НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІООРГАНІЧНОЇ ХІМІЇ ТА НАФТОХІМІЇ

ЛУКАШОВ Сергій Степанович

УДК 577.366+57.08.088.5+542.95

ПРОСТОРОВО УСКЛАДНЕНІ ЦІАНІНИ ДЛЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЇ ДЕТЕКЦІЇ НУКЛЕЇНОВИХ КИСЛОТ

02.00.10 – біоорганічна хімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата хімічних наук

КИЇВ – 2003

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі структури і функцій нуклеїнових кислот Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ.

Наукові керівники: | академік НАН України, доктор біологічних наук, професор

МАЦУКА Геннадій Харлампійович,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,

завідувач відділу структури і функцій

нуклеїнових кислот

кандидат хімічних наук, старший науковий співробітник

ЯРМОЛЮК Сергій Миколайович,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,

старший науковий співробітник відділу структури і функцій

нуклеїнових кислот

Офіційні опоненти: | доктор хімічних наук, професор

ТОЛМАЧОВ Олексій Іванович,

Інститут органічної хімії НАН України,

завідувач відділу кольору та будови органічних сполук

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

ГОВОРУН Дмитро Миколайович,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,

завідувач відділу молекулярної біофізики

Провідна установа: | Фізико-хімічний інститут ім. О. В. Богатського НАН України, відділ медичної хімії (м. Одеса)

Захист дисертації відбудеться 28 березня 2003 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.220.01 в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (02660, Київ-94, вул. Мурманська, 1)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (02660, Київ-94, вул. Мурманська, 1)

Автореферат розіслано 25 лютого 2003 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д.М.Федоряк

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. За останнє десятиліття флуоресцентні зонди на основі ціанінових барвників стали звичним засобом візуалізації нуклеїнових кислот (НК). Унікальна властивість ціанінів в сотні разів збільшувати квантовий вихід флуоресценції при взаємодії з НК дозволяє спрощувати процедури детекції і проводити кількісне визначення НК в присутності значного надлишку зонду. Відомі на сьогодні ціанінові флуоресцентні зонди для детекції НК базуються на обмеженому наборі флуорофорів, більшість з яких є монометинціанінами. Розширення набору флуорофорів за рахунок використання триметин- та пентаметинціанінів дозволить заповнити діапазон максимумів поглинання/випромінювання зондів в зручній для дослідження біологічних об’єктів області поза 600 нм та надасть нових можливостей для мультикольорової детекції НК.

Взаємодія ціаніну з НК спричинює значні зміни його спектрально-люмінесцентних властивостей. Це дає можливість вивчати комплекси ціанінів з НК простими методами електронної спектроскопії. Дотепер взаємодія з ДНК ретельно вивчена лише для монометинціанінів. Комплекси ціанінів з довшим поліметиновим ланцюгом а також процеси асоціації ціанінів в присутності НК систематично не досліджувались.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано у відповідності з планом науково-дослідних робіт ІМБіГ НАН України: державною бюджетною темою “Синтез та вивчення механізму взаємодії ціанінових флуоресцентних зондів з нуклеїновими кислотами” №2.2.4.16 за 1997-99 р. (№ держ. реєстрації: 0197U004292). Дослідження проводилися також згідно Угоди про матеріальну підтримку між Інститутом молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ та Ліверморською національною лабораторією Каліфорнійського університету (Lawrence Livermore National Laboratory, Livermore, CA, USA), № В507077, програма ІРР Міністерства Енергетики США.

Мета роботи полягала в розробці синтетичних підходів до отримання нових флуоресцентних барвників шляхом введення замісників до поліметинового ланцюга триметинціанінів, а також у вивченні впливу природи замісників на спектрально-люмінесцентні властивості модифікованих барвників у присутності НК.

Для досягнення поставленої мети вирішувалися такі завдання:

·

·

·

Об’єкт дослідження – просторово ускладнені ціаніни, нуклеїнові кислоти.

Предмет дослідження – синтез заміщених у поліметиновому ланцюзі триметинціанінів та вивчення їх спектрально-люмінесцентних властивостей в присутності нуклеїнових кислот.

Методи дослідження – органічний синтез, ЯМР1Н-спектроскопія, електронна спектроскопія поглинання та випромінювання, квантовохімічні розрахунки, гель-електрофорез.

Наукова новизна одержаних результатів. Розроблено ефективні підходи для одержання триметинціанінів заміщених у поліметиновому ланцюзі. Запропоновано новий зручний метод С-ацилювання активних метиленових груп імідазолідами карбонових кислот з використанням активуючого агента N,N’-карбонілдіімідазолу (КДІ).

Вперше встановлено, що первинні аліфатичні замісники в мезо-положенні поліметинового ланцюга значно зменшують власну флуоресценцію триметинціанінів і збільшують інтенсивність їх флуоресценції в комплексах з НК. Доведено, що переважним способом взаємодії триметинціанінів з НК є інтеркаляція. При цьому окремі мезо-заміщені триметинціаніни здатні в присутності АТ-послідовностей ДНК специфічно утворювати флуоресцентні J-агрегатні структури.

Практичне значення одержаних результатів. Мезо-алкілтриметинціаніни вперше запропоновано для флуоресцентного визначення НК в розчині та агарозному гелі. Виявлені закономірності впливу модифікації поліметинового ланцюга та гетероциклічних залишків на взаємодію триметинціанінів з біополімерами є важливою передумовою спрямованого пошуку нових ефективних флуоресцентних зондів. Мезо-метилтриметиноксаціанін запропоновано в якості високочутливого флуоресцентного зонда для візуалізації НК у гель-електрофорезі.

Особистий внесок здобувача. Основний об’єм експериментальної роботи, обробка та аналіз отриманих результатів, формулювання висновків дисертаційної роботи виконані особисто здобувачем. Частина досліджених барвників була люб’язно надана Ю.Л.Сломінським. Спектральні виміри проводені спільно з В.Б.Ковальською та М.Ю.Лосицьким. Комп’ютерне моделювання виконано у співпраці з Г.О.Качковським. Постановка задачі та обговорення результатів проведені разом з науковими керівниками.

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи доповідались на 8-ій Європейській конференції з спектроскопії біологічних молекул (Holland, Enschede, 1999), ХV та XVI Наукових конференціях з біоорганічної хімії та нафтохімії (Київ 2000, 2001), Міжнародній конференції “Хімія азотовмісних гетероциклів” (Харків, 2000), 7-ій Конференції з методів та застосування флуоресценції (Holland, Amsterdam, 2001), Конференції молодих науковців, аспірантів та студентів з молекулярної біології і генетики (Київ, 2001) та 5-му Міжнародному симпозіуму з функціональних р-електронних систем (Germany, Ulm 2002) а також на наукових семінарах відділу структури та функцій НК ІМБіГ НАН України (1998 – 2002).

Публікації. Основний зміст роботи відображено у 9 статтях в наукових фахових журналах та 5 тезах доповідей на наукових конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, експериментальної частини, обговорення результатів, висновків та списку використаних літературних джерел (138 найменувань). Дисертація викладена на 150 сторінках друкованого тексту і містить 11 таблиць, 18 схем та 38 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У першому розділі описано основні типи створених на основі ціанінових барвників флуоресцентних зондів для детекції НК. Розглянуто методи синтезу триметинціанінів з замісниками у поліметиновому ланцюзі і способи взаємодії ціанінів та іншних малих молекул з НК.

У другому розділі наведено методики синтезу ціанінових барвників та фізико-хімічних досліджень. Описано процедури приготування розчинів нуклеїнових кислот та барвників та порядок проведення спектральних досліджень, методи визначення констант зв’язування барвників з ДНК та квантовохімічні розрахунки параметрів комплексів барвник-ДНК.

У третьому розділі подано результати експериментальних досліджень та їх обговорення.

Винятково важливою властивістю ціанінів є значна (2-3 порядки) різниця між рівнем випромінювання зв’язаного та незв’язаного з НК барвника. Надлишок зонду не дає значного сигналу і при визначенні НК відпадає потреба у трудомісткій процедурі виділення комплексу зонд-НК. Такий спрощений аналіз називають гомогенною детекцією (homogeneous assay) НК. Поєднання конформаційної гнучкості поліметинового ланцюга та просторових ускладнень в молекулах ціанінів призводить до того, що часто їх геометрія дещо відрізняється від необхідної для ефективної флуоресценції плоскої конформації (рис. 1). З НК ціаніни утворюють достатньо міцні комплекси (К ? 105 – 106 М-1). При цьому молекула барвника стискається основами НК в інтеркаляційному комплексі або стінками малої борозенки в борозенковому комплексі і набуває практично плоскої конформації. Фіксація молекули барвника значною мірою обмежує коливальні рухи поліметинового ланцюга, які є головним каналом безвипромінювальної дезактивації збудженого стану ціанінів. В результаті спостерігається багатократне зростання інтенсивності флуоресценції барвника. В утворених з НК комплексах квантовий вихід ціанінів досягає 20 – 90%.

В молекулах монометинових ціанінів просторові ускладнення створюють два поруч розташовані гетерозалишки (рис. 1). Гетерозалишки в молекулах ціанінів з довшим поліметиновим ланцюгом, в тому числі триметинціанінів, знаходяться на значній відстані один від одного і не мають безпосереднього контакту. Основною формою таких молекул є плоска, повністю транс- конформація (рис. 2). Для застосування в гомогенній детекції НК такі барвники мають занадто високий рівень власного випромінювання (квантовий вихід до 10 %). Одним з можливих шляхів зменшення інтенсивності власної флуоресценції триметинціанінів є введення до їх поліметинового ланцюга об’ємних замісників (рис. 3).

Синтез модельних триметинціанінів. Симетричні триметинові барвники 3.1, 3.2, 3.25 – 3.32 з атомом водню та метильною групою в мезо-положенні поліметинового ланцюга отримали ортоестерним методом з виходами 14 – 94% (схема 1). Конденсацію з триметилортоацетатом проводили при 120оС в диметилацетаміді в присутності триетиламіну.

Схема 1. Синтез барвників 3.1, 3.2, 3.25 – 3.32-

Триметинціаніни 3.3 – 3.22 синтезували через активовані похідні ацилметиленових основ за схемою 2. Ацилметиленові основи 2.2 отримували ацилюванням метилметосульфату 2-метилбензотіазолу 2.1 хлорангідридами кислот в піридині при охолодженні. В якості ацилюючих агентів для ацилювання активної метильної групи 2.1 ми вперше запропонували імідазоліди карбонових кислот, що утворюються з карбонових кислот і N,N’-карбонілдіімідазолу (КДІ) в диметилформаміді. Ацилювання 2.1 імідазолідами проходило протягом 0,5-2 годин при кімнатній температурі, а продукти 2.2 виділялись з майже кількісним виходом. Запропонований спосіб дозволяє легко отримувати ацилметиленові основи з кислот, хлорангідриди яких нестійкі. Наприклад, з виходами 45 – 91% були синтезовані похідні метоксиоцтової, слизевої, 3-індоліл-оцтової і 1-нафтилоцтової кислот.

Ацилметиленові основи 2.2 послідовною дією хлорокису фосфору в хлороформі, водного гідросульфіду натрію та іодистого етилу перетворювали на ?-етилтіовінільні похідні 2.5, які в присутності триетиламіну вводили в реакцію з 2.1 з утворенням барвників 3.3 – 3.22 (схема 2).

Схема 2. Синтез барвників 3.3 – 3.22.

Вплив модифікації поліметинового ланцюга на спектрально-люмінесцентні властивості комплексів триметинціанінів з ДНК було розглянуто на прикладі триметинтіаціаніну 3.1. Введення замісників до мезо-положення поліметинового ланцюга триметинтіаціаніну суттєво зменшує рівень власної флуоресценції (І0) барвника (табл. 1). У заміщених барвників 3.3 – 3.22 І0 складає 0,01 – 1,21 умовних одиниць (у.о.), що значно менше за І0 = 8,77 у.о. у незаміщеного 3.1. Після додавання ДНК інтенсивність випромінювання барвників, за винятком 3.14, зростає. Для незаміщеного триметинтіаціаніну 3.1 це зростання (І/І0) складає тільки 2,4 рази, а для решти барвників має більшу величину і досягає 149 разів.

Величини І та І/І0 корелюють з розмірами замісника в мезо-положенні триметинтіаціаніну. Вторинні та третинні аліфатичні залишки створюють надмірні просторові перешкоди, в результаті чого інтенсивність випромінювання ДНК-комплексів таких барвників – 3.11, 3.13, 3.14 – порівняно невисока – 0,07 – 4,1 у.о.. Мезо-арил-триметинціаніни 3.15 – 3.19 при достатньо інтенсивній власній флуоресценції (0,51 – 0,87 у.о.) слабко випромінюють в ДНК-комплексах (3,05 – 6,88 у.о.). Введення до мезо-положення первинних нерозгалужених аліфатичних радикалів або замісників з об’ємними групами, які поєднані з мезо-положенням ланцюжком з двох і більше метиленових ланок (барвники 3.2 – 3.10) є найбільш вдалою модифікацією молекули триметинтіаціаніну. При взаємодії з ДНК інтенсивність флуоресценції таких барвників збільшується в середньому на два порядки, досягаючи рівня 34,2 – 42,3 у.о.. Цей рівень в 1,5 – 2 рази перевищує інтенсивність флуоресценції ДНК-комплексу незаміщеного триметинтіаціаніну 3.1 (21,3 у.о.). Очевидно первинні алкільні замісники збільшують жорсткість фіксації молекули барвника в комплексі з ДНК.

Таблиця 1

Спектрально-люмінесцентні властивості комплексів мезо-заміщених триметинтіаціанінів з ДНК..

Барвник |

Замісник R = | лДНК,

нм | еДНК.

10-5,

М-1см-1 | І0,

у. о. | л*ДНК,

нм | І,

у. о. | І/І0

3.1 | 557 | 0,65 | 8,77 | 581 | 21,3 | 2,4

3.2 | 538 | 0,8 | 0,23 | 572 | 34,2 | 149

3.3 | 540 | 0,92 | 0,51 | 573 | 36,9 | 72

3.5 | 550 | 0,37 | 0,09 | 603 | 13,2 | 145

3.6 | 545 | 0,39 | 1,21 | 570 | 9,3 | 7,7

3.8 | 543 | 0,68 | 0,55 | 573 | 41,5 | 76

3.10 | 544 | 0,24 | 0,38 | 565 | 42,3 | 112

3.11 | 544

585 | 0,48

0,35 | 0,15— |

570

605 | 3,1

4,1 | 21

27

3.13 | 584 | 0,26 | 0,01 | 605 | 0,44 | 48

3.14 | 588 | 0,16 | 0,04— | 0,07 | 1,75

3.15 | (536)

579 | 0,17

0,36— |

0,51— |

603— |

6,88— |

13,4

3.17 | 553 | 0,48 | 0,87 | 584 | 3,05 | 3,5

3.19 | 556 | 0,87 | 0,82 | 594 | 3,35 | 4,1

Наведено максимум поглинання ?ДНК та молярну екстинкцію ?ДНК барвника в присутності ДНК, максимум випромінювання барвника в присутності ДНК – ?*ДНК, інтенсивність власної флуоресценції барвника – І0 та його ДНК-комплексу І, а також приріст випромінювання при зв’язуванні – І/І0.

J-агрегація мезо-заміщених ціанінів в присутності НК. У полярному водному середовищі ціаніни, як правило, утворюють стопочні асоціативні структури – Н-агрегати. Агрегація проявляється в електронному спектрі поглинання в зниженні величини оптичної густини молекулярної смуги і появі на її короткохвильовому плечі нових смуг, що відповідають Н-агрегатам. J-агрегати ціанінів, максимуми поглинання яких зміщені в довгохвильову від молекулярного максимуму область, частіше утворюються у неполярних розчинниках.

В електронних спектрах поглинання та флуоресценції барвників 3.3, 3.4, 3.5, 3.11 (рис. 4) та 3.16 (рис. 5) в присутності ДНК з’являється чітко виділена довгохвильова J-агрегатна смуга, максимум якої батохромно зсунутий на 34-112 нм від молекулярного. Стоксів зсув у J-агрегатної смуги невеликий і розташування її у спектрах поглинання і флуоресценції близьке.

В спектрі флуоресценції ДНК-комплексу 3.11 J-агрегатна смуга знаходиться на довгохвильовому плечі молекулярної смуги (рис. 4). В спектрі флуоресценції 3.16 J-агрегата смуга чітко виділена в довгохвильовій області, а її інтенсивність перевищує інтенсивність молекулярної смуги (рис. 5).

J-агрегатні смуги в розглянутих спектрах триметинціанінів спостерігаються лише в присутності ДНК. В розчинах барвників у вільному стані та в присутності РНК вони майже непомітні (рис. 5). Напевне поява J-агрегатних смуг зумовлена взаємодією барвників з малою борозенкою ДНК.

Вплив будови гетерозалишків мезо-метилтриметинціанінів на спектрально-люмінесцентні властивості їх комплексів з НК. На прикладі барвників 3.1, 3.2, 3.25 3.32--прослідковується вплив структури гетероциклічних залишків на спектрально-люмінесцентні властивості ДНК-комплексів ціанінів.

Збільшення гідрофобності гетерозалишків зменшує розчинність барвників у воді. Через невисоку розчинність барвники 3.27 – 3.32 з залишками бензоселеназолу та нафтотіазолу значною мірою знаходяться у воді у вигляді асоціатів різної будови. Спектри поглинання 3.27 – 3.32 у водному середовищі містять кілька агрегатних смуг. Поява в розчині НК суттєво змінює контур смуг поглинання (рис. 6), та, судячи з відмінності від спектрів барвників в ДМФА (табл. 2), 3.27 – 3.32 не зв’язуються в комплекс з біополімером кількісно.

Таблиця 2

Флуоресцентні характеристики симетричних мезо-метилтриметинціанінів 3.2, 3.26, 3.28, 3.30, 3.32 та відповідних незаміщених барвників 3.1, 3.25, 3.27, 3.29 та 3.31.

Барв-

ник | Структура | ДМФА | Вода | ДНК | РНК

ІДМФА,

у.о. | ІДМФА/ І0 | І0,

у.о. | ІДНК,

у.о. | ІДНК/ І0 | ІРНК,

у.о. | ІРНК/ І0

3.25 | 25,50 | 1,9 | 13,4 | 25,6 | 1,9 | 28,9 | 2,15

3.26 | 3,94 | 1,4 | 2,8 | 76,5 | 27,0 | 66,2 | 23,64

3.1 | 18,20 | 2,1 | 8,77 | 21,3 | 2,4 | 17,4 | 1,98

3.2 | 0,79 | 3,5 | 0,23 | 34,2 | 149,0 | 31,4 | 137,0

3.27 | 28,20 | 471,0 | 0,06 | 0,17 | 2,9 | 0,22 | 3,72

3.28 | 1,88 | 4,6 | 0,41 | 2,6 | 6,3 | 5,09 | 12,4

3.29 | 41,00 | 686,0 | 0,06 | 0,13 | 2,2 | 0,62 | 10,3

3.30 | 1,44 | 7,2 | 0,20 | 15 | 76,0 | 1,25 | 6,7

3.31 | 23,2 | 289,0 | 0,08 | 0,07 | ~1,0 | 0,12 | 1,5

3.32 | 1,27 | 1,78 | 0,71 | 1,44 | 2,0 | 7,77 | 10,94

І0 – інтенсивність власної флуоресценції барвника у водному розчині, ІX – власна флуоресценція в диметилформаміді та флуоресценція барвника в присутності ДНК та РНК, ІХ/ І0 – приріст флуоресценції у відповідних умовах по відношенню до І0.

Інтенсивність випромінювання 3.1, 3.2 та 3.25 – 3.32 в ДМФА, в якому всі барвники добре розчинні, більша за інтенсивність випромінювання у воді: ІДМФА/І0 > 1. Особливо велика різниця між ІДМФА та І0 (289 – 686 разів) для малорозчинних у воді 3.27, 3.29 та 3.31 з незаміщеним поліметиновим ланцюгом.

Введення у мезо-положення поліметинового ланцюга метильної групи призводить до 5,7 – 28,5-кратного зниження ІДМФА барвника (табл. 2). Найбільш інтенсивно (ІДМФА = 3,94 у.о.) випромінює мезо-метил-триметиноксаціанін 3.26 (табл. 2) з атомом кисню в азольному кільці. Зменшення розміру гетероатома в ряду O<S<Se збільшує імовірність реалізації планарної флуоресцентної повністю транс- конформації.

В присутності НК інтенсивність випромінювання барвників 3.1, 3.2 та 3.25 – 3.32 зростає (табл. 2). У барвників з незаміщеним поліметиновим ланцюгом приріст інтенсивності випромінювання в присутності НК порівняно невеликий, ІДНК/І0 становить 1 – 2,9 раза, а ІРНК/І0 – 1,5 – 10,3 раза. При цьому інтенсивності випромінювання в присутності НК – ІДНК та ІРНК у 3.1 та 3.25 досягають ІДМФА, а у менш розчинних у воді 3.27, 3.29 та 3.31 вони поступаються ІДМФА на два порядки.

У мезо-метилзаміщених барвників 3.2, 3.26, 3.28, 3.30 та 3.32 ІДНК/І0 досягає 149 разів, а ІРНК/І0 – 137 разів. ІДНК та ІРНК барвників 3.2, 3.26, 3.30 та 3.32 перевищують ІДМФА. У 3.2 і 3.26 ІДНК та ІРНК перевищують величини ІДМФА, ІДНК та ІРНК відповідних незаміщених барвників 3.1 та 3.25 в 1,72 – 3 рази. Тобто, незалежно від природи гетерозалишку введення метильної групи у мезо-положення поліметинового ланцюга триметинціану збільшує жорсткість його фіксації в комплексі з НК.

Будова гетерозалишку може істотно впливати на характер взаємодії барвника з НК. Так 3.30 специфічно зв’язується з ДНК, а 3.32 – з РНК (рис. 7 та табл. 3).

Таблиця 3

Інтенсивність флуоресценції (у.о.) ізомерних нафтотіазолоціанінів 3.30 і 3.32

в індивідуальному стані та в присутності нуклеїнових кислот

Барвник | Водний

буфер | Нативна ДНК | РНК | poly(dA/dT) | poly(dGdC/dGdC)

3.30 | 0,2 | 15 | 1,25 | 25,4 | 4,2

3.32 | 0,71 | 1,44 | 7.8 | 3,3 | 2,1

По величині інтенсивності флуоресценції 3.30 та 3.32 в присутності полідезоксирібонуклеотидів poly(dA/dT) та poly(dGdC/dGdC) видно, що 3.30 виявляє спорідненість до АТ-послідовностей ДНК. Інтенсивність випромінювання 3.30 в присутності poly(dA/dT) виявилась вшестеро вищою за інтенсивність випромінювання в присутності poly(dGdC/dGdC). Інтенсивність флуоресценції в присутності нативної ДНК з випадковою послідовністю нуклеотидів має проміжне значення. АТ-специфічність барвника 3.30 свідчить про утворення борозенкового комплексу з ДНК. Оскільки борозенкове зв’язування з РНК не реалізується – мала інтенсивність випромінювання комплексу з РНК 3.30 цілком закономірна. 3.32 утворює флуоресцентний комплекс з РНК і не виявляє явної спорідненості до послідовності основ ДНК, що властиво інтеркаляторам.

Таким чином, попри схожість ізомерних молекул, барвники 3.30 та 3.32 утворюють з ДНК комплекси різної природи: 3.32 – інтеркаляційний, а 3.30 – борозенковий.

Залежність властивостей комплексів ціанінів з ДНК від довжини поліметинового ланцюга. Для монометинціанінів за умов надлишку НК спектрально-люмінесцентними методами та за допомогою спектроскопії ЯМР 1Н зафіксовано утворення комплексів лише інтеркаляційної будови. Інші типи взаємодії мають місце тільки при надлишку барвника, коли більшість посадкових місць для інтеркаляції вже зайнята.

Взаємодія з НК триметинціанінів і ціанінів, що мають довший поліметиновий ланцюг, вивчена не так ретельно. Методи, які дають точну інформацію про структуру комплексів НК-барвник – рентгеноструктурний аналіз чи спектроскопія ЯМР практично не застосовувались. Одні дані свідчать про співіснування різних типів зв’язування триметинціанінів навіть при значному надлишку ДНК. Згідно іншим – триметинціаніни взаємодіють з ДНК винятково як інтеркалятори.

На прикладі пар Cyan 40 – 3.40 та 3.43 – 3.2 ми порівняли властивості моно- та триметинових барвників, що мають однакові гетерозалишки і різну довжину поліметинового ланцюга. Всі барвники утворюють з ДНК флуоресцентні комплекси. При зв’язуванні з нативною ДНК сперми лосося збільшення інтенсивності випромінювання в стандартних умовах складало 2,4 – 259 раз. Пораховані з графіків флуоресцентного титрування константи стійкості ДНК комплексів становили: 1,69.105 М-1 для Сyan 40, 9,84.104 М-1 для 3.40, 5,08.104 М-1 для 3.43 та 2,45.105 М-1 для 3.2. Залежності від довжини поліметинового ланцюга не спостерігалося, проте всі чотири барвники утворювали з ДНК комплекси з характерними для інтеркаляторів значеннями констант зв’язування.

На графіках флуоресцентного титрування барвниками різних НК (рис. 8, 9) прослідковується залежність флуоресцентних властивостей комплексів від послідовності основ НК. Випромінююча здатність інтеркаляційних комплексів не повинна залежати від послідовності основ ДНК. Для борозенкових комплексів найвищу інтенсивність флуоресценції потрібно очікувати від комплексу з poly(dA/dT).

Рівень флуоресценції комплексів нативна ДНК-Сyan 40 та нативна ДНК-3.40 перевищує інтенсивність випромінювання відповідних комплексів з poly(dA/dT) і poly(dGdC/dGdC) (рис. 8). Проте, інтенсивність випромінювання у комплексів з poly(dGdC/dGdC) приблизно вдвічі більша, ніж у комплексів з poly(dA/dT). Відмінності у властивостях між комплексами Сyan 40 і 3.40 з різними НК суттєво більші, ніж відмінності у властивостях двох барвників з однією і тією ж НК. Це вказує на подібність будови комплексів, що утворюють монометинціанін Сyan 40 і триметинціанін 3.40 з НК.

Флуоресцентні властивості комплексів 3.43 і 3.2 більш прогнозовані. Інтенсивність випромінювання комплексу 3.43 і 3.2 з нативною ДНК поступається інтенсивності випромінювання комплексів з полінуклеотидами. 3.43 проявляє GC-специфічність, рівень випромінювання його комплексу втричі перевищує інтенсивність флуоресценції комплексів з нативною і poly(dA/dT). З ростом довжини поліметинового ланцюга 3.2 втрачає GC-специфічність, проте зростає схильність до утворення комплексів з poly(dA/dT). Ці комплекси помітно відрізняються від комплексів з poly(dGdC/dGdC). Насичення poly(dA/dT) барвником відбувається при втричі меншій концентрації 3.2, ніж насичення poly(dGdC/dGdC) (рис. 9). Тобто, комплекси 3.2 з poly(dA/dT) та poly(dGdC/dGdC) відрізняються один від одного, як борозенковий комплекс від інтеркаляційного, оскільки класичний інтеркалятор займає на НК 2 пари основ, а борозенковий ліганд 4-6 і більше.

Тож, барвники 3.43 і 3.2 більше відрізняються один від одного, ніж Cyan 40 і 3.40. Триметинціанін 3.2, на відміну від монометинціаніну 3.43 однаково добре взаємодіє і з АТ- і з GC-послідовностями ДНК і може утворювати як інтеркаляційні, так і борозенкові комплекси.

Дослідження взаємодії мезо-метилтриметинтіаціаніну 3.2 з ДНК спектрально-люмінесцентними методами. З метою визначення характеру взаємодiї триметинціанінів з ДНК на прикладі барвника 3.2 з найбільшим приростом інтенсивності флуоресценції при зв’язуванні проведені додаткові дослідження: 1) визначено константи зв’язування барвника з ДНК за результатами флуоресцентного титрування та міжфазного розподілу в системі етилацетат/вода; 2) розглянуто гасiння флуоресценцiї ДНК-комплексiв 3.2 під впливом електроліту хлориду натрію та анiонного гасника – йодид iона; 3) отримано спектр лiнiйного дихроїзму комплексу барвника з ДНК.

Константа зв’язування 3.2 з нативною ДНК Кзв, визначена за допомогою флуоресцентного титрування, становить 3,6104 М-1. Середнє значення Кзв, пораховане за методом двох фаз для трьох різних концентрацій ДНК (210-5 М, 410-5 М та 810-5 М), складає 1,5104 М-1. Отримані значення Кзв свідчать про утворення барвником 3.2 досить стійкого комплексу з ДНК.

Збільшення іонної сили розчину помітно зменшує стабільність борозенкових комплексів. Інтеркаляційні комплекси є більш стійкими до збільшення іонної сили. Додавання хлориду натрію за відсутності ДНК не впливає на інтенсивність випромінювання 3.2. В присутності ДНК при додаванні електроліту спостерігається гасіння флуоресценції 3.2, яке в координатах Штерна-Фольмера: І0/І = 1 + KSV[NaCl] для всіх використаних зразків ДНК лінійно залежить від концентрації солі (рис. 10). Найменше гасіння має місце для комплексу з poly(dGdC/dGdC), для якого слід очікувати найбільшої стійкості інтеркаляційного комплексу. Константи гасіння KSV – тангенси кутів нахилу прямих для всіх зразків ДНК є величинами одного порядку. Для ДНК еритроцитів курчат, poly(dA/dT) та poly(dGdC/dGdC) вони мають значення 3,12, 2,26 та 1,14 М-1, відповідно. Ці величини на порядок менші наведених в літературі KSV гасіння флуоресценції борозенково зв’язаних молекул. Це вказує на інтеркаляційну природу комплексів ДНК-барвник 3.2.

Утворення барвниками комплексів з ДНК екранує барвник від впливу середовища і, таким чином, повинно послаблювати гасіння флуоресценції 3.2 йодид іоном. В інтеркаляційному комплексі молекула барвника ефективно перекривається основами ДНК. В борозенковому комплексі барвник значно доступніший для гасника. Криві гасіння флуоресценції ДНК-комплексів 3.2 іоном йодиду наведено на рис. 11. В координатах Штерна-Фольмера спостерігається нелінійна залежність І0/І від концентрації гасника. Напевне одночасно мають місце щонайменш два механізми гасіння: взаємодія барвника з гасником та руйнування комплексу внаслідок збільшення іонної сили розчину. Лінійна апроксимація наведених кривих дає для комплексів нативної ДНК, poly(dA/dT) та poly(dGdC/dGdC) значення KSV 20,5, 19,9 та 3,2 М-1. Для незв’язаного барвника KSV = 26,2 M-1. KSV гасіння флуоресценції комплексу є добутком констант гасіння, що відповідають власне взаємодії гасника з барвником та руйнуванню комплексу під дією збільшеня іонної сили. Константи гасіння комплексів 3.2 мають менші значення, ніж KSV вільного барвника. Це свідчить про добре екранування молекули 3.2 і утворення барвником інтеркаляційних комплексів.

Cпектр лінійного дихроїзму комплексу з ДНК-барвник 3.2 представлено на рис. 12. Смуга поглинання в УФ-області за 15-кратного надлишку ДНК належить парам основ, а смуга з максимумом 540 нм – винятково барвникові. Для обох смуг приведений лінійний дихроїзм (LDr) сильно від’ємний. Toж, як пари основ, так і молекули барвника розташовані майже перпендикулярно до макроскопічної осі подвійної спіралі ДНК.

Значення величини лінійного дихроїзму смуги поглинання барвника у видимій області LDr3.2, як не дивно, в 1,56 раз перевищує значення LDrДНК смуги УФ-поглинання, яка відповідає основам ДНК. Отже, кут нахилу до осі подвійної спіралі ДНК молекули барвника (б3.2) ближчий до 90о, ніж для її основ (бДНК). З виразу для орієнтаційної компоненти лінійного дихроїзму можна отримати:

Якщо прийняти орієнтацію барвника перпендикулярною до осі подвійної спіралі, то наведене рівняння дає максимально можливе значення кута бДНК для основ ДНК близько 70о. Тож, взаємодія з барвником призводить до помітного відхилення конформації подвійної спіралі ДНК від В-форми, в якій кут нахилу основ відносно осі спіралі близький до 80о. Значні зміни структури ДНК відбуваються лише при інтеркаляційній взаємодії. Зв’язування борозенкових лігандів, навпаки, стабілізує В-форму спіралі ДНК.

Отже, отримані результати, а саме стійкість комплексів барвника з ДНК до збільшення іонної сили розчину, екранування барвника в комплексі від дії гасника флуоресценції, від’ємне значення приведеного лінійного дихроїзму для смуги поглинання ДНК-комплексу у видимій області, свідчать на користь того, що переважним способом взаємодії барвника 3.2 з ДНК є інтеркаляція.

Використання барвників для візуалізації НК в гель-електрофорезі. Для візуалізації ДНК в агарозному гелі були використані ціаніни 3.2, 3.23, 3.24, 3.26, 3.41, 3.43 – 3.45. Досліди проводили для кільцевої та лінійної форм дволанцюгової ДНК плазміди pZD9 (5kb), та фрагментів ДНК фага , розщепленої рестриктазою HindIII. Після електрофоретичного розділення платівки гелю протягом 30 хв. фарбували в розчинах барвників. Флуоресценцію барвників збуджували УФ-опроміненням на довжині хвилі 260 нм. Платівки гелю сканували і вираховували відносну інтенсивність флуоресценції забарвлених смуг НК. Застосовані для фарбування ціаніни утворювали з НК флуоресцентні комплекси, що випромінювали світіння різних кольорів. Барвники однаково ефективно забарвлювали кільцеву і лінійну ДНК. Чисельні характеристики, отримані для барвників 3.23 і 3.26 порівняно з бромистим етидієм (EtBr) подані в табл. 4.

Таблиця 4

Відносна інтенсивність (в умовних одиницях флуоресценції) смуг ДНК

на платівках агарозного гелю, забарвлених барвниками 3.23, 3.26 та EtBr.

Довжина фрагментів, п.о. ДНК | 3.23 | 3.26 | EtBr

23130 | 109,8 | 194,4 | 157,3

9416 | 119,7 | 159,5 | 166,2

6557 | 109,7 | 125,1 | 153,9

4361 | 80,9 | 71,7 | 101,8

2322 | 93,7 | 75,2 | 127,1

2027 | 88,0 | 70,9 | 117,3

кільцева ДНК pZD9 | 136,0 | 165,5

лінійна ДНК pZD9 | 131,4 | 168,0

В умовах проведеного експерименту чутливість визначення НК ціаніновими барвниками 3.23 та 3.26 при нижчому рівні фонового забарвлення агарозної платівки досягала чутливості визначення за допомогою EtBr (табл. 4). Але звернемо увагу на те, що молярна екстинкція EtBr в ультрафіолетовій області і у видимій області до 500 нм має приблизно одну і ту ж величину, яка на порядок поступається молярній екстинкції ціанінів у видимій області. Тобто, при збудженні флуоресценції ціанінів 3.23 та 3.26 на довжинах хвиль максимумів їх поглинання у видимій області (при 595 та 487 нм) ми отримали б на порядок більшу чутливість детекції, ніж спостерігали в даному експерименті.

ВИСНОВКИ

1. Вперше за допомогою спектрально-люмінесцентних методів вивчено взаємодію триметинціанінів з алкільними замісниками в поліметиновому ланцюзі з нуклеїновими кислотами та запропоновано використання цих барвників для флуоресцентного визначення НК в розчині та агарозному гелі.

2. Синтезовано понад 40 ціанінових барвників та вивчено вплив природи замісника у мезо-положенні поліметинового ланцюга на спектрально-люмінесцентні властивості триметинціанінів в присутності НК. Барвники з первинними алкільними мезо-замісниками випромінюють в комплексі з НК в 2-3 рази інтенсивніше ніж незаміщені аналоги. При зв’язуванні з НК приріст флуоресценції складає у мезо-алкілзаміщених барвників 2 порядки, а у незаміщених барвників лише 2-3 рази.

3. Для С-ацилювання активних метиленових груп четвертинних солей азотистих гетероциклів вперше запропоновано використання імідазолідів карбонових кислот.

4. За допомогою спектрально-люмінесцентних методів доведено, що триметинціаніни взаємодіють з НК переважно шляхом інтеркаляції.

5. Показано, що структура гетерозалишків суттєво впливає на характер взаємодії барвника з ДНК. Ізомер мезо-метил-нафтотіазолоціаніну з залишками нафто[1,2-d]тіазолу зв’язується з ДНК за інтеркаляційним механізмом. Ізомер з залишками нафто[2,1-d]тіазолу специфічно зв’язується з АТ-послідовностями ДНК з утворенням борозенкового комплексу.

6. Виявлено, що на АТ-послідовностях ДНК мезо-заміщені триметинціаніни специфічно утворюють флуоресцентні J-агрегатні структури.

7. Мезо-метил-триметиноксаціанін запропоновано для візуалізації НК в гель-електрофорезі.

Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації

1. Yarmoluk S.M., Kovalska V.B., Lukashov S.S., Slominsky Yu.L. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids. XII. -substituted carbocyanines as possible fluorescent probes for nucleic acids detection. // Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters – 1999. – 9 – Р.1677 – 1678.

2. Лукашов С.С., Лосицький М.Ю., Ярмолюк С.М., Сломінський Ю.Л. Взаємодія ціанінових барвників з нуклеїновими кислотами. 12. Нові монометинові ціаніни на основі 5,6-метилендіоксибензотіазолу та спектрально-люмінісцентні властивості їхніх комплексів з нуклеїновими кислотами // Біополімери і клітина – 2000. – 16, №6. – С. 562 – 572.

3. Yarmoluk S.M., Lukashov S.S., Ogul’chansky T.Yu., Losytskyy M.Yu., Kornyushyna O.S. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids. 21. Arguments for half-intercalation model of interaction // Biopolymers – 2001. – 62, №4. – Р.219 – 227.

4. Лукашов С.С., Лосицький М.Ю., Сломінський Ю.Л., Ярмолюк С.М. Взаємодія ціанінових барвників з нуклеїновими кислотами. 7. Карбоціанінові барвники, заміщені в поліметиновому ланцюзі, як можливі зонди для флюоресцентної детекції нуклеїнових кислот // Біополімери і клітина – 2001. – 17, №2. – С.169 – 177.

5. Лукашов С.С., Kачковський Г.О., Лосицький М.Ю., Ярмолюк С.М. Взаємодія ціанінових барвників з нуклеїновими кислотами. 22. Спектрально-люмінесцентні властивості монометинових пірилієвих і піридинових ціанінів та їх ДНК-комплексів // Біополімери і клітина – 2001. – 17, №3. – С.242 – 248.

6. Лукашов С.С., Качковський Г.О., Ярмолюк С.М., Мацука Г.Х. Взаємодія ціанінових барвників з нуклеїновими кислотами. 23. Комп’ютерне моделювання напівінтеркаляційної взаємодії монометинових ціанінових барвників з GCTA:TAGC – фрагментом ДНК // Біополімери і клітина – 2001. – 17, №4. – С.331 – 336.

7. Лукашов С.С., Маковенко І.Є., Сломінський Ю.Л., Ярмолюк С.М. Взаємодія ціанінових барвників з нуклеїновими кислотами. Мезо-метилзаміщені триметинціанінові барвники як можливі зонди для флуоресцентної детекції нуклеїнових кислот // Біополімери і клітина – 2001. – 17, №5. – С.448 – 454.

8. Kovalska V.B., Valyukh I.V., Lukashov S.S., Slominskii Yu.L., Yarmoluk S.M. An Investigation of Tricarbocyanines “Stains-All” and “iso-Stains-All” as Fluorescent Nucleic Acids Probes // Journal of Fluorescence – 2002. – 12, №2. – Р.209 – 212.

9. Лукашов С.С., Лосицький М.Ю., Ковтун Ю.П., Ярмолюк С.М. Взаємодія ціанінових барвників з нуклеїновими кислотами. Мезо-заміщені триметинціанінові барвники для флуоресцентної детекції нуклеїнових кислот // Біополімери і клітина – 2002. – 18, №3. – С.243 – 254.

10. Lukashov S.S., Lossytsky M.Yu., Yarmoluk S.M. “Half-intercalation” model of monomethіne cyanines interaction with DNA. // 8th Europ. Conf. Spectroscop. Biolog. Molec. (29 Aug. – 2 Sept. 1999, Enschede, Netherlands): рost-deadline papers – Enschede, 1999. – Р.15 – 16.

11. Лукашов С.С., Лосицький М.Ю., Ярмолюк С.М. Дослідження взаємодії 3,3’,9-триметил-тіакарбоціанін йодиду з ДНК спектрально-люмінесцентними методами // Міжнародна конференція “Хімія азотовмісних гетероциклів” (Харків, 2000): тези доповідей – Харків, 2000 – С.232.

12. Lukashov S.S., Makovenko I.E., Losytskyy M.Yu., Yarmoluk S.M. Interaction of mono- and thrimethine cyanine dyes with DNA // 7th Conference on Methods and Application of Fluorescence (Amsterdam, September 16-19, 2001): Abstract book – Amsterdam, 2001 – Р.123.

13. Makovenko I.E., Losytskyy M.Yu., Lukashov S.S., Slominskii Yu.L., Yarmoluk S.M. Substitution in polymethine chain of trimethine cyanines as a way to new fluorescent probes for nucleic acids detection // Conference for students, Ph.D. students and Young Scientists on Molecular Biology and Genetics (Kyiv, Ukraine, September 20-22, 2001): Abstract book – Kyiv, 2001 – Р.107.

14. Losytskyy M.Yu., Lukashov S.S., Yarmoluk S.M. Aggregation of fluorescent probes permits specific detection of biomolecules // Fifth International Symposium on Functional р-Electron Systems (May 30 – June 4, 2002, Ulm/Neu-Ulm, Germany): Abstract book – 2002 – ?.450.

Лукашов С.С. Просторово ускладнені ціаніни для флуоресцентної детекції нуклеїнових кислот. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук за спеціальністю 02.00.10 – біоорганічна хімія. – Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, Київ, 2003.

Вивчено вплив довжини та будови поліметинового ланцюга на спектрально-люмінесцентні властивості комплексів ціанінів з нуклеїновими кислотами (НК). З метою отримання флуоресцентних барвників для детекції НК розроблено хімічні підходи до синтезу нових триметинціанінів з замісниками в поліметиновому ланцюзі. Для отримання ацилметиленових основ – ключових інтермедіатів синтезу мезо-заміщених триметинціанінів вперше запропоновано С-ацилювання активних метиленових груп четвертинних солей азотистих гетероциклів імідазолідами карбонових кислот. Синтезовано та охарактеризовано понад 40 ціанінових барвників. Доведено, що введення до мезо-положення поліметинового ланцюга триметинціаніну первинної аліфатичної групи значно зменшує рівень власної флуоресценції барвника, тоді як в комплексі з ДНК мезо-алкіл-триметинціанін випромінює в 2-3 рази інтенсивніше за відповідний барвник з незаміщеним поліметиновим ланцюгом. Виявлено, що мезо-заміщені триметинціаніни АТ-специфічно утворюють з ДНК флуоресцентні J-агреганті структури. За допомогою спектрально-люмінесцентних методів показано, що переважним типом взаємодії триметинціанінів з НК є інтеркаляція. Низку барвників запропоновано для практичного використання у флуоресцентному визначенні НК.

Ключові слова: триметинціаніни, флуоресцентні зонди, детекція нуклеїнових кислот, J-агрегати, інтеркаляційне та борозенкове зв’язування.

Лукашов С.С. Пространственно затрудненные цианины для флуоресцентной детекции нуклеиновых кислот. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности 02.00.10 – биоорганическая химия. – Институт биоорганической химии и нефтехимии НАН Украины, Киев, 2003.

Диссертация посвящена изучению влияния длины и строения полиметиновой цепи на спектрально-люминесцентные свойства комплексов цианинов с нуклеиновыми кислотами. С целью получения новых флуоресцентных красителей-зондов для детекции нуклеиновых кислот в области 500-800 нм предложено использовать замещённые в полиметиновой цепи триметинцианины. Низкий уровень собственной флуоресценции таких красителей делает возможным определение нуклеиновых кислот в присутствии значительного избытка красителя, что значительно упрощает и ускоряет процедуры анализа.

Разработан синтез новых триметинцианинов с заместителями в полиметиновой цепи. Для получения ацилметиленовых оснований – ключевых интермедиатов синтеза мезо-замещённых триметинцианинов впервые предложено использовать для С-ацилирования активных метиленовых групп четвертичных солей азотистых гетероциклов легко получаемые в реакции с N,N’-карбонилдиимидазолом имидазолиды карбоновых кислот. Синтезировано и охарактеризовано более 40 цианиновых красителей.

Введение в мезо-положение полиметиновой цепи триметинцианина первичной алифатической группы позволило не только значительно снизить уровень собственной флуоресценции красителя. Оказалось, что в комплексе с ДНК мезо-алкил-триметинцианин излучает в 2-3 раза интенсивнее красителя с незамещённой полиметиновой цепью. Вторичные и третичные алифатические заместители в мезо-положении вносят избыточные пространственные затруднения в молекулы триметинцианина, результатом чего является низкая интенсивность флуоресценции ДНК-комплексов таких красителей. Красители с