АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ГЕРОНТОЛОГІЇ АМН УКРАЇНИ

НОЖИНОВА ОКСАНА АНАТОЛІЇВНА

УДК: 615.36:612.112.94

ВПЛИВ ПЕПТИДНОГО КОМПЛЕКСУ ТИМУСА – ТИМАЛІНУ

ТА ПРИРОДНОГО ПЕПТИДНОГО КОМПЛЕКСУ НИРОК

НА ПРОЦЕСИ АПОПТОЗУ ЛІМФОЦИТІВ ПЕРИФЕРІЙНОЇ КРОВІ ЗА ФІЗІОЛОГІЧНИХ УМОВ ТА МОДУЛЯЦІЇ АКТИВНОСТІ

ЇХ ВНУТРІШНЬОКЛІТИННИХ РЕГУЛЯТОРНИХ СИСТЕМ

14.03.03 – нормальна фізіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ - 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Центральній науково-дослідній лабораторії Української медичної стоматологічної академії, м.Полтава

Науковий керівник доктор медичних наук, професор

Кайдашев Ігор Петрович

завідувач Центральної науково- дослідної лабораторії,

завідувач кафедри внутрішніх хвороб з доглядом за

хворими Української медичної стоматологічної

академії

Офіційні опоненти:

-

завідувач кафедри нормальної фізіології, Українська медична стоматологічна академія;

-

Провідна установа: Національний медичний університет імені О.О. Богомольця Міністерства охорони здоров’я, кафедра клінічної імунології, м.Київ

Захист відбудеться “15” травня 2003 року о 1100 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 26.551.01 при Інституті геронтології АМН України за адресою: 04114, м. Київ, вул. Вишгородська, 67

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту геронтології АМН України (04114, м. Київ, вул. Вишгородська, 67).

Автореферат розісланий “14” квітня 2003 року.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради,

кандидат медичних наук Потапенко Р.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. На теперішній час однією з ключових проблем сучасної медицини є вивчення механізмів біорегуляції, що є складним комплексом міжклітинних взаємодій, які спрямовані на підтримку гомеостазу і відповідають за проходження таких важливих фізіологічних процесів, як диференціювання й поділ клітин, регенерація тканин, розвиток і старіння організму, обмін і відтворення генетичної інформації [Кузник Б.И. и соавт., 1999; Стадников А.А. и соавт., 2000; Хавинсон В.Х. и соавт., 2000; Турчанинова Л.И. и соавт., 2000].

У підтримці кількісного гомеостазу тканин, що постійно оновлюються (регенерують), поряд із процесами проліферації й диференціювання велику роль відіграє природна, програмована загибель клітин, що отримала назву апоптоз [Kerr et all., 1972; Afford S. et all., 2000; Дьяченко А.А., Дьяченко А.Г., 2001].

Як показали результати багатьох досліджень, апоптоз має велике значення в процесах, що забезпечують нормальний розвиток та функціонування клітин імунної системи, а порушення процесів клітинної загибелі може приводити до виникнення патологічних станів і захворювань, що супроводжуються дегенеративними та проліферативними змінами. [Qnishi J. Et all, 1997; Чехун В.Ф., 1999; Райхлин Н.Т., Райхлин А.Н., 2002]. Серед захворювань, в патогенезі яких апоптоз відіграє важливу роль, слід виділити: аутоімунні процеси, імунодефіцити, злоякісні пухлини, інфекційні (бактеріальні) захворювання, вірусні інфекції [Кайдашев И.П., 1998; Сепиашвили Р.Н., и др., 2000; Швембергер И.Н., Гинкул И.Н., 2002].

Останнім часом ведуться широкі дослідження, що присвячені вивченню механізмів дії і терапевтичних ефектів групи речовин поліпептидної природи, що виділені з різних тканин тваринного організму та об'єднані під назвою цитомединів. Використання пептидних речовин є перспективним шляхом модуляції процесів апоптозу клітин різних тканин та органів. Існують поодинокі відомості про використання пептидів для індукції [Wei C.H., et all, 1998; Никонова М.Ф., Григорьева Т.Ю. и др., 2000] або інгібування [Никонова М.Ф. и др., 1999; Бобро Л.И., Гриневич Ю.А., 1999] апоптозу лімфоїдних клітин, індукції апоптозу пухлинних клітин [Ellerby H.M.et all, 1999]. Але головне питання механізму дії тканинних пептидів ще далеке від свого завершення. Виходячи з цього, доцільним було б привернути увагу до участі в регуляції процесів апоптозу тканинних регуляторних пептидів із низькою молекулярною масою й пептидів головного комплексу гістосумісності.

Враховуючи тісний зв’язок між функціонуванням клітин імунної системи та участю пептидних речовин центрального та периферійного походження у їх регуляції [Кайдашев І.П., 1991-2002, Весніна Л.Е., 2000, Гейко О.О., 1999], а також важливу роль апоптозу в забезпеченні життєдіяльності імунокомпетентних клітин, питання його регуляції за допомогою тканинних пептидів є важливим не тільки з теоретичної точки зору, але й у дослідженні патогенезу імунних захворювань та в плані розробки нових методів їх терапії.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота є фрагментом науково-дослідної роботи МОЗ України “Пептидна регуляція процесів апоптозу за участю органних пептидних комплексів” № 0198U002719.

Мета та завдання дослідження. Мета роботи полягає у вивченні регуляції процесів апоптозу лімфоцитів периферійної крові комплексами пептидів тимуса та нирок за фізіологічних умов та модуляції активності їх внутрішньоклітинних регуляторних систем для поглиблення знань про фізіологічну регуляцію клітин імунної системи.

У відповідності з метою роботи були висунуті наступні задачі:

1. Вивчити вплив комплексу пептидів тимуса – тималіну та природного пептидного комплексу нирок на процеси апоптозу лімфоцитів периферійної крові за фізіологічних умов.

2. Вивчити вплив комплексу пептидів тимуса – тималіну та природного пептидного комплексу нирок на процеси апоптозу лімфоцитів периферійної крові за умов модулювання активності кальцієвої регуляторної системи.

3. Вивчити дію комплексу пептидів тимуса – тималіну та природного пептидного комплексу нирок на процеси апоптозу лімфоцитів периферійної крові, що викликані глюкокортикоїдами.

4. Вивчити вплив комплексу пептидів тимуса – тималіну та природного пептидного комплексу нирок на процеси апоптозу лімфоцитів периферійної крові при активації протеїнкінази С, накопичення в клітинах цАМФ.

5. Вивчити дію комплексу пептидів тимуса – тималіну та природного пептидного комплексу нирок на процеси апоптозу трансформованих лімфоїдних клітин.

Об’єкт дослідження – пептидна регуляція процесів апоптозу лімфоїдних клітин.

Предмет дослідження - регуляція процесів апоптозу лімфоцитів периферійної крові комплексом пептидів тимуса – тималіном та природним пептидним комплексом нирок (ППКН) за фізіологічних умов та модуляції активності їх внутрішньоклітинних регуляторних систем.

Методи дослідження. З метою виконання поставлених задач використовували індуктори та інгібітори для моделювання процесів апоптозу. Були використані методи досліджень, що характеризують процеси апоптозу, у відповідності до стадій його розвитку: морфологічні, імуноцитохімічні, молекулярно-біологічні. Можливі шляхи трансдукції сигналу досліджували із застосуванням методу імуноблотингу.

Наукова новизна одержаних результатів. Отримані нові результати, що свідчать про участь тималіну і природного пептидного комплексу нирок у регуляції підтримки кількісного гомеостазу тканин, що забезпечується завдяки процесам проліферації, диференціювання та апоптозу.

Уперше розкрита роль пептидних комплексів тимуса та нирок, до складу яких входять пептиди головного комплексу гістосумісності, в регуляції процесів апоптозу лімфоцитів периферійної крові. Отримані нові підтвердження необхідності комплексного підходу до вивчення процесів апоптозу лімфоїдних клітин з урахуванням стадій та особливостей їх розвитку в окремих популяціях клітин. Отримані нові дані, що пептиди тимуса та нирок в умовах моделювання індукції процесів апоптозу підвищують експресію bcl-2 та знижують рівень апоптозу неактивованих та активованих лімфоцитів периферійної крові. Уперше доведено, що пептидні комплекси тимуса та нирок здатні підсилювати апоптоз трансформованих лімфоїдних клітин, переважно Т-клітин.

Уперше показано, що трансдукція сигналу під дією тималіну і природного пептидного комплексу нирок може здійснюватися через молекули головного комплексу гістосумісності I – класу, що пов’язано з процесами фосфорилювання асоційованих із ними білків. Показана участь іонів кальцію в реалізації ефектів пептидних комплексів.

Отримані нові дані демонструють наявність у пептидів тимуса та нирок загального механізму дії, що підтверджує концепцію поліфункціональності кожного регуляторного пептиду й забезпечення однієї і тієї ж функції великим числом різних регуляторних пептидів [Ашмарин И.П., Ковалева С.В., 2002].

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати можуть бути використані для розширення сфери застосування тималіну в клінічній практиці та показують перспективність використання ППКН як лікарської речовини. Завдяки проведеним дослідженням отримані нові дані про фармакологічну активність речовин. Наявність проапоптотичних властивостей дексаметазону і теофіліну на лімфоцити периферійної крові необхідно враховувати при використанні їх у лікарській практиці. Розроблено спосіб тестування імунотропної активності пептидних препаратів на основі досліджень процесів апоптозу, отримано патент на винахід.

Результати роботи використовуються при викладанні лекційного курсу й у проведенні лабораторних занять на кафедрах нормальної фізіології, біохімії Української медичної стоматологічної академії.

Особистий внесок автора. Автор особисто розробив програму наукових досліджень, виконав молекулярно-біологічні та морфологічні методи дослідження. Самостійно провів аналіз усього отриманого ним фактичного матеріалу. Розробка основних положень і висновків роботи також належить дисертантові. Подяка молодшому науковому співробітникові Центральної науково-дослідної лабораторії Української медичної стоматологічної академії Рябенко В.В. за допомогу в проведенні імуногістохімічних досліджень.

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи повідомлені на конференції молодих учених “Фізіологія й патологія перекисного окислення ліпідів, гемостазу та імуногенезу” Української медичної стоматологічної академії (1998 та 1999); на IV Міжнародному конгресі студентів і молодих учених (м. Тернопіль, 2000); на XIX Конгресі Європейскої Академії алергології і клінічної імунології (м. Ліссабон, Португалія, 2000); на III З’їзді Імунологів і Алергологів СНГ (м. Сочі, Росія, 2000); на V Науково-практичній конференції “Актуальні питання алергології, клінічної і лабораторної імунології” (м.Київ, 2000); на XX Конгресі Європейської Академії Алергології та Клінічної Імунології (Берлін, Німеччина, 2001); на IV з’їзді імунологів та алергологів СНГ (м.Москва, Росія, 2001); на 58-му Щорічному з’їзді Американської Академії Алергології, Астми та Імунології (м. Нью-Йорк, США, 2002); на XI звітно-виборній та науково-практичній конференції Українського товариства фахівців з імунології, алергології та імунореабілітації (м. Київ, 2002); на Центральній і Східно-Європейській Конференції ”Алергія. Астма. Імунологія.” (м.Лодзь,Польща, 2002).

Публікації. За темою дисертації надруковано: 6 – статей у журналах (5 у фахових виданнях), 9 - тез доповідей, отримано деклараційний патент на винахід.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 143 сторінках друкованого тексту і складається з вступу, огляду літератури, розділу “Матеріали і методи досліджень”, 4 розділів власних досліджень, обговорення отриманих результатів, висновків, списку використаних джерел та додатку.

Робота містить 19 таблиць, 14 малюнків і 13 фото. Список літератури містить 109 вітчизняних робіт і 96 робіт іноземних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Для вирішення поставлених задач були проведені експериментальні дослідження на крові донорів віком 25-31 рік, лініях клітин HPB-ALL (Т-клітинний гострий лімфобласний лейкоз) і BJAB (лімфома Беркіта) та на 24 білих статевозрілих мишах лінії BALB/c масою 15-25 г.

Для дослідження впливу комплексу пептидів тимуса – тималіну (Россия, Санкт-Петербург, ЗМП) та природного пептидного комплексу нирок на процеси апоптозу лімфоцитів периферійної крові за фізіологічних умов тварин було розділено на такі групи: 1 група – інтактна; 2 – контрольна (тваринам внутрішньом'язово вводили 0,05 мл стерильного фізіологічного розчину натрію хлориду); 3 та 4 групи – дослідні (тваринам внутрішньом'язово вводили 0,1 мг/кг тималіну та 0,1 мг/кг ППКН відповідно протягом 5 днів). Кров тварин забирали шляхом декапітації під ефірним наркозом.

Для подальшого вивчення дії тималіну та ППКН на процеси апоптозу дослідження проводили на лімфоцитах периферійної крові донорів.

Суспензію лімфоцитів отримували шляхом інкубації при 370С протягом 1 години з додаванням 1,8% розчину декстрану (Fluka) у співвідношенні 2:1, із наступною дворазовою відмивкою фізіологічним розчином (15 М NaCl) та подальшим ресуспензуванням. Кількість клітин у суспензії, при підрахунку [Меньшиков В.В.,1987] у камері Горяєва складала в середньому 4-7х106/мл клітин.

На наступному етапі дослідження суспензію клітин інкубували в середовищі RPMI-1640 (Gibco BRL) із додаванням 10% ембріональної телячої сироватки (BioMark), 10 мМ HEPES (SIGMA, USA) і 100 мкг/мл гентаміцину сульфату ( ГНЦЛС, Україна) при 370С протягом 24 годин.

З метою поглибленого вивчення молекулярних механізмів дії пептидного комплексу тимуса – тималіну і ППКН на процеси апоптозу лімфоцитів периферійної крові за фізіологічних умов та модуляції активності їх внутрішньоклітинних регуляторних систем нами були проведені дослідження in vitro у модельних дослідах, що узагальнені в таблиці 1.

Таблиця 1

Схема дослідів

№ серії | Експериментальна модель | Кінцева концентрація речовин на 1 мл суспензії клітин

1 | 2 | 3

1 | Дія тималіну і ППКН за фізіологічних умов:

Контрольні клітини (інкубація 24 години) (n=6)

Клітини, оброблені тималіном (n=6)

Клітини, оброблені ППКН (n=6) |

0,12 мкг/мл тималін

0,12 мкг/мл ППКН

2 | Вплив тималіну і ППКН за умов зв’язування позаклітинного кальцію при дії ЕДТА

Контрольні клітини (інкубація 24 години) (n=6)

Клітини, оброблені ЕДТА (n=6)

Клітини, оброблені тималіном (n=6)

Клітини, оброблені ППКН (n=6)

Клітини, оброблені ЕДТА та тималіном (n=6)

Клітини, оброблені ЕДТА та ППКН (n=6) |

2,5 x 10-2 M ЕДТА

0,12 мкг/мл тималін

0,12 мкг/мл ППКН

2,5 x 10-2 M ЕДТА; 0,12 мкг/мл тималін;

2,5 x 10-2 M ЕДТА; 0,12 мкг/мл ППКН

3 | Вплив тималіну і ППКН за умов дії кальцієвого іонофору А 23187

Контрольні клітини (інкубація 24 години) (n=6)

Клітини, оброблені іонофором (n=6)

Клітини, оброблені тималіном (n=6)

Клітини, оброблені ППКН (n=6)

Клітини, оброблені іонофором та тималіном (n=6)

Клітини, оброблені іонофором та ППКН (n=6) |

2х10-7 М іонофор

0,12 мкг/мл тималін

0,12 мкг/мл ППКН

2х10-7 М іонофор; 0,12 мкг/мл тималін

2х10-7 М іонофор; 0,12 мкг/мл ППКН

4 | Вплив тималіну і ППКН за умов активації протеїнкінази С при дії ФМА

Контрольні клітини (інкубація 24 години) (n=6)

Клітини, оброблені ФМА (n=6)

Клітини, оброблені тималіном (n=6)

Клітини, оброблені ППКН (n=6)

Клітини, оброблені ФМА та тималіном (n=6)

Клітини, оброблені ФМА та ППКН (n=6) |

8х10-9 М ФМА

0,12 мкг/мл тималін

0,12 мкг/мл ППКН

8,1х10-9 М ФМА; 0,12 мкг/мл тималін

8,1х10-9 М ФМА; 0,12 мкг/мл ППКН

5 | Вплив тималіну і ППКН за умов накопичення в клітинах цАМФ при дії теофіліну

Контрольні клітини (інкубація 24 години) (n=6)

Клітини, оброблені теофіліном (n=6)

Клітини, оброблені тималіном (n=6)

Клітини, оброблені ППКН (n=6)

Клітини, оброблені теофіліном та тималіном (n=6)

Клітини, оброблені теофіліном та ППКН (n=6) |

10-3 М теофілін

0,12 мкг/мл тималін

0,12 мкг/мл ППКН

10-3 М теофілін; 0,12 мкг/мл тималін

10-3 М теофілін; 0,12 мкг/мл ППКН

6 | Вплив тималіну і ППКН за умов дії дексаметазону

Контрольні клітини (інкубація 24 години) (n=6)

Клітини, оброблені дексаметазоном (n=6)

Клітини, оброблені тималіном (n=6)

Клітини, оброблені ППКН (n=6)

Клітини, оброблені дексаметазоном та тималіном (n=6)

Клітини, оброблені дексаметазоном та ППКН (n=6) |

10-7М дексаметазон

0,12 мкг/мл тималін

0,12 мкг/мл ППКН

10-7М дексаметазон; 0,12 мкг/мл тималін

10-7М дексаметазон; 0,12 мкг/мл ППКН

З метою вивчення впливу тималіну на механізми активаційно-індукованого апоптозу лімфоцитів периферійної крові до суспензії клітин додавали фітогемаглютинін (ФГА) у дозі 10 мкг/мл та інкубували 72 години при 370С. Групування дослідів, кінцева концентрація обох пептидів і речовин індукторів та інгібіторів процесів апоптозу, термін інкубації після їх внесення, аналогічні з даними, наведеними в таблиці 1. Додатковою контрольною групою були клітини, що інкубували в присутності ФГА 72 години.

Для вивчення ролі тималіну і ППКН на процеси апоптозу трансформованих клітин використовували лінію клітин HPB-ALL (Т-клітинний гострий лімфобласний лейкоз) і BJAB (лімфома Беркіта). Клітини культивували в середовищі RPMI-1640 із додаванням 10% ембріональної сироватки, 10мM HEPES і 100 мкг/мл гентаміцину. Обидва пептиди вносили до культурального середовища в дозах 0,01 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл і 10 мкг/мл та інкубували 24 години при 370С.

Дослідження можливих шляхів передачі пептидного сигналу проводили на лінії клітин HPB-ALL (Т-клітинний гострий лімфобласний лейкоз), що культивували, як описано вище. Використовували: мишачі моноклональні антитіла (мкАТ) анті-HLA-A,B,C у розведенні 1:25 (Інститут експериментальної патології, онкології й радіобіології ім. Кавецького НАН України, Київ), моноклональні антитіла до фосфотирозину (клон 4G10) (Upstate Biotechnology Inc., USA), в розведенні 1:500, кролячі антитіла до імуноглобулінів миші, мічені пероксидазою (DACO, Denmark), в розведенні 1:500. Пептидні комплекси тимуса і нирок вносили в інкубаційне середовище в дозі 0,5 мкг/мл і інкубували 6 та 12 годин при 370С.

Для виконання поставлених перед нами задач були використані методи, що характеризують процеси апоптозу у відповідності до стадій його розвитку.

Bcl-2, P53 і CD95-антигени виявляли авідін-біотин імунопероксидазним методом. [Hartmann K.-U., 1997]. Використовували моноклональні антитіла до Bcl-2 (IgG1, kappa, DAKO), CD95 (LT95, IgG1, Sorbent) і P53 білку (clon DO-7, subclass IgG2b, kappa, DAKO). Розраховували кількість клітин, що експресують CD95, P53, Bcl-2, як відсоток клітин із наявністю експресії CD95, P53, Bcl-2 на 100 лімфоцитів, що реєстрували за допомогою світлового мікроскопа “Біолам”. Оцінювали ступінь експресії CD95, P53, Bcl-2 за наявністю коричневих відкладень продуктів окисної полімеризації діамінобензидину у вигляді гранул. Розраховували середній цитохімічний коефіцієнт (СЦК) як показник ступеня експресії CD95, P53, Bcl-2 лімфоцитів периферійної крові..

Досліджували морфологічні зміни при апоптозі: гіперхромність ядер, конденсацію й фрагментацію хроматину [Nagata Y., Tsukinoki K, 1997]. Крім класичного забарвлення за Май-Грюнвальдом-Романовським [Клаус Дж., 1990] використовували також флуоресцентний “ядерний” барвник Hoechst 33342 [Belloc F. et all., 1994]. Флуоресценцію ядер лімфоцитів реєстрували за допомогою мікроскопу “Люмам-P-8” (Ломо, Росія). Розраховували кількість клітин з морфологічними ознаками апоптозу як відсоток клітин із наявністю фрагментації або конденсації хроматину на 100 лімфоцитів.

Проводили аналіз міжнуклеосомної фрагментації ДНК. ДНК із клітин виділяли за допомогою модифікованого фенол-хлороформного методу [Max E. et al., 1992] і аналізували методом електрофорезу в 1,8% агарозному гелі із візуалізацією результатів в ультрафіолетовому світлі в присутності етидіуму броміду [Noda H. et all, 1997].

Визначали кількість лімфоцитів периферійної крові в 1 мл суспензії [Меньшиков В.В.,1987]. Проводили диференціювання живих та мертвих клітин за допомогою забарвлення клітин барвником акридиновий оранжевий/етидіум бромід [Киселева Е.П. и соавт., 2000]. Підраховували кількість зелених (живих) і оранжевих (мертвих) клітин за допомогою флуоресцентного мікроскопа “Люмам-P-8” (Ломо, Росія) в ультрафіолетовому світлі та видимій частині спектру. Розраховували кількість мертвих і живих клітин як відсоток клітин із наявністю оранжевого й зеленого забарвлення відповідно на 100 клітин.

Визначення можливих шляхів передачі пептидного сигналу досліджували з використанням методу імуноблотінга [Lefkovits Ed.I., 1997].

Отриманий цифровий матеріал був статистично оброблений на мікрокалькуляторі CITIZEN scintific calculator SR-135 та ПЕОМ ІВМ AuthenticAMD із використанням стандартної програми STATISTICA. Проводили обчислення середньої арифметичної (М), середньоквадратичного відхилення (m), помилки середньої арифметичної (м), вірогідність отриманих результатів коефіцієнтом Стьюдента (t).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

У відповідності із задачами роботи досліджували дію тималіну та ППКН на процеси апоптозу лімфоцитів периферійної крові за фізіологічних умов.

Порівнюючи дані, що були отримані для лімфоцитів периферійної крові мишей та лімфоцитів периферійної крові донорів, спостерігали однаковий базальний рівень фрагментації ядер у них (рис.1, А).

А Б

Рис.1 Порівняння рівня фрагментації ядер – А та конденсації хроматину – Б лімфоцитів периферійної крові мишей та лімфоцитів периферійної крові донорів за фізіологічних умов і дії тималіну та ППКН. 1 – контрольні клітини; 2 – дія тималіну; 3 – дія ППКН.

Відмічалась односпрямованність дії тималіну і ППКН на процеси апоптозу лімфоцитів периферійної крові мишей та донорів у бік підвищення клітин із конденсацією хроматину (рис.1., Б).

Враховуючи, що за даними літератури оптимальним часом для розвитку процесів апоптозу є 24 години, коли можливо морфологічно виявити клітини, що знаходяться на різних стадіях розвитку процесів апоптозу [Onishi Y., 1997; Шарова Н.И. и др., 2000], проводили вивчення базального рівня апоптозу лейкоцитів периферійної крові донорів до та після інкубації в культуральному середовищі протягом 24 годин.

Як показали результати наших досліджень, інкубація протягом 24 годин не приводить до суттєвих змін процесів апоптозу у клітинах. Отримані дані дають нам можливість використовувати 24-годинну культуру лімфоцитів периферійної крові донорів як модель вивчення впливу тималіну і ППКН на процеси апоптозу лімфоцитів периферійної крові за фізіологічних умов та модуляції активності їх внутрішньоклітинних регуляторних систем. Слід зазначити, що показники апоптозу мали високий рівень коливань, але в цілому співпадали з рівнем апоптозу лімфоцитів периферійної крові за даними літератури [Талаев В.Ю., и др., 2001; Ковальчук Л.В. и др., 2000].

Отримані нами дані демонструють, що в лімфоцитах периферійної крові, за фізіологічних умов, контроль блокади та активації апоптозу знаходиться в динамічній рівновазі, про що свідчить майже однаковий рівень експресії Bcl-2 та P53. Ми пропонуємо розглядати відношення Bcl-2/P53 як показник стійкості лімфоцитів периферійної крові до індукції апоптозу.

За цих умов при дослідженні дії тималіну і природного петидного комплексу нирок (ППКН) спостерігалось вірогідне підвищення експресії CD 95 і Bcl-2 (рис.2).

Рис.2 Експресія CD95, Bcl-2 на лімфоцитах периферійної крові донорів при дії тималіну та ППКН. *- p<0,05 порівняння з контрольними клітинами.

Необхідно відмітити, що експресія CD95 не є обов’язковим критерієм запуску процесів апоптозу, а виявляє лише готовність клітин до його індукції через указаний вище рецептор [Казначеев К.С., 1999]. В роботах Budd R.C. обґрунтовано припущення, що рецептори смерті, такі як Fas/Apo-1, TNF об’єднують два шляхи в клітині: проліферацію та апоптоз, їх активація може ініціювати як ріст і диференціювання клітин, так і їх загибель шляхом апоптозу [Budd R.C. , 2002].

Таким чином, лімфоцити реагують на пептиди як на активуючий сигнал, підвищуючи готовність до апоптозу, але внаслідок підсилення експресії Bcl-2 та зростання показника стійкості лімфоцитів до апоптозу (відношення експресії Вcl-2/Р53), рівень якого для тималіну складав - 1,07, а для пептидного комплексу нирок - 1,23, апоптотичні процеси не отримують подальшого розвитку.

Відомо, що вплив на імунокомпетентну клітину активаційних стимулів будь-якої природи – антигенів, мітогенів, медіаторів і цитокінів - призводить до запуску трьох внутрішньоклітинних систем: підвищення концентрації внутрішньоцитозольного кальцію, стимуляції протеїнкінази С і протеїнтирозин-фосфатаз [Cantrel D.A, 1990]. Змінюється співвідношення внутрішньоклітинних концентрацій цАМФ і цГМФ [Ляшенко В.А.,1988].

Враховуючи важливу роль внутрішньоклітинних посередників у реалізації дії більшості гормонів та інших біологічно активних сполук [Теппермен Дж., Теппермен Х., 1989], наступним кроком наших досліджень стало вивчення зв’язку між реалізацією ефектів тималіну та ППКН за умов модуляції активності вищезазначених внутрішньоклітинних регуляторних систем.

Однією з умов розвитку апоптозу може бути внутрішньоклітинне підвищення рівня кальцію, що пов'язане з надходженням його в клітину через кальцієві канали плазматичної мембрани або мобілізацією з внутрішньоклітинних депо [В.С. Новикова, 1996]. Ряд спостережень показали, що роль кальцій-хелатуючих речовин у попередженні апоптозу є суперечливою. Механізм, за допомогою якого іони кальцію можуть регулювати фрагментацію ДНК під час апоптозу, залишається нез'ясованим.

Було досліджено регуляторний вплив тималіну і ППКН при модулюванні активності кальцієвої регуляторної системи.

Зв'язування зовнішньо- та внутрішньоклітинного кальцію призводило до появи клітин із проявами апоптозу. Лімфоцити були нечутливі до стимулюючих апоптоз ефектів кальцієвого іонофора, навіть спостерігалося підвищення експресії Bcl-2.

Отримані дані свідчать, що розвиток апоптозу може відбуватися при зниженні вмісту кальцію всередині клітини.

Дія пептидів в умовах зв’язування зовнішньо- та внутрішньоклітинного кальцію сприяла зниженню експресії CD95; підвищенню експресії Bcl-2; вірогідному зменшенню відсотка клітин з конденсацією хроматину. Пептиди попереджували розвиток процесів апоптозу, односпрямовано діяли з кальцієвим іонофором, підвищували експресію Bcl-2. Це підтверджує раніш обговорене припущення про участь пептидного комплексу нирок у механізмах, що пов’язані із зміною рівня внутрішньоклітинного кальцію [Весніна Л.Е., Кайдашев І.П., 2000]. Цей ефект можливо пов’язаний із збільшенням проникності мембрани для кальцію. В теперішній час існують дані про вплив деяких нейропептидів, наприклад, окситоцину на плазматичну мембрану з утворенням, за допомогою молекули пептиду, іонних каналів після її вбудовування в ліпідний матрикс, що сприяє посиленню входу кальцію в клітину [Рыбальченко В.К,1988].

Крім того, під впливом тималіну і ППКН, підвищується експресія Вcl-2, який може виступати в ролі регулятора гомеостазу внутрішньоклітинного кальцію [Sen Soumitra, D'Incalci Maurizio, 1992].

Враховуючи тісний зв’язок між кальцієвою та протеїнкіназною регуляторними системами, а також важливу роль активації й інгібування протеїнкінази С в регуляції апоптозу [Khwaja A., Tatton L., 1999], нами було досліджено вплив поліпептидного комплексу тимуса – тималіну і ППКН на апоптоз лімфоцитів периферійної крові за умов активації потеїнкінази С.

Дослідженнями H.Kizaki et al. [Nishimoto Y., et all, 1997; Kizaki H., Tadakuma T., 1993] показано, що форболові ефіри стимулюють апоптоз тимоцитів протеїнкіназним, кальцій-залежним шляхами. В наших дослідженнях під впливом 4-форбол–12–міріст-13-ацетат (ФМА) відбувалася індукція процесів апоптозу лімфоцитів периферійної крові.

За цих умов додавання тималіну призводило до зниження експресії CD 95 у 3 рази, а ППКН у 2 рази; фрагментація ДНК не спостерігались.

Отримані результати дозволяють зробити висновок, що в тимоцитах і периферійних лімфоцитах існують спільні шляхи розвитку апоптозу, пов'язані з активацією протеїнкінази С. Цей внутрішньоклітинний каскад реакцій супроводжується значним підсиленням експресії CD95 (APO-1) на мембранах лімфоцитів периферійної крові. Тималін і природний пептидний комплекс нирок ефективно перешкоджають розвитку каскаду апоптотичних реакцій лімфоцитів, що може бути пов'язано з функціональним інгібуванням поліпептидними комплексами тимуса і нирок дії форболмірістацетата.

Тканинні пептиди здатні впливати на процеси диференціювання клітин, що відбувається у фазу G1 клітинного циклу та пов’язано з підвищенням концентрації цАМФ [Кузник Б.И., и др., 1998]. цАМФ може приймати участь у передачі сигналу до розвитку апоптозу всередину клітини [Невзорова В.А.,2001]. Тому необхідним було вивчення впливу пептидів на процеси апоптозу лімфоцитів периферійної крові за умов модуляції активності аденілатциклазної системи.

Модуляцію активності аденілатциклазної системи проводили шляхом інгібування фосфодіестерази теофіліном, що супроводжувалось підсиленням експресії CD95 та значним зменшенням експресії Bcl-2; зростанням кількості клітин із морфологічними проявами апоптозу.

Відомо, що тканинні пептиди в диференційованих лімфоцитах периферійної крові підвищують рівень цГМФ [Кузник Б.И., и др., 1998;], що сприяє зниженню ефекту зв’язування кальцію із сарколемними фосфоліпідами, підвищенню проникності фосфоліпідних везикул та проникненню катіона в клітину [Сербина И.М., 2001]. В наших дослідженнях дії тималіну та ППКН цей ефект супроводжується відміною сигналу до розвитку апоптозу: спостерігалось підвищення експресії Вcl-2 та зменшення кількості клітин із морфологічними проявами апоптозу.

Таким чином, пептиди відміняють сигнал до розвитку апоптозу лімфоцитів периферійної крові в умовах накопичення в клітині цАМФ.

В теперішній час глюкокортикоїди - хіміотерапевтичні лікарські засоби зі стимулюючими апоптоз властивостями - все більш широко використовуються для індукції апоптозу. Для з’ясування питання про участь тималіну та ППКН у регуляції процесів апоптозу лімфоцитів периферійної крові досліджували їх вплив за умов дії дексаметазону.

Під дією дексаметазону встановлено вірогідне збільшення експресії CD95 і P53, клітин із морфологічними ознаками апоптозу, зменшення експресії Bcl-2. Індукція апоптозу дексаметазоном відбувалася на фоні зменшення показника стійкості лімфоцитів до апоптозу, відношення експресії Вcl-2 /Р53 біля 0,60.

Під впливом пептидів виявлено зменшення експресії P53 і CD95, вірогідне підвищення експресії Bcl-2, зменшення відсоткового вмісту клітин із фрагментацією ядра. Вплив регуляторних пептидів збільшував показник стійкості клітин до індукції апоптозу, що складав 1,17-1,19. Згідно сучасним уявленням, Вcl-2 належить особливо важлива роль у попередженні апоптозу в лімфоїдних тканинах, що викликаний глюкокортикоїдами [Mann C.L. et all, 2000]. На сьогоднішній день встановлено, що bcl-2 ген проявляє свою антиапоптотичну дію до приєднання комплексу глюкокортикоїду з його рецептором до ДНК [Иванов А.А., 2000].

Отже, тималін та ППКН ефективно запобігали розвитку глюкокортикоїд-індукованого апоптозу та забезпечували підвищену стійкість до стимулюючих апоптоз агентів лімфоцитів периферійної крові.

Таким чином, модуляція внутрішньоклітинних регуляторних систем на лімфоцитах периферійної крові супроводжувалась активацією процесів апоптозу. За цих умов пептидні комплекси виступали як антиапоптотичні фактори.

Для підтвердження отриманих даних нами проведені дослідження впливу тималіну та ППКН на апоптоз активованих фітогемаглютиніном (ФГА) лімфоцитів (активаційно-індукований апоптоз).

Згідно результатам, пептидні комплекси тимусу та нирок пригнічують розвиток апоптозу активованих ФГА клітин як за рахунок зменшення активності проапоптотичних систем (зниження експресії CD95), так і підвищення антиапоптотичних (підвищення експресії Bcl-2) [Бойчук С.В., Мустафин И.Г., 2001].

Таким чином, досліджені пептидні препарати здатні запобігати розвитку активаційно-індукованого апоптозу лімфоцитів периферійної крові за фізіологічних умов та модуляції активності їх внутрішньоклітинних регуляторних систем.

Апоптоз грає ключову роль у видаленні з організму небажаних або потенційно небезпечних клітин, наприклад, трансформованих клітин [Владимирская Е.Б. и др., 1997]. Враховуючи отримані раніше дані про наявність у пептидів, виділених із тимусу, антиканцерогенних властивостей

[Хавинсон В.Х. и др., 2000], постає питання про механізми їх дії на клітинному рівні.

Нами було досліджено регуляторний вплив природного пептидного комплексу тимуса - тималіну і ППКН на апоптоз клітин HPB-ALL (гострий Т-клітинний лейкоз) та BJAB (лімфома Беркіта) із використанням різних доз пептидів.

Дослідження показало, що тималін і ППКН здатні стимулювати апоптоз трансформованих Т-клітин лінії HPB-ALL. При дії тималіну цей ефект мав дозозалежний характер та був більш виражений, ніж у ППКН. При дії ППКН ми спостерігали різноспрямовану фазову дію: малі дози пептиду стимулювали апоптоз, а великі - пригнічували. Пептидні комплекси, що вивчалися, незначно підсилювали апоптоз у В – клітинах у мінімальних дозах, але при збільшенні дози пептидів не впливали в них на процеси апоптозу.

Таким чином, отримані дані підтверджують висновок, що найбільшу активність пептидні біорегулятори виявляють по відношенню до тропного для них виду клітин і тканин. Можливо, на поверхні клітин існують специфічні сайти, що диференційовано сприймають вплив тимічних пептидів на програму апоптозу [Морозов В.Г., и др., 2000].

Раніше було обговорено припущення про роль пептидів, що пов’язані з молекулами ГКГС, як нового класу речовин, що здійснюють міжклітинну регуляцію [Кайдашев І.П., 1996]. Молекули ГКГС-I класу не є лише пасивними пептид-представляючими молекулами, вони також здатні передавати сигнали через клітинну мембрану, що призводить до активації генів [Bredenhold S, et all, 1996].

Щоб охарактеризувати можливі шляхи трансдукції сигналу в Т-клітинах після впливу пептидів, досліджували мембранні білки, що фосфорилюються за тирозином, які ко-імунопреципітуються з молекулами ГКГС-I класу, із застосуванням методу імуноблотінгу.

Проведені нами дослідження показали, що в умовах культивування лінія HPB-ALL конституційно експресує три фосфорильованих білки, які ко-імунопреципітуються з молекулами ГКГС-I класу: із молекулярною масою порядку 80-90, 35-40 і 14-20 kD. Внесення пептидів призводить до фазних змін експресії цих білків: через 6 годин впливу переважно знижується експресія смуг із м. м. 35-40 і 80-90 kD, через 12 годин їх експресія відновлюється.

Таким чином пептидний комплекс тимуса - тималін і природний пептидний комплекс нирок за фізіологічних умов та модуляції активності внутрішньоклітинних регуляторних систем у трансформованих клітинах, здатні моделювати процеси апоптозу лімфоцитів периферійної крові.

На нашу думку, антиапоптотична дія тималіну і ППКН, яка проявляється шляхом підвищення рівня експресії Bcl-2, може реалізуватися двома можливими механізмами: за рахунок ГКГС–I опосередкованої передачі сигналу із залученням фосфорилювання асоційованих із ними білків та внаслідок перерозподілу рівня внутрішньоклітинного кальцію.

Наявність у пептидів центрального та периферійного походження загального механізму дії на процеси апоптозу лімфоцитів периферійної крові підтверджує концепцію поліфункціональності кожного регуляторного пептида і забезпечення однієї і тієї ж функції великим числом різних регуляторних пептидів.

Знайдені ефекти пептидного комплексу тимуса – тималіну і ППКН дозволять розкрити механізми порушення процесів апоптозу при імунологічних захворюваннях, що супроводжуються підсиленням або гальмуванням процесів апоптозу та надають можливість фізіологічної регуляції й корекції процесів апоптозу імунокомпетентних клітин.

ВИСНОВКИ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.Ножинова О.А., Весніна Л.Е., Губенко І.Я., Беркало Л.В., Кайдашев І.П. Дія пептидного комплексу тимусу – тималіну на процеси апоптозу лімфоцитів периферійної крові в умовах зв’язування позаклітинного кальцію//Проблеми екології та медицини.-1999.-Т.3.,N.6.-С.51-53.

2.Ножинова О.А., Веснина Л.Э., Кайдашев И.П. Влияние пептидного комплекса тимуса на процессы апоптоза лимфоцитов периферической крови в условиях активации протеинкиназы С //Проблеми екології та медицини.-2000.-Т.4.,N.1.-С.26-29.

3.Ножинова О.А., Рябенко В.В., Губенко І.Я., Кайдашев І.П. Вплив пептидних комплексів нирок та тимуса (тималіна) на процеси апоптозу лімфоцитів периферійної крові//Імунологія та алергологія.-2000.-N.1.-С.63-66.

4. Кайдашев И.П., Ножинова О.А. Роль молекул MHC I класса на опухолевых Т-клетках в передаче пептидного сигнала// Імунологія та алергологія.-2002.-№2.-С.22-25

5. Ножинова О.А., Рябенко В.В., Кайдашев И.П. Влияние пептидных комплексов, выделенных из почек и тимуса, на апоптоз, инициированный дексаметазоном, в тимоцитах и лимфоцитах периферической крови// Экспериментальная онкология.-2002.-Т.24,№1.-С.69-71.

6.Ножинова О.А., Рябенко В.В. Вплив тканинних пептидів на активаційно-індукований апоптоз лімфоцитів периферійної крові//Материалы научно-практической конф.''Лекарства-человеку''.- Т.XV,№1-2.-Харьков.- 2001.- С.385-390.

7.Kaidashev I., Nozhinova O., Ryabenko V.,Vesnina L. The role of MHC peptides in the regulation of lymphocyte apoptosis //European journal of allergy and clinical immunology. XIXthe Congress of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology: Abstract Book. Lisbon, Portugal. July 1-5 2000.-Vol.55 suppl.63.-P.72.

8.Кайдашев И.П., Боброва Н.А., Веснина Л.Э., Гейко О.А., Ножинова О.А., Рябенко В.В. Роль тканевых пептидов, экстрагированных из молекул главного комплекса гистосовместимости, в регуляции экспрессии поверхностных рецепторов и процессов апоптоза тимоцитов и лимфоцитов периферической крови //Аллергология и иммунология .Материалы III съезда иммунологов и аллергологов.- 16-20 сентября Сочи, Россия.- 2000.-Т.1,№.2.-С.119.

9.Возможность использования тканевых пептидов в терапии иммунопатологий, вызванных нарушением апоптоза иммуноцитов/Кайдашев И.П., Баштовенко О.А., Гейко О.А., Рябенко В.В., Ножинова О.А. и др.//Матер. IV съезда имммунологов и аллергологов СНГ 12-14 сентября Москва, Россия.- 2001.-Т.,№2.-С.16.

10. Kaidashev I.P., Noginova O.A., Ryabenko V.V.Peptides bound to MHC class I molecules induce signal transduction by these molecules// AAAAI 58th Annual Meeting. New York, USA, 2002/Allergy and Clinical Immunology.-2002.-Vol.109, №1.-P.355.

11. Влияние пептидных комплексов тимуса, почек и поджелудочной железы на процессы апоптоза лимфоидных клеток/ Ножинова О.А., Кайдашев И.П., Рябенко В.В., Беркало Л.В., Куценко Л.А. и др. // VI звітно-виборна та науково-практична конференція Українського товариства фахівців з імунології, алергології та імунореабілітації: Тези доповідей. Київ, 2002/Імунологія та алергологія.-2002.-№2.-С.76.

12. Noshinova O., Kaidashev I., Ryabenko V The influence of the drug preparations from methylxanthine group on processes of apoptosis of T-lymphocytes//“Allergy Asthma Clinical Immunology” 4th Central and Eastern European Conference. Lodz, Poland, 2002/Allergy Asthma Immunology.-2002.-Vol.7.suppl.2.-P.179

13. Рябенко В.В., Ножинова О.А., Капустянський Д.В Вплив регуляторних пептидів на процеси апоптозу клітин імунної системи// IV Міжнародний конгрес студентів і молодих вчених (матеріали конгресу). Тернопіль, 2000 - С.333.

14. Кайдашев І.П., Ножинова О.А., Рябенко В.В. Спосіб корекції функціонального стану лімфоцитів периферійної крові. Деклараційний патент України № 48797 А, 7 А61К38/00, заяв.14.12.01, опубл.15.08.02. Бюл.№8.

АНОТАЦІЯ

Ножинова О.А. Вплив пептидного комплексу тимуса – тималіну та природного пептидного комплексу нирок на процеси апоптозу лімфоцитів периферійної крові за фізіологічних умов та модуляції активності їх внутрішньоклітинних регуляторних систем. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.03. – нормальна фізіологія.- Інститут геронтології АМН України, Київ, 2003.

Показано, що тималін та ППКН блокують розвиток апоптозу лімфоцитів периферійної крові в умовах активації протеїнкінази С, підвищення цАМФ у клітинах, перерозподілу внутрішньоклітиного кальцію під дією іонофору та кальцій-хелатуючих речовин, дії дексаметазону.

Вплив тималіну та ППКН призводив до загибелі лейкозних Т-лімфоцитів лінії HPB-ALL, що пов’язано з індукцією в них процесів апоптозу. При дії тималіну цей ефект мав дозозалежний характер. Тималін і ППКН не викликали активації процесів апоптозу В-лімфоцитів лінії BJAB.

Тималін та ППКН активують фосфорилювання за тирозином мембранозв’язаних білків, що коімунопреципітуються з молекулами головного комплексу гістосумісності (HLA-A,B,C). Тималін і ППКН