НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИКИ

Лар Олена Василівна

УДК 577.113.5: 577.152.3

КЛОНУВАННЯ ТА АНАЛІЗ СТРУКТУРИ І ОСОБЛИВОСТЕЙ ЕКСПРЕСІЇ ГЕНА ЕКЗОПЕКТАТЛІАЗИ ЕНДОФІТНОЇ

БАКТЕРІЇ Klebsiella oxytoca VN13

03. 00. 22- молекулярна генетика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2003

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології і генетики НАН України (м. Київ).

Науковий керівник: кандидат біологічних наук, старший

науковий співробітник

Козировська Наталія Олексіївна,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, старший науковий співробітник

відділу регуляторних механізмів клітини.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук

Менджул Михайло Іванович,

Інститут мікробіології і вірусології

ім. Д. К. Заболотного НАН України,

завідувач відділу вірусів водоростей;

кандидат біологічних наук, старший

науковий співробітник

Карпова Ірина Сергіївна

Інститут молекулярної біології і

генетики НАН України, старший науковий

співробітник відділу генетики людини.

Провідна установа: Інститут клітинної біології та генетичної

інженерії НАНУ, м. Київ.

Захист дисертації відбудеться “ 25” лютого 2003 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ-143,

вул. Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ-143,

вул. Заболотного, 150.

Автореферат розіслано “25” січня 2003 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук О. В. Підпала

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Інтенсивний розвиток генетичної інженерії та її впровадження в усі галузі біотехнології дозволяє проводити пошук та ідентифікацію генетичних детермінант корисних властивостей промислових штамів мікроорганізмів. У зв'язку з широким використанням у практиці сільського господарства біопрепаратів на основі ендофітних бактерій дослідження молекулярних механізмів взаємодії цих бактерій з рослиною стає наразі актуальним напрямком наукової роботи. До того ж, ефективність створюваних біопрепаратів можна значною мірою підвищити за рахунок модифікації генетичного контролю суттєвих для рослинництва характеристик бактерій.

Колонізуючи рослину, ендофітна бактерія K. oxytoca VN13 ефективно конкурує з патогенною мікрофлорою, а до того ж стимулює ріст рослинної біомаси фітогормонами та іншими фізіологічно активними речовинами, фіксує атмосферний азот та захищає рослини від накопичення в їх біомасі радіонуклідів та важких металів. Хоча в умовах України K. oxytoca VN13 не виживає поза асоціацією з рослиною, здатність до внутрішньої колонізації дозволяє їй швидко відновити популяцію зовнішньої поверхні кореня в разі вимирання бактерій при несприятливих умовах. Створені на основі K. oxytoca VN13 біопрепарати, зокрема “КЛЕПС”, добре зарекомендували себе як стимулятори росту та розвитку значної кількості сільськогосподарських культур, що дозволяє вважати їх природозберігаючою альтернативою використанню хімічних добрив.

Відомо, що здатність фітопатогенних бактерій, таких як Erwinia chrysanthemi та Erwinia carotovora, до мацерації рослинних тканин залежить від рівня експресії пектиназних генів, в першу чергу - пектатліаз, які задіяні в процесі деполімеризації пектину клітинної стінки рослини. У зв'язку з можливою залежністю здатності ендофітної бактерії K. oxytoca VN13 до колонізації рослин з рівнем експресії генів пектинолізису, вивчення організації та функціонування пектатліазних генів K. oxytoca VN13 може допомогти виявити молекулярні механізми цього процесу.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Виконана робота відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за бюджетною темою “Вивчення підходів до створення асоціації господарсько-цінних рослин з ендофітними бактеріями” (№ держреєстрації 0199V000725, 1999-2002 рр.).

Мета та завдання дослідження. Метою дослідження було вивчення організації одного з пектатліазних генів K. oxytoca VN13 та особливостей його експресії при наявності в середовищі індукторів рослинного походження, а також внесок кодованої ним пектатліази в загальну пектатліазну активність цієї бактерії. Відповідно до мети було поставлено такі завдання:

1.

2.

3.

4.

Для досягнення поставленої мети використовували такі методи як клонування генів у плазмідному векторі, направлений мутагенез in vitro та заміщення нативного гена на мутантний in vivo, визначення і комп'ютерний аналіз нуклеотидної послідовності гена та виведеної амінокислотної послідовності, біохімічне визначення активності ферментів.

Об'єктом дослідження були генетичні детермінанти пектолітичної активності K. oxytoca, а предметом - структура та регуляторні елементи гена, що кодує екзопектатліазу K. oxytoca VN13 та характер його експресії, а також внесок відповідного білка в загальну пектолітичну активність K. oxytoca VN13.

Наукова новизна одержаних результатів полягає в тому, що в результаті виконаної роботи було клоновано ген екзопектатліази K. oxytoca, вперше визначено та проаналізовано його нуклеотидну послідовність та кодований нею поліпептид порівняно з гомологічними білками інших бактерій. У промоторній частині pelX-гена ідентифіковано дві операторні ділянки для зв'язування KdgR- репресора, що вказує на належність pelX-гена до вказаного регулона, наявність якого в K. oxytoca VN13 було встановлено нами раніше (Ковтунович та ін., 2000). Створений мутантний штам K. oxytoca VN13 з інактивованим pelX- геном дозволив виявити наявність ще одного або декількох пектатліазних генів у даної бактерії. Встановлено конститутивний характер експресії pelХ-гена та висунуто припущення про існування додаткового негативного регулятора його експресії. Запропоновано можливу роль продукту гена pelX як ініціатора процесу пектинолізису.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати дозволяють охарактеризувати деякі риси структури і функціонування пектолітичної системи K. oxytoca VN13. Вказати на можливу роль продукту гена рelX як активатора процесу пектинолізису, а також можливі механізми контролю рослиною пектолітичної активності K. oxytoca, які дозволяють даній бактерії колонізувати внутрішні тканини рослини, але не спричиняти їх мацерацію, що може бути внеском у дослідженні механізмів створення асоціацій господарсько - цінних рослин із бактеріями.

Особистий внесок здобувача. Результати, які викладено в дисертації, отримано та проаналізовано особисто автором або за його безпосередньої участі у плануванні та проведенні експериментів.

Апробація матеріалів дисертації. Матеріали, викладені в дисертації, пройшли апробацію на міжнародному науковому семінарі “Fourth European Nitrogen Fixation Conference”, Севілья, Іспанія, 2000.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 3 статті у фахових наукових виданнях і тези однієї доповіді.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів, трьох розділів, в яких викладено отримані результати та їх обговорення, аналізу та узагальнення результатів, висновків та списку використаних джерел. Дисертацію викладено на 117 сторінках машинописного тексту. Вона містить 28 рисунків та 7 таблиць. Список використаної літератури охоплює 130 джерел.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження.

Бактеріальні штами та плазміди. У роботі використовували штами Еscherichia coli JM 109, Е. coli S17-1, Е. coli S17-1лpir ?а Klebsiella oxytoca VN13 з колекції відділу. Було використано плазміди pUC19, pUC28, pBluescriptSKM, pJP5603, pHP45Щ-Cm з колекції відділу та плазміди pDK5 та pCB192, що були люб’язно надані проф. Д. Кляйнером (Університет м. Байройт, ФРН).

Бактеріальні середовища та умови вирощування. Для вирощування бактерій використовували середовище LB та мінімальне середовище М9 (Miller, 1972). Антибіотики ампіцилін та рифампіцин використовували в концентрації 100 мкг/мл, канаміцин - 50 мкг/мл, хлорамфенікол - 60 мкг/мл. Штами Е. coli та K. oxytoca вирощувалися при 37С та 30С відповідно. Для якісного виявлення пектиназної активності використовували чашки з кальційстабілізованим поліпектатним гелем (Starr, 1977).

Біохімічне визначення пектатліазної та ?- галактозидазної активності. Загальну пектатліазну активність в лізатах бактеріальних культур вимірювали за методом, що базується на спектрофотометричному моніторингу вивільнення ненасичених продуктів з полігалактуронату натрію, які мають максимум поглинання при 235 нм (Starr et al., 1977). За одиницю активності брали кількість ферменту, що вивільняє 1 мкМ ненасичених уронідів з полігалактуронату за одну хвилину, що відповідає збільшенню поглинання реакційної суміші на 1,6 опт. од. при заданих умовах та температурі 37С (Евтушенков и др., 1996). ?- галактозидазну активність в лізатах бактеріальних культур вимірювали, використовуючи методику, що базується на спектрофотометричному моніторингу вивільнення забарвленого продукту (о- нітрофенолу) з безбарвного о- нітрофеніл- ?-d- галактопіранозиду (ОНПГ), який має максимум поглинання при 420 нм (Miller, 1972). За одиницю активності брали кількість ферменту, що вивільняє 1 мкМ о- нітрофенолу за одну хвилину, що призводить до збільшення поглинання реакційної суміші на 1,3 опт. од. при заданих умовах та температурі 30С, як це було встановлено за допомогою калібрувальної кривої. Питому активність ферментів вимірювали, перераховуючи загальну активність ферменту на 1 мл бактеріальних лізатів, вирівняних за оптичною густиною.

Генноінженерні методи. Виділення плазмід та хромосомної ДНК, гідроліз ендонуклеазами рестрикції, лігування, гель - електрофорез, елюцію ДНК з гелю та перенос фрагментів ДНК з агарозного гелю на нейлонову мембрану для блот- гібридизації здійснювали за стандартними методиками (Sambrook et al., 1989). Гібридизацію проводили з використанням набору для мічення та детекції фірми “Boehringer Mannheim”, в якому використовується дигоксигенінова мітка. Для отримання компетентних клітин бактерій та трансформації користувалися методом Нішімура (Nishimura, 1990). Первинну послідовність ДНК клонованого фрагмента визначали за методом Сенгера (Sanger, 1977), використовуючи апарат ALF expressTM та Cy5TM AutoCycle набір фірми “Pharmacia Biotech”; частину нуклеотидної послідовності отримали з сервісу “MWG AG Biotech" (Еберсберг, ФРН). Для аналізу ДНК та поліпептидного продукту використовували програму “Generunner”, програму NNPP (Neural Network Promoter Prediction) та “SignalP prediction 2.0” (Nielsen, 1997), а також програми blastn та blastx електронної служби Blast Національного центру біотехнологічної інформації (NCBI) (США).

Реєстрація нуклеотидної послідовності в електронному банку генів. Визначена нуклеотидна послідовність pelX- гена зареєстрована в EMBL, GenBank та DDBJ під номером AF454849.

Результати дослідження та їх обговорення.

Клонування pelX-гена K. oxytoca VN13, визначення і аналіз його нуклеотидної послідовності та виведеної амінокислотної послідовності кодованого ним білка. Для пошуку генів пектинолізису K. oxytoca VN13 було створено геномну бібліотеку на основі вектора pUC19 з використанням для її створення Sau3A фрагментів хромосомної ДНК K. oxytoca VN13 розміром 4-9 тис. п. н. Скрінінг 1000 клонів трансформантів на селективному Pес-SSA середовищі дозволив ідентифікувати один клон, що утворює заглиблення в поліпектатному гелі, тобто демонструє пектолітичну активність. З відібраного клону було виділено плазміду розміром 7,9 тис. п. н., що отримала назву pPL11.

Було проведено біохімічне визначення наявності пектатліазної активності в лізаті культури бактерій E. coli JM109, що містить плазміду pPL11. (табл. 1). Експеримент продемонстрував високий рівень пектатліазної активності для штаму Е. coli JM109, трансформованого pPL11 що в 10 разів перевищувала загальну пектатліазну активність K. oxytoca VN13. Отриманий результат дав можливість ідентифікувати клонований в складі плазміди pPL11 ген, як такий, що кодує пектатліазу.

Таблиця 1

Пектатліазна активність штамів бактерій E. coli JM109 без плазміди,

E. coli JM109 з плазмідою pPL11 та K. oxytoca VN13

Штам | Загальна пектатліазна активність, мкМоль·хв-1·мл-1

K. oxytoca VN13 | 0, 0023

Е. coli JM 109 (pPL11) | 0, 024

Е. coli JM 109 | 0

Рестрикційний аналіз, проведений за допомогою набору колекції рестриктаз, продемонстрував, що рPL11 містить 5,2 тис. п. н. інсерцію хромосомної ДНК (рис.1). Подальший делеційний аналіз дав змогу локалізувати клонований ген в межах 3 тис. п. н. SacI- EcoRV фрагмента рPL11, який було переклоновано у вектор pUC28 (рис.1), отриманою конструкцією pLC28Р трансформовано E. coli JM109 та перевірено на наявність пектатліазної активності. Було встановлено, що така активність у клітин E. coli з плазмідою рPL11 та pLC28Р не відрізняється. У складі вказаних конструкцій клонований ген має орієнтацію протилежну щодо напрямку транскрипції із векторного промотору Рlac. Це дозволяє зробити висновок про експресію пектатліазного гена в межах клонованого фрагмента хромосомної ДНК K. oxytoca VN13 із власного промотору.

Рис. 1. Рестрикційна карта повного та мінімального фрагментів ДНК, що містять клонований ген K. oxytoca VN13

За допомогою хроматографії на папері було встановлено екзосубстратну специфічність продукту клонованого гена при дії на полімерний субстрат-полігалактуронат, що є складовою частиною пектину стінки рослинної клітини.

Аналіз нуклеотидної послідовності pelX-гена. З метою визначення нуклеотидної послідовності клонованого гена, із вихідної конструкції pLC28Р було створено ряд субклонів. Для цього pLC28Р гідролізували відповідними рестриктазами, отримані фрагменти елюювали з агарозного гелю та клонували у вектори pUC19 та pUC28, які містять місця для зв’язування стандартних праймерів для секвенування. Було визначено нуклеотидну послідовність AgeI- EcoRV фрагмента pLC28P, що склала 2950 п. н. (рис.2). Аналіз послідовності виявив наявність відкритої рамки зчитування (ВРЗ), що починається ATG кодоном в позиції 609 та складає 2199 п. н. Аналіз кінцевої ділянки клонованого гена продемонстрував наявність GC- багатої паліндромної послідовності та полі-Т - ланцюг, який складається з 5 нуклеотидів (див. рис. 2). Ця структура може бути задіяна в термінації транскрипції pelX- гена.

1 ATCTTCATCGTCGCTGAAGAACGGCGCCGCCTGCTGCATGGCGTGGCCGGTACCAAGCTGTTCGGCCTGTAGGACCC

78 AGTTAAGATTGTCTTCGCGCAGCGTCTGGCGAAGCAGGTCGCCGCCGTGCCCGTACACCAGATGTACGGCGGATGCCC

156 CTAATTCTTTAGCCGCATCAATAACATGCTGCACCATCGGCTTTCCGGCCAGCGAATGCAACACCTTAGGAAGATCGG

234 AATACATGCGGGTACCTTTGCCTGCGGCAAGAATAACCACGCTCATCGGACTGTTTGACATACGCATCCTGACTGCTG

312 TTAGAACGAAAAGTAAAAGCCTTTCACGTTGAAATATCTACATATTTTTCATCATGAAACGAGACGAAGATAAAACGC

390 ACAAGCGTAACGCTATACACCATTTTAGGTGGGTATTTTTAGCCAGCGCAAACCCGTTTAGCGCAAAAAAAGCATTTT

468 AACGGGGAGGGATACCGGCTATCCCTCTGCTTTTGCTGTTTTTTTGATGGAAAAATAAAGAAAATCCATAAAGTAAAA

СИГНАЛЬНИЙ ПЕПТИД

MetProValAsnAsn

546 CGCGGTTTTAATATGCATTAATTGTGACGCAATAAATAGAAACACCATTTCATTTTCCTGATAATGCCGGTTAATAAT

AlaLeuProLeuGlnTyrProGlyGluLysAsnGluAsnLysIleProLeuAlaLeuThrLeuCysSerThrMetIle

624 TACCCAGGAGAAAAAAATGAAAACAAAATACCTTTGGCATTAACCCTTTGCAGTACGATGATCGCGCTACCGCTGCAG

SerAsnValLeuProAlaAsnGluGlyHisGlnTrpArgAlaIleAlaPheGlyGlnSerThrAspSerAsnPheSer

702 GCCAACGAAGGCCATCAGTGGCGGGCAATCGCCTTTGGGCAATCCACCGACAGTAACTTTTCCTCGAACGTGTTGCCG

AspLeuSerGlnProGluLysIleGlyValAsnAspValThrIleAlaGlyLysLysLeuThrProGlnAspSerAla

780 GAAAAAATTGGCGTCAATGATGTCACCATTGCCGGGAAAAAGCTGACGCCGCAGGATTCCGCCGATCTCAGCCAGCCC

ThrGluLeuProThrIleThrIleGluSerArgGlyGlyLysIleAlaAsnSerHisAspGlyLeuThrPhePheTyr

858 ATTACCATCGAGAGCCGGGGAGGTAAAATTGCCAACTCCCACGACGGACTGACCTTCTTTTACACCGAGCTGCCAACC

ArgProAlaAlaGlnAsnLysAsnPheIleLeuGlnAlaThrValThrValAsnGlnPheGlyProGluAsnGlyAla

936 AATAAGAATTTTATCCTGCAGGCTACGGTGACCGTCAATCAGTTTGGACCGGAAAATGGCGCGCGTCCGGCGGCGCAG

GlyTyrGluGluPheGluGlyAlaGlyLeuLeuValArgAspValIleGlyAsnProArgGlnGlnProLeuLysVal

1014 GAAGGCGCGGGACTGCTGGTCCGCGACGTCATTGGCAACCCGCGCCAACAGCCTCTCAAGGTCGGCTACGAAGAGTTC

IleLysLeuGlnAlaProAlaAlaSerAsnMetValMetAsnAlaIleMetThrGlnAspLysLysAspGlySerHis

1092 CCGGCGGCATCCAATATGGTGATGAACGCCATTATGACCCAGGATAAAAAAGATGGCTCGCATATCAAGCTGCAGGCT

TyrLysGluLysIleIleSerArgGluGlyIleThrGlnProTrpGlyAsnAlaGlyAlaAlaIleLysArgGlnSer

1170 ATTAGCCGGGAAGGGATAACCCAACCGTGGGGCAATGCGGGCGCTGCAATCAAGCGTCAAAGTTACAAAGAGAAAATC

AspIleGlnGlnThrProThrPheGlnLeuLysLeuGluArgThrAsnAspGlyPheIleThrSerTrpAlaAlaThr

1248 GATATCCAGCAAACCCCGACGTTTCAGCTTAAGCTGGAACGTACTAACGACGGATTTATTACCTCATGGGCGGCAACG

GlySerAsnGluTrpValSerGlnArgValProHisAlaAspLeuIleAlaGlnGlnAspLysGluHisTyrTyrVal

1326 GGCAGTAATGAATGGGTAAGCCAGCGGGTTCCTCACGCCGATCTGATTGCTCAGCAGGATAAAGAACATTACTACGTC

GlyPhePheAlaSerArgAsnAlaLysIleThrValSerAsnAlaSerLeuThrThrSerAlaAlaAsnThrValPro

1404 GGTTTCTTCGCCTCACGTAACGCCAAAATCACCGTCAGCAATGCTTCCCTGACGACCTCCGCGGCAAATACGGTTCCC

SerAlaProTyrValAlaLysSerTrpProProValMetGlnIleAlaSerGlyThrLysSerGlnSerLysGluTyr

1482 TCCGCCCCGTATGTTGCCAAAAGCTGGCCGCCGGTCATGCAAATTGCCTCGGGGACAAAAAGCCAGAGCAAAGAGTAT

LeuLeuGlnAlaArgThrAsnSerAspGlyArgIleThrValArgGlnAspGluValValIleGlyGlnAspLysAla

1560 CTCCTGCAGGCGCGCACGAATAGTGACGGACGCATCACCGTGCGTCAGGATGAAGTGGTGATCGGGCAGGATAAAGCC

ValLysAlaGlyGluMetTyrThrGlnProAlaValLeuLysAspLysSerThrPheGluIleSerPheThrProAla

1638 GTGAAGGCCGGAGAGATGTATACCCAGCCTGCCGTTCTGAAAGATAAAAGCACATTCGAAATTAGCTTCACTCCAGCC

ThrGlyAlaAsnThrLeuThrGlnThrLeuThrValGluGlnSerAlaAsnValThrGlyAsnThrLeuTyrAlaAla

1716 ACCGGCGCAAACACGCTGACCCAAACGCTGACGGTTGAACAGAGCGCCAATGTGACAGGCAATACGCTGTACGCCGCG

ProAspGlyLeuSerGlnAlaLysGlyThrThrAspSerProLeuAspLeuAlaThrAlaValAspLeuValProPro

1794 CCGGATGGGCTGTCGCAGGCTAAAGGGACGACGGACTCGCCGCTGGATTTAGCCACCGCTGTCGACCTCGTTCCCCCT

GlyGlyGlnIleValLeuAlaAlaValIleIleArgLysGlnProSerArgLeuAlaProArgLeuLysAspLysVal

1872 GGCGGGCAAATTGTATTAGCCGCAGTGATTATCCGCAAACAACCATCCCGGTTAGCGCCACGCCTGAAAGACAAAGTC

LysThrLeuLysAlaAspGlyLysAlaValIleHisGlyLeuLeuLeuAspAlaSerTyrTrpHisIleAsnGlyVal

1950 AAAACCCTGAAAGCCGACGGAAAAGCCGTGATTCACGGGCTCCTGCTGGATGCCAGCTACTGGCATATCAATGGAGTA

AspIleThrAspLysSerLeuArgValGlnGlySerHisAsnLeuIleGluAsnValThrAlaTyrArgAsnAspAsp

2028 GACATTACGGACAAGAGCCTGCGCGTACAGGGTAGCCATAACCTGATCGAGAACGTCACCGCGTATCGGAACGATGAT

ThrGlyIleGlnIleSerSerProAlaAspValGlyArgProLeuTrpAlaSerHisAsnArgValValAsnSerGlu

2106 ACCGGCATTCAAATTTCCTCTCCGGCGGATGTCGGACGCCCGCTGTGGGCCAGCCATAACCGGGTGGTGAATTCTGAA

SerPheAsnAsnGluAspProGlyLysIleAsnAlaAspGlyPheAlaValLysMetArgValGlyGluGlyAsnArg

2184 TCCTTTAATAACGAAGATCCGGGTAAAATTAACGCCGATGGCTTTGCGGTGAAAATGCGCGTAGGGGAGGGTAACCGG

LeuGluGlyCysTyrSerHisAspAsnIleAspAspGlyPheAspLeuPheAsnLysIleGluAspGlyAlaAsnGly

2262 CTGGAGGGCTGTTACTCACACGATAATATCGACGACGGCTTCGACCTGTTCAATAAGATTGAGGACGGCGCTAACGGC

ValValValIleGluAsnSerIleAlaArgAsnAsnThrSerAsnGlyPheLysLeuGlyGlyGluGlyGlnProVal

2340 GTTGTGGTGATCGAGAACTCCATTGCCCGCAATAATACCAGCAACGGCTTTAAGCTCGGTGGGGAAGGGCAGCCGGTC

AlaHisGluValArgAsnSerIleAlaIleGlyAsnHisLeuAspGlyPheThrAspAsnPheAsnProGlyLysLeu

2418 GCCCACGAGGTACGCAACAGCATCGCCATCGGCAATCATCTGGACGGTTTTACCGACAACTTCAATCCTGGCAAGCTG

ValValValAsnAsnValAlaValAspAsnGlnArgPheAsnTyrLeuPheArgProSerProTyrGlyAlaProGlu

2496 GTAGTGGTCAATAACGTCGCGGTGGATAACCAGCGCTTTAACTATCTATTCCGCCCAAGCCCGTATGGCGCACCGGAA

ThrGlnGlyThrPheSerAspAsnLeuSerLeuArgSerGlnProGlyLysTyrAspAspAlaValIleGlyAsnIle

2574 ACGCAGGGTACCTTCAGCGATAACCTTTCTCTGCGCAGCCAGCCGGGGAAATATGACGATGCCGTTATCGGGAACATT

AspAspSerAsnTyrPheIleHisGlyGlyArgSerIleAsnAlaGlnGlyLysSerIleHisSerAlaAspTyrGln

2652 GATGATAGCAACTACTTTATCCACGGTGGCCGAAGCATCAACGCCCAGGGAAAGAGCATTCACAGCGCCGACTATCAG

ThrLeuThrLeuProAspProLeuThrArgGluAlaAspGlySerPheAsnThrGlyAsnPheLeuSerArgAsn

2730 ACTCTGACGCTGCCGGATCCGCTGACGCGTGAGGCCGACGGCAGCTTTAACACCGGTAACTTCCTTAGCCGCAATTAA

2808 CCAGGGACACGCTAAAAACATAAAGGTCGCCCTCGGGCGACCTTTTTACTTCCTTTCCTGCTTCACACCGCATGTGTT

2886 GTCGTTTTAGTTAGCGGTACAGCGCATAAGCAGTCTGGNGAGCGGCTTCTTAGTGGTTGACGTAC

Рис. 2. Визначена нуклеотидна послідовність AgeI- EcoRV фрагмента плазміди pLC28Р та виведена амінокислотна послідовність первинного рelX- транслянту. Старт - та стоп - кодони, а також поліТ - ланцюг виділено жирним шрифтом. Підкреслено GC- багату паліндромну послідовність. Підкреслено початок ВРЗ, що транскрибується по протилежному ланцюгу ДНК

В межах секвенованого фрагмента виявлено початок ще однієї ВРЗ, що гомологічна glmU-гену E. coli та направлена протилежно до напрямку транскрипції pelX-гена (див. рис.2). В хромосомі E. chrysanthemi 3937 аналогічна ВРЗ має таке ж, як і у K. oxytoca VN13 розташування та орієнтацію стосовно pelX- гена, який кодує екзопектатліазу (Shevchik et al., 1999). Ці дані

можуть свідчити на користь спільного походження pelX-генів вказаних бактерій.

Отриману нуклеотидну послідовність було порівняно з нуклеотидними послідовностями споріднених генів, які розміщені в електронному банку генів. Єдиною знайденою гомологією були незначні ділянки ДНК гена екзопектатліази (pelX) Erwinia chrysanthemi (рис.3).

Рис. 3. ДНК- гомологія повних послідовностей pelX- генів K. oxytoca VN13 та E. chrysanthemi. Kl - K. oxytoca VN13, Erw - E. chrysanthemi. Жирна лінія відповідає гомологічним ділянкам, штрихова- ділянкам, де гомологія відсутня

Для пошуку потенційного промотору pelX- гена було використано програму NNPP, за допомогою якої знайдено два таких промотори з високим рейтингом за критеріями, що враховуються програмою (рис.4). Можливо, що у K. oxytoca VN13 обидва визначених промотори є функціональними, транскрипція з яких відбувається в різних умовах.

Рис. 4. Промоторна ділянка pelX- гена. Послідовності потенційних промоторів підкреслено чорними лініями. Вказано рейтинг. Потенційні точки ініціації транскрипції позначено “+1”, відповідні нуклеотиди вказано великими літерами. Потенційні операторні ділянки для KdgR- репресора виділено сірим.

Оскільки більшість пектиназних генів бактерій роду Erwinia контролюється KdgR- репресором, ми шукали потенційні KdgR- оператори в

промоторній ділянці pelX- гена. KdgR- оператор є послідовністю AATRAAAYRNYRTTTYATT, де R- пурин, Y- піримідин, N- будь-який нуклеотид. Було знайдено два потенційні KdgR- оператори, де 15 з 18 та 16 з 18 нуклеотидів збігаються з консенсусом (див. рис.4). Розташованість KdgR- операторів всередині промоторної ділянки pelX вказує на зарепресованість оперону в разі відсутності індукторів. У E. chrysanthemi індукторами експресії пектиназних генів є проміжні продукти катаболізму пектину, в даному випадку- 5-кето-4-дезоксиуронат, 2,5- дикето-3- дезоксиглюконат та 2- кето- 3- дезоксиглюконат (КДГ). Варто зазначити, що Е. coli має здатність катаболізувати гексуроніди, і головним регулятором транскрипції задіяних генів є також KdgR. Регуляція експресії пектиназних генів E. chrysanthemi в E. coli зберігається.

Аналіз виведеної амінокислотної послідовності первинного транслянту pelX- гена. Первинний транслянт pelX-гена, визначений програмою “Generunner”, містить 732 амінокислотні залишки та має вираховану ізоелектричну точку pI 6,34 (див. рис. 2). Цей поліпептид було порівняно з іншими спорідненими білками, які депоновані в електронному банку генів. Було виявлено високий рівень гомології даного поліпептиду за амінокислотною послідовністю щодо екзополігалактуронатліази Erwinia chrysanthemi та відсутність суттєвої гомології з бактеріальними ендопектатліазами (рис.5).

Найбільший рівень гомології як з екзо- так і з ендопектатліазами спостерігається в певній ділянці послідовності в межах 484-623 амінокислотних залишків РelX. Вказана консервативна ділянка може відповідати реакційному центру ферменту. Ще одна ділянка з високим рівнем гомології виявлена тільки для екзопектатліаз і розташована в діапазоні від 38 до 121 амінокислотного залишку РelX K. oxytoca VN13, вона може відповідати центру зв'язування ферменту із субстратом.

Оскільки більшість пектатліаз ервіній є секреторними білками, то ми шукали потенційний сигнальний пептид на N- кінці первинного pelX- транслянту. Для цього використовували програму “SignalP prediction 2.0”. Згідно висновків програми, існує ймовірність рівна 95%, що послідовність з 32 амінокислотних залишків, яка транслюється з першого ATG даної ВРЗ, є сигнальним пептидом (див. рис.2). Ці дані дозволяють зробити висновок про ймовірну периплазматичну або позаклітинну локалізацію зрілого РelX- білка, що узгоджується з даними щодо РelX E. chrysanthemi, який є периплазматичним білком (Shevchik et. al., 1999).

Рис.5. Порівняння амінокислотних послідовностей. K.ox- Klebsiella oxytoca VN13, E.chr.- Erwinia chrysanthemi, B.hal.- Bacillus halodurans, B.sp.- Bacillus sp., Cl.cel- Clostridium cellulovorans PelX- екзопектатліази, PelН, PelА – ендопектатліази

Створення мутантного штаму K. oxytoca VN13 з інактивованим pelX-геном. З метою створення мутанту спочатку інактивували pelX-ген на плазміді. Для цього клонували ЕсоRI фрагмент плазміди рНР45Сm, розміром 3,6 тис. п. н., що містить послідовність саt–гена та кодує резистентність до хлорамфеніколу (CmR), в унікальний ЕсоRI сайт плазміди pLC28P, який знаходиться в кодуючій частині pelX-гена. Отримана плазміда рLC28P::Сm мала розмір 9,3 тис. п. н. і містила cat- ген у структурній частині pelX- гена (рис.6).

Рис. 6. Схема інактивації pelX- гена на плазміді

Нездатність штамів E.coli з плазмідою рLC28P::Сm до продукції пектатліази підтвердила факт інактивації pelX-гена.

Для перенесення мутантного гена в хромосому K. oxytoca VN13 було використано плазміду рJP5603, що реплікується тільки в спеціальних штамах E.coli, які синтезують допоміжний -білок. Ця плазміда може бути мобілізована з штаму E. coli S17-1pir завдяки наявності в її послідовності mob-сайта плазміди RP4. Було створено плазміду pFU101, що містить два фрагменти pelX- гена, розділених геном стійкості до хлорамфеніколу в складі вектора рJP5603. Плазмідою pFU101 було трансформовано мобілізуючий штам E.coli S17-1pir для її кон’югативного перенесення в K. oxytocа VN13.

Було відібрано два клони транскон’югантів, які мали стійкість до хлорамфеніколу та не мали стійкості до канаміцину, що може свідчити про втрату плазміди та інтеграцію мутантної копії pelX-гена в хромосому K. oxytoca VN13.

Для перевірки даного припущення використовували метод ДНК-ДНК блот-гібридизації. Тотальну ДНК мутантних клонів, а також K.oxytoca VN13 дикого типу гідролізували окремо рестриктазами BglII, для якої відсутній сайт рестрикції в межах гена з інсерцією, та HindIII, гідроліз якою вищеплює cat- ген з pelX-гена (рис.6). Для виявлення гена стійкості до хлорамфеніколу як зонд використовували HindIII-фрагмент плазміди рНР45-Сm розміром 3,6 тис. п. н. Для ідентифікації гена pelX гібридизацію проводили з SacI-XbaI фрагментом pLC28P розміром 3,0 тис. п. н., що містить всю послідовність pelX.

Гібридизація з pelX-зондом показала, що клони мутантів, які були гідролізовані BglII, представлені однією гібридизаційною смугою, що відповідає цілому pelX-гену, теж саме спостерігається для ДНК K. oxytoca дикого типу (рис. 7А). На рисунку видно, що гібридизаційні смуги, які відповідають фрагменту ДНК мутантних клонів, що містить pelX-ген, мають більшу молекулярну масу через вставку cat- гена, ніж аналогічна смуга ДНК K. oxytoca VN13 дикого типу. ДНК клонів мутантів, розщеплена рестриктазою HindIII (рис. 7А) представлені двома гібридизаційними смугами. Це пояснюється тим, що фермент HindIII, вищеплює вставку з cat-геном, і, таким чином, розбиває фрагмент з pelX- геном на дві частини, з кожною з яких і гібридизувався зонд. У варіанті з ДНК K. oxytoca VN13 дикого типу, також обробленою HindIII, спостерігається тільки одна смуга, що є результатом відсутності сайта рестрикції для даної рестриктази всередині pelX K. oxytoca VN13.

Гібридизація з cat-зондом показала, що обидва мутанти мають цей ген в хромосомі (рис. 7Б). З рисунка видно, що cat-ген представлений у цих мутантів однією копією. Гібридизаційна смуга у ДНК клонів мутантів, розщеплена рестриктазою HindIII (рис. 7Б) відповідає розміру фрагмента вставки cat-гена в pelX, що вищеплюється даною рестриктазою.

Рис.7. А- Гібридизація з зондом “pelX”. З- зонд; Д.Т.- ДНК K. oxytoca VN13дикого типу, М1 та М2- ДНК мутантних клонів. Б- Гібридизація із зондом “Cm”. З- зонд; Д.Т.- ДНК K. oxytoca VN13 дикого типу, М1 та М2- ДНК мутантних клонів. Вказано рестриктази, якими проводився гідроліз

Результати гібридизаційного аналізу свідчать, що перевірені клони транскон’югантів є мутантами з інактивованим за рахунок інсерції cat-гена геном pelX, а також, що K.oxytoca VN13 має одну копію pel-гена з даною нуклеотидною послідовністю в геномі.

Для того, щоб перевірити наявність у K. oxytoca VN13 інших пектатліазних генів було проведено перевірку пектатліазної активності мутантного клону. Отримані результати наведено в таблиці 2.

Таблиця 2

Пектатліазна активність K. oxytoca VN13 дикого типу та мутантного штаму з інактивованим pelX-геном у хромосомі

Варіант | Пектатліазна активність, мкМоль·хв-1·мл-1

K. oxytoca VN13 дикий тип | 0,024

K. oxytoca VN13 pelX-- мутант | 0,014

Дані, наведені в таблиці дозволяють стверджувати, що K. oxytoca VN13 має в геномі більше ніж один ген, який кодує пектатліазу.

Створення гібридної конструкції, що містить кодуючу частину lacZ-гена під pelX-промотором. Для вивчення характеру експресії клонованого гена було створено гібридну конструкцію, яка містить кодуючу частину гена в-?алактозидази lacZ під pelX-промотором. Для створення вказаної конструкції було використано плазміду pCB192 з безпромоторним lacZ-геном. Полілінкер pCB192 розташований таким чином, що між ним та початком кодуючої частини lacZ знаходяться три стоп-кодони, які термінують трансляцію за трьома рамкам зчитування (рис. 8), а також сайт зв’язування з рибосомами, що дозволяє тран-

Рис. 8. Схема створення гібридної конструкції, що містить lacZ-ген під pelX-промотором. Вказано промоторні ділянки pelX та суміжного гена. Стоп-кодони виділено прямокутниками. СЗР- сайт зв’язування з рибосомою

сляцію lacZ-транскрипту. PstI-SmaI фрагмент pLC28P розміром 700 п. н., що включав 608 п. н. вище pelX- гена та 92 п. н. його кодуючої частини, було клоновано в полілінкер рСВ192. Конструкцією, що отримала назву pGalP (див. рис. 8), було трансформовано E. coli JM109 та K. oxytoca VN13.

Створену конструкцію було використано для вивчення характеру експресії pelX-гена, що визначався за рівнем ?-галактозидазної активності. Увагу було приділено двом індукторам- полігалактуронату (ПГН), продукти розщеплення якого відомі як індуктори експресії пектиназних генів E. chrysanthemi та E. carotovora, та рослинному екстракту, що діє аналогічним чином. Отримані дані порівнювалися з даними для загальної пектатліазної активності K. oxytoca VN13 (рис.9).

Рис. 9. ?- галактозидазна активність E. coli JM109 та K. oxytoca VN13, трансформованих pGalP та загальна пектатліазна активність K. oxytoca VN13. А- ?- галактозидазна активність E. coli JM109 (pGalP); Б- ?- галактозидазна активність K. oxytoca VN13 (pGalP); В- загальна пектатліазна активність K. oxytoca VN13.ГЛІЦ.- гліцерин; ГЛЮК.- глюкоза; ПГН- полігалактуронат; РЕ- рослинний екстракт

Потрібно зазначити ряд закономірностей, що простежуються в результатах даного дослідження.

1.

2.

3.

4.

5.

Суттєвий рівень конститутивного синтезу РelX та низький рівень індукції рelX-гена при додаванні субстрату, може вказувати на роль його продукту як ініціатора процесу пектинолізису. Незначна кількість продуктів розщеплення пектину, що утворюється внаслідок конститутивного синтезу РelX, перетворюючись на власне індуктори- 5-кето-4-дезоксиуронат, 2,5- дикето-3- дезоксиглюконат та 2- кето- 3- дезоксиглюконат, дозволяють зняти репресію інших генів, задіяних у процесі деполімеризації клітинної стінки рослини, що входять до складу KdgR-регулону.

Інгібування експресії пектатліазних генів рослинним екстрактом може вказувати на те, що рослина продукує певні речовини, які контролюють пектолітичну, тобто, мацеруючу активність ендофітної K. oxytoca. Присутність пектину в середовищі, стимулює бактерію до його розщеплення і дозволяє колонізувати рослину, а рослинні продукти контролюють ріст рівня експресії різних генів пектолітичної системи, уникаючи мацерації тканин та підтримуючи певну чисельність бактерій в асоціації. Наявність такого механізму дозволила б пояснити чому, навіть, при здатності до високого рівню синтезу пектатліаз, ендофітна K. oxytoca VN13, на відміну від фітопатогенних бактерій роду Erwinia, не спричиняє м'якої гнилі рослин.

ВИСНОВКИ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Kovtunovych G., Lar O., Kordyum V., Kleiner D., Kozyrovska N. Enhancing the internal plant colonization rate with endophytic nitrogen-fixing bacteria // Биополимеры и клетка. - 1999. - Т. 15, № 4. - С. 300-305.

2. Kovtunovych G., Lar O., Kamalova S., Kordyum V., Kleiner D., Kozyrovska N.. Correlation between pectate lyase activity and ability of diazotrophic Klebsiella oxytoca VN13 to penetrate into Plant Tissues by // Plant and Soil. - 1999. - Vol. 215.- P. 1-6.

3. Лар О. В., Ковтунович Г. Л., Козировська Н. О. Клонування і аналіз гена пектатліази pelX Klebsilla oxytoca VN13 // Біополімери і клітина.- 2002.-Т.17, № 5.- С. 417-422.

4. Kovtunovych G., Lar О., Kozyrovska N. Molecular mechanisms of diazotrofic Klebsiella oxytoca enter inside the plant tissue: the role of polygalacturonase and pectate lyase // Fourth European Nitrogen Fixation Conference. - Seville (Spain). - 2000. - P. 151.

Анотація

Лар О. В. Клонування та аналіз структури і особливостей експресії гена екзопектатліази ендофітної бактерії Klebsiella oxytoca VN13.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.22- молекулярна генетика. - Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 2003.

В дисертації викладено результати дослідження пектатліазної активності ендофітної бактерії K. oxytoca VN13, що використовується як основа біопрепаратів для рослинництва.

Клоновано та визначено нуклеотидну послідовність pelX-гена, який кодує екзопектатліазу. Проведено аналіз кодуючої та регуляторних ділянок вказаного гена. Виявлено операторні ділянки для репресора пектолітичної системи - KdgR. Велика ймовірність існування сигнального пептиду на N-кінці первинного транслянту pelX-гена вказує на позацитоплазматичну локалізацію зрілого РelX – білка.

Сконструйовано мутантний штам K. oxytoca VN13 з інактивованим pelX – геном та виявлено наявність додаткового пектатліазного гена (генів) K. oxytoca VN13. Створено гібридну конструкцію, що містить lacZ – ген, який кодує ?– галактозидазу, під pelX – промотором та за її допомогою встановлено конститутивний характер експресії pelX-гена K. oxytoca VN13. Конститутивний характер експресії pelX та відсутність його індукованості в присутності полігалактуронату та рослинного екстракту, може вказувати на роль його продукту як ініціатора процесу пектинолізису.

Запропоновано можливість існування механізму контролю пектолітичної активності та чисельності бактерій - асоціантів K. oxytoca VN13 у внутрішніх тканинах кореня рослини, що полягає в здатності рослини до синтезу певних речовин, які прямо або опосередковано є інгібіторами синтезу бактеріальних пектатліаз.

Ключові слова: Klebsiella oxytoca, пектиназа, пектатліаза, pelX.

Аннотация

Лар Е. В. Клонирование и анализ структуры и особенностей экспрессии гена экзопектатлиазы эндофитной бактерии K. oxytoca VN13.- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.22- молекулярная генетика. - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2003.

В диссертации изложены результаты по продолжению исследования пектолитической системы эндофитной бактерии K. oxytoca VN13, которая используется как основа биопрепаратов для растениеводства.

С целью поиска генов пектинолизиса K. oxytoca VN13 была создана геномная библиотека на основе вектора pUC19 с использованием для ее создания Sau3A-фрагментов хромосомной ДНК K. oxytoca VN13. Клонирован фрагмент хромосомной ДНК K. oxytoca VN13 размером 5,2 тыс. п. н. содержащий ген pelX, кодирующий пектатлиазу. При помощи метода хроматографии на бумаге установлена экзосубстратная специфичность продукта гена pelX. Определена и проанализирована полная нуклеотидная последовательность кодирующей части pelX-гена, а также его регуляторных областей. Определены потенциальные промоторные участки, найдены сайты для связывания репрессора генов пектинолизиса - KdgR. Высокая степень вероятности существования сигнальной последовательности на N-конце первичного транслянта pelX–гена указывает на внеклеточную либо периплазматическую локализацию зрелого РelX–белка, что согласуется с данными относительно экзопектатлиазы РelX Erwinia chrysanthemi, которая локализуется в периплазме. Проведен сравнительный анализ гомологии нуклеотидной последовательности pelX–гена и выведенной аминокислотной последовательности первичного транслянта с соответствующими последовательностями, депонированными в электронном банке генов. Не найдено существенной гомологии нуклеотидной последовательности гена с известными ДНК-последовательностями других микроорганизмов, кроме нескольких участков ДНК, длиной до 150 н.п. гомологичных pelX–гену Erwinia chrysanthemi. Кроме того, установлено, что участок нуклеотидной последовательности, прилежащий к началу pelX–гена K. oxytoca VN13 содержит начало открытой рамки считывания (ОРС), транскрибируемой по противоположной цепи ДНК, и гомологичной glmU- гену Escherichia coli, что совпадает с данными относительно аналогичного участка хромосомной ДНК, прилежащего к pelX-гену E. chrysanthemi.

Инсерционный мутант K. oxytoca VN13 по pelX-гену был создан с целью установления наличия дополнительных пектатлиазных генов у K. oxytoca VN13. Измерение пектатлиазной активности данного мутанта продемонстрировало наличие еще одного или нескольких пектатлиазных генов K. oxytoca VN13.

С целью изучения характера экспрессии pelX- гена в сравнении с общей пектатлиазной активностью K. oxytoca VN13 была создана гибридная конструкция, содержащая lacZ- ген, кодирующий ? – галактозидазу, под pelX- промотором. Был показан низкий базовый уровень экспрессии данного гена, а также его слабая индуцибельность в присутствии продуктов пектинового катаболизма и растительного экстракта. Такой результат свидетельствует, что в проникновении во внутренние ткани растения продукт гена pelX K. oxytoca VN13, скорее всего, играет роль инициатора процесса деполимеризации растительной клеточной стенки. Незначительное количество продуктов деградации пектину, которые образуются вследствие конститутивного синтеза РelX, превращаясь в собственно индукторы- 5-кето-4-дезоксиуронат, 2,5- дикето-3- дезоксиглюконат и 2- кето- 3- дезоксиглюконат, позволяют снять репрессию других генов, задействованых в процессе деполимеризации клеточной стенки растения, которые входят в состав KdgR-регулона.

Существенная разница в уровне экспрессии ?- галактозидазы в E. coli и в K. oxytoca VN13 (в шестнадцать раз выше в E. coli чем в K. oxytoca VN13 ), а также неполная дерепрессия экспрессии pelX при добавлении субстрата, может свидетельствовать в пользу наличия у K. oxytoca VN13 дополнительного негативного регулятора экспрессии pelX. В пользу этого предположения свидетельствует также тот факт, что уровень экспрессии гена экзополигалактуроназы K. oxytoca VN13 в E. coli и K. oxytoca VN13 практически не отличается.

Ингибирование экспрессии пектиназных генов растительным экстрактом может свидетельствовать о том, что растение продуцирует определенные вещества, контролирующие пектолитическую активность эндофитной K. oxytoca VN13. Присутствие пектина в среде стимулирует бактерию его расщеплять и позволяет колонизировать растение, а растительные продукты контролируют рост уровня экспрессии различных генов пектолитической системы, не приводя к мацерации тканей и поддерживая определенную численность бактерий в ассоциации.

Указывается на возможность существования механизма контроля численности бактерий- ассоциантов K. oxytoca VN13 во внутренних тканях корня растений, что проявляется в способности растения к синтезу определенных веществ, выступающих, прямо или косвенно, ингибиторами синтеза бактериальных пектатлиаз. Существование такого механизма могло бы пояснить почему, при высоком уровне синтеза пектиназ в условиях полной дерепрессии экспрессии соответствующих генов, эндофитная K. oxytoca VN13 не вызывает мягкой гнили растений.

Ключевые слова: Klebsiella oxytoca, пектиназа, пектатлиаза, pelX.

Summаry

Lar O. V. Cloning and analysis of the structure and a character of expression of exo- pectate lyase gene of endophytic bacteria Klebsiella oxytoca VN13.- Manuscript.

Тhesis for a candidate’s scientific degree of biological science by speciality 03.00.22- molecular genetic. - Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Science of Ukraine, Kyiv, 2003.

This manuscript presents results of investigation of the pectate lyase activity of endophytic bacteria Klebsiella oxytoca VN13, which is used for inoculant production.

The pelX gene of Klebsiella oxytoca VN13, coding for the pectate lyase activity, was cloned and sequenced. Coding and regulatory regions of pelX were analyzed. Two boxes for the KdgR repressor binding located in the promoter region were