Таким чином, навіть присутність ділянки гомології розміром 7.2 т.п.н. не є достатньою умовою для проходження інтеграції тільки за рахунок гомологічної рекомбінації.

Щоб виключити можливість сайт-специфічної інтеграції плазмід, які призначені для заміщення lnd-генів, була сконструйована плазміда pTNK (рис.7). Для цього pSET152 розщеплювали ендонуклеазами рестрикції HindIII та SphI, обробляли фрагментом Кленова і проводили лігування. В плазміді pTNK повністю видалений ген int і attP-фрагмент. В подальших експериментах ми використали цю плазміду для руйнування гена lndA. Для цього плазміду pKN1, яка несе N-фрагмент, розщеплювали ендонуклеазою KpnI. В результаті такого розщеплення ген lndA, оточений KpnI-сайтами, був видалений з плазміди. На його місце ми клонували ген стійкості до канаміцину (aphII) з плазміди pKAPA. В BamHI-cайт pTNK клонували змінений N-фрагмент, в якому ген lndA заміщений на ген стійкості до канаміцину aphII, і таким шляхом була отримана плазміда pNKN (рис.8). Таким чином, в плазміді pNKN є дві ділянки гомології до lnd-генів розміром по 2,7 т.п.н., які розділені геном aphII. Ця плазміда була кон?югативно перенесена в штам S.globisporus 1912, в результаті чого ми отримали 12 екскон?югантів, стійких до канаміцину, один з яких був чутливим до апраміцину, що свідчить про проходження подвійного кросинговеру між ділянками lnd-кластера в складі pNKN і хромосоми S.globisporus 1912.

З допомогою високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) (рис.9) і ТШХ вдалося встановити, що штам S.globisporus NKN не продукує ландоміцину Е. Таким чином, видалення гена lndA приводить до повного пригнічення синтезу ландоміцину Е, що підтверджує дані, отримані раніше шляхом класичної селекції, про його ключову роль в генетичному контролі цього антибіотика.

8. Використання генів біосинтезу ландоміцину Е для гетерологічної експресії в штамі S.fradiae Tu7217 – продуценті урдаміцинів.

Культура S.fradiae Tu2717 продукує полікетидний антибіотик ангуциклинової групи – урдаміцин А, який містить агліконову частину урдаміцинон, до якого приєднані два залишки D-олівози та один - L- родинози. Метою даного етапу роботи була гетерологічна експресія рекомбінантної плазміди pWPK1 (рис.10), яка несе гени біосинтезу ландоміцину Е, для в штамі S.fradiae Tu2717 з метою отримання нових урдаміцинів.

За допомогою ТШХ та ВЕРХ було показано, що у екстрактах з штаму S.fradiae Tu2717pWPK+ з’являється новий пік з УФ-спектром поглинання характерним для урдаміцинів. Ймовірно, це новий антибіотик, який утворюється в результаті гетерологічної експресії генів ландоміцину Е в штамі S.fradiae Tu2717.

9. Створення системи клонування в штамі S.cyanogenus S136

Штам S. cyanogenus S136 продукує ландоміцин А, який є найбільшим представником родини ландоміцинових антибіотиків, оскільки містить гексасахаридний ланцюг, який формується з 4-залишків D-олівози і 2 - L-родинози [Hoffmeister et al., 2001]. Порівняльне вивчення біосинтезу цих антибіотиків дозволить краще зрозуміти тонкощі та механізми синтезу ландоміцинів.

Трансформація протопластів S.cyanogenus S136 плазмідними ДНК не відбувається [Faust et al., 1994]. Тому ми використали міжродову конюгацію для перенесення плазмідних ДНК в цей штам. Інтегративна плазміда pSET152 та реплікативні pSOK101 pCHZ101 були перенесені в S.cyanogenus S136 з частотами 3,20,2 10-4, 2,10,2 10-4 та 5,30,3 10-4, відповідно.

Метою наступного етапу роботи було вивчення можливості і ефективності гомологічної рекомбінації між клонованими фрагментами lan-кластера і хромосомою S.cyanogenus S136. Для цього на основі нереплікативного вектора pOJmel, який містить oriT з RK2, район rep з pUC18 для реплікації в E.coli і ген aac(3)IV було сконструйовано три рекомбінантних плазміди pOJmellan1, pOJmellan2 і pOJmellan3, які містять фрагменти lan-кластера 7, 2,7 і 1,2 т.п.н., відповідно. Усі вони були трансформовані в E.coli ET12567 (pUB307) і перенесені в штам S.cyanogenus S136 шляхом конюгації. Ексконюганти були отримані в кількості 45-50, 5-7 і 2-4 колонії на чашку з pOJmellan1, pOJmellan2 і pOJmellan3, відповідно. Отже, ефективність проходження гомологічної рекомбінації у цьому штамі зростає із збільшенням розміру фрагмента, клонованого в плазміді. Lля проведення експериментів по заміні чи нокауту генів у S.cyanogenus S136 можна використовувати навіть гомологічний фрагмент величиною близько 1 т.п.н.

ТШХ екстрактів ландоміцинів з ексконюгантів штамів S.cyanogenus S136, які містять плазміди pOJmellan1, pOJmellan2 і pOJmellan3, показала, що штам S.cyanogenus S136pOJmellan2+ продукує ряд нових сполук і не синтезує ландоміцину А. Ексконюганти, які містять плазміди pOJmellan1 та pOJmellan3, не відрізняються за спектром синтезованих ландоміцинів від дикого типу. Просеквенувавши вставку з плазміди pOJmellan2, ми виявили, що вона містить гени глікозилтрансферази (lanGT3) і ГДФ-гексозосинтетази (lanZ2). Очевидно, що поява нових ландоміцинів є результатом полярного ефекту на гени lanGT4, lanZ4 та lanZ5 , розташовані в 3‘ напрямі від lanGT3 і lanZ2. Ми проаналізували зміни в структурі нових ландоміцинів, що їх продукують ексконюганти S.cyanogenus S136pOJmellan2+, методами рідинної хроматографії (ВЕРХ) та мас-спектроскопії. Молекулярні маси (Mr) сполук, що продукуються ексконюгантами, дорівнюють 598 Да, 582 Да, 339 Да, 453 Да, 633 Да і 512 Да. Виявилось, що LaF – є 11-дезоксиландоміцином D, LaH – моноглікозильованим 11-дезоксиландоміциноном. У нових ландоміцинах відсутня гідроксильна група у позиції С11, що характерна для всіх досі описаних ландоміцинів А-Е [Krohn C. et. al., 1997].

Результати наших досліджень дають змогу більш детально вивчати функціонування генів біосинтезу ландоміцину A в S. cyanogenus S136, використовуючи кон’югацію для заміщення, руйнування генів та гетерологічної експресії в цьому штамі.

10. Використання розробленої системи конюгації для перенесення плазмідних ДНК в ряд штамів Streptomyces

На сьогоднішній день проблема ефективного перенесення рекомбінантних ДНК в різні штами актиноміцетів є дуже актуальною. В даний час значно розширилось коло штамів – актиноміцетів, до яких застосовують методи генетичної інженерії, серед них є штами, для яких трансформація протопластів плазмідною ДНК не відбуваться, або її частота настільки низька, що не дозволяє використовувати цей метод для вивчення функціонування генів і отримання нових рекомбінантнтих штамів. Тому ми вирішили зробити спробу використати опрацьовану і вдосконалену нами методику конюгації між E.coli та актиноміцетами для перенесення плазмідних ДНК в ряд штамів, щоби оцінити наскільки широко її можна використовувати без суттєвих модифікацій.

Для роботи ми взяли 12 видів актиноміцетів, крім описаних S.fradiae, S.globisporus, S.kanamyceticus, S.lividans і проводили з ними схрещування за описаною вище методикою. Як видно з таблиці 1, ми отримали ексконюгантів після схрещування з усіма взятими в роботу штамами.

Успішне перенесення ряду плазмід в широке коло різних актиноміцетів з допомогою відпрацьованої нами методики робить її дуже зручним інструментом для конструювання продуцентів антибіотиків. Висока ефективність отримання ексконюгантів з вищепереліченими штамами дозволить на глибшому рівні вивчати біосинтез антибіотиків у цих продуцентів і отримувати нові “гібридні” антибіотики, які можуть продукуватися цими штамами. Даний метод також має хорошу перспективу бути використаним для перенесення рекомбінантних плазмід в нові штами актиноміцетів.

ВИСНОВКИ

В результаті виконаної роботи розроблено систему клонування генів у цілому ряді штамів актиноміцетів, для яких трансформація протопластів відбувається з низькою частотою. Показано ефективність використання цієї системи для отримання рекомбінантних штамів актиноміцетів шляхом спрямованого мутагенезу та гетерологічної експресії генів.

1. Створена система клонування генів в продуцентах канаміцину S.kanamyceticus та ландоміцину Е S.globisporus 1912 за допомогою кон’югаційного перенесення рекомбінантних плазмід з E.coli. Показана ефективність цього підходу стосовно ще 14 видів актиноміцетів, більшість з яких трансформуються з низькою частотою. Штами E.coli, які несуть плазміди IncPб групи несумісності, є найефективнішим донором у схрещуванні з актиноміцетами.

2. Інтегративні конюгативні плазміди pSET152 і pVWB стабільно підтримуються в хромосомах штамів S.globisporus 1912 і S.kanamyceticus 1 під час вирощування в неселективних умовах. Ексконюганти цих штамів в неселективних умовах втрачають реплікативні конюгативні плазміди pSOK101, pSOK201 та pCHZ101 з високою частотою.

3. Плазміда pSET152 інтегрується у два сайти (attB1 і attB2) хромосоми S.kanamyceticus 1 та S.globisporus 1912. Виявлено і секвеновано чотири ORF, що оточують attB1- і attB2- сайти S.kanamyceticus 1. Інтеграція pSET152 зумовлює руйнування ORF1, яка кодує білок, що, імовірно, бере участь у процесі конденсації хромосоми.

4. У ексконюгантів S.kanamyceticus 1 та S.globisporus 1912, що містять плазміду pSET152, пригнічується продукція канаміцину і ландоміцину Е, відповідно. Наявність в цих штамах реплікативних плазмід pSOK101, pSOK201, pCHZ101 та інтегративної pVWB не впливає на рівень продукції антибіотиків.

5. Розроблена система клонування використана для спрямованої інактивації генів S.globisporus 1912 і S.cyanogenus S136. Цим методом доведено, що клоновані lnd- та lan-кластери відповідають за синтез ландоміцинів Е та А, відповідно.

6. Інтеграція плазміди pOJmellan2 в хромосому штаму S.cyanogenus S136 призводить до полярного ефекту на гени lanGT4, lanZ3, lanZ4, lanZ5. Штам S.cyanogenus S136 pOJmellan2+ продукує нові ландоміцини F та Н. Гетерологічна експресія плазміди pWPK1, яка містить гени lndABCDLFE, у штамі S.fradiae Tu2717 призводить до продукції рекомбінантним штамом нової сполуки, ідентифікованої методом ТШХ та ВЕРХ.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА МАТЕРІАЛАМИ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Федоренко В.О., Басілія Л.І., Голець Л.М., Громико O.M., Демидчук Ю.O., Кириченко Н.В., Лужецький А.М., Мазепа А.Й., Мар‘їна О.В., Самбір М.В. Конструювання штаму Streptomyces kanamyceticus – продуцента канаміцину, використовуючи методи клітинної та та генної інженерії // Вісник Харківського університету.Сер.біол. 1999. Т.3, №1, P.138.

2. Федоренко В.О., Басілія Л.І., Панькевич К.О., Дубицька Л.П., Осташ Б.О., Лужецький А.М., Громико О.М., Крюгель Г. Генетичний контроль біосинтезу актиноміцетами протиракових антибіотиків-полікетидів // Бюлетень Інституту сільськогосподарської мікробіології . – 2000. – №8.-С.27-31.

3. Лужецький А., Мазепа А, Мар‘їна О. Використання міжродової кон‘югації Escherichia coli – Streptomyces для введення генетичної інформації в штами Streptomyces globisporus 1912 and Streptomyces kanamyceticus // Вісник Львівського університету. Сер.біол. 2000. №.25. С.74-80.

4. Лужецкий А.Н., Осташ Б.Е., Федоренко В.А. Межродовая конъюгация Еscherichia coli - Streptomyces globisporus 1912 с использованием интегративной плазмиды pSET152 и ее производных // Генетика. –2001.-Т.37, №10.-С.1340-1347.

5. Ostash B.O., Luzhetskiy A.M., Gromyko O.M., Fedorenko V.O. Transfer of plasmids from Escherichia coli to mutant strain Streptomyces globisporus LND900 with altered biosynthesis of antitumor antibiotic landomycin E // Науковий вісник Ужгородського національного