Інститут очних хвороб і тканинної терапії ім. В.П.Філатова АМН України

МАКСАКОВА ОЛЕНА ВАЛЕНТИНІВНА

УДК 617.713-001.4-085.32-085.31

ТЕРАПЕВТИЧНА ЕФЕКТИВНІСТЬ ПОЛІПЕПТИДНИХ ПРЕПАРАТІВ У КОМПЛЕКСНІЙ ТЕРАПІЇ ТРАВМАТИЧНИХ ПОШКОДЖЕНЬ РОГОВОЇ ОБОЛОНКИ

(експериментально-клінічне дослідження)

14.01.18 – Очні хвороби

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Одеса – 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Українській медичній стоматологічній академії МОЗ України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Воскресенська Людмила Костянтинівна, Українська медична стоматологічна академія, завідувач кафедри очних хвороб.

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Кондратенко Юрій Миколайович, Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика МОЗ України, професор кафедри очних хвороб;

доктор медичних наук, старший науковий співробітник Красновид Тетяна Андріївна, Інститут очних хвороб і тканинної терапії ім. В.П.Філатова АМН України, керівник відділення травм ока (опіки, контузії та проникаючі поранення).

Провідна установа: Дніпропетровська державна медична академія, МОЗ України, кафедра очних хвороб, м. Дніпропетровськ.

Захист відбудеться “30” травня 2003 р. о 1200 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.556.01 в Інституті очних хвороб і тканинної терапії ім. В.П.Філатова АМН України за адресою: 65061, м. Одеса, Французький бульвар, 49/51.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту очних хвороб і тканинної терапії ім. В.П.Філатова АМН України за адресою: 65061, м. Одеса, Французький бульвар, 49/51.

Автореферат розісланий “29” квітня 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор медичних наук, професор Пономарчук В.С.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Проблема репаративної регенерації при травматичному пошкодженні рогової оболонки на сучасному етапі залишається актуальною, оскільки внаслідок травм порушується структура рогівки, що у 25,6% випадків призводить до змін зору та інвалідності (Майчук Ю.Ф., 1982; Красновид Т.А., 1993; Гундорова Р.А., 1997; Кондратенко Ю.Н., 1999). Останнім часом увагу вчених привертають процеси, загальною ознакою яких є порушення стромально-епітеліальної взаємодії, міжклітинного та міжтканинного гемостазу. Крім цього, активно вивчається група адгезивних молекул, зокрема фібронектину (ФН), які мають регуляторний вплив на процеси міжклітинної та міжтканинної взаємодії (Хомутовский О.В.,1984; Брикман И.В.,1990; Адамова Н.А.,1992) шляхом участі в клітинній адгезії і розпластування клітин на фібрилярних субстратах, регуляції їх рухливості, структурної організації інтерстиціального матріксу, і мають також протизапальну, коагулопротекторну дію (Муминов Т.А., 1985 ; Васильев С.А. и соавт., 1994; Harrisson F. et al., 1985). Праці, присвячені вивченню рівня фібронектину при епітеліальних ушкодженнях різноманітної локалізації, зокрема рогівки, нечисленні. Роль переднього епітелію в утворенні міжклітинної рідини строми пояснює виснаженість міжклітинного матриксу, зміни синтезу кислих мукополісахаридів (ГАГ) при дефектах рогівки. В той же час регенеруюча епітеліальна тканина, яка швидко вкриває травмовану поверхню, сприяє нормалізації метаболічних процесів у стромі (Бездетко П.А. с соавт., 1994; Майчук Ю.Ф., 1997; Егоров Е.А., 1999). Таким чином, стан переднього епітелію визначає виразність відновних процесів при ушкодженні рогівки і цілком залежить від кількісної характеристики тканинного фібронектину (Федоров Н.А.,1991; Арнаутова Л.В., 1989; V.Berman, 1980; F.U. Prause et аl., 1982, Адо Махаммад, 1994;). Необхідність спрямованої регуляції комплексу локальних змін, зокрема, у системі місцевого гемостазу за наявності епітеліально-стромального дефекту рогової оболонки, змусила здійснити пошук нових регуляторних механізмів модуляції.

Останнім часом доведено існування нової системи біологічної регуляції, опосередкованої дією тканинних пептидів, що мають специфічний вплив на рівні клітинних популяцій Дослідження в цьому напрямку дозволили сформулювати уявлення про їхні основні функції, до числа яких відноситься перенесення міжклітинної інформації в багатоклітинному організмі і регуляція захистних систем організму - гемостазу (Кузник Б.И. с соавт., 1989-2002; Olson G., 1993; Fischer E.G., 1998). Пошук адекватних методів терапії травматичних пошкоджень рогівки, які б прискорювали процеси регенерації і при цьому сприяли високим функціональним результатам, не втрачає своєї актуальності.

Перспективним для вивчення із групи поліпептидних препаратів вважається вітчизняний гексапептид даларгін, синтетичний аналог лей-енкефаліна, який має антиоксидантні, імунорегулюючі, антистресові і, що найбільш важливо, репаративні властивості. Існують докази реалізації стимулюючого ефекту даларгіну на процеси клітинного ділення через опіантні рецептори (КоробовН.В., 1988; Тимошин С.С., 1990; Колотилов М.М. с соавт., 1995).У літературі мають місце повідомлення про застосування даларгіну лише для лікування важких опіків очей (Смолякова П.П. с соавт.1994) Клінічне застосування препарату дозволено Фармкомітетом України у 1996 році.

Особливий інтерес становить також вивчення виділеного з тканин Eisenia foetida пептидного біологічно активного комплексу – „Вермілат”, що синтезований в Українській медичній стоматологічній академії і виявив широкий спектр біологічної активності, впливаючи, зокрема, на процеси міжклітинної і міжтканинної кооперації, місцеві зміни в системі гемостазу (патент України №5743). Цей препарат у результаті проведених доклінічних експериментальних досліджень одержав характеристику коректора метаболізму сполучної тканини (Кайдашев И.П с соавт., 1992; Кайдашев И.П., 1996).

Вибір теми наших досліджень був зумовлений тим, що пептидні комплекси здатні впливати на стан метаболічних процесів в ушкоджених клітинах. Зокрема нас зацікавило питання про можливий вплив поліпептидних препаратів на процеси репарації рогівки, залежно від рівня структурного фібронектину.

Дане дослідження присвячене експериментальному і клінічному вивченню ефективності поліпептидних препаратів у комплексній терапії травматичних пошкоджень рогової оболонки.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження є фрагментом ініціативної роботи Української медичної стоматологічної академії „Створення лікарських біопрепаратів “Вермілат”, “панкреолат”, “нефролат” та організація їх промислового виробництва” КФ-40203 № 0199V00159( 1999-2001 рр.), співвиконавцем якої була автор.

Мета дослідження. Підвищення ефективності лікування хворих з травматичними пошкодженнями рогової оболонки на основі експериментального обґрунтування стимулюючої дії поліпептидних препаратів (даларгіну і “Вермілату“) у репарації пошкодженої рогівки, що грунтується на ролі фібронектину та ГАГ і можливість пептидної регуляції змін у системі гемостазу .

Для досягнення мети були поставлені такі завдання:

1. Під час експерименту на кролях вивчити вплив даларгіну та “Вермілату“ на процеси регенерації переднього епітелію і строми травмованої рогівки з визначенням оптимальної терапевтичної концентрації препаратів при різних способах введення — парабульбарному та за допомогою методу електрофорезу.

2. Експериментально вивчити вплив даларгіну та “Вермілату“ на тканини інтактного ока.

3. Розробити об`єктивний тест для виявлення прихованих дефектів рогової оболонки при травматичних її пошкодженнях.

4. Вивчити роль і динаміку тканинного фібронектину та глікозаміногліканів у процесі регенерації рогівки під впливом поліпептидних препаратів при експериментальній дозованій кератоектомії.

5. Експериментально та клінічно підтвердити пептидний механізм регуляції системи гемостазу при корекції епітеліально-стромальних порушень рогової оболонки.

6. Вивчити терапевтичну ефективність даларгіну в комплексній терапії хворих із травматичними пошкодженнями рогової оболонки порівняно з традиційним лікуванням і розробити показання до його застосування.

Об`єкт дослідження: регуляція процесів регенерації рогівки.

Предмет дослідження: пептидна регуляція місцевих процесів у тканинах( репарація) і системи гемостазу при травматичному пошкодженні рогової оболонки.

Методи дослідження. Висунуті завдання вирішували шляхом дослідження вмісту глікозаміногліканів та фібронектину в тканинах рогівки та коагулогічні дослідження крові в експерименті з метою визначення спрямованості дії та ефективності поліпептидних препаратів;офтальмологічні методи дослідження зорових функцій і статусу органа зору,клінічне коагулогічне обстеження пацієнтів із травматичними пошкодженнями рогової оболонки для оцінки перебігу процесу та ефективності запропонованого способу комплексної корекції.

Результати клінічних досліджень були опрацьовані з використанням комп’ютерної програми Microsoft Excel 97.

Наукова новизна одержаних результатів, отриманих особисто здобувачем і поданих на захист. У роботі вперше при експериментальному дослідженні встановлено, що під дією поліпептидних препаратів, даларгіну та “Вермілату”, спостерігалися кількісні зміни фібронектину і глікозаміногліканів, що сприяло стимуляції репаративних процесів у травмованій рогівці і мало прогностичне значення.

Експериментально показано, що парабульбарні введення поліпептидних препаратів, даларгіну і “Вермілату”, сприяють покращенню показників судинно-тромбоцитарного гемостазу.

Вперше обґрунтовано і клінічно доведено ефективність парабульбарного введення та за допомогою електрофорезу даларгіну при травматичних пошкодженнях рогівки.

Практичне значення одержаних результатів. Запропоновано спосіб лікування травматичних пошкоджень рогової оболонки різної етіології шляхом стимуляції її репаративних процесів, який полягає у використнні поліпептидного препарату даларгіну, що вводиться парабульбарно (протягом 7 днів 1-2 рази на день по 0,5 мл) або за допомогою електрофорезу (з анода силою струму 2-3 мА, з тривалістю процедури 5-7хв.) в концентрації 1000мкг/мл залежно від глибини ураження рогової оболонки.Терапевтична ефективність лікування становить 91,3%

Розроблений і запропонований для використання у практичній офтальмології спосіб діагностики прихованих дефектів рогової оболонки, що полягає у застосуванні розчину антибіотика тетрацикліну на 0,9% фізіологічному розчині у співвідношенні 1:1000000 і відрізняється від традиційного флюоресцеїнового тесту тим, що дає змогу слідкувати за перифокальним набряком з метою прогнозування поширення процесу.

Результати роботи впроваджені в навчальний процес кафедри очних хвороб Української медичної стоматологічної академії (УМСА), у наукові дослідження центральної науково-дослідної лабораторії (ЦНДЛ) УМСА МОЗ України, а також у клінічну практику очних відділень Полтавської обласної клінічної лікарні, 1-ї міської лікарні м.Кременчука, регіональних поліклінік мм. Полтави №4 і Кременчука МСЧ КрАЗ; очного відділення Миргородської ЦРЛ.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертації розроблена програма досліджень під керівництвом проф. Л.К.Воскресенської. Експериментальні дослідження автором проведені самостійно на базі віварію Української медичної стоматологічної академії. Клінічні спостереження проводилися на хворих. Гістоморфологічні та гістохімічні дослідження проведені разом із співробітниками ЦНДЛ Української медичної стоматологічної академії. Автором отримано патент України на „Спосіб лікування травматичних пошкоджень рогової оболонки” (№ 990207245), а також на „Спосіб діагностики прихованих дефектів рогової оболонки ока різного походження”(№ 99020704). За матеріалами дослідження опублікований інформаційний лист №159. Самостійно проведені патентний та інформаційний пошук із використанням пошукових систем Internet, аналіз отриманого фактичного матеріалу, розробка основних положень та висновків роботи.

Апробація результатів роботи. Матеріали дисертації викладені та обговорені на міжнародній національній конференції до 70-ї річниці Болгарської співдружності з офтальмології „Новости в офтальмологията” (м.Софія, 1997); на науковій конференції офтальмологів, присвяченій 90-річчю акад. Н.О. Пучковської (м. Одеса, 1998); на II Міжнародному конгресі студентів та молодих учених (м. Тернопіль, 1999); на науковій конференції офтальмологів, присвяченій 125-річчю з дня народження акад. В.П.Філатова (м.Одеса, 2000); на Міжнародній конференції офтальмологів Одеса-Генуя (м.Чернівці, 2001); на Х-му Українському з`їзді офтальмологів (м.Одеса, 2002 рік); апробація дисертації проведена на засіданні Апробаційної Ради №1 Української медичної стоматологічної академії 26 червня 2002 року.

Публікації. Основні положення дисертації викладені у 12 публікаціях, з яких 6 статей - у наукових фахових виданнях, рекомендованих ВАК України (4 одноособові); 2 патенти опубліковані у бюлетені „Промислова власність”, 4 роботи - у матеріалах конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 166 сторінках комп`ютерного тексту українською мовою. Складається зі вступу, 4 розділів, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, списку використаних джерел. Робота ілюстрована 23 таблицями, 30 рисунками. Список використаних джерел викладений на 24 сторінках і нараховує 228 джерел.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Для спостереження за основними ознаками захворювання, а також для вивчення впливу терапевтичної концентрації розчину поліпептидних препаратів на оболонки ока, оптичні середовища, сітківку використовували огляд у прохідному світлі, боковому освітленні, біомікроскопію, офтальмоскопію, флюоресцеїнову пробу.

Запропонована нами нова методика тетрациклінового тесту дає змогу виявити приховані дефекти епітелію та інфільтрацію строми навколо вогнища пошкодження. З цією метою використовували розчин антибіотика тетрацикліну у фізіологічному розчині у співвідношенні 1:1000000 одиниць, який інстилювали в око тварин після нанесення дефекту рогівки і оцінювали при цьому ступінь зміни забарвлення дефекту епітелію, а також інтенсивність інфільтрації строми навколо основного вогнища через фотохромний фільтр за допомогою біомікроскопії. Використання цього способу дало змогу об`єктивно диференціювати поверхневі ураження від глибоких, у динаміці контролювати зміну площі виразкування.

Морфометричні дослідження проводили з використанням сітки Г.Г.Автандилова (1990) і окулярної вставки для морфометрії з ціною поділки 0,01мм. Для оцінки стану ерозій, під час її загоєння, проводили кількісну планіметрію за методом Є.В.Кулішова.(1974) Для розв'язання поставлених у роботі завдань були виконані експериментальні та клінічні дослідження. Експериментальні дослідження здійснено на 80 кролях породи “шиншила”, віком 6-8 місяців, вагою 2,5-3 кг, які утримувалися на стандартному раціоні віварію.

Проведено 6 серій дослідів, під час яких за допомогою клінічних, гістоморфологічних та гістохімічних методів вивчався вплив регуляторних пептидів (даларгіну та “Вермілату”) з метою корекції репаративних процесів травмованої рогової оболонки.

Перша серія експерименту, (18 кролів), спрямовувалася на вивчення впливу поліпептидних препаратів на оболонки ока інтактних тварин при різних способах введення. Препарати вводилися парабульбарно, у вигляді електрофорезу (по 7 днів) та інстиляцій (протягом 30 днів) у дозі: даларгін - 1000мкг/мл, “Вермілат”- 0,1 мкг/мл відповідно до груп (по 3 тварини в кожній). Для контрольних спостережень були використані ліві очі, які одержували фізіологічний розчин.

У 2-3 серіях експерименту (36 тварин) проведені дослідження, що мали за мету визначення оптимальної концентрації даларгіну та “Вермілату” і раціонального режиму їх застосування в умовах поверхневої часткової експериментальної кератоектомії (Є.А.Єгоров,1971). Досліджено наступні концентрації даларгіну: 700,800,900,1000,1500,2000 мкг/мл та “Вермілату”: 0,01;0,05;0,1;0,25;0,5;1,0 мкг/мл (по 3 тварини на кожну концентрацію розчину). Препарати вводили 1 раз на добу парабульбарно (в праві експериментальні очі) по 0,5 мл протягом 7 днів. Ліве око вважали за контрольне і призначали ізотонічний розчин хлориду натрію. Клінічні спостереження за швидкістю епітелізації рани проводили впродовж терміну повного відновлення дефекту рогівки з врахуванням первинної площі пошкодження, яку вимірювали у міліметрах реепітелізованої поверхні за добу.

Наступні 4-5 серії експерименту (20 кролів) були спрямованіні на вивчення терапевтичної дії оптимальних концентрацій поліпептидних препаратів (даларгіну 1000мкг/мл, “Вермілату” 0,1 мкг/мл) на моделі глибокої експериментальної кератоектомії (Ю.Ф.Майчук, 1982). Вивчення динаміки показників площі епітелізації рогівки проводили порівняно із загальноприйнятим лікуванням (солкосерил) та без лікування в умовах введення фізіологічного розчину.

У 6 серії експерименту (6 тварин) для порівняльної дії даларгіну і “Вермілату“ на репаративні процеси епітелію та строми пошкодженої рогівки був застосований метод введення вказаних препаратів за допомогою електрофорезу (з аноду силою току 2-3 мА з тривалістю процедур 5-7 хвилин, 5-7 сеансів на курс).

У всіх серіях експерименту спостерігали процеси епітелізації протягом 7 діб, віддалені результати - протягом 30 днів. Тварини виводилися з досліду на 1-й, 3-й, 7-й і 30-й день для гістоморфологічного та гістохімічного дослідження очей.

Критеріями ефективності дії поліпептидних препаратів, при експериментальній дозованій травмі рогової оболонки, були площа і термін епітелізації первинних дефектів рогівки, тривалість запальної реакції переднього відділу ока, наявність та характер ускладнень, термін початку та тривалості васкуляризації рогівки, інтенсивність помутніння рогової оболонки за шкалою В.В. Войно-Ясенецького.

З метою вивчення ланок патогенезу репаративних процесів пошкодженої рогівки проводили імуногістохімічне вивчення тканинного фібронектину на зрізах тканин дослідних і контрольних груп ( Д.Ф.Глузман, 1993).

Вивчення кислих мукополісахаридів проводили з використанням групових гістохімічних методик і шляхом постановки низки хімічних контролів (А.Л. Шабодаш, 1974).

Клінічні спостереження проведені на 90 хворих (93 ока) з травматичними пошкодженнями рогової оболонки. Хворі основної групи були поділені на 2 підгрупи: першу, що включала 30 хворих (30 очей) з неускладненим перебігом процесу (поверхневі ураження), яким призначали даларгін як монопрепарат у вигляді парабульбарних ін’єкцій; другу, що охоплювала 30 хворих (33 ока) з глибокими пошкодженнями рогової оболонки (травматичні кератити, виразки рогівки), яким призначали даларгін у комплексній терапії у вигляді електрофорезу. Контролем слугували результати комплексного традиційного лікування 30 хворих (солкосерил, симптоматичні засоби). Під час формування груп порівняння передбачалося їх зіставлення з основною групою за статтю, віку, клінічним проявам і важкістю перебігу захворювання.

Клінічне обстеження виявило у всіх хворих основної групи типові симптоми рогівкового синдрому. При біомікроскопії переднього відділу ока були виявлені запальні інфільтрати.

У 9 (30%) хворих запальний інфільтрат знаходився у поверхневих шарах рогівки, у 21 (70%) - поширювався на середні ділянки і супроводжувався виразкуванням епітелію.

Запальна інфільтрація глибоких шарів рогівки спостерігалася у 27 (81,8%) хворих і супроводжувалася її виразкуванням у 6 (18,1%) пацієнтів.

У 2 (2,5%) хворих на момент обстеження було діагностовано глибоку виразку рогівки з гіпопіоном.

Локалізація ушкоджень була переважно оптичною у 20 (66,3%) хворих і параоптичною у 10 (33,3%) хворих з поверхневими ураженнями рогівки. Інфільтрація глибоких шарів рогівки спостерігалася у 16 (48,4%) хворих в оптичній частині і у 17 (51,5%) хворих - у параоптичній ділянці рогівки.

Аналіз ефективності використання даларгіну ґрунтувався на порівняльній оцінці динаміки основних ознак захворювання, спостереження за якими здійснювалося за допомогою загальноприйнятих офтальмологічних методів дослідження. З метою оцінки регенераторних можливостей рогової оболонки при травматичних пошкодженнях різного ступеня важкості застосовували тетрацикліновий тест, який має прогностичне значення щодо перебігу травматичного процесу рогівки.

У роботі використані різні методи дослідження периферичної крові (Балуда В.П.и соавт., 1980; Глузман Д.Ф., 1993; Bergerh H.D.1954; Quick A.J., 1966; Bigg R.M. Et ol., 1962; Hensen A. et al., 1963).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

На початковому етапі досліджень, що полягав у визначенні оптимальної концентрації поліпептидних препаратів, на підставі аналізу спостережень за процесом епітелізації дозованої травми рогової оболонки під впливом різних концентрацій даларгіну і “Вермілату” найбільш ефективними визначені: для даларгіну -1000 мкг/мл, для “Вермілату”- 0,1 мкг/мл. Диниміка швидкості епітелізації травмованої рогівки з використанням поліпептидних препаратів у різних концентраціях наведені на рисунку 1.2.

Рис.1. Динаміка швидкості епітелізації рани рогівки з використанням даларгіну в різних концентраціях. По осі абсцис – дні спостережень, по осі ординат – швидкість епітелізації (у мм2/день).

Рис.2. Динаміка швидкості епітелізації рани рогівки з використанням “Вермілату” в різних концентраціях.

По осі абсцис – дні спостережень, по осі ординат – швидкість епітелізації (у мм2/день).

Вивчення швидкості епітелізації рогової оболонки під впливом оптимальних терапевтичних концентрацій поліпептидних препаратів на моделі експериментальної глибокої кератоектомії виявило, що порівняно з дією солкосерилу, фізіологічного розчину відновлення епітеліального шару настає швидше при використанні поліпептидних препаратів (табл. 1).

Як свідчать експериментальні дані, під впливом даларгіну і “Вермілату” епітелізація завершилася, в середньому, відповідно через 28,95±0,45 годин (р<0,001), та 29,4±0,26 годин (р<0,001), проти 51,50,06 годин при використанні солкосерилу і 69,60,75 годин у контролі. Зникнення запальної реакції переднього відділу ока у тварин, які отримували поліпептидні препарати , відзначено на 3,1±0,2 добу, що в 3 рази швидше, ніж у групі, де препарати не застосовувалися (10,9±0,2 доба). Зникнення цих симптомів у тварин, які одержували загальноприйняте лікування, відбувалося на 6,08±0,3 добу (р<0,05).

Як показали наші дослідження, під час розвитку регенераторних епітеліальних процесів у рогівці ока кролика контрольної групи виявилось зниження рівня фібронектину (р<0,05). В експериментальній групі з солкосерилом експресія фібронектину визначалася як помірна.

Після дії поліпептиднних препаратів більш швидка епітелізація пошкодженого ока рогівки пов`язана зі значним підвищенням рівня фібронектину, який визначає репарацію тканин. Так, на 3 добу у цій дослідній групі накопичення фібронектину були виразні, цитоархітектоніка епітеліального шару відповідала нормальному епітелію, рубцевих змін підлеглій стромі не спостерігалось. Отримані дані підтверджуються кількісною характеристикою змін тканинного фібронектину: збільшення зерен продукту в одиницях поля зору під мікроскопом майже у 2,5 рази порівняно з контролем (р<0,05). На стадії клінічного одужання поліпептидні препарати сприяють стабільно високому рівню змісту глікозаміногліканів (у 2 рази вищий порівняно з контролем, р<0,05), що підтверджується змінами мікроструктур у клітинах переднього епітелію, які забезпечують синтез глікозаміногліканів. Співвідношення компонентів реалізації епітелізації дефектів рогівки представлено на гістограмі (рис. 3).

Таким чином, з огляду на отримані нами регуляторні дії поліпептидних препаратів, можна припустити, що глікозаміноглікани і фібронектин є практично, визначальними факторами адгезії клітин до субстрату. Пептидергічна регуляція гістогенезу через корекцію рівня фібронектину значною мірою визначає адекватність репаративних процесів тканин.

Таблиця 1

Вплив поліпептидних препаратів на швидкість ( мм2) регенерації рогівки

при травматичному її пошкодженні

Групи | Вихідна площи-на рани (мм2) | Площина рани через (години) | Середній термін епітелиза-ції (години) | 12 | 24 | 36 | 48 | 60 | 72 | 84 | 96 | 120 | 144 | (Даларгін 1000 мкг/мл в п/б ін‘єкціях)

(n = 10) | 50 | M

m | 21,3 ± 0,5 | 10,6 ± 0,5 | 6,4 ± 0,1

1,8 ±

0,1 | 0,4 ± 0,3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 28,95 ±

0,45

p<0,01

p*<0,001 | Вермілат 0,1 (мкг/мл в п/б ін‘єкціях)

(n = 10) | 50 | M

m | 27,3 ± 1,2 |

16,5 ± 0,3 |

8,7 ± 0,4 |

4,8±

0,1 |

2,5 ±

0,3 |

0,5 ± 0,1 |

0 |

0 |

0 |

0 |

29,4 ±

0,26

p<0,01

p*<0,001 | (Солкосеріл п/б) (n = 5) | 50 | M

m | 32,4 ± 0,3 |

19,1 ± 0,5 |

11,3 ± 0,1 |

5,3±

0,3 |

2,1 ±

0,2 |

1,2 ± 0,3 |

0 |

0 |

0 |

0 |

51,5 ±

0,06

p<0,01 |

III (контроль)

(n = 5) | 50 | M

m | 48,7 ± 0,8 |

36,7 ± 0,8 |

25,5 ± 0,4 |

14,2 ± 0,9 |

8,6 ± 0,2 |

5,6 ± 0,6 |

2,5 ± 0,1 |

1,7 ± 0,1 |

0,8 ± 0,1 |

0 | 69,6 ±

0,75 |

Примітка: р – рівень значимості між підгрупами основної групи і контролем;

Р* - рівень значимості різниці між підгрупами основної групи.

Клінічні спостереження за станом очей інтактних кролів протягом місячного застосування інстиляцій даларгіну та “Вермілату” у відповідних дозах (1000мкг/мл, 0,1мкг/мл), а також парабульбарних ін`єкцій і за допомогою електрофорезу (протягом 7 днів) не виявили негативної дії на оболонки ока, оптичні середовища, сітківку, а також на внутрішньоочний тиск. Отримані клінічні спостереження підтверджені гістоморфологічним вивченням стану вказаних тканин ока, в яких також не було виявлено патологічних ознак.

Показники, що характеризують стан мікроциркуляторного і коагуляційного гемостазу вірогідно нормалізувалися уже на 3-4 добу після травми порівняно з контролем (p<0,05).

Проведені нами експериментальні дослідження обґрунтували можливість застосування вітчизняного, комерційно доступного поліпептидного препарату даларгіну у лікуванні травматичних пошкоджень рогової оболонки різного ступеня виразності.

Ми вперше проводили аналіз клінічних результатів лікування хворих із травматичними ушкодженнями рогівки, які отримували даларгін у концентрації 1000 мкг/мл, у вигляді парабульбарних ін`єкцій або за допомогою електрофорезу, в залежно від ступеня важкості процесу. Одержані результати порівняні з даними загальноприйнятого комплексного лікування хворих, під час якокого даларгін не застосовувався.

а)

б)

Рис.3. Гістограми співвідношення компонентів реалізації епітелізації дефектів рогівки впродовж терміну дослідження (а — контроль, б — дослід).

Примітка: ось абсцис – час після кератоектомії (доба), ось ординат – проценти співвідношення компонентів до загальної товщини рогівки.

Порівняльний аналіз показав, що використання розчину даларгіну в концентрації 1000 мкг/мл у комплексному лікуванні хворих із травматичними пошкодженнями рогівки, суттєво скорочує строки зникнення запальної реакції переднього відділу ока та епітелізації рогівки, зменшує кількість ускладнень, сприяє підвищенню гостроти зору(табл.2).

Таблиця 2

Порівняльна оцінка ефективності даларгіну в комплексній терапії хворих із травматичними ушкодженнями рогової оболонки

Основні ознаки, дні | S | Основна група (n=60) | Контрольна група (n=30) | P

Епітелізація | M

m

S | 3,5

0,34

1,8 | 7,78

0,36

3,7 | p<0,05

Резорбція інфільтратів | M

m

S | 4,9

0,8

2,5 | 8,63

0,75

2,8 | p<0,05 | Ліквідація симптомів запалення | M

m

S | 7,0

0,68

3,4 | 9,8

0,25

5,8 | p<0,05

Відновлення чутливості рогівки | M

m

S | 6,6

0,4

3,8 | 10,9

0,2

4,5 | p<0,01 | Клінічне одужання, ліжко/день. | M

m

S | 6,62

0,2

2,1 | 11,0

0,2

0,1 | p<0,01

Примітка: вірогідність значень при p<0,05.

Так, в основній групі, що отримувала даларгін як монопрепарат при поверхневих ураженнях рогівки і за допомогою електрофорезу на фоні комплексної терапії при глибоких травматичних пошкодженнях, епітелізація наставала на 3,5±0,34 добу, проти контрольної групи - 7,78±0,36 день (р<0,05), резорбція інфільтрату відбувалася на 4,9±0,8 (р<0,05) день, проти 8,63±0,75 доби, клінічне одужання спостерігали на 6,62±0,2 день, проти 11,0±0,2 днів (p<0,01) у контрольній групі хворих. В результаті лікування запропонованим способом термін перебування хворих у стаціонарі зменшився в середньому на 3,5 дня.

Прискорення строків регенерації і рання ліквідація запалення переднього відділу ока сприяли формуванню більш ніжних помутнінь чи повної їх відсутності, що позитивно вплинуло на відновлення гостроти зору. Після лікування динаміка відновлення зорових функцій основної та контрольної груп залежала від локалізації та характеру ушкодження (оптична та параоптична зони). У процесі лікування хворі всіх груп відзначали поступове відновлення гостроти зору. При пошкодженнях рогівки легкого ступеня гострота зору 0,5-1,0 склала 85,5%, проти 55,5% у контрольній групі. У хворих із значними глибокими травмами рогової оболонки гострота зору 0,5-1,0 спостерігалася у 68,9% випадкив проти 31,1% випадків у хворих, які одержували традиційне лікування.

Застосування даларгіну в комплексній терапії травматичних пошкоджень дало змогу зменшити кількість ускладнень і рецидивів ерозій рогової оболонки, а також сприяло формуванню прозорої рогівки. Згідно з отриманими даними, у хворих, які одержували даларгін як самостійний препарат, у 26 (86,6%) хворих наступало повне одужання з відновленням прозорості рогівки. Ніжні хмароподібні помутніння сформувалися у 4 (13,3%) хворих. Одужання в групі хворих, які одержували даларгін у сполученні з електрофорезом, наступало у 23 (69,6%) хворих. Наслідки пошкодження у вигляді хмароподібного помутніння спостерігались у 9 (27,2%) хворих і призвели до досить грубого рубцювання на місці глибоких інфільтратів у 1 (3%) хворого, з великим терміном захворювання.

Необхідно відмітити, що місцеве застосування даларгіну в концентрації 1000 мкг/мл, як при парабульбарному введенні, так і за допомогою електрофорезу, добре переноситься хворими і в жодному випадку ми не спостерігали загострення процесу або алергічну реакцію.

Отримані позитивні результати в лікуванні хворих базуються, по нашим даними, на змінах у системі мікроциркуляторного та коагуляційного гемостазу. Відзначено, що більш глибокі системні порушення спостерігалися в результаті глибоких травм рогової оболонки, при яких було виявлено зниження рівня сироваткового фібронектину(265,3528,32мкг/мл при 343,2541,20мкг/мл у контролі,р<0,05),зменшення агрегаційних властивостей тромбоцитів за всіма показниками,що практично не змінювалися після традиційних методів лікування. Більше вираженими у даній групі були і зміни в системі зсідання крові, а саме, спостерігалося зниження рівня антитромбіну ІІІ, подовження протромбінового часу та фібрінолізу. Під впливом запропонованого лікування відбулося відновлення більшості змінених показників до вихідного рівня (р< 0,05).

Таким чином, нами отримані докази участі системи гемостазу (місцевого та загального) у репаративних процесах при епітеліально-стромальних порушеннях рогової оболонки та пептидергічного механізму регуляції цих процесів через корекцію рівня експресії тканинного фібронектину.

Значною мірою такі зміни гемостазу пов'язані із властивостю поліпептидів послаблювати перебіг запального процесу і забезпечувати більш швидку регенерацію тканин.Виявлені дані підтверджують дію поліпептидних препаратів як коректора метаболізму сполучної тканини, протектора процесів міжклітинної кооперації,який сприяє процесам епітелізації з протизапальним ефектом.Крім того,отримані данні свідчать про те,що пептидні речовини (даларгін і „Вермілат”) відіграють важливу роль у регуляції гемостазу як патогенетичного фактора розвитку стромально-епітеліальних порушень рогової оболонки.

Порівняльний аналіз динаміки лікування аналогічних форм ураження рогової оболонки показав, що ефективність принципово нового методу лікування з використанням поліпептидних препаратів не поступається відомим схемам комбінованої терапії травматичних пошкоджень.

Застосування даларгіну у комплексі з традиційними методами дало змогу отримати виражений клінічний ефект:скорочення терміну лікування хворих на 3,5 дня, високу терапевтичну ефективність, яка становить 91,3% .

Все це стає підґрунтям для більш широкого впровадження даларгіну в офтальмологічну практику.

Знайдені ефекти пептидного комлексу „Вермілат” дозволяють рекомендувати подальше його вивчення як потенційного лікарського препарату.

ВИСНОВКИ

1. Травма рогової оболонки є одним із найбільш важких захворювань органа зору, внаслідок чого порушується структура тканин рогівки, що призводить до інвалідності майже у 25,6% випадків щодо загальної кількості захворювань очей. Проблема лікування хворих на травматичні пошкодження рогівки, є актуальною і своєчасною тому, що не знайшла свого повного розв,язання,у зв,зку з відсутністю наукових даних про особливості порушень у системі гемостазу в осередку запалення,відсутністю патогенетично орієнтованої корекції цих порушень,що свідчить про необхідність розробки нових більш ефективних методів лікування цієї патології.

2. Експериментально-клінічні дослідження показали, що оптимальною терапевтичною концентрацією преаратів для лікування травматичних пошкоджень рогової оболонки, на експериментальній моделі поверхневої та глибокої кератоектомії, є: для даларгіну - 1000 мкг/мл, “Вермілату”- 0,1мкг/мл.

3. На основі даних експериментальних досліджень встановлено, що даларгін і “Вермілат”, не мають токсичного і алергічного впливу на інтактне око при довготривалому місцевому їх застосуванні.

4. Запропонований новий спосіб об`єктивного виявлення прихованих дефектів рогової оболонки при травматичних її пошкодженнях тетрацикліновий тест - дозволяє в динаміці кількісно визначити площу та глибину ураження рогівки, що дає можливість судити про ефективність лікування.

5. Шляхом експерименту на кролях, на моделях епітеліально-стромального дефекту встановлено, що поліпептидні препарати вдвічі прискорюють процеси епітелізації, термін ліквідації запалення, резорбції інфільтрату, тривалість клінічних симптомів.

6. Вперше виявлено, що поліпептидні комплекси стимулюють у 2,5 рази (порівняно з контролем) експресію структурного фібронектину на тлі стабільно високого рівня глікозаміногліканів, нормалізуючи стан тканин у процесі розвитку епітеліально-стромальних порушень рогівки ока, що можна вважати за прогностичний тест репарації.

7. Пептидні речовини відіграють важливу роль у регуляції гемостазу: нормалізують рівень сироваткового фібронектину, а також, показники мікроциркуляторного та коагуляційного гемостазу.

8. Даларгін у комплексному лікуванні травматичних пошкоджень рогівки при поверхневих формах, у вигляді парабульбарних ін`єкцій і глибоких формах, у вигляді поєднань з електрофорезом у дозі 1000 мкг/мл , швидше ліквідує запалення і скорочує строки лікування хворих на 3,5 дня, порівняно з традиційною терапією.

9. На основі експериментальних та клінічних досліджень запропоновані раціональні та доступні схеми застосування вітчизняного препарату даларгіну, терапевтична ефективність якого в комплексному лікуванні травматичних пошкоджень рогівки становить 91,3%.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Максакова Е.В. Применение препаратов полипептидной природы в офтальмологии // Проблемы экологии и медицины. – 1999. – Т. 3, № 5. – С.42 - 45.

2. Максакова Е.В. Даларгин в лечении травматических повреждений роговицы // Офтальмологический журнал. – 2000.– № 6. – С.95- 97.

3. Воскресенская Л.К., Корниенко В.В., Максакова Е.В. Ферменты фибринолитической системы в патогенезе травматических повреждений роговицы // Проблемы экологии и медицины. – 2001.– Т. 5, № 3-4. – С.23-24.

4. Максакова О.В. Даларгін – електрофорез у лікуванні травматичних ушкоджень рогової оболонки // Галицький лікарський вісник. – 2001.– № 2. – С. 100-101.

5. Максакова Е.В. Эффективность применения пептидного биорегулятора даларгина в комплексном лечении травматических повреждений роговицы // Офтальмологический журнал. – 2002. – № 2. – С.31 – 33.

6. Патент 33293 А Україна, UA 6 A 61К 38/00. Спосіб лікування травматичних ушкоджень рогової оболонки / Максакова О.В., Корнієнко В.В. – № 99020704; Заявл. 9.02.1999; Опубл. 15.02.2001; Промислова власність. Офіційний бюлетень №1. – С.159.

7. Патент 33300 А Україна, UA 6 А 61В 3/00. Спосіб діагностики прихованих дефектів рогової оболонки ока різного походження / Максакова О.В., Корнієнко В.В.- № 99020725; Заявл. 09.021999; Опубл. 15.02.2001; Промислова власність. Офіційний бюллетень № 1. – С. 120.

8. Максакова Е.В. Влияние полипептидного комплекса “Вермилат” на репаративную регенерацию роговичных тканей // Национальна конференция с международно участие по случай 70 години Българско дружества по офтальмология “Новости в офтальмологията”. – София, 1997. – С.61 - 64.

9. Максакова Е.В., Корниенко В.В. Новый прогностичекий тест в лечении ожогов роговицы // Тезисы докладов Международной конференции офтальмологов, посвященной 90-летию Н.А.Пучковской. – Одесса-Генуя, 1998. – С. 141- 143.

10. Максакова Е.В., Воскресенская Л.В., Корниенко В.В. Эффективность применения пептидного биорегулятора для лечения травматических кератитов // Тезисы докладов Международной конференции, посвященной 125- летию с дня рождения акад. В.П.Филатова. – Одесса, 2000. – С. 5 - 6.

11. Максакова Е.В. Доказательства реализации стимулирующего действия даларгина на репарацию роговицы // Тези доповідей Х з`їзду офтальмологів України. – Одеса. -2002. – С.47.

12. Максакова Е.В., Воскресенская Л.К. Роль фибронектина и гликозаминогликанов в патогенезе реэпителизации роговицы // Актуальні проблеми сучасної медицини.– Полтава, 2002. – Т.2. –Вип.2 (4). - С. 29-31.

АНОТАЦІЯ

Максакова О.В. Терапевтична ефективність поліпептидних препаратів у комплексній терапії травматичних пошкоджень рогової оболонки. — Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.18– очні хвороби.– Інститут очних хвороб і тканинної терапії ім. В.П.Філатова АМН України, Одеса, 2003.

Дисертація присвячена питанням підвищення ефективності лікування хворих на травматичні пошкодження рогової оболонки шляхом обгрунтованого використання поліпептидних препаратів (даларгіну) в їх комплексній терапії. Визначено оптимальні дози поліпептидних препаратів для клінічного застосування. Встановлено, що у тварин з дозованою травмою (поверхневою і глибокою) поліпептидні препарати впливають на процеси регенерації завдяки стимуляції ендогенного фібронектину на фоні стабільно високого рівня глікозаміногліканів. Експериментально та клінічно підтверджено пептидний механізм регуляції системи гемостазу та рівня адгезивних молекул сироватки при корекції епітеліально-стромальних порушень рогової оболонки. Розроблений спосіб лікування у вигляді парабульбарних введень даларгіну в дозі 1000 мкг/мл поліпшує якість лікування хворих на травматичні ушкодження рогівки: скорочує термін лікування на 3,5 дні порівняно з традиційною терапією, дає змогу досягти клінічного одужання у 91,3% хворих, що підтверджує його клінічну ефективність.

Ключові слова: фібронектин, гемостаз, травматичні пошкодження рогівки, пептидергічна регуляція.

АННОТАЦИЯ

Максакова Е.В. Терапевтическая эффективность полипептидных препаратов в комплексной терапии травматических повреждений роговой оболочки. — Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.18 – глазные болезни. — Институт глазных болезней и тканевой терапии им. В.П. Филатова АМН Украины, Одесса, 2003.

Диссертация посвящена вопросам повышения эффективности лечения больных травматическими кератитами путём обоснованного применения полипептидного препарата даларгина в их комплексной терапии. Работа базируется на экспериментальных и клинических исследованиях. Впервые в условиях эксперимента на моделях частичной и глубокой кератоэктомий изучена эффективность полипептидных препаратов (даларгина и “Вермилата”) как корректоров метаболизма соединительной ткани с противовоспалительным, регенераторным действием. Отечественный синтетический аналог лей-енкефалина даларгин разрешен к применению Фармкомитетом Украины в 1996 году (регистрационное свидетельство П/96/376/9). Медицинский препарат „Вермилат” получен в Украинской медицинской стоматологической академии (патент Украины № 5743) путем экстракции из ткани кольчатых червей Eishenia foetida, представляет собой комплекс биологически активных пептидов, моллекулярной массой 10kD.В результате экспериментальных исследований установлено, что введение даларгина в дозе 1000 мкг/мл и “Вермилата” в дозе 0,1 мкг/мл толерантно переносится структурами глаза.В проведенных сериях эксперимента подтверждено действие полипептидных препаратов как корректоров метаболизма соединительной ткани, их положительное влияние на процессы эпителизации и межклеточного взаимодействия за счет стимуляции выработки эндогенного структурного фибронектина на фоне стабильно высокого уровня гликозаминогликанов при травматических повреждениях роговицы. Экспериментально и клинически подтвержден пептидный механизм регуляции системы гемостаза и уровня адгезивных молекул сыворотки при коррекции эпителиально-стромальных нарушений роговой оболочки.В ходе эксперимента был впервые разработан и применен объективный способ оценки глубины и площади изъязвления роговицы с помощью тетрациклинового теста ( патент №99020704). Проведенные клинические исследования подтвердили эффективность применения даларгина для лечения больных с травматическими повреждениями роговицы как монопрепарата при поверхностных повреждениях и в комплексной терапии в сочетании с электрофорезом (патент № 990207245).Установлено, что применение даларгина эффективно в 91,3% случаев при сокращении сроков лечения больных на 3-5дня по сравнению с другими способами лечения. Основные результаты работы, такие, как оценка уровня тканевого фибронектина при нарушениях межклеточных взаимодействий при травматических повреждениях роговицы, внедрены в научно-исследовательскую работу и педагогический процесс на теоретических и клинических кафедрах УМСА.

Ключевые слова: фибронектин, гемостаз, травматические повреждения роговицы, пептидная регуляция.

ANNOTATION

Maksakova E.V. Therapeutic efficiency of peptide remedies in the complex therapy of traumatic injuries of the cornea. – Manuscript.

Thesis for the candidate’s degree by speciality 14.01.18 – Eye Diseases. – The Filatov Institute of Eye Diseases and Tissue Therapy, Academy of Medical Sciences of Ukraine, Odessa, 2003.

There was studied the possibility of using of polypeptide remedy dalargin in the complex therapy of the cornea traumatic injuries. Clinical and histologycal studies showed absence of toxic effect of the remedy on the structures of intact eyes of the rabbits. By its chemical composition, dalargin is related to hexapeptide opoids and is one of the synthetic analogues of leukineenkephaline and biological complex “Vermilat”. There was studied the condition of the pathologic process without treatment on the background of conventional therapy and in using dalargin as drops and its subconjunctival injections. Experimentally and clinically there was proved that peptic mechanism of regulation of the hemostasis system and the level of adhesive molecules of serum in correction of epithelium – stromal violations of the cornea. There was given a comparative assessment of the results after treatment of 90 patients, divided into three groups (in group I dalargin was given in injection into the cojunctiva, in group II – dalargin was given with electrophoresis, group III – was a control