НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИКИ

Ольхович Наталія Вікторівна

УДК 616-056.7-07

Аналіз мутацій в гені арилсульфатази А

та особливості біохімічної діагностики

метахроматичної лейкодистрофії

03.00.22 – молекулярна генетика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2003

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у Київській медичній академії післядипломної освіти імені П.Л.Шупика.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор

Горовенко Наталія Григорівна,

Київська медична академія післядипломної освіти

імені П.Л.Шупика, завідувач кафедри медичної генетики,

клінічної імунології і алергології.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Лукаш Любов Леонідівна,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,

завідувач відділу генетики людини;

доктор біологічних наук, професор

Великий Микола Миколайович,

Національний медичний університет імені О.О.Богомольця

МОЗ України, професор кафедри біоорганічної, біологічної та

фармацевтичної хімії.

Провідна установа: Київський національний університет імені Т.Г.Шевченка,

кафедра загальної та молекулярної генетики, м.Київ.

Захист дисертації відбудеться “_27_”_січня____2004р. о 10.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 03143, м.Київ-143, вул. Академіка Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, 03143, м.Київ-143, вул. Академіка Заболотного, 150.

Автореферат розіслано “_24_”_грудня_______2003р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук О.В.Підпала

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Метахроматична лейкодистрофія (МЛД) – аутосомно-рецесивне захворювання, яке належить до найпоширеніших лізосомних хвороб накопичення і обумовлене мутаціями в гені арилсульфатази А (AСA) (Kolodny et al., 1995). На сьогодні описано 95 мутацій в гені АСА, що пов’язані з розвитком захворювання, простежуються особливості частоти та спектра мутацій серед хворих на МЛД різного етнічного походження (Kolodny et al., 2002).

Первинним біохімічним дефектом при МЛД є порушення функціональної активності арилсульфатази А (АСА) – лізосомного ферменту, який бере участь у деградації цереброзидсульфату. Внаслідок цього дефекту цереброзидсульфат накопичується в лізосомах клітин, що і призводить до розвитку тяжкого нейродегенеративного захворювання з прогресуючим перебігом. Біохімічну діагностику МЛД, яка базується, перш за все, на демонстрації дефіциту активності АСА в гомогенаті лейкоцитів, ускладнює феномен псевдодефіциту АСА, тобто зниження активності ферменту in vitro за відсутності будь-яких проявів захворювання (Thomas, 1994). Доведено, що псевдодефіцит АСА пов’язаний з двома тісно зчепленими мутаціями в гені АСА – загальним поліморфізмом N350S та втратою сигналу поліаденілювання (Thomas, 1994). Популяційні дослідження, проведені в різних європейських регіонах, показали, що розповсюдженість алеля псевдодефіциту АСА (ПД-алеля) серед здорового населення досить велика – від 6% у Польщі (Lugowska et al., 2000) до 12% у Великій Британії (Barth et al., 1994). Таким чином, існування псевдодефіциту АСА, а також клінічний поліморфізм МЛД і наявність фенокопій цього захворювання серед іншої неврологічної патології як спадкового, так і набутого характеру, робить дуже важливою розробку ефективних методів диференціальної діагностики і достовірного визначення генотипу осіб з родин, обтяжених МЛД. Хибнопозитивна діагностика МЛД, яка можлива у випадку поєднання псевдодефіциту АСА з неврологічною патологією іншого генезу, зменшує шанси на проведення належного ефективного лікування у пацієнтів. Хибнонегативна ж діагностика, навпаки, підвищує невиправдані витрати на діагностичні та лікувальні заходи.

Дослідження генетичних особливостей та розповсюдженості лізосомних хвороб накопичення серед різних східно-європейських популяцій мають велике наукове та практичне значення. Лише за умов визначення цих особливостей стає можливою розробка максимально ефективної діагностичної програми скринінгу мажорних мутацій у пацієнтів певної популяції, яка дозволяє не лише ідентифікувати хворих, але і встановлювати гетерозиготне носійство у членів їхніх родин. Серед країн СНД тільки російські дослідники проводили вивчення біохімічної та молекулярно-генетичної характеристики деяких захворювань цього класу (Karsten et al., 1998). В Україні ця група спадкових захворювань взагалі не вивчалась.

Останнім часом активно ведуться дослідження можливостей корекції різних лізосомних хвороб накопичення, в тому числі і МЛД (Matzner et al., 2000; Matzner et al., 2001; Matzner et al., 2002; Consiglio et al., 2001). Тому рання діагностика цього захворювання, особливо в пресимптоматичний період, має дуже велике значення для розробки підходів до його лікування.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження проводили в рамках тематичного плану Київської медичної академії післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика “Визначення ролі ендогенних та екзогенних факторів у виникненні та перебігу генної та хромосомної патології на різних етапах онтогенезу” (номер держреєстрації 0101U000231, 2001 – 2005 рр.).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було визначення частоти і спектра мутацій в гені АСА та їхнього зв’язку з біохімічними показниками в родинах високого ризику метахроматичної лейкодистрофії в Україні для розробки стратегії молекулярно-генетичного та біохімічного обстеження осіб з підозрою на обтяженість цією патологією.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі завдання:

1) провести скринінг мажорних мутацій в гені АСА у хворих на МЛД в Україні;

2) дослідити взаємозв’язок виявлених мутацій в гені АСА з клінічними типами МЛД;

3) визначити частоту алеля псевдодефіциту АСА серед населення України;

4) вивчити можливість використання біохімічних методів для диференціації дійсного дефіциту та псевдодефіциту арилсульфатази А, а також для встановлення гетерозиготного носійства мутацій в гені АСА;

5) розробити нормативні значення активності арилсульфатази А для населення України;

6) розробити алгоритм лабораторного обстеження осіб з підозрою на наявність МЛД або обтяженість цією патологією.

Об’єкт дослідження – спадкове захворювання – метахроматична лейкодистрофія.

Предмет дослідження – спектр і поширеність мутацій в гені АСА в Україні, а також особливості біохімічної діагностики МЛД.

Методи дослідження – виділення та очищення ДНК, полімеразна ланцюгова реакція, рестрикційний аналіз, алель-специфічна ампліфікація, визначення активності АСА з використанням синтетичного хромогенного субстрату, статистична обробка даних.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше досліджено розповсюдженість мажорних мутацій (“І”- та “А”-алелів) в гені АСА серед хворих на МЛД в Україні. Сумарна частота цих мутацій серед обстежених нами пацієнтів склала 20%, що нижче середньоєвропейської (47%). Досліджено взаємозв’язок мажорних мутацій в гені АСА та клінічного перебігу захворювання у пацієнтів. Вперше визначено частоту алеля псевдодефіциту АСА серед населення України, яка склала 7,7%. Дані про частоту алеля псевдодефіциту АСА серед населення України доповнюють інформацію про особливості його розповсюдженості в східно-європейському регіоні. Розроблено модифікацію методу визначення активності арилсульфатази А, яка дозволяє диференціювати дійсний дефіцит, псевдодефіцит АСА та встановлювати гетерозиготне носійство мутацій в гені АСА. Вперше визначено рівні нормальної активності АСА для населення України. Вперше розроблено алгоритм обстеження осіб при підозрі на наявність або обтяженість МЛД.

Практичне значення одержаних результатів. Під час виконання цієї роботи було створено зручну у використанні базу даних мутацій в гені АСА, яка дозволила проаналізувати особливості частоти і спектра цих мутацій в різних популяціях і розробити стратегію молекулярно-генетичного обстеження хворих на МЛД в Україні. Крім того, ідентифікація мутацій в гені АСА у пацієнтів з МЛД дає можливість проведення пренатальної діагностики в обтяжених цією патологією родинах, для яких вона є єдиним засобом профілактики народження хворої дитини. Стандартизовані нами умови оцінки придатності зразків гомогенату лейкоцитів для визначення активності АСА (патент № 56511 А, заявл. 02.07.2002, опубл. 15.05.2003. бюл. № 5) дозволяють запобігти виникненню помилок під час діагностики метахроматичної лейкодистрофії. Розроблений нами спосіб диференціації дійсного дефіциту та псевдодефіциту АСА (патент № 54174 А, заявл. 30.05.2002, опубл. 17.02.2003. бюл. № 2) та ідентифікації гетерозиготного носійства МЛД (патент № 51468 А, заявл. 05.04.2002, опубл. 15.11.2002. бюл. № 11) на підставі біохімічних методів дозволяють запобігти встановленню хибнопозитивного або хибнонегативного діагнозу МЛД. Ці розробки впроваджено в практику установ системи охорони здоров’я МОЗ України та включено до Реєстру галузевих нововведень МОЗ України (№№ 174/19/03; 175/19/03). Розроблений нами діагностичний алгоритм дозволяє проводити верифікацію діагнозу метахроматичної лейкодистрофії, а також визначення носіїв мутацій в гені АСА, що призводять до дійсного дефіциту та псевдодефіциту ферменту за допомогою мало затратних біохімічних методів. Це підвищує ефективність ретро- та проспективного медико-генетичного консультування. Алгоритм впроваджено в практику Медико-генетичного центру УДСЛ “ОХМАТДИТ” та використовується в навчальному процесі на кафедрі медичної генетики, клінічної імунології і алергології КМАПО ім. П.Л.Шупика.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційну роботу було виконано під керівництвом завідувача кафедри медичної генетики, клінічної імунології та алергології КМАПО ім. П.Л.Шупика, д.мед.н., професора Н.Г.Горовенко. Планування дослідження, обговорення, аналіз, інтерпретацію отриманих даних, підготовку патентів та частини публікацій до друку проводили разом з науковим керівником.

Здобувачем особисто проаналізовано літературні дані за темою дисертаційної роботи, проведено виділення ДНК та визначено розповсюдженість ПД-алеля гена АСА серед здорових осіб в Україні, перевірено наявність цих мутацій у хворих на МЛД та членів їхніх родин. Проведено роботу із визначення “І”- та “А”-алелів в гені АСА хворих на МЛД і членів їхніх родин. Виконано роботу по стандартизації біохімічних методів діагностики МЛД, розроблено модифікацію методики визначення активності АСА та алгоритм лабораторного обстеження осіб при підозрі на МЛД. Здобувач висловлює щиру подяку спеціалісту з вищою освітою Медико-генетичного центру УДСЛ “ОХМАТДИТ” Недобой А.М. за допомогу в проведенні біохімічних досліджень (визначення активності АСА у частини досліджених осіб). Автор щиро вдячна співробітникам відділу радіаційної медицини Інституту проблем атомного бомбардування при Медичній школі університету м.Нагасакі (Японія), професору С. Ямашита та асистенту професора Н. Такамура за люб’язно надану можливість проведення молекулярно-генетичних досліджень (визначення “А”-алеля гена АСА у частини досліджених осіб).

Клінічне обстеження хворих, зразки яких досліджувалися в роботі, проводили співробітники Медико-генетичного центру УДСЛ “ОХМАТДИТ” к.мед.н., завідувач МГЦ Галаган В.О., лікарі-генетики Радзиховська О.В. та Циганкова М.А., а також співробітники кафедри медичної генетики, клінічної імунології і алергології КМАПО імені П.Л.Шупика, к.мед.н., доцент Коблянська Г.М., к.мед.н., асистент Шейко Л.П. Особлива подяка к.мед.н., лікарю-неврологу МГЦ “ОХМАТДИТ” Пічкур Н.О. за допомогу в оцінці клінічних даних пацієнтів з МЛД. Отримані результати обговорено та опубліковано в спільних публікаціях.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідались на Науково-практичній конференції “Сучасний стан медичної генетики в Україні” (Київ, 1999), Науково-практичній конференції “Пренатальний і постнатальний скринінг вродженої та спадкової патології” (Харків, 2000), III З’їзді медичних генетиків України (Львів, 2002), VIII Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002) та I Українському конгресі з клінічної генетики з міжнародною участю “Метаболічні спадкові захворювання” (Харків, 2003).

Публікації. За темою дисертації було опубліковано 12 друкованих праць, зокрема 4 статті, 3 деклараційних патенти на винахід та тези 5 доповідей на науково-практичних конференціях та з’їздах.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, результатів власних досліджень та їх обговорення, висновків, списку використаних джерел. Текст дисертації ілюстровано 23 таблицями та 18 рисунками. Перелік використаних джерел охоплює 169 найменувань. Дисертаційну роботу викладено на 124 сторінках машинописного тексту.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали та методи дослідження. Зразки периферичної крові дітей з групи пошуку, у яких на основі клінічних даних запідозрено наявність МЛД, було отримано в Медико-генетичному центрі УДСЛ “ОХМАТДИТ”. Групу контролю склали здорові донори з різних регіонів України, які добровільно брали участь у обстеженні та не були кровними родичами дітей з групи пошуку.

Визначення активності АСА в гомогенаті лейкоцитів проводили за стандартним методом Баума (Baum et al., 1959) та за нашою модифікацією (патент №54174 А від 17.02.2003). У роботі використовували синтетичний хромогенний субстрат п-нітрокатехолсульфат (“Sigma”, США). У разі виявлення зниженої активності АСА у пацієнта, додатково проводили біохімічне та молекулярно-генетичне обстеження членів ядерної родини (мати, батько, сибси).

Виділення та очищення препаратів ДНК із свіжої крові з антикоагулянтом (ЕДТА) проводили з використанням комерційного набору “ДНК-сорб-В” (“Амплисенс”, Росія). ДНК із замороженої крові з великим терміном давності виділяли за допомогою стандартного методу – шляхом гідролізу лізатів клітин протеїназою К з наступною фенольною екстракцією (Маниатис и др., 1985).

Ампліфікацію послідовностей ДНК in vitro за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) проводили в автоматичному режимі на термоциклерах “Perkin Elmer” 2400 (США) та ASTEC PC808 (Японія) за стандартним методом (Saiki et al., 1988). Олігонуклеотидні праймери для ПЛР були синтезовані фірмою “Синтол” (Росія). У роботі використовували термостабільні ДНК-полімерази DiaTaq (“Амплисенс”, Росія) та TaKaRa ExTaq (“TaKaRa Biomedicals”, Японія).

Алель-специфічну ампліфікацію використовували для аналізу алеля псевдодефіциту АСА (Gieselmann et al., 1991). Аналіз продуктів ампліфікації проводили в 1,5%-му агарозному гелі.

Рестрикційний аналіз продуктів ПЛР проводили для виявлення мажорних мутацій в гені АСА. У роботі використовували ендонуклеази рестрикції виробництва фірми “Fermentas” (Литва), “New England Biolabs” (США) та “Promega” (США). Для аналізу мутації IVS2+1 (“І”-алеля) використовували ендонуклеазу рестрикції MvaI, а для аналізу мутації P426L (“А”-алеля) – PstI (Coulter-Mackie et al., 1997).

Візуалізацію та реєстрацію результатів електрофорезу проводили за допомогою УФ-трансілюмінатору та відеосистеми з комп’ютерною програмою аналізу зображення “Біотест-А” (Біоком, Росія). Гідролізовані продукти ПЛР аналізували за допомогою електрофорезу в 8%-му (для “І”-алеля) та 20%-му (для “А”-алеля) поліакриламідному гелі.

Статистичну обробку результатів здійснювали, використовуючи критерії Стюдента, чІ та правило 3?. Для визначення необхідного обєму вибірки для популяційних досліджень керувались рекомендаціями Г.Ф.Лакіна (Лакін, 1989).

Результати дослідження та їх обговорення. Створення бази даних мутацій в гені АСА та її аналіз. Для систематизації даних про відомі мутації в гені AСA, описані в інших популяціях, ми ознайомились з найбільшим ресурсом баз даних про мутації в генах, що пов’язані з виникненням спадкових захворювань людини (www.hgmd.org) та низкою інших інформаційних ресурсів з колекції баз даних з молекулярної біології (Baxevanis, 2002). У зв’язку з відсутністю упорядкованої інформації про мутації в гені AСA, яка необхідна для розробки алгоритму молекулярно-генетичних досліджень, нами було створено власну базу даних про мутації в гені AСA з інформацією про тип і локалізацію мутації, етнічне походження і кількість описаних випадків та джерело отримання інформації, яку ми розташували на сайті http://www.genetics.org.ua/mld_base.htm. При аналізі цієї бази даних нами було виявлено певні етнічні розбіжності в частоті та спектрі мажорних мутацій в гені АСА (табл. 1).

Так, частота найпоширенішої мутації, “I”-алеля, в Європі градієнтно знижується з півночі на південь – з 43% у Великій Британії до 25% в Іспанії. Частота другої за ступенем поширеності мутації, “А”-алеля, як було нами показано, також має градієнтне зниження з півночі на південь – з 30% у Німеччині до 2 % в Італії. Крім цих двох мажорних мутацій, нами було показано специфічне накопичення деяких місенс-мутацій у певних етнічних регіонах: I179S – в Австрії, A212V – у Великій Британії, D255H – в Іспанії та G99D – в Японії. Інші мутації в гені АСА описані в поодиноких випадках.

Таблиця 1

Частота мажорних мутацій у гені AСA в різних популяціях

Мутація | Регіон | Частота, % | Джерело інформації

“I”-алель

(IVS2+1) | Ізраїль (араби-мусульмани)

США (Індіанці Наваго)

Європа

Велика Британія

Німеччина

Італія

Іспанія

Україна

Японія | 100

99

43

30

29

25

10

0,1 | Zlotogora et al., 1994

Holve et al., 2001

Barth et al., 1993

Gieselmann et al., 1991

Regis et al., 1996

Gort et al., 1999

Наші дані

Hasegawa et al., 1993

“А”-алель (P426L) | Німеччина

Велика Британія

Україна

Італія | 30

16

10

1,9 | Gieselmann et al., 1991

Barth et al., 1993

Наші дані

Regis et al., 1996

Таким чином, створена нами база даних дозволила упорядкувати та проаналізувати результати проведених популяційних досліджень для подальшої розробки стратегії молекулярно-генетичного обстеження хворих на МЛД в Україні.

Молекулярно-генетичний скринінг мажорних мутацій в гені АСА у родинах хворих на МЛД в Україні. Для проведення молекулярно-генетичного скринінгу мажорних мутацій в гені АСА було виділено і проаналізовано ДНК пацієнтів з 10 родин, їхніх батьків (13 осіб) та сибсів (2 особи).

Для визначення “I”-алеля проводили ампліфікацію фрагмента гена АСА на межі 2-го екзону і 2-го інтрону та подальший рестрикційний аналіз продукту ампліфікації ендонуклеазою рестрикції MvaI. Сплайсингова мутація “I”-алеля порушує сайт розпізнавання MvaI, що призводить до втрати здатності цього ферменту розщеплювати ампліфікований фрагмент (рис.1А). Серед усіх обстежених пацієнтів “I”-алель було знайдено лише у одного (пацієнт Гв.О.) в гомозиготному стані.

Для визначення “А”-алеля проводили ампліфікацію ділянки 8-го екзону гена АСА та подальший рестрикційний аналіз продукту ампліфікації ендонуклеазою рестрикції PstI (рис. 1Б). Місенс-мутація “А”-алеля (P426L) утворює додатковий сайт розпізнавання для рестриктази PstI. Серед усіх обстежених пацієнтів “А”-алель було знайдено у двох (пацієнти Бл.Б. та Бз.О.) в гетерозиготному стані.

Рис.1. Рестрикційний аналіз мажорних мутацій в гені АСА: А – MvaI–аналіз “I”-алеля в родині Гв.: 1 – гомозигота за “І”-алелем (пробанд); 2,3,4 – гетерозиготні носії “І”-алеля (мати, батько, сибс); Мм – маркер молекулярної маси (pUC19/MspI). Б – PstI–аналіз “A”-алеля в родині Бл.: 1,2 – гетерозиготні носії “А”-алеля (пробанд, мати); 3 – норма (батько); Мм – маркер молекулярної маси (pUC19/MspI)

Градієнтне зниження частоти мажорних мутацій в гені АСА серед європейських популяцій з півночі на південь деякою мірою робить очікуваною одержану нами досить низьку їхню частоту в українській популяції – 10% (2 з 20 алелів) для “I”-алеля та 10% (2 з 20 алелів) для “А”-алеля.

Для ідентифікації інших мутацій в гені АСА, що призвели до розвитку захворювання у пацієнтів з МЛД, нами заплановано визначення у них повної послідовності нуклеотидів цього гена. Нами було проаналізовано зразки ДНК трьох пацієнтів (Olkhovich et al., 2003). В результаті секвенування нами було встановлено, що у пацієнта Бз.О. з мутацією P426L в 8-му екзоні в одному алелі, інший алель несе мутацію P136S в 2-му екзоні. Цю мутацію було описано Горт та ін. у іспанського пацієнта з ювенільною формою МЛД (Gort et al., 1999). При секвенуванні гена АСА у пацієнта Бл.Б., один алель якого також несе мутацію P426L, в іншому алелі було знайдено заміну основи, яка відповідає мутації F247S в 4-му екзоні. Цю мутацію досі не було описано в літературі. При секвенуванні гена АСА у пацієнта Я.Н. було знайдено дві заміни основи: одна заміна відповідає мутації D381E в 7-му екзоні, друга заміна відповідає мутації A469G у 8-му екзоні. Обидві виявлені мутації досі не були описані в літературі. Для підтвердження того, що описані нами зміни в гені АСА є мутаціями, було використано рестрикційний аналіз. Для цього за допомогою комп’ютерної програми BioEdit 5.0.9. побудовано рестрикційні карти 4-го, 7-го та 8-го екзонів гена АСА і встановлено сайти впізнавання рестриктаз, що порушуються при виникненні описаних нами мутацій. Відповідний рестрикційний аналіз ампліфікованих екзонів ДНК пацієнтів Я.Н.(генотип D381E/A469G) та Бл.Б. (генотип F247S/P426L) підтвердив існування описаних нами нових мутацій у цих пацієнтів.

Нами проведено скринінг вперше описаних нами мутацій в гені АСА в 50 зразках ДНК з банку донорської крові. У жодній із досліджених нами 100 хромосом не було виявлено описаних нами мутантних алелів. Це свідчить про те, що описані нами мутації не є поліморфними варіантами гена АСА.

Кореляції генотипу і фенотипу у пацієнтів з МЛД. Генотип-фенотипічні кореляції для мажорних мутацій гена АСА були описані в ряді робіт (Polten et al.,1991; Kappler et al.,1991; Gieselmann et al.,1991). Відомо, що “I”-алель є нуль-мутацією, яка призводить до синтезу молекули арилсульфатази А з повною втратою функціональної активності, тоді як інша мажорна мутація, “А”-алель (P426L), порушує віддалену від функціонально активних ділянку ферменту і спричиняє більш м’який перебіг захворювання.

Аналіз зв’язку клінічного типу МЛД і певного генотипу обстежених нами хворих показав, що генотип-фенотипічні кореляції серед українських пацієнтів добре узгоджуються з описаними раніше закономірностями щодо мажорних мутацій: гомозигота за “І”-алелем (пацієнт Гв.О.) мав тяжку пізню інфантильну форму МЛД, тоді як компаундні гетерозиготи за “А”-алелем та новими описаними нами мутаціями (пацієнти Бл.Б. та Бз.О.) мали більш м’яку ювенільну форму захворювання. Клінічний перебіг МЛД у пацієнта з новими описаними нами мутаціями в обох алелях (пацієнт Я.Н.) характеризувався дуже раннім початком і швидким прогресуванням, що ймовірно свідчить про спричинення цими мутаціями серйозних уражень молекули АСА.

Відомості про взаємозв’язок нових описаних нами мутацій в гені АСА з певним клінічним фенотипом пацієнтів стали вагомим внеском у загальну інформацію про генотип-фенотипічні кореляції при МЛД.

Таким чином, проведений нами аналіз мутацій в гені АСА показав, що частота найпоширеніших у західноєвропейських популяціях мутацій, “І”- та “А”-алелів, у хворих на МЛД в Україні досить низька, а інші мутації є унікальними для кожної родини. Це значно ускладнює розробку стратегії молекулярно-генетичної діагностики цього захворювання і надає особливого значення можливості проведення достовірної диференційної діагностики МЛД за допомогою біохімічних методів.

Визначення частоти алеля псевдодефіциту АСА серед населення України. Один із факторів, який необхідно враховувати при оцінці достовірності диференційної діагностики МЛД за допомогою біохімічних методів, це можливість існування у досліджуваної особи псевдодефіциту АСА. Це явище не асоціюється з будь-якими клінічними проблемами, але може значно ускладнити процес встановлення діагнозу МЛД та гетерозиготного носійства в родинах з високим ризиком МЛД тільки на підставі біохімічного обстеження. Враховуючи це, ми визначили розповсюдженість алеля псевдодефіциту АСА серед населення України. Для цього було виділено і проаналізовано ДНК із 117 зразків донорської крові. Дослідження проводили з використанням методу алель-специфічної ампліфікації (рис.2).

Рис. 2. Алель-специфічна ампліфікація ПД-алеля:

зверху вказано зразки: 1 – особа, яка не має ПД-алеля; 2,3 – особи, гетерозиготні за ПД-алелем; Мм – маркер молекулярної маси (123 п.н., “Gibco”);

знизу вказано комбінацію алель-специфічних праймерів: Н – нормальний алель; ПД-алель псевдодефіциту АСА

В результаті проведеного дослідження ПД-алель було виявлено у 18 із 234 обстежених алелів, що склало 7,7 %. Серед них в 4-х випадках ПД-алель було знайдено в гомозиготному стані і в 10-ти – в гетерозиготному.

Стандартизація умов визначення активності АСА в гомогенаті лейкоцитів для діагностики МЛД. Для оцінки можливості використання стандартної методики вимірювання активності АСА за Баумом для діагностики метахроматичної лейкодистрофії було визначено коефіцієнти внутрішньосерійної та загальної відтворюваності, які склали відповідно 1,7% та 5,0%.

Під час оцінки результатів серій вимірювань, що проводились нами для визначення коефіцієнта загальної відтворюваності, кілька значень активності АСА у однієї і тієї ж особи виходили за межі трьох сигм та повинні б бути вилучені з роботи. Ретельний аналіз цих аномальних значень показав, що всі вони були отримані при використанні для дослідження зразків із низьким вмістом білка (менше 150 мкг/реакцію). Відомо, що концентрація білка в реакційній суміші фактично відображає концентрацію ферменту і має велике значення для ферментативної реакції (Диксон и др., 1982). Вивчення різних інформаційних джерел виявило дуже суперечливі рекомендації щодо оптимальної кількості білка в реакційній суміші при визначенні активності АСА – від 50 мкг/реакцію (Wenger et al., 1991) до 600 мкг/реакцію (Tylki-Szymanska et al., 1998). У зв’язку з тим, що ці рекомендації не узгоджувались із нашими спостереженнями, ми вивчили вплив концентрації білка в гомогенаті лейкоцитів на активність АСА в цьому гомогенаті. З цією метою було проведено вимірювання активності АСА в лейкоцитах периферійної крові десяти осіб у серіях розведень первинного гомогенату відносно концентрації білка. Отримані результати показали, що відтворюваність вимірювань зберігалась лише в тих зразках, де кількість білка в реакційній суміші знаходилась в межах 200 – 400 мкг. Таким чином, було встановлено, що для отримання достовірних результатів визначення активності АСА необхідно суворо дотримуватись встановлених нами критеріїв придатності зразка гомогенату лейкоцитів для дослідження відповідно кількості білка (патент № 56511 А від 15.05.2003). Замала кількість білка в пробі штучно занижує, а надмірна – завищує показники активності арилсульфатази А, що може призвести до одержання хибнонегативного або хибнопозитивного діагнозу метахроматичної лейкодистрофії у пацієнтів.

Визначення рівня нормальної активності АСА для населення України. Для достовірного визначення нормального рівня активності АСА та враховуючи встановлену нами досить високу частоту псевдодефіциту АСА в популяції України (7,7%), необхідно було виключити наявність ПД-алеля у осіб контрольної групи. Визначення ПД-алеля було проведено всім особам групи контролю з використанням методу алель-специфічної ампліфікації. У чотирьох осіб з групи контролю було виявлено наявність ПД-алеля в гені АСА. Таким чином, статистичну обробку значень активності АСА для визначення середнього значення цього показника в нормі проводили лише тим особам, у яких було доведено відсутність ПД-алеля гена АСА. Нормальна активність АСА для населення України склала 118,5 ± 25,8 нмоль/год/мг білка (при стандартному методі визначення за Баумом).

Аналіз активності АСА у пацієнтів групи пошуку. Визначення активності АСА в гомогенаті лейкоцитів за Баумом є скринуючим тестом, який дозволяє виокремити хворих на МЛД з групи пацієнтів, які мають подібну до МЛД клінічну симптоматику (групи пошуку). Всім пацієнтам групи пошуку (78 осіб) було проведено біохімічне визначення активності АСА в гомогенаті лейкоцитів за Баумом. На підставі отриманих результатів та відповідно до визначеної нами нормальної активності, дітям з клінічними проявами, подібними до МЛД, та нормальною активністю АСА (65 осіб), діагноз МЛД було відхилено.

У дітей зі зниженою порівняно з контролем активністю АСА (13 осіб), наявність псевдодефіциту АСА було перевірено методом алель-специфічної ампліфікації. У 4-х пацієнтів (Ф.М., Р.А., Шн.Д. та Ж.А.) було виявлено наявність ПД-алеля, що могло спричинити хибне встановлення діагнозу МЛД цим пацієнтам. З іншого боку, з літератури відомо чимало випадків, коли спостерігається одночасне успадкування МЛД та псевдодефіциту АСА однією особою (Gieselmann et al., 1991; Hageman et al., 1995). Таким чином, наявність ПД-алеля у дитини не виключає для неї можливості мати і МЛД.

Стандартний метод визначення активності АСА за Баумом не дозволяє диференціювати дійсний дефіцит та псевдодефіцит АСА для запобігання хибного встановлення або відхилення діагнозу МЛД. Найдостовірнішим способом підтвердження діагнозу МЛД є ідентифікація мутацій в гені АСА у пацієнта. Але незначна частка мажорних і, у переважній більшості, унікальні для кожної родини мутації в цьому гені (що показали наші дослідження) значно ускладнюють використання молекулярно-генетичних методів для диференціальної діагностики МЛД.

Спосіб диференціації дійсного дефіциту та псевдодефіциту АСА біохімічним методом. Нами було запропоновано модифікацію методу біохімічного визначення активності АСА в гомогенаті лейкоцитів, яка дозволила диференціювати дійсний дефіцит та псевдодефіцит АСА, а також встановлювати гетерозиготне носійство МЛД (патенти № 54174 А від 17.02.2003, № 51468 А від 15.11.2002). Показано, що у осіб з псевдодефіцитом АСА активність ферменту in vitro знижена при температурі 37?С (стандартний метод визначення за Баумом). Але, за умови інкубації реакційної суміші при температурі 4 ?С протягом 18 годин, активність арилсульфатази А зберігається нормальною. Таким чином, при паралельному визначенні за Баумом та модифікованим нами методом, активність ферменту при МЛД буде зниженою в обох випадках, тоді як при псевдодефіциті АСА зниження активності буде спостерігатися тільки при визначенні за Баумом, а при використанні модифікованого методу вона буде знаходитись у межах норми.

Було проведено контроль якості вимірювань активності АСА модифікованим методом. Коефіцієнти внутрішньосерійної та загальної варіації не перевищували гранично допустимого значення, що свідчить про можливість застосування цієї методики з діагностичною метою. Також було встановлено рівень нормальної активності АСА при визначенні за цією методикою в групі контролю у осіб з доведеною молекулярно-генетичним методом відсутністю псевдодефіциту АСА. Нормальна активність АСА при визначенні за модифікованою методикою, становила 241,7 ± 19,7 нмоль/ мг білка за 18 год.

Диференціація дійсного дефіциту та псевдодефіциту АСА в групі осіб зі зниженою активністю АСА. У дітей зі зниженою активністю АСА було проведено паралельне визначення активності АСА за Баумом та модифікованим методом. Крім того, всім дітям цієї групи було проведено визначення ПД-алеля молекулярно-генетичним методом. У трьох дітей, у яких в гені АСА було знайдено алель псевдодефіциту АСА (Р.А., Шн.Д. та Ж.А.), активність АСА була знижена при визначенні за Баумом, але, за умови інкубації зразків при температурі 4 є?, активність АСА була нормальною. У пацієнта Ф.М. з підтвердженою молекулярно-генетичним методом наявністю псевдодефіциту АСА, активність АСА була різко знижена при обох способах визначення. На підставі цього пацієнтам Р.А., Шн.Д. та Ж.А. діагноз МЛД було відхилено, тоді як пацієнту Ф.М. діагноз МЛД підтверджено.

Справедливість нашого припущення щодо можливості диференціації дійсного дефіциту та псевдодефіциту АСА за допомогою модифікованої нами методики визначення активності АСА було перевірено і підтверджено у 11 осіб з псевдодефіцитом АСА, наявність якого було доведено молекулярно-генетичним методом.

Аналіз даних біохімічного та молекулярно-генетичного обстеження хворих на МЛД, членів їхніх родин та осіб з псевдодефіцитом АСА. Спираючись на результати проведеної нами роботи із стандартизації та оптимізації методу біохімічної діагностики МЛД, було проаналізовано значення активності АСА у пацієнтів з МЛД, членів їхніх родин, осіб із псевдодефіцитом АСА та осіб контрольної групи з використанням статистичних методів. При виявленні зниженої активності АСА відсутність псевдодефіциту АСА перевіряли за допомогою молекулярно-генетичних методів.

Нами було сформовано п’ять груп осіб: група А – пацієнти з МЛД (11 осіб); група Б – діти з неврологічними порушеннями іншого генезу (66 осіб); група В – гетерозиготні носії мутацій в гені АСА (15 осіб); група Г – особи з псевдодефіцитом АСА (14 осіб); група Д – здорові особи без ПД-алеля (53 особи). Підставою для зарахування індивідуума до тієї чи іншої групи був комплекс клінічних, біохімічних та молекулярно-генетичних даних.

На рис. 3.1 графічно представлено взаємне розташування меж значень активності АСА всіх груп при визначенні за Баумом. Статистичний аналіз цих даних показав, що існує статистично достовірна відмінність активності АСА між групами, але межі значень в групах А і Г та В і Г суттєво перекриваються. Тобто, якщо результати вимірювання активності АСА за стандартним методом у конкретної особи потрапляють у ділянку перекривання, виникають великі труднощі при розмежуванні дійсного дефіциту та псевдодефіциту АСА, а також при визначенні гетерозиготних носіїв МЛД-мутацій та ПД-алеля в гені АСА.

Рис. 3. Розподіл значень активності АСА за групами при стандартному методі визначення (1) та за нашою модифікацією (2): А – пацієнти з МЛД; Б – пацієнти з неврологічною симптоматикою іншого генезу; В – гетерозиготні носії МЛД; Г – особи з псевдодефіцитом АСА; Д – здорові особи без ПД-алеля

Статистичний аналіз результатів вимірювань активності АСА модифікованим методом показав, що при температурі 4?С межі значень активності ферменту в групах пацієнтів з МЛД (група А) та осіб з псевдодефіцитом АСА (група Г), а також гетерозиготних носіїв МЛД (група В) та осіб з псевдодефіцитом АСА (група Г) взагалі не перекриваються (рис. 3.2). Крім того, з рисунку 3.2 видно, що існує чітке розмежування активності АСА у хворих на МЛД (група А), гетерозиготних носіїв (група В) та осіб, які не мають цієї патології (групи Б, Г і Д).

Таким чином, використання запропонованої нами модифікації методу визначення активності АСА дозволяє достовірно диференціювати хворих на МЛД та пацієнтів із неврологічною симптоматикою іншого генезу, навіть за умови наявності у останніх алеля псевдодефіциту АСА. Крім того, завдяки нашій модифікації, встановлення статусу гетерозиготного носія МЛД біохімічним методом за рівнем достовірності не поступається молекулярно-генетичним методам визначення генотипу особи.

Алгоритм лабораторного обстеження осіб при підозрі на наявність захворювання або обтяженість МЛД. Проаналізувавши результати проведеного нами комплексного біохімічного і молекулярно-генетичного обстеження пацієнтів з МЛД, членів їхніх родин, осіб з псевдодефіцитом АСА та здорових осіб, було створено алгоритм раціонального лабораторного обстеження при підозрі на наявність МЛД або обтяженість цією патологією (рис.4).

Обстеженню підлягають пацієнти, неврологічні порушення у яких подібні до МЛД. Серед здорових осіб лабораторному обстеженню підлягають члени родин пацієнтів із встановленим діагнозом МЛД, подружні пари, які мали померлу дитину із встановленим чи непідтвердженим діагнозом МЛД в анамнезі або при проспективному обстеженні близькородинного шлюбу.

На першому етапі обстеження слід проводити визначення активності АСА з використанням стандартної методики за Баумом з урахуванням встановленої нами кількості білка в досліджуваному зразку. Граничним значенням, яке обумовлює розподіл осіб на цьому етапі на дві групи, є активність АСА 83 нмоль/год/мг білка, що становить М+3? для групи гетерозиготних носіїв МЛД. Висока цінність цього етапу обстеження полягає в тому, що у осіб з активністю АСА вище 83 нмоль/год/мг білка однозначно вирішується питання про відсутність мутацій в гені АСА, а неврологічні порушення у таких індивідуумів оцінюються як спричинені іншими чинниками. Як показали наші дослідження, у більшості осіб групи пошуку (58 з 79, тобто 73% в дослідженій нами групі пацієнтів з підозрою на МЛД) виявили саме таку активність. Таким чином, кількість осіб, які потребують подальшого детальнішого обстеження значно зменшується вже на першому етапі.

I ЕТАП Визначення активності АСА при 37?С

II ЕТАП Визначення активності АСА при 4?С

III ЕТАП Молекулярно-генетичне Молекулярно-генетичне

дослідження мутацій визначення

в гені АСА ПД-алеля

Рис. 4. Алгоритм обстеження осіб при підозрі на наявність або обтяженість МЛД

Другий етап обстеження полягає у визначенні активності АСА модифікованим нами методом, який дозволяє виокремити осіб з активністю нижче 83 нмоль/год/мг білка при визначенні за Баумом на три підгрупи. Критерієм зарахування особи до тієї або іншої підгрупи є верхня гранична активність АСА (М+3?) при модифікованому методі визначення для досліджених нами груп осіб. Важливість другого етапу обстеження обумовлена високою інформативністю значень активності АСА, отриманих при цьому методі визначення. Фактично, цей етап дозволяє, без залучення молекулярно-генетичних методів, виокремити: хворих на МЛД (активність АСА нижче за 66 нмоль/год/мг білка); гетерозиготних носіїв МЛД (активність АСА в межах 85 – 168 нмоль/год/мг білка); осіб із псевдодефіцитом АСА, здорових або з неврологічною симптоматикою іншого генезу (активності АСА вище за 168 нмоль/год/мг білка).

При підтвердженні діагнозу або носійства МЛД, подальше обстеження проводиться з використанням молекулярно-генетичних методів для встановлення типу мутацій в гені АСА, що призвели до розвитку хвороби. Стратегія молекулярно-генетичного обстеження є загальноприйнятою: на першому етапі проводять скринінг мажорних мутацій, якими у випадку МЛД є “I”- та “А”-алелі, за відсутності мажорних мутацій проводять секвенування послідовності гена АСА для визначення молекулярних порушень, що призвели до розвитку захворювання.

Впровадження розробленого нами алгоритму в практику Медико-генетичного центру УДСЛ “ОХМАТДИТ” дозволило протягом одного року провести диференційну діагностику в 34 родинах, які мають дітей з МЛД-подібними неврологічними порушеннями. У 30 родинах діагноз МЛД було відхилено; в одній родині було підтверджено діагноз МЛД у пробанда і гетерозиготне носійство у батьків; у двох родинах, які мали дітей із підтвердженим раніше діагнозом МЛД, було встановлено гетерозиготне носійство у родичів другого ступеня спорідненості та в одній родині було відхилено діагноз МЛД у пацієнта з псевдодефіцитом АСА, що дозволило запобігти хибнопозитивній діагностиці.

Таким чином, розроблений нами алгоритм обстеження осіб при підозрі на наявність МЛД або обтяженість цією патологією дозволив раціонально і з великим ступенем достовірності ідентифікувати хворих та гетерозиготних носіїв МЛД, а також диференціювати дійсний дефіцит та псевдодефіцит АСА, що в цілому зменшує часові, фінансові та фізичні витрати на проведення обстеження іншими методами. Крім того, алгоритм дозволяє, використовуючи біохімічні методи, чіткіше окреслювати групу родин, обтяжених МЛД, які потребують молекулярно-генетичного дослідження з метою отримання інформації для подальшої пренатальної діагностики.

ВИСНОВКИ

1. Визначено розповсюдженість мажорних мутацій (“І”- та “А”-алелів) гена АСА у хворих на МЛД в Україні. Сумарна частота мажорних мутацій склала приблизно 20%, що нижче середньоєвропейської (47%).

2. Підтверджено генотип-фенотипічні кореляції, описані для мажорних мутацій в гені АСА: гомозигота за “І”-алелем мала пізній інфантильний тип МЛД; компаундні гетерозиготи за “А”-алелем та іншими мутаціями мали ювенільний тип МЛД.

3. Визначено частоту алеля псевдодефіциту АСА серед населення України. Алель псевдодефіциту знайдено у 18 з 234 обстежених хромосом, що склало 7,7 %.

4. Розроблено модифіковану версію методу біохімічної діагностики МЛД, яка базується на виявленні дефіциту активності арилсульфатази А в гомогенаті лейкоцитів при особливих умовах визначення і дозволяє розмежувати дійсний дефіцит і псевдодефіцит АСА, а також встановлювати гетерозиготне носійство МЛД.

5. Стандартизовано умови проведення аналізу визначення активності АСА