ІНСТИТУТ АГРОЕКОЛОГІЇ ТА БІОТЕХНОЛОГІЇ
УКРАЇНСЬКОЇ АКАДЕМІЇ АГРАРНИХ НАУК

МАЛИНОВСЬКА ІРИНА МИХАЙЛІВНА

УДК 631.95:631.461: 631.416.2

АГРОЕКОЛОГІЧНІ ОСНОВИ МІКРОБІОЛОГІЧНОЇ

ТРАНСФОРМАЦІЇ БІОГЕННИХ ЕЛЕМЕНТІВ ҐРУНТУ

Спеціальність 03.00.16 – екологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора сільськогосподарських наук

Київ - 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в лабораторії ґрунтової мікробіології Інституту

землеробства УААН

Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор, академік УААН ПАТИКА Володимир Пилипович,

Інститут агроекології і біотехнології УААН,

директор інституту

Офіційні опоненти: доктор сільськогосподарських наук, професор

ВОЛКОГОН Віталій Васильович, Інститут

сільськогосподарської мікробіології УААН,

завідувач лабораторії біологічної трансформації

азоту і фосфору

доктор біологічних наук, професор ГОЛОВКО Ераст Анатолійович,

Центральний національний ботанічний сад НАН України, завідувач відділу алелопатії рослин

доктор сільськогосподарських наук, професор

СЛЮСАР Іван Тимофійович,

Інститут землеробства УААН, завідувач

лабораторії землеробства на осушених землях

Провідна установа: Білоцерківський державний аграрний університет

Міністерства агрополітики України

Захист відбудеться “ 21 січня ” 2003 р. о 10 00 годині на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д 26.371.01 при Інституті агроекології УААН.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту агроекології УААН.

Відгуки на автореферат у двох примірниках, завірені печаткою просимо надсилати за адресою: Україна, Київ, вул. Метрологічна буд.12, 03143

Автореферат розісланий “ 18 ” грудня 2002р.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради,

кандидат сільськогосподарських наук Заякіна Г.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Серед актуальних проблем сільськогосподарського виробництва, що не вирішені до цього часу, однією із головних є проблема мінерального, зокрема фосфорного, живлення рослин. Застосування фосфорних мінеральних добрив не повністю вирішує проблеми дефіциту фосфору тому, що коефіцієнт його використання з добрив не перевищує 20% і в умовах економічної кризи мінеральні добрива недоступні виробнику сільськогосподарської продукції із-за їх дорожнечі.

Одним із шляхів вирішення проблеми є застосування бактеріальних препаратів поліфункціональної дії, які мають цілий ряд переваг: поліпшують мінеральне живлення рослин, нагромаджують біологічний азот у ґрунті, призводять до зниження темпів розкладання гумусових речовин, покращують структурованість ґрунту, зменшують випаровування вологи ґрунту і масштаби ерозії [Патыка В.Ф., 1995]. Бактеріальні препарати дозволяють одержати екологічно чисту продукцію, тому що містять природні ефективні штами, які не здатні викликати у людини віддалені генетичні наслідки подібно неприродним хімічно синтезованим засобам. Одним із важливих наслідків використання бактеріальних препаратів поліфункціональної дії є також зниження рівня захворюваності рослин, що дозволить зменшити застосування пестицидів і тим самим поліпшити екологічну ситуацію в агрофітоценозах.

Препарати на основі фосфатмобілізуючих бактерій дозволяють мобілізувати 30% і більше закріпленого в ґрунті фосфору [Патыка В.Ф., 1995]. Однак до цього часу не повністю з'ясовано механізм взаємодії фосфатмобілізуючих мікроорганізмів з мінеральною основою ґрунту та рослинами, особливо бобовими, для яких існує теоретична можливість поліпшення не тільки фосфорного, але й азотного живлення.

Таким чином, вивчення механізмів взаємодії мікроорганізмів з мінеральною основою ґрунту актуальне і цінне з наукового погляду, а подальший добір серед фосфатмобілізуючих мікроорганізмів штамів з підвищеною здатністю до синтезу біологічно активних речовин і антибіотиків дозволить створити ефективний бактеріальний препарат поліфункціональної дії.

Зв'язок роботи з науковими програмами. Дисертаційна робота виконана за тематичними планами лабораторії ґрунтової мікробіології “Розробити систему біодіагностування родючості ґрунтів і мікробіологічні методи підвищення продуктивності сільськогосподарських культур”, завдання 05.02 “Створити біопрепарати на основі азотфіксуючих, фосфатмобілізуючих мікроорганізмів і бактерій фунгістатичної дії для підвищення врожайності сільськогосподарських культур, якості сільськогосподарської продукції” згідно із завданнями, передбаченими науково-технічними програмами УААН “Родючість ґрунтів” і “Кормовиробництво” (№№ державної реєстрації: 0196U018391 і 0196U018397).

Мета і завдання досліджень. Вивчення механізму біологічної деструкції ґрунтових мінералів фосфатмобілізуючими бактеріями з метою вдосконалення методологічних підходів до відбору мікроорганізмів для створення препарату поліфункціональної дії ”Фосфонітрагін”, що поліпшує мінеральне живлення бобових рослин, стимулює їх розвиток, підвищує стійкість до абіотичних стресів та знижує рівень захворюваності бактеріальними і грибковими хворобами.

Дослідженнями передбачалось:

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Об'єкт досліджень – процес деструкції природних фосфоровмісних сполук і мінералів ґрунтовими фосфатмобілізуючими мікроорганізми; динаміка розкладу фосфоровмісних сполук бактеріальними метаболітами різної природи; інтенсивність розчинення залежно від природи мінералу, що деструктується, і хімічної будови молекул метаболітів; здатність фосфатмобілізуючих мікроорганізмів до синтезу біологічно активних речовин; особливості і закономірності взаємодії фосфатмобілізуючих мікроорганізмів з рослинами залежно від сорту сої, дози фосфорних добрив, штаму і способу культивування мікроорганізму, присутності чи відсутності азотфіксуючих мікроорганізмів.

Предмет досліджень - штами мікроорганізмів з підвищеною здатністю до розчинення мінеральних і органічних фосфатів; бактеріальні метаболіти, відповідальні за деструкцію фосфоровмісних сполук; фосфоровмісні сполуки і мінерали; ґрунти з різним вмістом рухомого фосфору; фізіолого-біохімічні та біометричні показники розвитку бактеризованих рослин сої різних сортів .

Методи досліджень: мікробіологічний – для вирощування біомаси мікроорганізмів у різному фізіологічному стані і на різних стадіях розвитку; хімічний - для визначення концентрації розчиненого фосфору та кремнію, хлорофілу, дегідрогенази, вмісту макроелементів у ґрунті, зерні і біомасі рослин та ін.; інфрачервоної спектроскопії – для оцінки якості зернової продукції; вимірювально-ваговий - для визначення біометричних показників бактеризованих рослин; математично-статистичний – для оцінки вірогідності отриманих результатів і визначення кореляційних відносин; розрахунково-порівняльний – для оцінки ефективності різних видів бактеріальної обробки.

Наукова новизна роботи. Вперше показано, що основою деструктуючої активності культуральної рідини фосфатмобілізуючого мікроорганізму B.mucilaginosus є комплекс екзополісахариду з низькомолекулярними кислими метаболітами. Бактеріальні полісахариди різного хімічного складу не володіють самостійною деструктуючою активністю по відношенню до природних фосфоровмісних сполук, однак приймають активну участь у деструкції мінералів, підсилюючи інтенсивність їх мобілізації низькомолекулярними вторинними метаболітами в 2-4 рази.

В умовах нестерильного ґрунту бактеріальні екзополісахариди, сорбуючи низькомолекулярні метаболіти та іони, перешкоджають їх споживанню аборигенною мікрофлорою. Виявлена нова екологічна функція бактеріальних полісахаридів ґрунтових мікроорганізмів: здатність запобігати вимиванню рухомого фосфору за надмірного зволоження.

Встановлено, що обробка чорнозему лучного фосфатмобілізуючими мікроорганізмами дозволяє збільшити ступінь рухомості фосфору на 10-50% залежно від дози внесених у сівозміні фосфорних мінеральних добрив.

З метою створення бактеріального препарату, що поліпшує мінеральне живлення бобових рослин, з музейних і виділених із ризосфери штамів відібрано 30 бактеріальних культур з підвищеною фосфатмобілізуючою активністю, які здатні продукувати біологічно активні речовини, а також індукувати підвищену стійкість проростків сої до абіотичних стресів. Вперше запропоновано комплексну обробку насіння бобових рослин азотфіксуючими і фосфатмобілізуючими мікроорганізмами, що дозволяє поліпшити як азотне, так і фосфорне живлення рослин. Виявлено існування штамово-сортової специфічності між фосфатмобілізуючими мікроорганізмами і сортами сої. З метою вирішення цієї проблеми запропонований новий вид обробки: одночасно декількома штамами виду B.subtilis – поліштам.

Практична цінність. На основі проведених досліджень розроблені рекомендації з використання комплексної передпосівної обробки насіння бобових рослин азотфіксуючими і фосфатмобілізуючими мікроорганізмами, що дозволяє заощадити близько 30-45 кг/га фосфорних і 45-60 кг/га азотних мінеральних добрив, збільшити врожайність сої на 12-31%, поліпшити якість зернової продукції, зокрема, підвищити вміст білка на 1,52-2,17%. При вирощуванні сої пропонується обробка насіння препаратом „Фосфонітрагін”, який включає ефективні комбінації штамів: для сорту Київська 91 – Br.japonicum 634б + B.subtilis 203с (приріст урожайності - 4,8ц/га), B.pumilis M (5,8 ц/га), B.mucilaginosus (5,1 ц/га), Rh.erythropolis B-850 (5,2 ц/га); для сорту Київська 27 – Br.japonicum 634б + B.subtilis 5 (6,4ц/га), B.mucilaginosus (4,5 ц/га), B.subtilis 33 (4,7 ц/га), B.subtilis 100 (5,1 ц/га).

При вирощуванні квасолі рекомендується передпосівна обробка насіння препаратом “Фосфонітрагін”, що включає R. faseoli 8 + B.subtilis 5 (приріст урожайності - 9,9ц/га) ; кормових бобів - R.leguminosarum 367а + Rh. eryhtropolis B-850 (7,7 ц/га), чи B.pumilis M (7,6 ц/га) ; гороху - R.leguminosarum 100 + B.subtilis 5 (9,9ц/га), чи B. mucilaginosus (9,8 ц/га). Для всіх бобових культур рекомендується обробка “Фосфонітрагіном”, що включає поліштам B.subtilis.

Результати досліджень впроваджені в колективних і фермерських господарствах Київської, Чернігівської, Черкаської і Сумської областей на площі 290 га, що підтверджується довідками й актами конкретних господарств.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем висунута робоча гіпотеза, розроблена програма досліджень і відповідно до обраних методик проведені лабораторні, польові і виробничі досліди. Робота виконана автором самостійно, а також за участю співробітників лабораторії ґрунтової мікробіології Інституту землеробства УААН, старшим науковим співробітником якої є дисертант. Дослідження з таксономічного визначення виділених штамів фосфатмобілізуючих мікроорганізмів проведені разом із співробітником Київського національного університету ім.Т.Г.Шевченко Домбровською І.В. Польові досліди з вивчення індивідуальної ефективності штамів фосфатмобілізуючих мікроорганізмів у відношенні до сої проводили спільно з лабораторією селекції сої, у відношенні до інших бобових культур – спільно з лабораторією інтенсивних технологій зернобобових і круп'яних культур, досліди з вивчення рівня ураженості хворобами бактеризованих рослин сої і люпину – разом із співробітниками відділу захисту рослин від шкідників і хвороб.

Апробація роботи. Результати досліджень, основні положення і висновки дисертації доповідались, обговорювались і надруковані в матеріалах: Міжнародної науково-практичної конференції молодих вчених і фахівців “Шляхи раціонального використання земельних ресурсів України” (Чабани,1995); Міжнародної конференції “Биосинтез и деградация микробных биополимеров. Фундаментальные и прикладные аспекты ” (Пущино,1995); Міжнародної науково-практичної конференції молодих вчених і фахівців “Наслідки пошуків молодих вчених-аграрників в умовах реформування АПК” (Чабани, 1996р.), 6-ої конференції молодих вчених і фахівців, присвяченій 50-річчю створення Інституту фізіології рослин і генетики НАН України, “Актуальні проблеми фізіології рослин і генетики”( м.Київ,1996 р.); Конференції “Сучасні проблеми охорони земель” (м.Київ,1997); International regional seminar “Environment Protection: modern Studies in Ecology and Microbiology” (Ужгород, 1997); 1-ого з'їзду мікробіологів Узбекистану (Ташкент,1997); Міжнародної науково-практичної конференції “Землеробство 21 століття – проблеми та шляхи вирішення” (Чабани, 1999р.); Всеукраїнського науково-практичного семінару “Насінництво кормових культур у сучасних умовах господарювання” (Чабани, 1999г); Всеукраїнської науково-практичної конференції “Землеробство України в XXI столітті” (Чабани, 2000); на засіданнях методичної комісії з питань землеробства і рослинництва Інституту землеробства УААН.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 40 експериментальних робіт, у тому числі 26 статей у журналах і збірниках, з яких 10 написані без співавторства.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу , огляду літератури, опису методів дослідження, 10 розділів викладення результатів досліджень, висновків, списку цитованої літератури (392 першоджерела), 9 додатків. Матеріали роботи викладено на 415 сторінках машинописного тексту. Дисертація містить 106 таблиць та 10 малюнків.

ЗМІСТ РОБОТИ

АГРОЕКОЛОГІЧНІ ОСНОВИ ДЕСТРУКЦІЇ ПРИРОДНИХ МІНЕРАЛІВ

(огляд літератури)

У розділі наведено аналіз результатів досліджень вітчизняних та зарубіжних дослідників щодо механізмів біотичної та абіотичної деструкції природних мінералів, зокрема ґрунтовими мікроорганізмами, особливостей деструкції саме фосфоровмісних мінералів ґрунту, а також ролі мікроорганізмів у мінеральному живленні рослин. На основі здійсненого аналізу обґрунтовано необхідність та перспективи проведення досліджень.

УМОВИ, ОБ’ЄКТИ ТА МЕТОДИ ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕНЬ

Предметом досліджень були штами ґрунтових мікроорганізмів-біодеструкторів фосфоровмісних мінералів і сполук: Bacillus alvei ИМВ-2. B.cereus 99, ИМВ-65, Bacillus sp. 32, 40, 90, 217, B. subtilis 63z, 74, 223, 203c, 310, ЖКГ-2, 36-6D, Cellulomonas cellulans 7406, Rhodococcus. erythropolis B-850, 40014, B-353, Rhodococcus luteus 177, 306, Rh. opacus 7025, люб'язно надані співробітниками Інституту мікробіології і вірусології НАН України І.Б.Сорокуловою і Т.М.Ногіною. Крім того, в роботі використовували штами, ізольовані з ґрунту та ризосфери сої за ознакою підвищеної здатності мобілізувати важкорозчинні органічні і мінеральні фосфати: B.pumilis M, B.pumilis Н2, B. subtilis Н3, Н4, Н5, B.mucilaginosus отриманий з колекції Інституту мінеральних ресурсів Мінгео України. Предметом досліджень були також районовані сорти сої Київська 27, національний стандарт у системі Державного сортовипробування України, та Київська 91 і Чернятка – нові сорти сої, які внесені до Державного реєстру сортів рослин України.

Вирощування мікроорганізмів проводили у колбах об’ємом 750 мл з 50-250 мл середовища протягом 18-24 годин на качалках (160 чи 240 об/хв.) при температурі 25-30оСРозподіл метаболітів культуральної рідини здійснювали із застосуванням іонообмінної смоли КУ-2Н+- форма). Елюювання проводили 1,0N NaOH .

Скринінг музейних штамів проводився на агаризованому середовищі Муромцева-Герретсена за ознакою появи навколо колоній зони просвітління [Муромцев, 1957]. Величина зони розчинення включно до 0,79 мм відповідала, за нашими розрахунками, низькій, 0,8 ,99мм — середній; 2,0мм і вище — високій фосфатмобілізуючій активності. При вивченні фосфатмобілізуючої активності на рідкому середовищі фосфоровмісні мінерали стерилізували при 160оС і вносили в концентрації 5г/л. Про процес деструкції судили за появою в розчині фосфат-іонів, визначених колориметричним методом Мерфі — Райлі [Агрохим.методы иссл. почв, 1975]

Продукування бактеріями біологічно активних речовин визначали методом рулонної культури [Бабаян, 1981].

Польові досліди проводили в господарстві “Чабани” Інституту землеробства УААН на чорноземно-лучному малогумусному легкосуглинковому ґрунті, орний шар якого характеризується такими показниками: вміст гумусу (за Тюріним) – 2,94%; рН сольовий – 5,10; рН водний – 5,95; вміст рухомого фосфору (Р2О5) – 11,7 мг/100г ґрунту; обмінного калію (К2О) – 12,7 мг/100г ґрунту (за Кірсановим). Попередником сої в усі роки досліджень була озима пшениця. Норма висіву складала 600 тис. схожих насінин/га, ширина міжрядь – 45 см. Розміщення варіантів було таким: А1 – контроль: насіння, оброблене водою з водогону; А2 – обробка насіння ризоторфіном (фон); 3 – фон + досліджуваний мікроорганізм.

Для моноінокуляції використовували Bradyrhizobium japonicum 634б (А2) з розрахунку виробничого навантаження 3*105 кл/насіння; при комплексній інокуляції обидва штами, азотфіксуючий і фосфатмобілізуючий, вносили порівну - 3*105 кл/насіння.

Визначення впливу дози фосфорних добрив на ефективність мікробіологічної обробки насіння сої здійснювали на фоні N30Р45К60 і N30Р90К60. В усіх дослідах повторність - чотириразова, площа посівної ділянки – 13,5 м2, облікової – 9,9 м2.

Статистичну обробку результатів проводили за Доспеховим Б.А. [1985].

МЕХАНІЗМ ДЕСТРУКЦІЇ B.MUCILAGINOSUS ФОСФОРОВМІСНИХ СПОЛУК

Дослідження механізму руйнування фосфоровмісних сполук проведені на прикладі ґрунтового полісахаридсинтезуючого мікроорганізму B.mucilaginosus. Однак, отримані результати можна екстраполювати на інші мікроорганізми, оскільки механізм взаємодії бактерій з мінералами включає використання вторинних метаболітів, синтез яких властивий усім ґрунтовим мікроорганізмам.

Таблиця 1 

Фосфатмобілізуюча здатність компонентів і метаболітів

культуральної рідини B.mucilaginosus

Варіант | Винос фосфору, Р2О5 мг/л**

Плавлений магнієвий фосфат | Фосфоритне борошно

1.Нативна культуральна рідина, рН 6,0 | 160 ±4,22 | 42,6 ±1,39

2.Культуральна рідина, прогріта при 80оС | 167±12,5 | 40,2 ±7,05

3.Клітини, відмиті фізіологічним розчином | 8,56 ±1,83 | 3,50 ±0,52

4.Клітини, відмиті фізіологічним розчином і прогріті при 80оС | 8,13 ± 0,46 | 3,20 ± 0,46

5.Недіалізований ЕПС | 25,6 ± 2,11 | 7,90 ± 0,46

6.Діалізований ЕПС (0,5 г/л) | 14,4 ±0,42 | 5,29 ±0,19

7.Фільтрат лужних метаболітів | 9,78 ±1,06 | Не визн.

8.Фільтрат кислих метаболітів | 85,4 ±3,66 | 13,3 ±0,63

9.Фільтрат кислих метаболітів + ЕПС (0,5г/л) | 128 ±4,23 | 39,5 ±0,92

10. Поживне середовище (контроль) | 50,0 ±7,20 | 9,0 ±1,00

**Всі експериментальні дані приведені за виключенням значення контролю (вар.№10)

Відповідно до даних, представлених у табл.1, клітини B.mucilaginosus, відмиті від метаболітів культуральної рідини, мають низьку здатність щодо мобілізації фосфору вивчених мінералів. Внесок клітин у загальну фосфатмобілізуючу активність культури складає 5,4% (плавлений магнієвий фосфат - ПМФ) і 8,2% (фосфоритне борошно - ФБ).

Досліди з вивчення мобілізуючої активності культуральної рідини (КР) показали, що при інактивації ферментів не спостерігається зниження її деструктуючої здатності. Таким чином, доведена неферментативна природа руйнування мінералів культурою B.mucilaginosus .

Високоочищений екзополісахарид (ЕПС) і лужні метаболіти B.mucilaginosus мають незначну мобілізуючу активність щодо фосфору сполук, які досліджувалися. Деструкція вивчених мінералів активно проходить у водному розчині кислих метаболітів: винос фосфору з ПМФ і фосфоритного борошна складає відповідно 53,4% і 31,3% від виносу фосфору у вихідній культуральній рідині. Деструкція сполук у розчині, що містить одночасно органічні кислоти і полісахарид, ефективніша і становить 80-92% від виносу фосфору в нативній культуральній рідині. Отже, полісахарид B.mucilaginosus, маючи власну незначну мобілізуючу активність щодо фосфоровмісних сполук, інтенсифікує їх руйнування в розчинах кислих метаболітів. Процес деструкції мінералів здійснюється комплексом вторинних метаболітів, до якого входять органічні кислоти та екзополісахарид.

З метою визначення впливу хімічного складу очищених полісахаридів на їх мобілізуючу активність було проведено порівняльне дослідження деструкції фосфоритного борошна і плавленого магнієвого фосфату в розчинах полісахаридів мікроорганізмів різного систематичного положення (табл.2). Встановлено, що полісахариди різного хімічного складу мають низьку мобілізуючу активність по відношенню до фосфору вивчених сполук.

Таблиця 2

Винос фосфору ( Р2О5, мг/л) ** з фосфоритного борошна і плавленого магнієвого фосфату очищеними бактеріальними полісахаридами

Фосфоровмісна сполука | Продуценти полісахаридів*

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8

Фосфоритне борошно | 7,81±

1,83 | 6,90±

0,92 | 8,73±

1,59 | 9,24±

1,84 | 4,65±

0,87 | 5,13±

0,92 | 4,15±

0,56 | 2,37±

0,94

ПМФ | 15,7± 2,19 | 15,5±

4,84 | 13,6±

0,92 | 14,5±

0,92 | 9,96±

1,83 | 9,96±

0,92 | 8,13±

1,83 | 6,91±

1,06

* 1 ЕПС шт. Bacillus sp.Д-31, 2 B.mucilaginosus, 3 - R.leguminosarum 248b, 4 R.legu-minosarum 249b, 5 Corynebacterium sp., 6 Mycobacterium sp., 7 Bacillus sp., 8 декстран Т-70.

** З даних, представлених у табл.2, виключені значення контролю, що склали (за 4 години розчинення) для фосфоритного борошна — 5 мг/л, для ПМФ — 12 мг/л.

Таким чином, встановлено, що бактеріальні полісахариди різного хімічного складу мають незначну деструктуючу активність по відношенню до фосфору, сполуки якого є дуже стійкими щодо мобілізації. Не маючи власної істотної деструктуючої дії, екзополісахариди в 2-4 рази інтенсифікують розкладання фосфоровмісних мінералів у розчинах низькомолекулярних бактеріальних метаболітів. Інтенсифікуюча дія екзополісахаридів зумовлена, можливо, їх високою здатністю до акумулювання мобілізованих іонів. Відомо, що полісахариди мікробного походження беруть активну участь у сорбції неорганічних іонів, вміст яких може складати до 34% від сирої ваги полісахариду [Dugan, 1987]. Александровим В.Г. і Заком Г.А. [1950] за допомогою мікрохімічних реакцій було доведено, що капсульний слиз B.mucilaginosus містить значну кількість кремнію та алюмінію. Нами також підтверджені ці дані: після осадження етанолом полісахарид забарвлюється в темно-синій колір, що свідчить про сорбцію на макромолекулах великої кількості фосфат-іонів. Очищений діалізом полісахарид при проведенні кольорової реакції на фосфор залишається практично безбарвним.

Полісахариди є поліфункціональними молекулами, здатними до іонізації у водних середовищах, тобто є поліелектролітами. Поліелектроліт у розчинах утворює полііон і протилежні іони. Оскільки на макромолекулах полісахаридів активно проходять процеси сорбції іонів, то для вивчення механізму дії полісахаридів на мінерали її порівнювали із впливом універсальних іонообмінних смол - катіонітом КУ-2  і аніонітом ЕДЕ-10П.

Таблиця 3

Деструкція плавленого магнієвого фосфату в розчинах різних метаболітів

у присутності катіоніту (К) і аніоніту (А) протягом трьох годин

Реагент | Винос фосфору,

Р2О5 мг/л | Адсорбований фосфор,

Р2О5 мг/л

з катіоніту | з аніоніту

1. Щавлева кислота+К | 43,9 ± 1,99 | 0

2. Щавлева кислота+А | 36,6 ± 6,16 | 7,32

3. Щавлева кислота | 29,3 ± 1,73

4. NaOH + K | 54,9 ± 1,89 | 0

5. NaOH + A | 9,16 ± 1,69 | 7,32

6. NaOH | 11,0 ± 1,67

7. Сірчана кислота + К | 56,7 ± 1,89 | 0

8. Сірчана кислота + А | 34,8 ± 1,84 | 8,76

9. Сірчана кислота | 34,8 ± 1,73

10.Дистильована. вода + К | 47,6 ± 1,39 | 0

11.Дистильована. вода + А | 9,15 ± 1,75 | 7,32

12.Дистильована. вода | 5,49 ± 0,76

Отримані результати свідчать про те, що вплив іонообмінних смол на фосфоровмісні сполуки подібний до дії бактеріальних полісахаридів: вони прискорюють та підсилюють розкладання мінералу. Інтенсивність процесу залежить від природи і концентрації низькомолекулярного метаболіту та природи сполуки, що деструктується (табл.3). Однак, істотна різниця між іонообмінними смолами і полісахаридами полягає в тому, що перші мають високу власну деструктуючу активність і невелику сорбційну ємкість відносно вилужених фосфат-іонів. Бактеріальні по-лі-са-ха-ри-ди на відміну від іонообмінних смол ефективно сор-бу-ють фосфат-іони – понад 1000 мг/г сухого ЕПС.

ФУНКЦІОНАЛЬНА РОЛЬ ЕКЗОПОЛІСАХАРИДІВ

МІКРООРГАНІЗМІВ ҐРУНТУ І РОСЛИН

Незважаючи на велику кількість досліджень капсульних і позаклітинних полісахаридів бактерій, їх функції залишаються недостатньо вивченими. У розділі розглянуті функції екзогенних полісахаридів, які продукуються ґрунтовими бактеріями, а також мікроорганізмами філосфери і ризосфери рослин. Функції полісахаридів розглядаються в їх взаємозв'язку з хімічним складом, структурною організацією макромолекул, гідрофільністю, а також сорбційними і реологічними властивостями. Показано екологічну значимість цих полімерів, а саме: участь екзогліканів у встановленні інформаційних, трофічних, механічних та інших зв'язків у природних біоценозах, що включають як мікро-, так і макрооб'єкти. Позаклітинні полісахариди відіграють також суттєву роль у збереженні життєздатності окремих видів бактерій і популяцій в екстремальних умовах.

Описано процес споживання клітинами B.mucilaginosus власного екзополісахариду, виявлений при вивченні динаміки синтезу і деструкції ЕПС у рідкому середовищі. Енергія і сполуки, що вивільняються при деструкції полісахариду, використовуються для проходження процесу споруляції клітин B.mucilaginosus, про що свідчить відсутність підвищення концентрації редукуючих речовин у культуральній рідині в процесі деструкції ЕПС (табл.4).

Таблиця 4

Динаміка споруляції B.mucilaginosus при вирощуванні культури
на середовищі за співвідношення азоту до вуглецю 1:80. |

Час культивування, діб

1 | 2 | 3 | 4 | 5

Число спор в одиниці об’єму (мл)·107 | 1,76 | 2,12 | 9,52 | 18,1 | 24,7

Відношення кількості спор до кількості вегетативних клітин ,% | 2,40 | 3,34 | 10,5 | 20,4 | 30,9

Концентрація ЕПС, г/л | 1,90±0,22 | 2,40±0,21 | 1,09±0,11 | 0,62±0,08 | 0,03±0,004

Вміст речовин, що редукують, г/л | 19,4±2,30 | 17,5±1,82 | 17,4±2,00 | 17,2±1,95 | 16,9±1,94

Використання полісахаридів для споруляції характерно для анаеробів, тоді як у аеробів цей процес відбувається з використанням такої запасної живильної речовини як полі-?-оксимасляна кислота [Шлегель Г.,1972]. Особливість процесу споживання полісахариду B.mucilaginosus полягає також в тому, що споживається не внутрішньоклітинний ЕПС, а полісахарид, виділений у культуральну рідину.

Таким чином, вперше для факультативно аеробних бактерій встановлена можливість використання власного екзополісахариду як комплексного джерела субстрату та енергії для проходження процесу споруляції. Це явище лежить в основі особливої стратегії росту і виживання полісахаридсинтезуючих бактерій у ґрунті: з появою вільного субстрату бактерії починають рости і при надлишку вуглецю швидко синтезують капсулу, що сорбує з навколишнього середовища мінеральні елементи і бактеріальні метаболіти. Після вичерпання поживних речовин період швидкого росту завершується і починається споруляція, для проходження якої використовуються акумульовані в капсулі вуглеводи, метаболіти та мінеральні елементи.

Представлені в табл. 5 експериментальні дані свідчать про виявлення нової екологічної функції бактеріальних екзополісахаридів, а саме: екзополісахариди запобігають вимиванню рухомого фосфору ґрунту за умов надмірного зволоження .

Таблиця 5

Вплив полісахариду B.mucilaginosus різного ступеня очищення
на вимивання водорозчинних фосфатів з чорнозему лучного

(1 - ґрунт, що містить 0,15 мг Р2О5г; 2 ґрунт, що містить 5,00 мг Р2О5г)

Концентрація внесеного фосфату, Р2О5 мг/100г ґрунту |

Варіант | Концентрація фосфору, що вимивається, Р2О5 мг/100г

Нативний ЕПС | Недіалізований ЕПС | Діалізований ЕПС

1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2

20 (А) | водний | 9,17 | 14,3 | 9,88 | 16,6 | 9,70 | 15,0

20 (А) | ЕПС | 5,56 | 8,60 | 6,04 | 9,88 | 8,40 | 13,3

10 (В) | водний | 3,12 | 10,3 | 3,12 | 10,3 | 3,10 | 8,6

10 (В) | ЕПС | 0,73 | 5,03 | 2,56 | 6,59 | 2,56 | 6,59

5 (С) | водний | 1,54 | 6,62 | 2,76 | 6,62 | не визн. | не визн.

5 (С) | ЕПС | 0,19 | 1,15 | 1,11 | 2,40 | не визн.не визн.

Встановлено, що нативний екзополісахарид B.mucilaginosus зменшує ступінь вимивання фосфатів порівняно з контролем на 104%, недіалізований полісахарид – на 56,3%, діалізований полісахарид – на 30,3% (табл.5). Зі збільшенням концентрації внесеного фосфору ефективність дії -полісахариду знижується. Можливо, це обумовлено обмеженістю сорбційної ємкості бактеріального полісахариду, а також тим, що за умов повільної дифузії надлишок фосфат-іонів не сорбується і піддається вимиванню. Недіалізований полісахарид ефективніше перешкоджає вимиванню рухомих фосфатів, тому що він має вищу (на 55%) сорбційну ємкість по відношенню до аніонів фосфорної кислоти порівняно з діалізованим полісахаридом.

Переваги сорбованого стану іонів полягають не тільки в тому, що мінеральні елементи менше піддаються вимиванню, але й у тому, що сорбція на макромолекулах полісахариду є оборотною. В результаті діяльності коріння: виділення кислих продуктів метаболізму, сидерофорів, створення градієнта концентрацій проходить десорбція іонів і вони можуть бути використані рослинами.

УЧАСТЬ ОРГАНІЧНИХ КИСЛОТ БАКТЕРІАЛЬНОГО ПОХОДЖЕННЯ

В ПРОЦЕСІ ДЕСТРУКЦІЇ ҐРУНТОВИХ МІНЕРАЛІВ

Літературні, а також отримані нами експериментальні дані свідчать про активну участь у процесі деструкції мінералів органічних кислот ґрунтових мікроорганізмів.

Встановлено, що вплив хімічної будови молекул кислот на інтенсивність розкладання фосфоровмісних сполук і мінералів виявляється, в основному, за присутності бактеріального полісахариду, у водному ж розчині ефективність дії кислот залежить від природи сполуки, що деструктується. Внесення бактеріального полісахариду у водні розчини органічних кислот підсилює розкладання фосфоровмісних сполук і мінералів у 2-5 разів. У максимальному ступені полісахарид збільшує руйнування сполук у розчині лимонної кислоти: плавленого магнієвого фосфату — у 2,4 раза, термофосфату (ТФ) — у 2,1 раза, фосфоритного борошна — у 5,0 разів.

Розкладання фосфорних сполук у розчинах аскорбінової і щавлевої кислот бактеріальний полісахарид підсилює в меншому ступені, ніж у розчині лимонної кислоти: плавленого магнієвого фосфату — відповідно в 1,9 і 1,4 раза, фосфоритного борошна — у 4,4 і 4,0 рази (мал.1).

Моделювання руйнування фосфоровмісних сполук і мінералів у нестерильних умовах дозволило встановити, що в умовах ґрунту органічні кислоти піддаються споживанню аборигенною мікрофлорою, особливо аскорбінова і лимонна, в меншій мірі – янтарна кислоти. Водні розчини органічних кислот через 18 годин інкубування в нестерильних умовах зменшують свою мобілізуючу активність в 2-7 разів. Внесення полісахариду у водні розчини кислот дозволяє уникнути швидкого споживання останніх мікроорганізмами, в результаті чого ефективність деструкції мінералів у нестерильних умовах не змінюється порівняно із стерильними умовами. Внесення бактеріального полісахариду в розчин органічних кислот дозволяє перевести останні в сорбований стан, в результаті чого їхня доступність для споживання різко зменшується. Таким чином, полісахридсинтезуючі бактерії не лише інтенсивніше руйнують мінерали порівняно з мікроорганізмами, що синтезують тільки низькомолекулярні метаболіти, але й утворюють стійкіший та довгостроково функціонуючий у ґрунті деструктуючий комплекс .

ДИНАМІКА ЗМІНИ ДЕСТРУКТУЮЧОЇ АКТИВНОСТІ

КУЛЬТУРАЛЬНОЇ РІДИНИ B.MUCILAGINOSUS

Всупереч поширеній у літературі думці про те, що біологічна деструкція мінералів відбувається повільно, при вивченні динаміки бактеріального розчинення термофосфату встановлено, що мак-си-ма-ль-ний ви-нос фосфору у культуральну рідину B.mucilaginosus проходить у експоненціальній фа-зі рос-ту між-6 і 18 годинами інкубування. В цей пе-рі-од ін-тен-си-вно на-коп-ичуються екзополісахарид та ме-та-бо-лі-ти кислої природи, про що свідчить зниження рН від 7,4 до 5,5. 

Динаміка деструкції окремих мінеральних часток має двофазний характер. Інтенсивніший винос фосфору відбувається в перші хвилини взаємодії метаболітів з частками мінералу. Швидкість деструкції в першій фазі розчинення (V1) вивчених мінералів у 3-5 разів перевищує швидкість наступного виносу фосфору. Причиною швидкого руйнування мінералів протягом перших хвилин взаємодії є, ймовірно, проходження реакції деструкції в активних центрах на поверхні мінеральних часток. Після закінчення руйнування дефектної поверхні починається повільніший винос фосфору з внутрішніх упорядкованих шарів мінеральних часток.

Таблиця 6

Розкладання фосфоритного борошна низькомолекулярними реагентами

за присутності (1) і відсутності (2) полісахариду B.mucilaginosus.

Варіант | Концерн-трація, г·екв | Швидкість розкладання V1,Р2О5 мг/л·год | Кінцевий винос фосфору, Р2О5 мг/л

1 | 2 | 1 | 2

Щавлева кислота | 0,008 | 382 ±5,90 | 84,3 ±5,90 | 209 ±14,9 | 49,4 ±2,20

Щавлева кислота | 0,08 | 402 ±20,60 | 126 ±18,3 | 249 ±26,3 | 76,9 ±3,93

NaOH | 0,01 | 58,2 ±9,60 | 22,1 ±1,39 | 106 ±7,10 | 11,0 ±0,60

NaOH | 0,05 | 64,4 ±6,20 | 29,2 ±1,83 | 112 ±4,20 | 16,5 ±1,10

Сірчана кислота | 0,0035 | 337 ±40,1 | 18,8 ±1,89 | 197 ±17,3 | 16,5 ±0,95

Сірчана кислота | 0,035 | 410 ±23,4 | 117 ±18,6 | 212 ±17,6 | 87,6 ±3,68

Екзополісахарид B.mucilaginosus впливає на швидкість розкладання V1 і на кінцевий рівень розчинення фосфоровмісних сполук з різною інтенсивністю залежно від природи деструктуючого реагенту. Ефективнішим є внесення полісахариду при розчиненні фосфоритного борошна (міцнішого з вивчених мінералів) у розчинах NaOH і H2SO4 : кінцевий винос фосфору в розчині полісахариду збільшується порівняно з водним розчином цих реагентів відповідно у 9,7 і 12 разів (табл.6). -При цьому швидкість розчинення фосфоритного борошна V1 за присутності полісахариду вище швидкості мобілізації фосфору у водних розчинах у 3,5-18 разів. Особливо ефективно впливає ЕПС B.mucilaginosus на розчинення фосфоритного борошна в реакціях, що проходять за гідролітичним механізмом.

Вивчення впливу умов зберігання на фосфатмобілізуючу ак-ти-внос-ть показало, що комплекс метаболітів B.mucilaginosus досить стабільний за різних умов зберігання. Мобілізуюча активність культуральної рідини B.mucilaginosus по відношенню до термофосфату за 13 діб зберігання при перемішуванні і температурі 280 С зменшилася на 26,5%, без перемішування — на 32,9%, за кімнатної температурі та в холодильнику — на 51%. Основне зниження мобілізуючої активності спостерігається протягом першої доби зберігання.

ДОБІР ШТАМІВ МІКРООРГАНІЗМІВ З ПІДВИЩЕНОЇ

ФОСФАТМОБІЛІЗУЮЧОЮ АКТИВНІСТЮ

Муромцевим Г.С. [1975] показано, що свіжовиділені з ґрунту штами фосфатмобілізуючих бактерій при збереженні і пересіваннях на штучних живильних середовищах досить швидко втрачають цю здатність, що обумовлено, можливо, локалізацією генів фосфатмобілізації на плазмідах [Yong Kim Kil,1994]. У зв'язку з цим, доцільно відбирати штами з колекцій, де вони зберігаються досить довго і всі нестабільні ознаки вже загублені.

Як предмет дослідження були обрані представники родів Bacillus, Rhodococcus, Rhizobium та ін. Види цих родів, за літературними даними, здатні переводити в розчинний стан фосфор ряду мінералів та нерозчинних солей [Domey Sabine, 1992; Геллер,1971; Иллялетдинов,1966].

В результаті проведених досліджень було встановлено, що за величиною зони розчинення із 167 обстежених штамів роду Bacillus 22 штами (13,2%) мали високу , 30 (18,0%) – середню і 38 (22,8%) - низьку фосфатмобілізуючу активність. Нокардіо- і корінеподібні бактерії здатні розчиняти трикальцієвий фосфат у меншій мірі порівняно з бацилами. Із 187 обстежених культур 10 штамів (5,3%) мали високу, 23 (12,3%) - середню і 33 (17,6%) - низьку фосфатмобілізуючу активність .

При обліку кількості активних штамів за коефіцієнтом К (відношення радіусу зони просвітління до радіусу колонії був підтверджений ) також був підтверджений висновок про те, що представники роду Bacillus на агаризованих середовищах є активнішими розчинниками фосфатів, ніж нокардіоподібні бактерії. Із 167 вивчених штамів бацил 36,5% мають низьке, 13,8% - середнє і 4,2% - високе значення К. У нокардіо- і корінеподібних бактерій із 187 обстежених штамів 25,1% мають низьке, 8% - середнє і 1,6% - високе значення К. Таким чином, серед бацил вищий відсоток активних штамів (50%), ніж у нокардіоподібних бактерій (32%). Штамів бацил із середнім та високим значенням К на 70 і 125% більше, ніж штамів нокардіо- і корінеподібних бактерій.

Вивчення здатності відібраних бактерій розчиняти фосфоровмісні сполуки в умовах глибинного культивування показало, що винос фосфору із термофосфату склав у середньому 110-120 мг/л (табл.7). Активніше розчиняли термофосфат свіжовиділений із ґрунту штам Bacillus sp. Д-31 та музейні штами B.subtilis 72 і 54, B.mucilaginosus.

Плавлений магнієвий фосфат піддається бактеріальній деструкції в меншій мірі, ніж термофосфат. Винос фосфору в середньому становив 80-85 мг/л (табл.7) . Активніше розчиняють плавлений магнієвий фосфат Bacillus sp. Д-31, Д-13 і B.subtilis 63z. Кісткове і фосфоритне борошно розчиняються в культуральній рідині вивчених мікроорганізмів з низькою інтенсивністю (табл.7). Винос фосфору в середньому із кісткового борошна становив 20-25 мг/л, із фосфоритного борошна - 25-30 мг/л. Активнішими у відношенні кісткового і фосфоритного борошна були штами Bacillus sp.223 і Д-31, B.subtilis 72.

Таблиця 7

Мобілізація фосфору із нерозчинних фосфатів різними мікроорганізмами

Штам | Термофосфат | ПМФ | Кісткове борошно | Фосфоритне борошно

1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2

1. B.cereus 99 | 96,0 | 116 | 59,2 | 73,0 | 14,8 | 32,3 | 19,3 | 35,7

2. B.subtilis 100 | 83,3 | 63,8 | 68,7 | 74,4 | 19,3 | 33,5 | 17,9 | 24,8

3. Bacillus sp.223 | 115 | 56,3 | 78,7 | 42,0 | 37,6 | 30,8 | 38,5 | 28,8

4. Bacillus spД-31 | 131 | 67,6 | 126 | 79,7 | 40,6 | 32,8 | 43,3 | 31,9

5. B.subtilis 72 | 140 | 59,0 | не визн. | не визн. | 5,6 | 30,0 | 18,2 | 36,4

6. B.subtilis 54 | 106 | 155 | 53,8 | 66,1 | 12,6 | 30,0 | 18,2 | 36,4

7. Bacillus sp Д-13 | 107 | 149 | 107 | 202 | 15,9 | 37,2 | 15,1 | 26,5

8. B.subtilis 63z | 106 | 81,6 | 116 | 126 | 24,5 | 33,4 | 22,2 | 25,3

9. B.mucilaginosus | 184 | 176 | 59,4 | 38,7 | 28,7 | 35,4 | 26,5 | 28,2

1 - кількість розчиненого фосфору, Р2О5 мг/л ; 2 - питома фосфатмобілізуюча активність (Ауд), Р2О5 мг/г біомаси.

Згідно з літературними даними [Павлова В.Ф., 1982], не всі мікробні культури, що утворюють зони розчинення фосфатів на агаризованому середовищі, мобілізують фосфор у рідкому глюкозо-аспарагіновому середовищі, що вимагає для характеристики штамів обов'язкового визначення фосфатмобілізуючої активності в рідкому середовищі. З метою з'ясування цього питання, вивчали кореляційний зв'язок між активністю розчинення фосфатів на агаризованому і рідкому живильних середовищах 69 штамами роду Bacillus. Встановлено, що існує тісний кореляційний зв'язок (R=0,67) між питомою фосфатмобілізуючою активністю в рідкому живильному середовищі та відношенням розміру зони розчинення до розміру колонії (К). Використання нового показника фосфатмобілізуючої активності (К) дозволить спростити проведення скринінгу штамів - на агаризованому середовищі.

Бактеріальна обробка чорнозему лучного в модельних дослідах за відсутності вегетуючих рослин підвищує ступінь рухомості фосфору на 10-50% залежно від дози внесених у сівозміні фосфорних мінеральних добрив. Зі збільшенням дози добрив зменшується різниця між стерильними і нестерильними варіантами досліду. На контролі (без добрив) у стерильному варіанті досліду бактеріями переводиться в розчинний стан на 50% фосфору більше, ніж при бактеріальній обробці нестерильного ґрунту, де надлишок рухомого фосфору споживається аборигенною мікрофлорою. Бактеріальна обробка тим ефективніша, чим більше фіксованого фосфору міститься в ґрунті. Разом з тим, не виявлено індивідуальних переваг у п'яти досліджуваних штамів у відношенні розчинення фосфатів за високої їх концентрації в ґрунті.

ЗМІНА ПАРАМЕТРІВ РОЗВИТКУ ПРОРОСТКІВ СОЇ ВНАСЛІДОК

КОМПЛЕКСНОЇ БАКТЕРІАЛЬНОЇ ОБРОБКИ НАСІННЯ

Багато ґрунтових мікроорганізмів здатні до синтезу-біологічно активних речовин (БАВ), що збільшують схожість насіння, прискорюють розвиток проростків, особливо на перших етапах онтогенезу рослин. Тому більшість штамів фосфатмобілізуючих бактерій, що використовували в польовому досліді, попередньо вивчали на здатність продукувати біологічно активні речовини .

У дослідах з рулонними культурами були виявлені штами, що стимулюють ріст проростків сої сорту Чернятка. Збільшення довжини стебла порівняно з контролем за обробці B.mucilaginosus складало 66%, B.pumilis M - 50%, B.subtilis 5 – 40%, B.subtilis ЖКГ-2 - 37%, Rh.erythropolis B-850 – 36%, B.alvei ИМВ-2 - 31% і Bacillus sp. 90 - 29%. Більшість вивчених штамів збільшували також довжину кореня проростків: Bacillus sp. 217 – на 41%, B.subtilis 310 – на 37%, Bacillus sp. 40 – на