ХАРКІВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

КУЗНЄЦОВ ІВАН ВІКТОРОВИЧ

УДК. 612.07.2:577.1

МОЛЕКУЛЯРНІ МЕХАНІЗМИ АДАПТАЦІЇ КОЛАГЕНОВИХ СТРУКТУР ДО ЗМІН ТЕМПЕРАТУРИ

03.00.04 - біохімія

Автореферат дисертації

на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків – 1998

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у НДЧ Харківського державного університету,

Міністерство освіти України.

Науковий керівник:

- доктор біологічних наук, старший науковий співробітник, Перський Євген Ефроїмович, професор кафедри фізіології людини та тварин Харківського державного університету.

Офіційні опоненти:

- доктор біологічних наук, професор, Петренко Олександр Юрьєвич, провідний науковий співробітник відділу кріомедицини Інституту проблем кріобіології та кріомедицини НАН України;

- доктор біологічних наук, старший науковий співробітник, Тимошенко Ольга Павлівна, зав. лабораторією біохімії і експериментального моделювання Харківського науково-дослідного Інституту ортопедії і травматології ім. М.І. Сітенко МОЗ України.

Провідна організація - Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, м. Київ.

Захист відбудеться 2 грудня 1998 p. o 1515 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 64.051.17 Харківського державного університету, за адресою: 310077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. ІІІ-15.

З дисертацією можна ознайомитися у Центральній науковій бібліотеці Харківського державного університету: 310077, м. Харків, пл. Свободи, 4

Автореферат розісланий 2 _листопада 1998 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Падалко В.І.

Загальна характеристика роботи

Актуальність роботи. Сполучна тканина відіграє важливу роль у процесах адаптації багатоклітинних тварин до температури навколишнього середовища. У значній мірі ці процеси забезпечуються структурною стабільністю колагену – основного конструкційного компонента сполучної тканини.

В багатьох роботах було показано, що структурна стабільність колагену, яка оцінюється за температурою його денатурації, близька до верхньої межі температури середовища мешкання у пойкілотермних тварин чи температури тіла – у гомойотермних [Бурджанадзе, 1989-1993, Есипова, 1991, 1995, Сhellan , 1993, Rigby, 1990].

В основі цієї залежності знаходиться кореляція між температурою денатурації молекул та вмістом у них імінокислот, зокрема відносної кількості серед них залишків оксипроліну [Бурджанадзе, 1992, Berg, 1993, Nemethy, 1986, Ramachandran, 1973]. Сумарна кількість імінокислот у колагені тварин різних видів, що живуть нині, є наслідком тривалої молекулярної еволюції і закріплена генетично. Вміст оксипроліну визначається інтенсивністю гідроксилювання залишків проліну, яке здійснюється ферментом пролілгідроксилазою в процесі посттрансляційної модифікації первинної структури колагену [Eichner, 1988]. Слід підкреслити, що структурна стабільність надмолекулярних утворень сполучної тканини залежить і від загальної концентрації колагену, а також і від інших посттрансляційних та постсинтетичних його модифікацій: глікозилювання , що веде до утворення колаген-полісахаридних комплексів [Kimura, 1992]; поперечне звязування [Kivirikko, 1990, Richard-Blum, 1994] та взаємодія з іншими структурними компонентами сполучної тканини. Усі ці структурні характеристики колагенових утворень, як і ступінь гідроксилювання залишків проліну, безпосередньо генетично не закрплені і визначаються активністю ферментів, які здійснюють процеснг колагену.

Таким чином, еволюційно закріплена кореляція між вмістом оксипроліну в колагені, його структурною стабільністю і температурою навколишнього середовища є лише одним з аспектів температурної адаптації тварин і відноситься до видів, які вже протягом довгого часу живуть у постйних температурних умовах.

В той же час пойкілотермні тварини середньої смуги відчувають сезонні зміни температури, що досягають десятків градусів. Тому повинні існувати і інші - швидкі механізми адаптації колагену до значних змін температури навколишнього середовища. Механізми такого типу можуть використовувати і гібернантні ссавці, температура тіла яких при переході від стану бадьорості до стану сплячки та навпаки суттєво змінюється протягом короткого часу.

Таким чином, здається певним, що температура навколишнього середовища шляхом дії на активність відповідних ферментів синтезу, процесінгу та розпаду колагену може безпосередньо впливати на перебудову його надмолекулярних утворень і, як наслідок, змінювати їх структурну стабільність.

Проте, по цей час питання про вплив температури навколишнього середовища на інтенсивність цих стадій обміну колагену практично не досліджувалось. Між тим його вивчення дозволило б висвітити не лише молекулярні механізми швидкої адаптації колагенових утворень пойкілотермних та гібернантних тварин до температури зовнішнього середовища, а й внести певну ясність у питання про виникнення та еволюцію цих механізмів у хребетних, в тому числі гомойотермних тварин.

Одержані результати також можуть бути важливими і для розвитку уявлень про загальні механізми температурної адаптації.

Звязок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота була виконана у НДЧ Харківського державного університету в межах теми “Структурно-метаболічні механізми адаптації сполучної тканини до дії екстремальних факторів’’, № держреєстрації 0197U003060.

Мета та завдання дослідження. Встановити, як впливає температура середовища на синтез, процесінг, розпад і структурну стабільність колагену хребетних тварин різних систематичних груп in vivo та in vitro. З’ясувативати, які молекулярні механізми лежать в основі швидкої структурної адаптації колагену до температури. Порівняти їх особливості у пойкілотермних (риб), гібернантних (кажанів) та гомойотермних (щурів) тварин з метою виявлення основних закономірностей еволюції цих механізмів. Для досягнення мети були поставлені такі задачі:

1.

1.

1.

1.

Наукова новизна роботи. Вперше показано, що температурна залежність інтенсивності синтезу колагену в дослідах in vitro у всіх досліджених органах обох вивчених видів ссавців має двогорбий характер з максимумами в областях 10-15 0С та 25-35 0С. Інтенсивність гідроксилювання проліну має аналогічний характер, зокрема ступнь гідроксилювання в усіх випадках вищий в другій області . Ступінь глікозилювання колагену (як ферментативного, так і неферментативного) також є максимальним в області 35 0С. Знайдено зворотню залежність між температурою середовища і інтенсивністю аутоколагенолізу, максимум якого припадає на 10-15 0С. Вперше показано, що ступнь поперечного зв’язування в надмолекулярних колагенових утвореннях підвищується зі зростанням температури середовища. Встановлено, що термостабільність колагену, яка оцінюється за температурою та ентальпією його денатурації, вища для молекул, синтезованих in vitro при 35 0С, ніж для молекул, синтезованих при 10 0С, і корелює з більш високим ступенем гідроксилювання, глікозилювання та поперечного зв’язування колагену, що спостерігається при температурі 35 0С.

Вперше показано, що у пойкілотермних хребетних зміна температури навколишнього середовища, а у гібернантних ссавців зміна температури тіла безпосередньо регулює будову та структурну стабільність колагенових утворень шляхом дії на інтенсивність процесів синтезу, процесінгу та розпаду колагену. Такі ж самі структурно-метаболічні механізми температурної адаптації колагену знайдені і у гомойотермних ссавців в умовах in vitro.

Вперше показано, що в умовах in vitro процеси структурно-метаболічної перебудови колагенових утворень подібні в сполучній тканині тварин різних систематичних груп, що мають різні типи температурної регуляції.

Теоретичне та практичне значення роботи. Проведені дослідження дозволили виявити молекулярні механізми швидкої адаптації колагенових утворень до температури зовнішнього середовища. Виявлені етапи обміну колагену, які безпосередньо регулюються температурою і ведуть до відповідності між структурною стабільністю сполучної тканини і температурою навколишнього середовища. Ці результати дозволяють доповнити сучасні погляди на молекулярні механізми адаптації тварин до температури і можуть бути корисними у розробці уявлень про походження та еволюцію цих механізмів.

Отримані результати дозволяють доповнити деякі уявлення про молекулярні механізми адаптації білків до температури середовища. Вони також можуть мати значення при аклімації тварин та у екології.

Особистий внесок здобувача: підбір, обробка та аналіз літературних даних; постановка наукової задачі; вибір і реалізація аналітичних методів її вирішення; участь у розробці схеми можливих механізмів структурної адаптації колагенового матриксу сполучної тканини тварин з різними типами терморегуляції до зміни температури навколишнього середовища; аналіз та інтерпретація одержаних результатів.

Апробація результатів дисертації. Результати і основні положення роботи доповідались на: XIV зїзді Українського фізіологічного товариства (Київ, 1994), симпозіумі “Биологические механизмы старения” (Харків, 1994), ІІ конгресі патофізіологів України (Київ, 1996), ІІ Українському біохімічному зїзді (Київ, 1997), ХV зїзді Українського фізіологічного товариства (Донецьк, 1998), ІІІ Міжнародому симпозіумі Биологические механизмы старения (Харків, 1998), ІІ зїзд Українського біофізичного товариства (Харків, 1998).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 11 робіт.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, роздлів: лтературний огляд, матеріали та методи досліджень, результати власних досліджень та їх обговорення, підсумкових висновків та переліку використаної літератури із 220 найменувань. Роботу викладено на 137 сторінках друкованого тексту, вона містить 5 таблиць і 18 рисунків.

Розділ 1. Літературний огляд

У першому підрозділі літературного огляду наведено теоретичні та експериментальні дані про структуру колагенових утворень сполучної тканини. Розглянуто результати вивчення синтезу, посттрансляційних та постсинтетичних модифікацій цих сполук на різних рівнях їх організації. Показано. яку роль відіграє колаген у створенні сполучно-тканинного матриксу. У другому підрозділі наведені дані про деякі механізми температурної адаптації тварин. Розглядаються механізми адаптаціі білків до різних температурних умов. Наведені дані про кореляцію між структурою колагенових утворень та термодинамічними параметрами його денатурації для тварин, що живуть при постійних температурних умовах.

Розділ 2. Матеріали і методи дослідження.

Експерименти були проведені на хребетних тваринах, що відносяться до трьох систематичних груп з різним типом терморегуляції. Представниками пойкілотермних були риби двох видів: в дослідах in vivo – гамбузія звичайна (Gambusia affinis), in vitro – карп звичайний (Cyprinus carpio). Представниками гібернантних ссавців в дослідах in vitro були кажани виду великий підковоніс (Rhinolophus ferrum-equinum), а гомойотермних –щури-самки лінії Вістар (Rаttus norvegісus).

В експериментах in vivo з пойкілотермними тваринами гамбузй поділяли на дві групи та вміщували в акваріуми з температурою води 14 та 24 0С. Після 35-добової аклімації в акваріуми вносили 14С-пролін. На 45-у добу риб умертвляли і в експеримент брали шкіру, хребет і хвостовий плавець. У дослідах in vitro досліджували шкіру та плавальний міхур карпа. Його гомогенат вміщували у розчин Рінгера-Кребса, що містив 3Н-пролін. і інкубували при температурах 15 та 25 0С [Лебедев, 1978, Martens, 1989].

Досліди з ссавцями проводили in vitro для зняття характерної для них температурної регуляції. У щурів вивчали шкіру спини та серце, а у кажанів - шкіряну перетинку крила. Обєктом дослідження у різних експериментах був колаген типу І та сумарний колаген органів. Інкубування гомогенатів проводили так саме. як і в експериментах з рибами in vitro, при температурах інкубації 10, 15, 20, 25, 30, 35 та 40 0С у щурів і 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 0С у кажанів.

Після інкубації колаген вилучали з органів [Слуцкий, 1969, Никитина, 1992], відчищали центрифугуванням та діалізом і використовували у подальших дослідженнях.

Вміст колагену оцінювали за оксипроліном [Stegemann, Stalder, 1967].

Про інтенсивність синтезу колагену судили на підставі питомої радіоактивності в ньому 14С-оксипроліну (в дослідах in vivo) та 3Н-оксипроліну (в дослідах in vitro) [Замараева, 1977, Лебедев, 1978, Martens, 1989].

Ступінь гідроксилювання проліну в колагені визначали за [Berg, 1982]. Розподіл радіоактивного проліну та оксипроліну проводили за Замараєвою [Замараева, 1977].

Рівень загального глікозилювання колагену визначали за сірчано-фенольним методом. Для визначення ферментативного глікозилювання використовували метод конкурентного інгібірування трансфераз [Dubous, 1986, Smith, 1989].

Інтенсивність аутоколагенолізу визначали на підставі відношення вільного оксипроліну, що вийшов зі зразків у інкубаційне середовище в процесі інкубації, до загальної кількості оксипроліну, який знаходився у зразках до початку інкубації [Перський, 1997].

Поперечне звязування колагену оцінювали в дослідах in vitro за його розчинністю в екстракційному розчині [Утевская, Перский, 1982]. В дослідах з рибами in vivo його оцінювали також за відношенням денатурованого колагену до загальної кількості колагену у зразках до їх нагріву [Никитина, 1992].

Термостабільність колагену, синтезованого в дослідах in vitro при різних темпе-ратурах, оцінювали за термодинамічними параметрами його денатурації [Перский, Гим-пелевич, 1990, Кузнецов, Перский, Соловьева, 1998].

Робота виконана з використанням спеціального програмного забезпечення: Microsoft Word for Windows 6.0, Borland Quadro Pro 5.0, CorelDRAW 5.0, Global DeLorme Explorer.

Розділ 3. Результати досліджень та їх обговорення.

Експерименти на рибах in vivo .

На рис. 1 А наведено залежність інтенсивності синтезу колагену шкіри, хвостового плавця та хребта від температури навколишнього середовища. Видно, що найбільша інтенсивність синтезу колагену спостерігається при температурі 24 0С. При цій же температурі вищий і ступінь гідроксилювання залишків проліну в колагені шкіри (рис. 1 Б). Характерно, що цей параметр лежить у межах 27-38 %, що відповідає середнім значенням ступеня гідроксилювання залишків проліну в колагені риб середніх широт.

Рис. 1. Температурна залежність інтенсивності синтезу колагену шкіри (1А), хребту (2А), хвостового плавця (3А) гамбузій; інтенсивності гідроксилювання колагену шкіри(1Б), хребту (2Б) та хвостового плавця (3Б) гамбузій.

Концентрація оксипроліну в шкірі риб також вища при температурі води 24 0С (рис. 2 А). При цій температурі відбувається і інтенсифікація процесів поперечного звязуван-

Рис. 2. Температурна залежність концентрації колагену в шкірі гамбузій (А); розчинності колагену шкіри гамбузій в 1М NaCl (Б); виходу колагену зі шкіри гамбузій при її нагріві у воді (В).

ня колагену в шкірі. Про це свідчить зниження виходу зі шкіри риб денатурованого колагену при нагріванні тканини у воді при 60 0С, а також нейтральнорозчинного колагену при його екстракції 1M NaCl (рис. 2 Б та 2 В).

Наведені дані свідчать про те, що підвищення температури навколишнього середовища викликає у риб структурну перебудову колагенових утворень. Вона полягає у зростанні стабільності колагену як на молекулярному, так і на надмолекулярному рівнях і відзначається узгодженими змінами інтенсивності послідовних стадій його обміну.

Експерименти на рибах in vitro.

У табл.1 наведені дані про інтенсивність різних стадій обміну колагену плавального міхура риб у дослідах in vitro. Найбільша інтенсивність синтезу спостерігається при 25 0С. Ступінь гідроксилювання проліну у колагені при цій температурі також вищий. Ці дані свідчать про зростання структурної стабільності індивідуальних молекул колагену, синтезованих при вищій температурі навколишнього середовища. Рівень розпаду колагену при цій температурі найменший. У поєднанні з інтенсифікацією синтезу при 25 0С це веде до підвищення концентрації колагену в тканині при цій температурі інкубації. Ступінь поперечного звязування в колагені також найбільший при 25 0С, про що свідчить зниження виходу розчинного колагену в процесі екстракції 1М NaCl. Зростання концентрації колагену в тканині, а також підвищення ступеня його поперечного звязування при вищій температурі середовища веде до збільшення структурної стабільності і надмолекулярних колагенових утворень.

Таблиця 1

Вплив температури інкубаційного середовища на різні стадії обміну колагену в плавальному міхурі карпа звичайного.

Темпера-

тура інкубації,

Т, 0C |

Питома радіоактивність

3Н-Опро,

імп/ хв/мкг Опро | Ступінь гідро-

ксилювання проліну,

3Н-Опро_____

3Н-Опро+3Н-Про | Ступінь

глікози-лювання ко-лагену, % |

Рівень

аутокола-генолізу, % | Розчин-ність колагену в 1М NaCl, %

15 | 195 + 9,8 | 0,37 + 0,026 | 3,2 + 0,25 | 2,9 + 0,12 | 2,3 + 0,08

25 | 810 + 37 | 0,46 + 0,037 | 5,7 + 0,38 | 1,3+0,09 | 1,4+ 0.04

Таким чином, ми бачимо, що в дослідах in vitro підвищення температури навколишнього середовища викликає швидку перебудову обміну колагену, яка веде до зростання структурної стабільності на усіх рівнях його організації. Певно, що така перебудова є одним з механізмів швидкої адаптації пойкілотермних організмів до різких змін температури навколишнього середовища.

Експерименти на гібернантних та гомойотермних тваринах in vitro.

На рисунках 3-7 та в табл. 2 і 3 наведені дані про вплив температури на різні стадії обміну колагену деяких органів ссавців у дослідах in vitro. Оскільки колаген типу І складає основну масу (більш 90%) колагену шкіри статевозрілих тварин, його властивості у значній мірі визначають термостабільність надмолекулярних колагенових утворень. З рис. 3 та

Рис. 3. Температурна залежність інтенсивності синтезу колагену в шкірі щурів (1) та в

шкіряній перетинці крила кажанів (2).

даних табл. 2 видно, що залежності питомої радіоактивності оксипроліну в колагені шкіри тварин обох видів і в колагені серця щурів від температури мають два максимуми.

В всіх випадках перший максимум спостерігається при 15 0С, другий же – при 25 0С для шкіри кажанів та 35 0С – для шкіри та серця щурів. Залежності інтенсивності гідроксилювання залишків проліну для колагену шкіри щурів та шкіряної перетинки крила кажанів від температури наведені на рис. 4. Вони теж мають два максимуми, при температурах 15 та 35 0С.

Температурна залежність гідроксилювання залишків проліну у колагені серця щурів має лише один максимум при 35 0С (табл. 2).

Рис. 4. Температурна залежність інтенсивності гідроксилювання колагену в шкірі щурів (1) та в шкіряній перетинці крила кажанів (2).

Таблиця 2

Вплив температури інкубаційного середовища на різні стадії обміну колагену та розпаду загального білка серця 3-місячніх щурів-самок лінії Вістар.

Темпера-тура інкубації, Т, 0С | Питома радіоактивність

3Н-Опро, імп/хв/мкг Опро | Ступінь гідроксилювання проліну,

3Н-Опро_____

3Н-Опро+3Н-Про | Рівень аутоко-лагено-лізу, % | Рівень розпаду загального

білка, %

10 | 310+14 | 0,28+0,012 | 0,6+0,04 | 4,5+0,22

15 | 845+37 | 0,31+0,015 | 4,8+0,37 | 8,6+0,36

20 | 182+16 | 0,33+0,014 | 0,7+0,06 | 5,7+0,28

25 | 183+10 | 0,30+0,025 | 0,6+0,05 | 3,5+0,17

30 | 304+23 | 0,35+0,018 | 0,8+0,03 | 3,3+0,19

35 | 507+41 | 0,46+0,011 | 0,98+0,04 | 2,8+0,15

40 | 160+6,5 | 0,27+0,013 | 0,7+0,02 | 3,1+0,17

На рис. 5 наведені дані про загальний ступінь глікозилювання колаген-полісахаридних комплексів в шкірі щурів. Це глікозилювання включає до себе як ферментативне, так і неферментативне приєднання гексоз до колагену. У відповідності з наведеними даними спостерігається лише один пік як загального, так і ферментативного глікозилювання – при 35 0С.

Рис. 5. Температурна залежність ступеня загального глікозилювання колагену (1) та ступеня ферментативного глікозилювання колагену (2).

Температурні залежності кількості розчинного колагену, що екстрагується зі шкіри тварин обох видів, наведені на рис. 6. Як бачимо, між розчинністю колагену і температурою інкубації є зворотня лінейна залежність, при цьому максимум розчинності спостерігається при 5 0С, а мінімум – при 40 0С. Це свідчить про інтенсифікацію поперечного

Рис. 6. Температурна залежність розчинності свіжосинтезованого колагену шкіри щурів, що вийшов у розчин у процесі екстракції 1M NaCl (1), та свіжосинтезованого колагену шкіряної перетинки крила кажанів, що вийшов у розчин в процесі екстракції 0,5М СН3СООН (2).

ковалентного звязування молекул колагену при підвищенні температури середовища, що веде до зростання стабільності його надмолекулярних утворень.

На рис. 7 та в табл.2 наведені дані про температурну залежність аутоколагенолізу у шкірі тварин обох видів і в серці щурів. Усі ці дані якісно подібні. Максимум інтенсивності розпаду колагену у шкірі та серці щурів відзначається при 15 0С, а у шкірі кажанів – при 10 0С. Таким чином, ми бачимо, що температура середовища безпосередньо впливає на активність ферментів синтезу та процесінгу колагену. Це веде до перебудови обміну, спрямованого на зміну структурної стабільності колагенових утворень і приведення їх у відповідність з температурою середовища. Для виявлення цього ефекту була виміряна термостабільність колагену, синтезованого при різних температурах.

Рис. 7. Температурна залежність аутоколагенолізу в шкірі щурів (1) та в шкіряній перетинці крила кажанів (2).

На рис.8 зображені криві теплопоглинання фібрил, утворених з колагену, синтезованого при 15 та 35 0С, а в табл. 3 наведені разраховані за цими кривими термодинамічні параметри його денатурації. Результати розрахунків свідчать, що термостабільність колагену, синтезованого при 35 0С, значно вища ніж термостабільність колагену, синтезованого при 15 0С. Це вказує на звязок між температурними залежностями вивчених етапів обміну колагену і структурної стабільності цього білка, синтезованого при різних температурах.

Рис. 8. Температурна залежність теплопоглинання фібрил, утворених з колагену, що був синтезований при 15 0С (1) та при 35 0С (2).

Таблиця 3

Ступінь гідроксилювання колагену, синтезованого при різних температурах,

та термодинамічні параметри плавлення утворених з нього фібрил.

Темпера- тура інкубації, Т, 0С | Ступінь гідроксилюван-ня колагену, % | Температура денатурації, К | Ентальпія денатурації, (кДж/моль) х 102 | Ентропія денатурації,

Дж/моль

15 | 41,5 | 320,5 | 0,89 + 0,12 | 0,28 + 0,02

35 | 52,3 | 321,5 | 1,45 + 0,23 | 0,45 + 0,02

Аналіз температурних залежностей досліджених стадій обміну дозволяє виявити механізми, що ведуть до підвищення термостабільності колагену, синтезованого при 35 0С. Інтенсивність синтезу колагену при цій температурі у 4 рази вища, ніж у інтервалі температур 20-30 0С, а інтенсивність розпаду найменша. Вищий при цій температурі і ступінь гідроксилювання залишків проліну у колагені, а як наслідок найбільш висока структурна стабільність індивідуальних молекул. При 35 0С більш високий і рівень постсинтетичних модифікацій колагену. Таким чином, при температурі, що близька до температури тіла гомойотермних ссавців, виявляється узгодження інтенсифікації і уповільнення стадій обміну колагену, спрямованих на утворення адекватної цій температурі структурної стабільності колагену.

При зниженні температури виявляється, що при 15 0С одночасно і різко зростають синтез, розпад та розчинність колагену, у той час, як ступінь його гідроксилювання знижується. Для пояснення виявленого ефекту слід розглянути особливості експерименту. У вилучених зразках, що знаходяться у інкубаційному розчині, фізіологічна температурна регуляція відсутня. При низькій температурі інкубації структурна стабільність колагенових утворень у них вища, ніж необхідна. Тому у зразках повинна відбутися перебудова цих утворень, спрямована на приведення у відповідність їх структурної стабільності зовнішній температурі. Як бачимо з отриманих даних, майже це і відбувається у зразках тканини. Різка інтенсифікація розпаду веде до вилучення молекул колагену, структурна стабільність яких не відповідає температурі. На їх місце приходять нові, свіжосинтезовані та менш стабільні молекули, які мають нижчий рівень гідроксилювання, глікозилювання та поперечного звзування. Таким чином, у зразках шкіри відбувається зміна обміну колагену, що веде до адаптації тканини до більш низької температури середовища, яка не є характерна для вивчаємого виду ссавців.

Цей процес відбувається лише тому, що у колаген-синтезуючих клітинах ссавців і ферментатівні системи, оптимум дії яких знаходиться при низькій температурі. Характерно, що при зниженні температури інкубації вже до 10 0С, в дослідах in vitro зі щурами, інтенсивність як синтезу, так і розпаду різко знижується. При якісно подібному характері температурних залежностей вивчених стадій обміну колагену щурів та кажанів між ними відмічається і деяка різниця. Перш за все привертає до себе увагу те, що як абсолютні величини, так і максимуми кривих, які відображують інтенсивність синтезу та розпаду колагену кажанів, не збігаються з такими у щурів. Так, в області високих температур максимум інтенсивності синтезу колагену у кажанів відмічається не при 35, а при 25 0С (рис. 3). Максимум розпаду колагену у кажанів також зсунуто у область більш низьких температур (рис. 7).

Ця рiзниця повязана, можливо, з рiзними умовами iснування цих видiв та з рiзними типами механiзмiв їх терморегуляцiї. Таким чином, виявленi залежнi вiд температури перебудови колагенових утворень у кажанiв можуть бути пристосуванням до двох рiзних станiв – активного та пасивного.

Одержанi данi надають можливiсть зробити висновок, що у процесi еволюцiї хребетних тварин виробився єдиний унiверсальний механiзм швидкої структурно-метаболiчної адаптацiї колагенового матриксу до змiн температури навколишнього середовища. В процесi подальшої еволюцiї ссавцiв цей механiзм продовжує використовуватися тiльки гiбернантними тваринами. У гомойотермних вiн залишився, можливо, тiльки у виглядi релiкта.

ВИСНОВКИ

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

Список опублікованих праць за темою дисертації:

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

Кузнєцов І.В. Молекулярні механізми адаптації колагенових структур до змін температури. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук з спеціальністю 03.00.04 - біохімія - Харківський державний університет, Харків, 1998.

Проведено порівняльне дослідження основних етапів обміну колагену, що забезпечують його стабільність на молекулярному та надмолекулярному рівнях у процесі температурної адаптації у пойкілотермних, гібернантних та гомойотермних тварин. Показано, що в усіх випадках основні етапи обміну колагену змінюються однаково, що забезпечує позитивну кореляцію між термостабільністю колагену та температурою навколишнього середовища. Така перебудова обміну повязана зі зміною синтезу, процесінгу та розпаду колагену. В експериментах in vitro продемонстровано також, що при зниженні температури інкубаційного середовища інтенсифікується розпад більш тер-мостабільного та синтез менш термостабільного колагену.

Показано, що такі механізми швидкої адаптації колагенових утворень до тем-ператури середовища можуть безпосередньо використовуватися пойкілотермними хребетними, що існують в умовах різких сезонних змін температури. Схожі механізми використовуються і гібернантними ссавцями, температура тіла яких також може швидко змінюватися протягом короткого часу при переході від стану бадьо-рості до стану сплячки.

Зроблено висновок, що у гомойотермних ссавців у ході еволюції також залишився реліктовий механізм температурної адаптації кола-генового каркасу сполучної тканини.

Ключові слова: адаптація, колаген, температура, обмін, аутоколагеноліз, термодинамічні параметри, денатурація, структурна стабільність.

Кузнецов И.В. Молекулярные механизмы адаптации коллагеновых структур к изменениям температуры. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04. - биохимия. -Харьковский государственный университет, Харьков, 1998.

Проведено сравнительное исследование основных этапов обмена коллагена, обеспечивающих его стабильность на молекулярном и на надмолекулярном уровнях в процессе температурной адаптации пойкилотермных, гибернантных и гомойотермных животных. Показано, что во всех случаях основные этапы обмена изменяются сходным образом, обеспечивая положительную корреляцию между термостабильностью коллагена и температурой окружающей среды. Такая перестройка обмена связана, в основном, с изменением синтеза, процессинга и распада коллагена. В экспериментах in vitro продемонстрировано также, что при снижении температуры инкуба-ции интенсифицируется распад более термостабильного и синтез ме-нее термостабильного коллагена.

Показано, что такие механизмы быстрой адаптации коллагено-вых структур к резким изменениям температуры среды могут непосредственно использо-ваться пойкилотермными позвоночными, обитающими в условиях резких сезонных колебаний температуры окружающей среды. Сход-ные механизмы используются, по-видимому, и гибернантными млекопитающими, температура тела которых также может резко из-меняться при переходе от состояния бодрствования к состоянию спячки.

Сделан вывод, что у гомойотермных млекопитающих в ходе эволюции также сохранился реликтовый механизм температурной адаптации коллагенового каркаса.

Ключевые слова: адаптация, коллаген, температура, обмен, аутоколлаге-нолиз, т

ермодинамические параметры, денатурация, структурная стабильность.

Kuznetsov I.V. Molecular mechanisms of collagen structures adaptation to the temperature influence. - Manuscript.

Thesis for degree of candidate of biological sciences on the speciality 03.00.04 - biochemistry. Kharkov State University, Kharkov, 1998.

The comparative investigation of the collagen metabolism main stages were done. These stages provide the stability on collagen molecular and supramolecular levels at temperature adaptation of cold-blooded, hibernating and warm-blooded animals.

It was shown that in these three cases all metabolism stages change in the same way which provides positive correlation between collagen thermostability and the environment temperature. Such rebuildings of metabolism connect mainly with synthesis, processing and degradation changes.

In experiments in vitro there is the intensification of more thermostable collagen degradation and synthesis of less thermostable collagen with the decreasing of incubation temperature.

These mechanisms of collagen structures quick adaptation to the sharp environment temperature changes can be used by cold-blooded animals, which live in such conditions. The same mechanisms have hibernating animals, because their body temperature changes at the transition awaking to sleeping state.

We have made the conclusion that warm-blooded animals also have these mechanisms of collagen quick adaptation to the temperature influence and they exist in relict form.

Key words: adaptation, collagen, temperature, metabolism, autocollagenolysis, thermodynamic parameters, denaturation, structure stability.

Підписано до друку 20.10.98

Об’єм 1 др.а Обл.-друк. а. – 0,75

Формат паперу 60х84 1/16

_____ Наклад 100 пр.___________________________________________________ Зам. 22/142___

АО “Кіпі-Різо”, м. Конституції, 6

(0572) 45-21-33