НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

ЛІННІК Тамара Павлівна

УДК 57.043:636.5.082.453: 66.095.11

Фізико-хімічні фактори кріопошкоджень і

кріозахисту сперматозоїдів півнів у циклі

низькотемпературного консервування

03.00.19- кріобіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

ХАРКІВ - 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

Науковий консультант: академік НАН України, доктор медичних наук,

професор, лауреат Державних премій СРСР

та України Грищенко Валентин Іванович,

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини

НАН України, директор

Офіційні опоненти:

Доктор біологічних наук Бондаренко Тетяна Петрівна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу кріобіохімії і фармакології НГС

Доктор -біологічних-наук, Вишневський Валентин Йосипович, Інститут тваринництва УААН, лабораторія генетики, головний науковий співробітник

Доктор біологічних наук, професор, академік УААН Осташко Федір Іванович, Харківський біотехнологічний центр УААН, головний науковий співробітник

Провідна установа:

Харківський Національний університет ім. В.Н.Каразіна, кафедра біологічної і медичної фізики, Міністерство освіти і науки України

Захист відбудеться “18 ” березня 2003 року 0 13 30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 при Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою 61015, м.Харків, вул. Переяславська, 23.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІПК і К НАНУ: 61015, м.Харків, вул. Переяславська, 23.

Автореферат розісланий “12 ” лютого 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор мед.наук, професор Гольцев А.М.

ЗАГАЛЬНА характеристика роботи

Актуальність теми. Широке застосування штучного запліднення в практиці тваринництва, птахівництва, а також в області медицини для вирішення проблеми безплідності обумовило інтенсивний розвиток однієї з найважливіших областей кріобіології - розробку теоретичних і прикладних основ кріоконсервування сперми. По даній проблемі накопичений значний експериментальний матеріал, надруковані солідні монографії та оглядові праці (Милованов В.К.,1962; Осташко Ф.И.,1978; Курбатов А.Д., Платов Е.М и др.,1988; Грищенко В.И. и др.,1990; Наук В.А.,1991; Lake P.E.,1984; Watson P.F.,1995; Leibo S.P., Bradley L.,1999). Розроблені і впроваджені в практику методи кріоконсервування сперми різних видів сільськогосподарських тварин, птахів, а також людини, що забезпечують задовільне одержання потомства (Осташко Ф.И.,1978; Наук В.А.,1991; Нарубина Л.В.,1995; Грищенко В.И., Лучко Н.А.,1997; Борончук Г.В.,1998; Sexton T.,1980; Watanabe M.,1980; Lake P.E.,1986; Schram G.P.,1988). Незважаючи на значні успіхи, існуючі методи та сучасні технології кріоконсервування сперми не дозволяють ефективно застосовувати генетичний матеріал високопродуктивних плідників у селекційно-племінній практиці, тому що немає змоги зберегти більш ніж 50-60 % функціонально повноцінних клітин після заморожування-відтавання сперми практично усіх видів, включаючи і сперму півнів. Тому передчасно вважати проблему кріоконсервування сперми, у тому числі і сперми птахів, цілком вирішеною.

Одним з шляхів вирішення даної проблеми є комплексне вивчення фізико-хімічних факторів кріопошкоджень, що діють на кожному з етапів низькотемпературного консервування (інкубація з кріопротектором та кріозахисним середовищем, охолодження та заморожування, відігрів). У роботах, що присвячені вивченню впливу умов кріоконсервування на життєздатність сперматозоїдів півнів (Очкур С.И.,1990; Lake P.E.,1982 –1986; Terada T., Maeda T., 1983-1988; Wishart G.J., 1985-1990; Seigneurin F., Blesbois E.,1994), зміни морфології, метаболізму і функціональної активності сперматозоїдів, які виникають на різних етапах кріоконсервування, досліджуються, як правило, після повного циклу заморожування - відтавання, тобто розглядається інтегральний вплив суми факторів. Часто, навпаки, вивчають лише окремі моменти складного багатофакторного процесу низькотемпературного консервування, які практично не піддаються узагальненню, тому що результати отримані не в ідентичних умовах і на різних породах півнів, а тому мають суперечний характер. При такому підході теоретичне пояснення причин ушкоджень, що виникають при кріоконсервуванні, не завжди експериментально доведене. Закономірності, отримані в експериментах на одних об'єктах, наприклад, на еритроцитах, переносити на інші клітини, зокрема, на сперматозоїди, слід з обережністю, тому що останні мають більш складну морфологію, неоднорідну структуру цитоскелету і гетерогенну цитоплазматичну мембрану, що відрізняється за своїм складом і властивостями в різних частинах сперматозоїда. Навіть використання даних, отриманих на спермі інших видів тварин, не завжди виправдано, тому що сперма півнів має специфічні особливості. Незважаючи на те, що сперма півнів була успішно заморожена вже в середині минулого сторіччя (Shaffner C.et al.,1941; Polge et al.,1949), цілий ряд питань фундаментального характеру дотепер залишається відкритим. Не з’ясовані температурні зони дії основних факторів кріопошкоджень сперматозоїдів півнів, недостатньо вивчена залежність їх життєздатності від режимних параметрів охолодження. Є зовсім мало даних про вплив фізико-хімічних властивостей кріозахисних середовищ, зокрема, осмотичності та іонної сили, на морфологічну збереженість і функціональну активність сперматозоїдів у циклі кріоконсервування. Такі дані дозволили б одержати експериментальні докази на користь тієї чи іншої теорії і наблизитися до розшифровки механізму кріопошкодження клітин.

Сперматозоїди півнів вважаються відносно кріостійкими клітинами, і тому вони є зручним модельним об'єктом для вирішення ряду теоретичних загальнокріобіологічних задач. До найбільш важливих з них можна віднести з'ясування природи пошкоджуючої дії кріопротекторів та дослідження різних аспектів механізму їх кріозахисної активності. Одним з перспективних підходів до рішення цих задач є вивчення впливу структури і фізико-хімічних властивостей речовин на їх цитотоксичність і кріопротекторну активність у гомологічних рядах хімічних сполук з поступово ускладненою структурою. Є лише окремі роботи (Шраго М.И., Ханина Л.А. 1985 –1999; Nash T.,1966; Boutron P.,1979-1999), присвячені цьому науковому напрямку. Такі дослідження мають важливе теоретичне і практичне значення, тому що дозволяють не тільки розширити існуючі уявлення про механізми кріопротекторної дії речовин, але і здійснити науково-обґрунтований пошук засобів зниження цитотоксичності захисних агентів, що застосовуються, і нових ефективних кріопротекторів.

У зв’язку з цим вивчення фізико-хімічних факторів кріопошкоджень і кріозахисту, що впливають на життєздатність сперматозоїдів півнів у циклі низькотемпературного консервування, є актуальною проблемою, вирішення якої дозволить науково обгрунтувати нові підходи до створення ефективних методів кріоконсервування клітин.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дослідження виконані в рамках НДР ІПК і К НАН України за темами: “Дослідження залежності кріопротекторних властивостей речовин ряду поліолів та аліфатичних амідів від їх структурних і фізико-хімічних характеристик з метою створення ефективних кріоконсервантів для біологічних об'єктів” (№ держреєстрації 01870065543), “Синтез і вивчення кріозахисної активності і токсико-фармакологічних властивостей екзоцелюлярних кріопротекторів на основі модифікованих поліолів за дії на клітини низьких температур” (№ держреєстрації 0201У005150), “Вивчення ефективності етоксилатів поліолів (метил- і амідозаміщених) як кріопротекторів для кріоконсервування компонентів крові, клітин і тканин фетоплацентарного комплексу людини і тварин” (№ держреєстрації 0101У003481).

Мета і задачі дослідження.

Мета дослідження: з'ясувати внесок фізико-хімічних факторів кріопошкоджень, що впливають на структурно-функціональний стан сперматозоїдів півнів на етапах кріоконсервування, і на підставі цього розробити науково-обгрунтовані підходи до створення ефективних способів кріозахисту клітин.

Задачі дослідження:

1. Вивчити залежність пошкоджуючої дії речовин двох класів хімічних сполук (діолів і амідів) на сперматозоїди півнів від умов експозиції (температура і час експозиції, концентрація речовин) до заморожування;

2. Визначити залежність цитотоксичності амідів і діолів від їх структури і фізико-хімічних властивостей;

3. Провести дослідження впливу структури і фізико-хімічних властивостей діолів і амідів (16 речовин) на їх кріозахисну активність при кріоконсервуванні сперми півнів;

4.Вивчити вплив вмісту кріозахисного середовища (вуглеводи, амінокислоти, антиоксиданти, білки) на життєздатність сперматозоїдів півнів на різних етапах кріоконсервування;

5.Визначити вплив фізико-хімічних властивостей кріозахисного середовища (осмотичність, іонна сила) на морфофункціональну збереженість сперматозоїдів півнів у процесі кріоконсервування;

6. Вивчити вплив режимних параметрів і кінцевої температури охолодження на структурно-функціональний стан сперматозоїдів півнів;

7. На підставі отриманих даних розробити метод кріоконсервування сперми півнів і оцінити ефективність методу на різних породах півнів протягом тривалого терміну низькотемпературного збереження.

Об'єкт дослідження. Процес низькотемпературного консервування сперми півнів різних порід у кріозахисних середовищах, що відрізняються вмістом вуглеводів, амінокислот, антиоксидантів, білків і кріопротекторів двох класів хімічних сполук (амідів і діолів), при різних умовах охолодження і заморожування.

Предмет дослідження. Морфологічна і функціональна збереженість сперматозоїдів півнів різних порід на етапах кріоконсервування в залежності від умов інкубації з кріопротекторами і кріозахисними середовищами до заморожування, від фізико-хімічних властивостей кріопротекторів і кріозахисних середовищ, а також від режимних параметрів охолодження і заморожування і тривалості низькотемпературного збереження в умовах кріобанка.

Методи дослідження. Використано класичні і сучасні фізико-хімічні і біологічні методи дослідження: ІЧ- і УФ- спектроскопія, рефрактометрія, кондуктометрія, сталогмометрія, віскозиметрія, пікнометрія, осмометрія, світлова і люмінесцентна мікроскопія, а також математичні методи статистичної обробки, кореляційний і регресійний методи аналізу і моделювання.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше отримані порівняльні дані цитотоксичної дії на сперматозоїди півнів двох гомологічних рядів хімічних сполук (16 речовин). Визначена залежність пошкоджуючої дії вивчених речовин від їх структури, фізико-хімічних властивостей і умов інкубації, що дозволило установити, що цитотоксична дія амідів на сперматозоїди має хімічну природу, у той час як діолів не тільки хімічну, але й осмотичну природу з переважним внеском останньої. Виявлено, що аміди і діоли виявляють диференційну пошкоджуючу дію на мембрани голівок і акросоми сперматозоїдів у процесі кріоконсервування: аміди переважно ушкоджують акросоми, тоді як діоли - мембрани голівок.

Вивчена кріопротекторна активність 16 сполук діолів і амідів у залежності від їх структури і фізико-хімічних властивостей, при цьому уперше досліджені ізомери бутандіолу як кріопротектори для сперми півнів. Встановлено, що в ряді амідів кращими кріопротекторами є N,N – диметилформамід, N,N – диметилацетамід, N – метилацетамід, у ряді діолів – етиленгліколь, 1,2-пропандіол, 2,3-бутандіол. Уперше визначена залежність кріопротекторної активності речовин від їх кріоскопичної константи, яку пропонується використовувати як додаток до інших показників гідрофільності речовин у доекспериментальному скринінгу ефективних кріозахисних агентів. Розглянуто порівняльні аспекти механізму кріозахисної дії амідів і діолів.

Вивчено вплив різних добавок (амінокислоти, вуглеводи, антиоксиданти, білки) до кріозахисного середовища на життєздатність сперматозоїдів півнів у циклі кріоконсервування. Уперше установлено, що додавання білка в кріозахисне середовище істотно знижує цитотоксичну дію амідів на сперматозоїди півнів. Досліджено вплив осмотичності кріозахисного середовища на морфологічну і функціональну збереженість сперматозоїдів до і після заморожування-відтавання. Визначено діапазон осмотичності позаклітинного середовища, у якому сперматозоїди зберігають свою життєздатність. Уперше проведена кількісна оцінка оптимального значення іонної сили кріозахисного середовища, що забезпечує відновлення життєздатності сперматозоїдів після кріоконсервування. Визначено вимоги до фізико-хімічних властивостей кріозахисного середовища для успішного кріоконсервування сперми півнів.

Досліджено вплив режимних параметрів і кінцевої температури охолодження і заморожування на життєздатність сперматозоїдів. Показано, що основним пошкоджуючим фізико-хімічним фактором є температурно-осмотичний шок, що викликає руйнування акросомальних структур сперматозоїдів у діапазоні температур від –3 до –8 0С при швидкості охолодження вище 15 0С/хв.

Доведена можливість успішного тривалого низькотемпературного збереження сперми півнів різних порід протягом 9-10 років. Виявлено, що стійкість сперми півнів різних порід до дії низьких температур істотно різниться.

Практичне значення одержаних результатів. На підставі проведених досліджень цитоксичності, кріопротекторної активності амідів і діолів, режимних параметрів охолодження і заморожування розроблений і перевірений на практиці метод кріоконсервування сперми півнів без відмивання кріопротекторів (А.с. СССР № 1524882). Сперма півнів дев'яти порід була заморожена за розробленим нами методом і закладена на збереження в кріобанк НДІ птахівництва УААН, вивчена і доведена ефективність даного методу кріоконсервування сперми півнів при тривалому низькотемпературному збереженні протягом 9-10 років.

Визначено оптимальний склад і діапазон фізико-хімічних властивостей (осмотичність та іонна сила) кріозахисного середовища для кріоконсервування сперми півнів.

Вивчені структурні і фізико-хімічні показники 16 сполук амідів і діолів можуть бути використані як довідкові характеристики, а також для дослідження впливу кріопротекторів на біофізичні процеси в циклі кріоконсервування різних біологічних об'єктів.

Запропоновані рекомендації, в яких йдеться про способи зниження пошкоджуючої дії амідів і діолів на сперматозоїди та про оптимальний режим охолодження і заморожування при кріоконсервуванні сперми півнів.

Особистий внесок здобувача. Основні результати досліджень, які наведені в дисертації, отримані здобувачем особисто. Запропоновані ідеї і методичні підходи для постановки і проведення експериментів, приймалася особиста участь у проведенні експериментальної роботі. Вибір теми, визначення мети і задач дослідження, математична обробка, аналіз, інтерпретація та узагальнення отриманих результатів, а також формулювання основних положень і висновків проведені самостійно.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідалися на Щорічних робочих нарадах “Консервація генетичних ресурсів”, Пущіно, 1990,1991,1993,1995,2000; на VI з'їзді фармакологів УРСР “Фармакологія, стан і перспективи досліджень”, Харків, 1990; на республіканській конференції “Актуальні проблеми птахівництва України”, Харків,1990; на II Міжнародній конференції “Успіхи сучасної кріобіології”, Харків, 1992; на конференції “Theoretical basis of criopreservation”, Hrades Kralove, 1992; на I з'їзді Українського суспільства кріобіології і кріомедицини, Харків, 1995; на 36-ому Міжнародному конгресі кріобіологів, Marseille-France, 1999, на III Українській конференції по птахівництву з міжнародною участю, Алушта, 2001; на Всеукраїнській науковій конференції “Успіхи та перспективи розвитку кріобіології і кріомедицини”, Харків, 2001; на ІІІ З’їзді Українського біофізичного товариства, Львів, 2002.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 42 наукові роботи, з них 30 статей у фахових наукових виданнях, 10 тез, отримано 2 авторських свідоцтва на винаходи.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 327 сторінках друкованого тексту. Складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, 4-х розділів власних досліджень і їх обговорення, заключення, практичних рекомендацій, висновків і списку використаної літератури, що включає 372 джерела на 37 сторінках. Робота ілюстрована 39 таблицями і 35 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень. Дослідження проведені на спермі півнів породи мінорів і австролорпів, що знаходилися в умовах віварію ІПКіК НАН України, а також на півнях і курах колекційних порід, що є при НДІ птахівництва УААН. Сперму одержували методом масажу абдомінальної області, для досліджень використовували суміш еякулятів декількох півнів (Курбатов А.Д, 1987). Для оцінки життєздатності сперматозоїдів визначали рухливість, кількість сперматозоїдів з цілими мембранами голівок і з цілими акросомами (Сахацкий Н.И.,1987), використовуючи прижиттєве фарбування клітин флуоресцентними барвниками этідіум бромідом і тіазиновим червоним. Для визначення запліднюючої здатності сперматозоїдів застосовували штучне запліднення курей (Курбатов А.Д.,1987) з наступною инкубацією яєць в інкубаторі “У-55”.

Як кріопротектори вивчені два гомологічні ряди хімічних сполук амідів і діолів: формамід (ФА), ацетамід (АЦ), N-метилацетамід (МАЦ), N,N-диметилформамід (ДМФА), N,N-диметилацетамід (ДМАЦ), ацетилморфолін (АЦМОР), N-(-оксиетил)ацетамід (АЦЕАМ), N,N-(-диоксиетил)ацетамід (АЦДЕАМ), етиленгліколь (ЕГ), 1,3-пропандіол (1,3-ПД), 1,2-пропандіол (1,2-ПД), 2-метоксиетанол (МЕ), 1,4-бутандіол (1,4-БД), 1,3-бутандіол (1,3-БД), 2,3-бутандіол (2,3-БД), 1,2-бутандіол (1,2-БД). Усі речовини марки “х.ч.” чи “ч.д.а.” додатково очищали (Протива М.,1966). Для ідентифікації досліджуваних речовин визначали: щільність, температуру кипіння і плавлення, показник злому (Иоффе Б.Ф.,1974), УФ-спектри на спектрофотометрі “СФ-26”, ІЧ-спектри на спектрофотометрі “Specord –75 IR”. Чистоту речовин перевіряли хроматографічним методом на газорідинному хроматографі “ЛХМ-8”.

Вивчено наступні фізико-хімічні характеристики речовин та їх водних розчинів: інтегральну теплоту змішання амідів з водою (Белоусов В.П.,1970); коефіцієнт розподілу в системі вода - н-октанол рефрактометричним методом (Кейл Б.,1966); поверхнева активність на межі фаз вода - гептан методом сталагмометрії (Воюцкий С.С.,1974); розчинність солей NaCI і KCI у 50 % -них водних розчинах речовин кондуктометричним методом (Пичугин Ю.И.,1983), кріоскопічні константи речовин (Александров Ю.И.,1975). Розміри молекул речовин визначені за допомогою збудованих на комп'ютері тривимірових моделей Стюарта-Бриглеба (Физер Л.,Физер М.,1970).

У складі кріозахисних середовищ використані наступні речовини: глутамат натрію (“Merck”, “х.ч.”), протамін сульфат, хлорид натрію, ацетат натрію, ацетат калію, ацетат магнію; інозит, глюкоза, фруктоза, лактоза, сахароза, мальтоза; гліцин, аланін; яєчний сироватковий альбумін (ЯСА), сироватковий альбумін людини (САЛ), овомукоід марки В ( “Реахім”, “х.ч.”); глутатіон, ензит, бакланозит, тіосульфат натрію (“Реахім”, “х.ч.”), а також полівінілпіролідон з М.м. 12000 (ПВП-12000) (“Merck”, “х.ч.”). Осмотичність кріозахисних середовищ і плазми еякулятів вимірювали на осмометрі ОМК-1Ц-01, іонну силу кріозахисних середовищ розраховували (Ізмайлов Н.А.,1959).

Для вивчення впливу компонентів і фізико-хімічних властивостей кріозахисного середовища на життєздатність сперматозоїдів використаний слідуючий вихідний склад середовища ( г/100 мл H2O): глутамат натрію – 1,7; фруктоза – 0,5; ацетат калію – 0,25; протамін сульфат – 0,0024; ПВП-12000 – 0,2. При рішенні інших задач застосовували середовище ЛКС-1 (Курбатов А.Д.,1984) та С2. Для вивчення впливу низькотемпературного зберігання на протязі 9-10 років на життєздатність сперматозоїдів використовували середовища BHSV (Schramm G.P.,1989) та С2.

При дослідженні цитотоксичності речовин сперму розбавляли середовищем з кріопротектором у співвідношенні 1:1. Вивчена пошкоджуюча дія амідів та діолів на сперматозоїди в діапазоні концентрацій від 0,25 до 2 М при експозиції в інтервалі температур від 40 до 4 0С і тривалості інкубації сперматозоїдів з різними середовищами і кріопротекторами від 15 хв до 192 годин. Кріопротекторна активність речовин досліджена в діапазоні концентрацій від 0,5 до 1,5 М.

Застосовували декілька різних способів охолодження і заморожування сперми півнів: у гранулах, пластикових ампулах і пайєтах. Підготовку сперми до заморожування у всіх випадках проводили аналогічно. Щойноотриману сперму охолоджували до кімнатної температури і розбавляли у співвідношенні 1:1 середовищем без кріопротектора. Після 30-40 хв витримки при температурі 4 0С додавали розчин речовини в тому ж середовищі до необхідної концентрації у співвідношенні 2:1. При заморожуванні в гранулах суспензію накрапували по 0,05 см3 на гідрофобізовану та охолоджену до визначеної температури алюмінієву підкладку. Заморожування проводили на лабораторній установці. Розморожування гранул здійснювали на предметному склі в потоці теплого повітря з інтегральною швидкістю 400 0С/хв. При заморожуванні сперми в контейнерах після додавання кріопротекторів сперму розливали в пластикові ампули ємкістю 0,6 см3 чи розфасовували в пайєти ємкістю 0,25 см3, і відразу ж заморожували на лабораторній установці чи на програмному заморожувачі УОП-3 (СКТБ ІПКі К). Відтавання здійснювали на водяній бані при 40 0С.

Вивчені швидкості охолодження на різних етапах заморожування знаходилися в діапазоні від 1 до 200 0С/хв. Був досліджений вплив швидкості охолодження на життєздатність сперматозоїдів на наступних етапах: від 4 0С до –8 0С; від –8 до –25 0С; від –25 до –80 0С з наступним зануренням у рідкий азот. При вивченні критичних температурних зон дії основних факторів кріопошкоджень сперматозоїдів, заморожували необхідну кількість зразків сперми до визначеної температури зі швидкістю 2, 10 і 40 0С/хв. Після досягнення необхідної температури відігрівали частину зразків та оцінювали життєздатність сперматозоїдів.

Сперма дев'яти порід півнів була заморожена, закладена на збереження в НДІ птахівництва УААН, життєздатність сперматозоїдів вивчена через півроку, 1рік і 9-10 років зберігання в рідкому азоті.

Для статистичної обробки результатів досліджень, математичного моделювання і планування використали метод Фішера-Стьюдента (Закс Л.,1976), кореляційний, регресійний методи аналізу (Адлер Ю.П.,1976).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Цитотоксичність і кріопротекторна активність діолів та амідів. Досліджена пошкоджуюча дія діолів та амідів на сперматозоїди півнів залежно від їх концентрації, температури експозиції, а також тривалості контакту з клітинами. У табл. 1 приведені результати життєздатності сперматозоїдів після 60 хв інкубації клітин при 20 0С у присутності і після видалення кріопротекторів. Для видалення кріопротекторів до суспензії сперматозоїдів швидко додавали середовище у співвідношенні 1: 9, знижуючи концентрацію речовин до безпечного для клітин рівня. У табл.2 представлені результати дослідження впливу діолів і амідів на життєздатність сперматозоїдів півнів у залежності від тривалості інкубації з ними при 4 0С.

Установлено, що всі досліджені речовини двох класів хімічних сполук амідів і діолів чинять цитотоксичну дію на сперматозоїди півнів ще на етапі інкубації, але рівень і ступінь розвитку ушкоджень клітин під їх впливом відрізняються в залежності від умов експозиції. Дані, приведені в табл.1, показують, що рухливість сперматозоїдів підвищилася після видалення 5 сполук ряду амідів (ФА, АЦ, МАЦ, ДМФА, ДМАЦ) і 4 речовин ряду діолів (ЕГ, 1,2-ПД, МЕ, 2,3-БД), але рівня контролю не досягла. Кількість сперматозоїдів з морфологічними ушкодженнями в присутності зазначених речовин і після їх видалення не змінилася. Видалення з клітинної суспензії інших трьох сполук ряду амідів (АЦМОР, АЦЕАМ, АЦДЕАМ, які можна вважати діолами, з включеним у їх молекулу амідним радикалом) та чотирьох сполук ряду діолів (1,3-ПД, 1,4- БД, 1,3-БД, 1,2-БД) не тільки не призвело до відновлення рухливості сперматозоїдів і їх морфологічної збереженості, а навпаки, викликало масову загибель клітин. Рухливими в полі зору залишалися лише окремі сперматозоїди, а кількість клітин з аномальною морфологією збільшилася до 60 - 70 %. Оскільки для видалення кріопротекторів використано досить жорсткий прийом – швидке перенесення клітин в умови гіпотонії стосовно внутрішньоклітинного вмісту, можна припустити, що загибель сперматозоїдів, що спостерігається, обумовлена осмотичним фактором.

З точки зору на структуру і фізико-хімічні властивості досліджених речовин, слід було очікувати, що аміди, особливо дизаміщені, будуть більш цитотоксичними відносно сперматозоїдів у порівнянні з діолами. Аміди більш гідрофобні (табл.3), мають високу діелектричну проникність, дипольний момент і виражену донорно-акцепторну здатність. Однак це підтверджується тільки при концентрації амідів більш 1,5 М (рис.1 і 2) і температурі експозиції клітин з ними вище 25 0С (рис.3). Якщо додавання речовин до сперми проводиться при температурі 4 0С і тривалість експозиції не перевищує 15 хв, аміди менше ушкоджують клітини до заморожування (табл.2). Отримані результати показують, що в ряді амідів менш цитотоксичними є ДМФА, МАЦ і ДМАЦ, у ряді діолів – ЕГ, 1,2-ПД і 2,3-БД. При тривалій інкубації сперматозоїдів з ними при температурі 4 0 С (табл.2) рівень ушкоджених клітин не перевищує 20-30 %. За ступенем збільшення їх рівня ушкоджень на сперматозоїди півнів ці речовини розподілилися в наступній послідовності: ДМФА МАЦ ДМАЦ ЕГ 1,2-ПД 2,3-БД.

Таблиця 1

Життєздатність сперматозоїдів півнів через 60 хв інкубації при 20 0С

у присутності та після видалення кріопротекторів (п = 6, при р 0,05)

Аміди:

ФА

АЦ

МАЦ

ДМФА

ДМАЦ

АЦМОР

АЦЕАМ

АЦДЕАМ

Діоли:

ЕГ

1,3-ПД

1,2-ПД

МЕ

1,4-БД

1,3-БД

2,3-БД

1,2-БД

Контроль |

40 5

60 5

75 3

75 4

70 5

50 5

40 7

40 6

60 5

40 5

70 3

30 4

45 5

45 5

50 7

40 6

95 5 |

60 5

75 5

85 4

85 3

80 5

25 5

од.

од.

75 5

од.

80 5

50 5

од.

од.

65 5

од.

95 5 |

23,5 3,6

21,7 4,7

12,7 2,3

12,3 1,8

15,2 2,1

24,6 5,2

28,4 3,7

38,2 2,4

15,9 1,7

28,4 1,3

17,1 1,2

32,8 5,1

25,0 2,8

26,9 3,4

23,4 4,1

38,1 4,3

6,7 1,4 |

25,1 1,9

23,9 1,7

14,3 1,3

13,1 1,1

17,1 1,6

59,4 2,4

74,3 3,9

77,6 4,1

16,6 1,8

64,3 3,4

17,4 1,7

35,7 2,9

66,8 3,7

69,2 3,1

28,6 2,3

71,2 4,3

7,4 1,2

Примітка: * - концентрація речовин у суспензії сперматозоїдів до видалення 1 М; контроль - сперма, розведена середовищем у тих же пропорціях і в тій же послідовності, що і з кріопротекторами.

Виявлено, що речовини ряду амідів і діолів на етапі інкубації в залежності від їх концентрації по-різному впливають на збереженість мембран голівок і цілісність акросом, дані приведені на рис. 1 і 2. У присутності діолів при концентрації 1,5 М кількість клітин з ушкодженими мембранами досягає

Таблиця 2

Залежність життєздатності сперматозоїдів півнів від тривалості

інкубації з амідами і діолами при 4 0С (п = 6, при р 0,05)

Досліджувана речовина

Рухливість* сперміїв, % | Кількість сперміїв з морфологічними

ушкодженнями після інкубації, %

15 хв | 60 хв | 120 хв | 240 хв

Аміди:

ФА

АЦ

МАЦ

ДМФА

ДМАЦ

АЦМОР

АЦЕАМ

АЦДЕАМ

Діоли:

ЕГ

1,3-ПД

1,2-ПД

МЕ

1,4-БД

1,3-БД

2,3-БД

1,2-БД

Контроль |

55 5

75 5

85 7

85 3

80 5

60 5

65 5

50 5

75 4

50 8

80 5

50 6

60 8

55 5

65 7

50 4

95 4 |

11,7 1,3

10,7 1,2

7,2 0,3**

7,5 0,5**

8,4 0,7

16,4 2,1

26,3 2,3

34,6 3,7

8,6 0,7

21,9 1,7

9,0 0,8

15,3 1,7

22,2 2,4

24,3 2,1

12,7 1,2

26,4 2,2

6,0 1,6 |

22,1 2,6

20,7 2,7

11,2 1,3

10,5 1,8

12,1 1,1

23,6 3,2

32,4 2,7

46,7 3,4

16,9 1,7

34,0 2,3

17,3 1,2

26,3 2,1

30,7 2,8

34,2 2,4

28,9 1,1

42,4 2,3

6,2 1,4 |

27,1 2,7

25,6 1,4

16,9 1,3

14,7 1,4

17,4 1,7

36,2 2,3

40,4 2,7

58,3 2,9

20,7 1,7

40,4 2,3

21,6 1,2

33,8 3,2

42,6 3,5

43,9 2,8

30,7 2,7

52,7 3,1

6,7 1,3 |

47,1 2,3

40,6 2,6

28,9 1,5

27,4 1,3

31,3 1,6

46,8 2,1

53,9 2,1

66,1 2,7

32,7 1,5

51,0 2,7

29,7 1,3

49,8 1,7

57,6 3,7

58,7 3,2

42,7 3,7

59,4 4,1

9,8 1,4

Примітка: концентрація речовин – 1 М; * - рухливість визначена після 15 хв. інкубації; контроль – сперма півнів, яка розведена середовищем ЛКС-1 без кріопротектора у співвідношенні 1:1; ** - недостовірні порівняно з контролем при р 0,05.

15-20 % (рис.1), у той час як у присутності амідів – не перевищує рівня 12 % навіть при концентрації 1,5 М та температурі інкубації 25 0С. Але аміди більш значно ушкоджують акросоми, ніж діоли (рис.2). За концентрації амідів 1,5 М в суспензії при температурі 25 0С до 27 % сперматозоїдів мають аномальні акросоми. Отримані дані показують, що морфологічні ушкодження сперматозоїдів під впливом амідів та діолів мають диференційний характер: діоли в більшому ступені пошкоджують мембрани голівок, аміди – акросомальну структуру клітин.

Рис. 1. Вплив амідів і діолів на збереженість мембран голівок

сперміїв при 25 0С в залежності від їх концентрації, тривалість

інкубації 20 хв.

Рис. 2. Вплив амідів і діолів на цілісність акросом сперміїв при 25 0С

в залежності від їх концентрації, тривалість інкубації 20 хв.

Залежність пошкоджуючої дії діолів і амідів на сперматозоїди від температури інкубації також істотно відрізняється (рис.3). Кількість сперматозоїдів з морфологічними аномаліями в присутності амідів з підвищенням температури інкубації клітин з ними монотонно збільшується, у той час як під впливом діолів ця залежність має більш складний характер, а саме, - досягає максимуму при 15 0С і зменшується з ростом температури інкубації до рівня, що спостерігається при 4 0С ( див. рис.3).

Рис.3. Залежність рівня ушкоджень сперматозоїдів півнів під впливом

амідів (а) і діолів (б) від температури інкубації: час експозиції 30 хв,

концентрація речовин 1 М.

Розходження в реакції сперматозоїдів на видалення кріопротекторів (див.табл.1), різний характер та рівень ушкоджень сперматозоїдів під впливом амідів та діолів у залежності від температури інкубації (див.рис.3, а і б) вказують на те, що механізм цитотоксичної дії амідів і діолів на сперматозоїди відрізняється. В загальну цитотоксичну дію амідів основний вклад вносить хімічна (чи біохімічна) компонента, у той час як цитотоксичність діолів має не тільки хімічний характер, але й осмотичний, з переважним внеском останнього фактора. На користь цього свідчить також порівняльний аналіз цитотоксичної дії двох гомологічних рядів сполук на сперматозоїди у залежності від їх структури і фізико-хімічних властивостей (див.табл.3).

Таблиця 3

Розмір молекул діолів та амідів і фізико-хімічні властивості,

які характеризують їх гідрофобність

Речовина | М.М. | Коеф. розпо-ділу,

Кр * | Адсорбція,

моль/м2

х10-9 ** | Lm , ЕDm , Е | Vcm,Е3 | Sm , Е2

Аміди:

ФА

АЦ

МАЦ

ДМФА

ДМАЦ

АЦМОР

АЦЕАМ

АЦДЕАМ

Діоли:

ЕГ

1,3-ПД

1,2-ПД

МЕ

1,4-БД

1,3-БД

2,3-БД

1,2-БД |

45,04

59,07

73,10

73,10

87,12

129,06

103,12

147,0

62,07

76,10

76,10

76,10

90,12

90,12

90,12

90,12 |

0,049

0,062

0,113

0,233

0,291

0,388

0,280

0,394

0,040

0,064

0,076

0,121

0,137

0,182

0,227

0,308

|

4,2

10,7

12,6

19,4

27,2

28,5

28,0

39,8

2,6

16,6

7,40

11,8

16,9

17,3

16,9

22,3 |

3,3

3,8

4,9

4,1

5,1

6,6

7,4

7,5

5,2

5,7

5,0

5,3

7,4

6,0

5,8

6,1 |

2,0

3,2

3,2

3,9

4,2

3,7

4,3

4,8

2,6

4,1

3,7

2,3

4,0

3,6

3,9

4,3 |

10,4

30,5

39,4

44,0

70,6

70,9

107,4

135,6

27,6

75,2

53,7

22,0

92,9

61,0

69,2

88,5 |

6,6

12,2

15,7

16,0

21,4

24,4

31,8

36,0

13,5

23,4

18,5

12,2

29,6

21,6

22,6

26,2

Примітка: Lm – довжина молекули; Dm – діаметр молекули; Vcm - об’єм молекули у формі циліндра, розрахований за формулою: Vcm = Rm2Lm; Sm – площа проекції молекули, розрахована за формулою: Sm = LmDm; розміри молекул наведені в Е; Кр * - коефіцієнт розподілу речовин у системі вода- н-октанол; **- адсорбція речовин на межі фаз вода-гептан.

У табл. 3 приведені фізико-хімічні властивості речовин, що характеризують їх гідрофобність, а також структурні параметри молекул (їх розмір, який визначений за допомогою збудованих на комп'ютері тривимірових моделей Стюарта-Бриглеба). Виявлено, що рівень ушкоджень сперматозоїдів під впливом діолів залежить від розмірів їх молекул - чим більший об’єм молекули речовин, тим вища їх цитотоксичність (рис.4). Така ж залежність зберігається і для речовин з однаковою молекулярною масою – ізомерів бутандіолів та пропандіолів. Цей факт також підтверджує, що в загальну цитотоксичність діолів основний вклад вносить осмотичний фактор.

Рис. 4. Залежність цитотоксичності діолів від об’єму їх молекул: 1 – МЕ; 2 – ЕГ; 3 – 1,2 -ПД; 4 – 2,3-БД; 5 – 1,3 -ПД; 6 – 1,2 -БД; 7 – 1,4-БД;

8 – АЦЕАМ; 9 – АЦДЕАМ.

Цитотоксична дія амідів (МАЦ, ДМФА і ДМАЦ) на сперматозоїди на відміну від діолів виявляється тільки при високій температурі і концентрації вище 1М і не залежить від розмірів їх молекул. Речовини ряду амідів не викликають осмотичний стрес при їх додаванні в суспензію та видаленні із клітин (табл.1 і 2), що, можливо, обумовлено їх високою проникністю крізь ліпідний бішар мембран на відміну від діолів, які головним чіном дифундують крізь гідрофільні пори (Toon M.R.,1990). Висока здатність амідів взаємодіяти з ліпідними компонентами мембран ( їх гідрофобність) з одного боку, з донорно- акцепторними групами протеїнів і водою (їх гідрофільність) - з іншого, а також відносно малі розміри молекул, можуть обумовлювати їх високу спроможність проникати крізь мембрани клітин. Рівень ушкоджень сперматозоїдів під дією амідів, напевне, залежить від їх здатності впливати на гідрофобні й електростатичні взаємодії біомакромолекул клітин, що обумовлена високою діелектричною проникністю амідів, дипольним моментом та їх гідрофобністю. Отже, цитотоксичність амідів з більшим ступенем ймовірності може мати хімічний (чи біохімічний) характер, але не осмотичний.

Таким чином, вже на етапі підготовки сперматозоїдів до заморожування після введення кріопротекторів частина клітин втрачає свою життєздатність. Рівень ушкоджень сперматозоїдів під впливом кріопротекторів на цьому етапі можна знизити до 5-10 % , якщо дотримувати необхідні умови інкубації клітин. Температура введення амідів у клітинну суспензію мусить бути не вища 4 0С, концентрація амідів не більша 1М, тривалість інкубації клітин з ними не більша 15 хв. Для зниження рівня ушкоджень сперматозоїдів під впливом діолів їх кінцева концентрація не повинна перевищувати 0,5 М. На відміну від амідів введення діолів можна проводити і при кімнатній температурі, а тривалість інкубації продовжувати до 30 хв.

Інший спосіб зменшення цитотоксичної дії кріопротекторів - використання суміші амідів і діолів, що підтверджено експериментально.

Вивчення кріопротекторної активності еквімолекулярних кількостей речовин (1 М) двох гомологічних рядів сполук амідів і діолів при кріоконсервуванні сперми півнів показало, що в ряді амідів кращими кріопротекторами є ДМФА, МАЦ і ДМАЦ, у ряді діолів - ЕГ,1,2-ПД, 2,3-БД (табл.4), тобто ті речовини, які на етапі інкубації з клітинами мають меншу цитотоксичність (табл.1 і 2). Кріопротекторну активність відносно сперматозоїдів півнів виявили також АЦ, МЕ та АЦМОР, але на більш низькому рівні.

Встановлено, що ці речовини, враховуючи тільки морфологічну збереженість клітин після кріоконсервування під їх захистом, за ступенем зниження їх ефективності розподіляються в наступній послідовності:

МАЦ ДМФА ДМАЦ 1,2-ПД ЕГ 2,3-БД МЕ = АЦ АЦМОР.

За ступенем відновлення запліднюючої здатності розморожених сперматозоїдів речовини розподіляються аналогічно (див.табл.5), за винятком МАЦ, який не довів свою ефективність, прогнозовану на підставі показників морфологічної збереженості:

ДМФА ДМАЦ 1,2-ПД МАЦ ЕГ 2,3-БД МЕ = АЦ АЦМОР.

Таким чином, ефективними кріопротекторами у відношенні сперматозоїдів півнів є 5 речовин – ДМФА, ДМАЦ, 1,2-ПД, МАЦ та ЕГ. Заплідненість яєць, отримана після штучного запліднення курей відігрітою спермою без видалення кріопротекторів, складає 85,0; 69,8; 61,5; 45,1 та 42,9 %, відповідно. При цьому ДМФА перевершує за кріопротекторною активністю всі зазначені речовини, відновлюючи на 15 % більше життєздатних клітин після відтавання, чим застосований при кріоконсеруванні сперми півнів ДМАЦ, і на 20-40 % більше, ніж інші вивчені кріопротектори (табл.4 і 5).

Виявлено, що залежність кріопротекторної активності амідів і діолів від їх концентрації в суспензії сперматозоїдів розрізняється: в амідів проходить максимум і знижується зі збільшенням концентрації, у діолів їх кріозахисна ефективність з підвищенням концентрації монотонно зростає. Оптимальною концентрацією для забезпечення високої кріопротекторної активності у відношенні сперматозоїдів в амідів є 0,75-1,0 М, у діолів – 1,0 -1,5 М.

Виявлено, що аміди добре захищають клітини при заморожуванні як при повільних швидкостях охолодження, так і більш швидких, причому з тенденцією до високих швидкостей охолодження в присутності дизаміщених амідів, особливо з ДМАЦ (див. рис.5). Вирогідно, це обумовлено тим, що дизаміщені аміди на відміну від діолів не змінюють або навіть підвищують проникненість мембран сперматозоїдів для води (Gilmore J.A.,1995). Отримані дані, а також результати аналізу залежності кріопротекторної активності вивчених речовин двох класів хімічних сполук від їх структури і фізико-хімічних властивостей дозволяє припустити, що механізм кріозахисної дії діолів має переважно колігативну основу, обумовлену їх високою гідрофільністю.

Таблиця 4

Життєздатність сперматозоїдів півнів після заморожування-відтавання

під захистом амідів та діолів (п = 12, при р 0,05)

Досліджувана речовина | Рухливість сперміїв,

% | Кількість сперміїв після

відтавання, %

до заморожування* | після

відтавання | з цілими мембранами голівок | з цілими акросомами

Амиды:

ФА

АЦ

МАЦ

ДМФА

ДМАЦ

АЦМОР

АЦЕАМ

АЦДЕАМ

Діоли:

ЕГ

1,3-ПД

1,2-ПД

МЕ

1,4-БД

1,3-БД

2,3-БД

1,2-БД

55 5

75 5

85 7

85 4

80 5

60 5

65 5

50 5

75 4

50 8

80 5

50 6

60 8

55 5

65 7

50 5 |

8 5

17 4

56 5

55 3

50 5

15 5

10 5

8 4

39 4

15 5

48 3

20 5

20 5

15 5

36 5

5 3 |

13,7 0,7

34,5 0,5

69,4 0,4

68,5 0,3

66,1 0,3

17,7 1,2

15,5 1,4

11,4 1,6

42,1 0,3

16,8 0,9

51,7 0,5

24,7 1,2

12,6 0,7

12,4 0,9

40,3 1,1

10,7 0,6 |

10,4 1,1

18,1 1,3

36,4 0,7

39,6 0,4

32,8 0,9

8,4 1,3

9,3 1,7

2,6 0,6

26,2 0,7

5,2 0,4

29,4 1,2

11,6 0,8

9,3 0,6

8,4 0,7

24,1 0,7

3,4 0,6

Примітка: концентрація речовин у суспензії клітин 1 М; * - рухливість

визначена після 15 хв інкубації з речовиною; заморожування сперми

проводили в гранулах і в ампулах;

У той час як у механізм кріозахисної дії амідів істотний вклад вносить також їх гідрофобність. Висока здатність взаємодіяти з ліпідними компонентами мембран і їх низька в'язкість забезпечують їм не тільки унікальну проникність усередину клітин, але і, ймовірно, можливість позитивно впливати на властивості мембран, збільшуючи їх стійкість в під час кріоконсервування.

Таблиця 5

Запліднююча здатність сперміїв півнів, кріоконсервованих

під захистом амідів та діолів

Речовина | Закладено яєць, шт. | Заплідненість

яєць | Виводимість

яєць | Вивід

курчат,

%

шт. | % | шт. | %

Аміди:

АЦ

МАЦ

ДМАЦ

ДМФА

АЦМОР

Діоли:

ЕГ

1,2-ПД

МЕ

2,3-БД |

102

91

179

127

117

91

91

83

82 |

16

41

125

108

3

39

56

5

23 |

15,7

45,1

69,8

85,0

2,6

42,9

61,5

6,0

28,0 |

12

37

104

91

3

34

43

3,0

13,0 |

75,0

90,2

83,2

84,3

100,0

87,2

76,8

60,0

56,5 |

11,8

40,7

58,1

71,7

2,6

37,4

47,3

3,6

15,9

Примітка: концентрація кріопротекторів 0,75 М, середовище BHSV (Schramm G.P.,1989), розведення сперми середовищем 1:4; штучне запліднення курей проведене без видалення кріопротекторів, заморожували сперму в пайєтах.

Рис. 5. Залежність життєздатності сперматозоїдів півнів при

заморожуванні в гранулах під захистом різних кріопротекторів

від температури підкладки, концентрація речовин 1 М.

Дизаміщені аміди до того ж здатні як до утворення сильних водневих зв'язків з водою, що перевершують по енергії Н - зв'язки вода-вода, за рахунок донорно-акцепторних взаємодій, так і до структуризації води за рахунок гідрофобної гідратації. Аміди на відміну від діолів знижують ефективну концентрацію електролітів шляхом їх переводу із іонної в молекулярну форму. Дизаміщені аміди мають яскраво виражену дифільність – високу гідрофільність і гідрофобність одночасно. Можливо, це обумовлює відмінність їх механізму кріозахисної дії від діолів. Додатково до колігативного, основою якого є взаємодія з водою, виявляється специфічний характер їх дії, обумовлений здатністю амідів безпосередньо впливати на властивості і структуру мембран і цитоскелету клітин.

Виявлена залежність між кріопротекторною активністю вивчених речовин і їх кріоскопічною константою. При цьому коефіцієнти кореляції між показниками життєздатності сперматозоїдів після кріоконсервування і кріоскопічною константою в межах одного гомологічного ряду амідів чи діолів досягають значень 0,75 - 0,85 при р 0,05. Таким чином, кріоскопічну константу речовин можна використовувати в доекспериментальному скринінгу ефективних кріозахисних агентів як доповнення до інших характеристик їх гідрофільності.

Вплив складу і фізико-хімічних властивостей кріозахисного середовища на життєздатність сперматозоїдів півнів. Показано, що при гіпотермічному зберіганні сперми півнів в присутності вивчених вуглеводів тільки введення інозиту і мальтози негативно позначається на життєздатності сперматозоїдів. У всіх інших середовищах життєздатність сперматозоїдів незалежно від використаного вуглеводу зберігається на однаковому рівні. Після заморожування – відтавання вірогідно кращі результати отримані при введенні в середовище фруктози або глюкози, лактози та інозиту. При цьому виявлено, що фруктоза, глюкоза і лактоза практично на одному рівні забезпечують збереженість мембран голівок у процесі кріоконсервування (65-70 % цілих клітин), у той час як на цілісність акросом вони впливають по-різному. У середовищах з моносахаридами зберігається після відтавання 35-37 % клітин з цілими акросомами, у середовищах з лактозою кількість сперматозоїдів з цілими акросомами знижується до 31 %. Однак при кріоконсервуванні сперми в середовищі з лактозою отримана найвища збереженість мембран голівок (71 % клітин). Таким чином, за ступенем зменшення позитивного впливу на життєздатність сперматозоїдів півнів після кріоконсервування вивчені вуглеводи розташувалися в наступній послідовності: фруктоза глюкоза лактоза інозит сахароза мальтоза. Показано, що моносахариди відновлюють після заморожування - відтавання більшу кількість рухливих клітин і підтримують їхню активність протягом більш тривалого часу, зберігаючи при цьому більшу кількість клітин з цілими акросомами. Дисахариди забезпечують після кріоконсервування більшу кількість сперматозоїдів с цілими мембранами голівок.

Додавання амінокислот гліцину та аланіну в кріозахисне середовище привело до зниження життєздатності сперматозоїдів після відтавання. Введення антиоксидантів у кріозахисне середовище не