Національна Академія Наук України

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця

Островська Ольга Ігорівна

УДК 577.354+615.322:612.822

Механізми взаємодії FMRFa-подібних пептидів з

протон-активованими каналами в сенсорних нейронах щурів

03.00.02 – біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Киiв – 2003

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі фізико-хімічної біології клітинних мембран Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.

Науковий керівник: академік НАН України, доктор біологічних наук

Кришталь Олег Олександрович,

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України,

зав. відділом фізико-хімічної біології клітинних мембран.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук

Федулова Світлана Анатоліївна,

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України,

провідний науковий співробітник

відділу загальної фізіології нервової системи;

кандидат біологічних наук

Пархоменко Микола Тимофійович,

Інститут біохімії ім. Паладіна НАН України,

провідний науковий співробітник відділу нейрохімії.

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка,

біологічний факультет, кафедра біофізики.

Захист відбудеться "__2___" ___грудня_______ 2003 р. о "__14_" годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий "__30__" __листопада__ 2003 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми.

Ацидоз тканин – звичайне явище при хворобах, асоційованих із хронічним болем, таким як запалення, серцева ішемія, ріст пухлин. Периферичні нервові закінчення волокон, що відповідають за больову чутливість (ноціцептори), збуджуються під дією низьких значень рН.

Протон-активовані струми широко розповсюджені в сенсорних нейронах, в тому числі в найменших за діаметром, ноціцептивних. Ці макроскопічні струми протікають через протон-чутливі іонні канали ASICs, що мають домінуючу натрієву провідність. На даний момент відомо 7 субодиниць ASICs. Той факт, що різні субодиниці здатні утворювати гетеромультимери, передбачає виявлення великої кількості фармакологічно роздільних струмів. Ще на зорі вивчення протон-активованих каналів було виявлено 3 основні типи струмів, що мають різну кінетику.

Враховуючи те, що практично будь-які метаболічні порушення, а також пошкодження, приводять до закислення тканин, питання про зв’язок до цього часу незрозумілої функції протон-чутливих каналів із ноціцепцією стає все більш інтригуючим. Однак роль субодиниц ASICs в ноціцепції досі чітко не встановлена. Дослідження, проведені на нокаутних мишах, дали суперечливі результати. Однак в інших дослідженнях була висунута гіпотеза про критичну роль ASIC3 субодиниці при серцевому болю.

Лімітуючим фактором у вивченні цього питання є гостра нестача селективних лігандів ASICs. Новий поштовх до вирішення проблеми дали дослідження, у яких було показано, що Phe-Met-Arg-Phe-амід (FMRFамід) – ендогенний пептид безхребетних і деякі споріднені йому пептиди, у тому числі нейропептид FF, який присутній у ссавців, модулюють струми, що протікають через канали ASICs. Було також показано, що ці пептиди по-різному діють на різні субодиниці ASICs. Ще раніше було відомо, що пептиди FMRFaмід і нейропептид FF модулюють сприйняття болю.

У світлі виявлених нових можливостей модуляції ASICs пептидами, стає актуальним питання: наскільки специфічна FMRFa-подібна структура молекули нейропептиду для зв’язуючого локусу каналу? Вивченню цього питання була присвячена наша робота.

Мета і завдання дослідження.

Мета даного дослідження – вивчити взаємодію FMRFa-подібних пептидів із протон-активованими каналами сенсорних нейронів щурів. Завдання, які необхідно було вирішити для досягнення поставленої мети, полягали в наступному:

1. Використовуючи метод фіксації потенціалу в конфігурації “ціла клітина” та внутрішньоклітинної перфузії в нейронах спінальних і тригемінальних гангліїв щурів, виділити підкласи протон-активованих каналів, що мають різні електрофізіологічні характеристики і співвіднести їхню експресію із анатомічною локалізацією та діаметром нейронів.

2. Визначити електрофізіологічні характеристики впливу ряду FMRFa-подібних пептидів ендогенного і синтетичного походження на протон-активовані канали сенсорних нейронів щурів і виявити особливості взаємодії FMRFa-подібних пептидів з різними підкласами цих каналів.

3. Дослідити механізм взаємодії ендогенних RFa-подібних пептидів із протон-активованими каналами.

4. На основі даних, отриманих при вирішенні завдань 2 і 3, провести аналіз відповідності структури RFa-подібних пептидів та їх активності при взаємодії з протон-активованими каналами сенсорних нейронів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Робота виконувалася в рамках наукових тем відділу фізико-хімічної біології клітинних мембран інституту фізіології ім. О.О. Богомольця, а також проекту INTAS 2001-0651.

Наукова новизна одержаних результатів.

У роботі вперше проведена систематизація характеристик протон-активованих струмів у сенсорних нейронах. Вивчено вплив ряду раніше недосліджених RFa-подібних пептидів ендогенного (FLRFa, FIRFa, YMRFa, FTRFa) і синтетичного походження на протон-активовані струми в сенсорних нейронах. Уперше запропоновано механізм дії ендогенних RFa-пептидів і проведено детальний аналіз кореляції хімічної структури пептиду з активністю його дії на протон-активований струм у сенсорних нейронах щурів. Виявлено, що FMRFa у D-конфігурації виявляє таку ж активність, як і його L-аналог. Отримані нами дані проясняють механізм взаємодії RFa-подібних пептидів із протон-активованими каналами. Ця інформація вказує на специфічний характер цієї взаємодії з ноціцептивними нейронами, що також виявлено вперше.

Практичне значення одержаних результатів.

Результати проведеної роботи можуть бути використані для вибору найбільш перспективних пептидів для дослідження in vivo, а також для наступного синтезу потенційних фармакологічних агентів, що діють на протон-активовані канали.

D-FMRFa може бути випробуваний як фармакологічний агент, оскільки пептиди D-конфігурації не зачіпаються ферментами-рестриктазами в організмі.

Особистий внесок здобувача.

Автором особисто були проведені всі електрофізіологічні експерименти з ендогенними RFa-подібними пептидами і розробка деяких лабораторних методик. Автором самостійно проведено систематизація та аналіз всіх одержаних результатів і зроблені всі висновки. Скрінінг RFa-подібних пептидів синтетичного походження проводився разом зі співробітниками інституту фізіології ім. О.О. Богомольця асп. Бекетовим А.Г., к.б.н. Лішко П.В. і к.б.н. Цинцадзе Т.Ш. Одержання первинної культури сенсорних нейронів проводилося разом із к.б.н. Волковою Т.М.

Апробація результатів дисертації.

Основні положення і висновки дисертації доповідались й обговорювались на Міжнародному Симпозіумі “Мембрана та сигнальна передача” (Київ, 2000), 13-ій Європейській Конференції Студентів і Аспірантів (Німеччина, Берлін, 2002), Міжнародний Конгрес Молодих Учених (Нідерланди, Лейден, 2003), Всеукраїнській науково-практичній конференції “Сучасні технології органічного синтезу та медичної хімії” (Харків, 2003), 3-ому Конгресі Федерації Європейських Фізіологічних Товариств (Ніцца, Франція, 2003), 6-ому Світовому Конгресі Нейронаук (Прага, Чехія, 2003).

Публікації.

Результати роботи опубліковані в 9 роботах, з яких 3 складають статті у вітчизняних та зарубіжних наукових виданнях та 6 – тези доповідей на наукових конференціях.

Структура та обсяг дисертації.

Дисертація складається з вступу, літературного огляду, матеріалів і методів дослідження, результатів дослідження, обговорення результатів, висновків, списку використаної літератури із 112 найменувань і додатків. Робота викладена на 146 сторінках, містить 37 рисунків, 14 таблиць, 2 додатки (на 9 сторінках).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Літературний огляд. Розглянута історія відкриття та дослідження протон-активованих каналів та RFa-подібних нейропептидів.

Матеріали та методи досліджень.

Об’єкт досліджень. Дослідження проводились на ферментативно ізольованих та культивованих нейронах спінальних й тригемінальних гангліїв щурів лінії Вістар віком 5-10 діб. Ганглії, що виділялися, занурювали на 30-50 хв. у розчин буферу PBS, що насичувався карбогеном (95% О2, 5% СО2) та містив 0.3% трипсину й 0.1% колагенази при t = 32?С. Після ферментативної обробки ганглії поміщали в чашки Петрі із середовищем DMEM. В невеликому об’ємі цього середовища ганглії розпорошувалися металевими голками та багаторазово пропускались крізь скляну піпетку до одержання суспензії ізольованих нейронів. Суспензію нейронів переносили в чашки Петрі на покривні скельця. Чашки заповнювались середовищем наступного складу: 45% ?-MEM, 45% DMEM, 10% теляча сироватка. Культуру, що посадили, знаходилась в інкубаторі при 37?С в атмосфері 95% повітря й 5% СО2. В дослідах використовувалась 1-2 добова прикріплена культура.

Методи досліджень. Реєстрація іонних струмів через мембрану нейронів проводилася методом внутрішньоклітинної перфузії із використанням скляних мікропіпеток, які мали опір 2-5 МОм. Піпетки заповнювалися внутрішньоклітинним розчином (в мМ): TrisPO4 50, TEA-Cl 40, EGTA 5, Tris-HCl 20, рН 7.25. Як позаклітинний розчин використовувався розчин Рінгера (РР) (в мМ): NaCl 130, KCl 5, CaCl2 2.5, HEPES/MES 10, pH доводився розчином NaOH. Піпетку з нейроном вміщували в отвір V-образної скляної трубки, що занурена у позаклітинний розчин. Програмно кероване відкривання клапана дозволяло швидко змінювати розчин в V-образному коліні трубки. Робилась швидка зміна РР з кондиціонуючим рН на РР с активуючим рН. При цьому спостерігався вхідний струм, який блокувався амілоридом. Даний струм ідентифікувався як амілорид-чутливий протон-активованый струм. Синхронно з відкриванням клапана проводився запис струму, що протікає через мембрану досліджуваного нейрона. Сигнал поступав на контрольний осцилограф і аналогово-цифровий перетворювач, підключений до інтерфейсу прямого доступу до пам'яті персональної ЕОМ. Всі реактиви, які використовувалися в роботі, були вироблені фірмами Sigma (USA) та Gibco (Scotland). Усі пептиди були люб'язно надані доктором Л. Морозом (Університет Флориди, США).

Результати досліджень.

Властивості протон-активованих каналів в сенсорних нейронах

Ми досліджували більш 600 нейронів, які виділялися із спінальних та тригемінальних гангліїв щурів. Із них приблизно половина відповідала на швидкий спад рН с 7.4 до 5.2 вхідним струмом, що десенситизується, із амплітудою піку 0.2 – 20 нА. Ми виділяли 3 групи клітин: великі (діаметр складав 10-20 мкм), середні (25-30 мкм) й маленькі (35-60 мкм). Як нами було з’ясовано, середні клітини могли в рівній мірі мати характеристики, які притаманні великим або маленьким клітинам.

Кінетичні характеристики протон-активованого струму. Відповідно із даними Кришталя й Підоплічко, ми виявили 3 типи протон-активованих струмів, які викликані ступеневим закисленням зовнішнього середовища: швидкі струми, в яких десенситизація розвивалася в межах 2-5 с (приблизно 60% від всіх досліджуваних клітин, що мали протон-індуковану провідність); середні (5-10 с, 30%); повільні, що затухають за час 10 с й більш (10%). Це спрощене розподілення, оскільки багато нейронів демонструвало відповіді змішаної кінетики. Кінетика спаду протон-активованої провідності була досліджена в 111 нейронах апроксимацією кривої десенситизації із похибкою в межах 10% за формулою:

I = I0 + Afast*exp(-1/?fast*t) + Aslow*exp(-1/?slow*t) (1) або I = I00 + A*exp(-1/?*t) (2), де I – струм в момент часу t, I0 – струм, що не десенситизується, Afast й Aslow – амплітуда кожної експоненти, ?fast й ?slow – часові константи десенситизації, I0 + Afast + Aslow = 1 для формули (1); A + I0=1 у випадку формули (2). Для процедури апроксимації кожна крива була обрізана до моменту пікового значення й нормована до від’ємного значення піку. Переважна більшість швидких струмів апроксимувалось багатоекспоненціальним рівнянням (2). Компонента струму, що не десенситизується, I00 зустрічалася нечасто й складала менш 10% від амплітуди струму.

Різноманітність відповідей за кінетикою затухання спостерігається завдяки неоднаковій експресії субодиниць ASICs від клітини до клітини: досліджувана нами клітинна лінія HEK-293T, яка експресує ASIC1? субодиницю, демонструвала моноекспоненціальні відповіді, із ? = 1314?395 мс (N = 7).

Ми не зафіксували суттєвої різниці за параметром кінетики струму в клітинах спінальних й тригемінальних гангліїв.

Результати апроксимації кривих десенситизації для 80 клітин великого й середнього діаметра представлені на рис. 1А.

А Б В

Рис. 1. Розподілення значень констант десенситизації 80 нейронів великого/середнього (А) та 30 – маленького (Б - гістограма для 15 швидких нейронів, В - 15 повільних) діаметрів; на вкладках зображено типовий струм для кожної групи.

Із 80 десенситизаційних кривих нейронів діаметра 25-50 мкм 23 апроксимувались біекспоненціальною функцією із переважним вкладом швидкої компоненти, 2 були повільні моноекспоненціальні та решта – швидкі моноекспоненціальні. Перший пік гаусівського розподілення 330188 мс на рис. 3.1 відповідає ?fast моно- та біекспоненціальних нейронів. Другий менший пік 1366864 мс відповідає ?slow біекспоненціальних нейронів. У повільних нейронів ???було 3927 й 4224 мс. На рис. 1 Б,В представлені результати апроксимації 30 десенситизаційних кривих маленьких за діаметром нейронів. Із них 15 швидких моноекспоненціальних (рис. 1Б) та 15 повільних - 10 моноекспоненціальних й 5 біекспоненціальних (рис. 1В). Гістограма для швидких маленьких клітин має 2 піка за Гаусом: 129?45 й 353?133 мс, таким чином, швидкі струми у великих та маленьких сенсорних нейронах вельми схожі.

Характеристики стаціонарної активації протон-активованого струму. Ми дослідили 20 клітин різної анатомічної локалізації, діаметра та кінетики. Піки відповідей, одержаних при різних активуючих рН (кондиціонуючий рН бів постійним – 7.4), апроксимувались за рівнянням I/Imax=1/(1+exp((pH-pH50)/k (3), де I – пік протон-активованого струму при активуючий концентрації протонів 10-рН, Imax – максимальний струм, одержаний при насичуючому рН, pH50 – активуючий рН, при якому досягається 50% струм від максимального, k – коефіцієнт крутизни кривої. Коефіцієнт Хіла визначався за рівнянням Хіла I/Imax = [H+]n/([H50]n+[H+]n (4), де I – пік протон-активованого струму при активуючий концентрації протонів [H+], Imax – максимальний струм, одержаний при насичуючому рН, n - коефіцієнт Хіла, [H50] – концентрація протонів, при якій досягається половинний від максимального пік струму.

Характеристики різних груп клітин практично відрізнялись (рис. 2). рН половинної активації виявився 6.330.04 (N=10) для нейронів спінального ганглію та 6.320.04 (N=7) для нейронів тригемінального ганглію. Слід відмітити деякі окремі винятки – клітини з підвищеною або зниженою чутливістю к рН. Набрати статистику для таких випадків було важко.

Рис. 2. Криві стаціонарної активації протон-активованих струмів: 1 – клітини DRG; 2 – клітини тригемінального ганглію; 3 – приклад клітини з підвищеною чутливістю до рН, pKa 6.750.04; 4 – приклад клітини із зниженою чутливістю до рН, pKa 5.20.04.

Характеристики стаціонарної десенситизації протон-активованого струму. Було досліджено 42 нейрони великого та маленького діаметра. Піки протон-активованих відповідей, одержаних при переході із розчинів із різним кондиціонуючим рН в розчин із постійним активуючим рН 5.2, апроксимувались за рівнянням (3), коефіцієнт Хіла визначався за рівнянням (4). Дані, одержані на клітинах спінальних та тригемінальних гангліїв, різнились в межах похибки. Дані від маленьких та великих клітин в своїй більшості апроксимувались різними кривими з рН50, що відрізняються на 0.1 одиницю рН, а саме: для великих клітин це значення було 7.11±0.02, а для маленьких – 7.21±0.02 (рис. 3А).

A Б

Рис. 3. А: Криві стаціонарної десенситизації протон-активованих струмів для більшості сенсорних нейронів: 1 – великі нейрони, N = 13 (тип I); 2 – маленькі нейрони, N = 19 (тип III). Б: Приклади струмів при рН0 7.4 й 7.15: 1 – для великої клітини; 2 – для маленької клітини.

Коефіцієнти Хіла для кривих на рис. 3А розрізнялись незначно: 7.5±1 для кривої 1 й 9.4±0.06 для кривої 2. Завдяки великій крутизні вищенаведених кривих стаціонарної десенситизації різниця в 0.01 одиницю рН приводить до великої різниці в амплітуді струмів при невеликій ацидифікації зовнішнього середовища (рис. 3Б). При кондиціонуючому рН 7.15 амплітуда протон-активованих струмів, для більшості нейронів великого діаметра, що характеризуються рН половинної десенситизації стаціонарної десенситизації протон-активованого струму 7.1, складала 70% максимальної (рН0 7.4), а маленьких нейронів – тільки лише 24%.

Нам вдалося виділити ще один підклас великих клітин, переважно з біекспоненціальною кінетикою протон-активованого струму, який відрізняється драматично низькою чутливістю до кондиціонуючого рН. Для цього типу кривої стаціонарної десенситизації рН50 складав 6.78±0.02, а коефіцієнт Хіла – 2.8±0.4 (N=5).

Найбільш характерні підкласи протон-активованого струму в сенсорних нейронах щурів.

На основі аналізу проведених вище досліджень ми виділили 3 характерні підкласи протон-активованих струмів, що реєструються в наших експериментальних умовах. Характеристики підкласів наведені в таблиці 1. Можна сказати, що характерним параметром кожного підкласу є притаманна йому крива стаціонарної десенситизації.

Таблиця 1. Підкласи протон-активованих струмів в сенсорних нейронах щурів.

Хар-ка

Підклас | Кінетика

десенситизації | рН50 | Діаметр

нейронів

I | Будь-якого типу | 7.21±0.02

тип III | Переважно

маленький

II | Швидка, середня | 7.11±0.02

тип I | Переважно

великий

III | Переважно середня | 6.78±0.02

тип II | Великий

Взаємодія FMRFa-подібних пептидів з ASICs

Ефект ендогенних FMRFa-подібних пептидів.

Ми якісно підтвердили дані, одержані Асквітом та іншими в 2000 році, а також перевірили дію ще декількох нейропептидів, які були виділені із різноманітних безхребетних: YMRFa – п’явки Hirudo, FIRFa - каракатиці й аскариди, FTRFa - нереїди. Порівняння даних, одержаних нами та Асквітом й іншими, представлено в таблиці 2.

Більшість пептидів уповільнювали кінетику десенситизації протон-активованого струму.

За даними наших експериментів, FMRFa не тільки уповільнював кінетику протон-активованого струму, але й суттєво збільшував амплітуду струму. Нейропептид FF ніяк не діяв на протон-активовані канали, в той час як незначний ефект цієї сполуки на ці канали був показаний в DRG й значний ефект – на гетеромерах ASIC2a+3. Пептиди не впливали на струм в клітинній лінії, яка трансфікована субодиницею ASIC??

Таблиця 2. Дія ендогенних FMRFa-подібних пептидів на протон-активовані струми за нашим даними та Асквіта та інших.

Сенсорні нейрони (наші дані), n=3 

Пептид | I/I0±sd (%) | t0.5/t0.50±sd (%) | С (мкМ)

FMRFa | 224±22 | 276±111 | 50

FLRFa | 101±5.5 | 248±107 | 50

FIRFa | 95.5±13 | 325.5±97 | 50

YMRFa | 88±4 | 395±133 | 100

FTRFa | 107.5±30 | 94.5±15 | 50

Нейропептид FF | 100 | 100 | 50

Ефект уповільнення кінетики RFa-подібними пептидами був якісно однаковим для протон-активованих струмів із різного типу кінетикою спаду, але різним кількісно: у випадку пептиду KNFLRFa 50?M відношення t0.5 pept/ t0.5 cont було 43345% для струмів із швидкою кінетикою спаду та 14835% - із повільною та середньою кінетикою спаду (рис. 4).

Рис. 4. Ефект KNFLRFa 50 мкM на струми різного типу. 1 – приклад кривої струму з швидкою кінетикою десенситизації; 2 –з середньою кінетикою десенситизації; 3 – з повільною кінетикою десенситизації.

Дослідження Асквіта та інших показали, що крім уповільнення кінетики десенситизації RFa-подібні пептиди індукують компоненту протон-активованого струму, що не десенситизується. Ми знайшли, що дана компонента, насправді, десенситизується: на рис. 5 видно, що величина компоненти, що не десенситизується, однакова як для контрольного струму, так й для струму під дією пептиду. Причому це твердження є справедливим для нейронів, як маленького, так й великого діаметра. Таким чином, другим ефектом пептидів є індукування надповільної компоненти десенситизації ( складає в середньому від 20 с до 2 хв.).

Рис. 5. Поступова десенситизація струму до рівня базової лінії:

1 – контрольний струм, викликаний стрибком рН с 7.25 до 5.2;

2 – струм під дією YMRFa (50 мкM).

Дозозалежні зміни кінетики протон-активованих струмів під дією ендогенних FMRFa-подібних пептидів.

Досліджувались струми, яким властива швидка моноекспоненціальна кінетика десенситизації в контролі. На рис. 6A продемонстровані приклади дозозалежного ефекту FIRFa на протон-активовані струми. Ступінь уповільнення десенситизації струму прогресує із збільшенням концентрації пептидів аж до насичення.

А Б

Рис. 6. А: Ефект різних концентрацій FIRFa на кінетику десенситизації протон-активованого струму; Б: Зміна вкладу повільною й швидкою компоненти із збільшенням концентрації FIRFa, N = 7; 1 – Aslow, 2 – Afast.

Біекспоненціальна апроксимація кривих десенситизації протон-активованих струмів в контролі й під дією різних концентрацій пептиду (за формулами 1 та 2 відповідно) демонструє наступне: аплікація пептиду викликає появу повільною компоненти струму. Часова константа slow цієї компоненти не змінюється із збільшенням концентрації пептиду, в той час як її вклад Aslow зростає за рахунок зменшення вкладу первісного контрольного струму. Кінетика контрольної швидкої компоненти fast не змінюється під дією пептиду, але її амплітуда Afast зменшується із паралельним ростом амплітуди повільної компоненти Aslow. Цей процес, без врахування вкладу I0 для наочності, показано на рис. 6Б.

Ми припускаємо, що пептиди селективно діють на канали швидкого типу (або субодиниці, що утворюють ці канали) й змінюють властивості десенситизації: fast fast*. Таким чином, fast* еквівалентно slow біекспоненціальної апроксимації кривих десенситизації протон-активованих струмів, модульованих пептидом. Збільшення дози пептиду веде до збільшення кількості модульованих каналів. Цей процес відображається амплітудами швидкої й повільної компонент, таким чином, Afast й Aslow є парціальними вкладами нормальних й модульованих каналів, відповідно. Графічно процес переходу все більшої кількості каналів в модульований стан із збільшенням концентрації пептиду представлений на рис. 7.

Рис. 7. Розщеплення струму під дією FIRFa на нормальну та модульовану складову (контроль fast = 340 мс, I0=0.02).

Ефект RFa-подібних пептидів сильно залежить від величини активуючого рН.

Кінетика десенситизації струму, що протікає через протон-активовані канали сенсорних нейронів щурів, практично не залежить від величини активуючого рН (рис. 8А), який індукується активуючими рН від 6.6 до 5.2. Це твердження справедливе для струму будь-якого типу кінетики (швидка, середня або повільна) десенситизації. Тільки дуже низькі значення рН здатні активувати повільний компонент струму в деяких випадках. Ми спостерігали дуже слабке уповільнення кінетики десенситизації при значеннях рН нижче 5.5.

Під дією синтетичного пептиду KNFLRFa– N–подовженої версії ендогенного пептиду FLRFa, спостерігалась інша картина (рис. 8Б й С). Повну відсутність модулюючої дії пептиду при активуючому рН 6.8 (струм є швидким моноекспоненціальним) можна порівнювати із максимальним ступенем уповільнення струму при рН 4.0 (струм стає повільним моноекспоненціальним).

A Б

Рис. 8. Протон-активований струм, який збуджується рН від 6.8 до 4.0 при постійному кондиціонуючому рН 7.4. На А й Б криві струмів нормовані до контрольних значень піку при рНакт 5.2. А – контроль, рНакт від 6.8 до 5.2. Б – під дією KNFLRFa 50 мкМ (рНакт від 6.6 до 5.2).

Аналогічний ефект спостерігався й у випадку ендогенних пептидів FMRFa та FIRFa. Концентрація 50 мкМ була обрана, оскільки відповідає приблизно дозі половинного ефекту на кінетику десенситизації (рис. 6).

Природа цього феномену, схоже, криється в збільшенні ефективної (діючої) концентрації пептиду: як й у випадку вимірів залежності уповільнення кінетики десенситизації протон-активованого струму від концентрації пептиду, зміни кінетики десенситизації струму описувалися збільшенням амплітуди повільної компоненти Aslow за рахунок зменшення амплітуди швидкої компоненти Afast по мірі зниження значення активуючого рН, що показано на рис. 9. Значення констант десенситизації fast й slow не змінювались при прикладенні розчинів з різними активуючими рН.

АБВ

Рис. 9. Збільшення вкладу повільної компоненти струму під дією пептидів по мірі зниження значення рНакт: А - KNFLRFa 50 мкМ (N=5); Б - FIRFa 50 мкM (N=2); В - ефект FMVFa 50 мкМ на протон-активовані струми, які індукуються різними значеннями активуючого рН (кондиціонуючий рН залишався постійним – 7.4): 1 – контрольний струм, рНакт 5.2, 2 – сімейство струмів під дією пептиду при рНакт 6.6 - 5.2. Струми нормовані до пікового значення, показаного контрольного струму.

Ми припустили, що така залежність ефективної (діючої) концентрації пептиду від величини активуючого рН може бути результатом наявності аргінінового амінокислотного залишку R, який присутній у всіх RFa-пептидах ендогенного походження. Цей залишок містить гуанідинову групу (рКа ~ 12.5), яка має позитивний заряд в середовищі з рН 5 – 8. Ми перевірили, чи буде спостерігатися вищевказана залежність під дією синтетичного пептиду FMVFa, при будь-яких рН середовища, що зберігає квазі-нейтральний заряд (всі RFa-пептиди мають позитивний заряд за рахунок заряду N-кінцевої NH2 групи (рКа ~ 10), однак цей заряд практично не впливає на модуляцію пептидами протон-активованого струму). Дійсно, під дією 50 мкМ FMVFa залежність кінетики десенситизації від значень активуючого рН була вкрай незначною (рис. 9В). Слід відмітити, що FMVFa мав помітний ефект при рНакт 6.6 й навіть 6.8, в той час як такий не спостерігався в присутності ендогенних пептидів за тих же умов.

Крива стаціонарної активації не зсувалась під дією пептидів.

RFa-подібні пептиди зсувають криву стаціонарної десенситизації вздовж вісі рН.

Ми вирішили перевірити, чи супроводжується зміна кінетики спаду струму під дією пептидів змінами в залежності стаціонарної десенситизації від рН. KNFLRFa 50 мкМ не змінює криву стаціонарної десенситизації у випадку нейронів великого діаметра (криві стаціонарної десенситизації, характерні для II й III підкласів протон-активованого струму, див. табл. 1), однак зсувають її у бік більш кислих значень рН у випадку нейронів маленького діаметра (рис. 10). KNFLRFa 50 мкМ зсуває криву I типу на 0.06 одиниць рН у бік більш кислих значень, рКа кривої змінюється з 7.210.02 до 7.150.02.

Рис. 11 демонструє суттєвість зсуву кривої у випадку нейронів маленького діаметра (тип I): при рН0 7.15 пікове значення струму майже подвоюється у присутності пептиду. Зсув кривої I типу пов’язаний не з діаметром клітини, а з експресуємим механізмом: при тестуванні нейронів великого діаметра, які мають характеристику стаціонарної десенситизації III типу (а не I або II, що більш характерно для клітин великого діаметра), пептиди також зсували криву. Що цікаво, феномен зсуву також не залежить від кінетики десенситизації.

Рис. 10. Вплив пептидів на різні типи кривих стаціонарної інактивації протон-активованих струмів: А - зсув кривої III типу на 0.06 одиниць рН, ромбиками вказано дію 200 мкМ пептидів (KNFLRFa – світлий, FIRFa – темний); Б – KNFLRFa 50 мкМ не зсуває криву I типу;).

Рис. 11. Приклади струмів, одержаних при попередній інкубації клітини при різних рН0 в контролі, та при прикладенні KNFLRFa 50 мкМ для клітини зі струмом швидкою кінетики десенситизації,

Як вже було вказано, концентрація пептидів 50 мкм відповідає приблизно значенню рКа для залежності доза – ефект (уповільнення кінетики десенситизації протон-активованого струму). Дана концентрація також не є насичуючою для ефекту зсуву кривої стаціонарної десенситизації I типу, збільшення концентрації пептиду до 200 мкм приводило до значного зсуву кривої, що перевищує різницю між кривими стаціонарної десенситизації I й II типу (рис. 12). Дія FIRFa при рН0 7.17: I/I7.4 = 0.790.02; а KNFLRFa 200 мкм при рН0 7.10: I/I7.4 = 0.39.

Вплив пептидів на уповільнення кінетики десенситизації протон-активованого струму не залежало від кондиціонуючого рН.

1 2

Рис. 12. Зсув кривої стаціонарної десенситизації I типу під дією FIRFa 200 мкм: 1 –струми при рН0 7.4 в контролі й під дією FIRFa 200 мкм, 2 – при рН0 7.17 в контролі й під дією FIRFa 200 мкм.

Вплив заміщення, додавання й видалення амінокислотних залишків в ендогенному тетрапептиді FMRFа на модуляцію протон-активованих каналів.

Ми дослідили близько 180 синтетичних FMRFa-споріднених пептидів переважно L-конфігурації, в основному типи X-MRFa, F-X-RFa, FM-X-RFa, FMR-Xa. Більшість амідів уповільнювали кінетику протон-активованого струму та не впливали значно на амплітуду струму.

Загальні висновки:

1) амідна група на С-кінці є необхідною для ефекту пептидів. Наприклад, пептиди FLRF, MRF, RF практично не впливають на протон-активовані струми, на відміну від їх амідних аналогів. Ми передбачаємо, що даний ефект пояснюється тим, що наявність амідної групи приводить до посилення гідрофобності С-кінця, оскільки амідний залишок СО-NH2 є неполярним на відміну від карбоксильного залишку СООН.

2) Глутамат E та аспартат D амінокислоти в будь-якому положенні повністю нівелювали активність. E й D розрізняються всього лише на одну СH2 групу й їх наявність в пептиді приводить до появи короткого високополярного бокового ланцюга СH2-СH2-СООН або СH2-СООН, який несе надлишкову електронну густину й здатний набувати від’ємного заряду за рахунок відщеплення рухомого протону: R-COOH R-COO-.

3) Центральні АК найкращі – полярні, із недостатком електронної густини, як АК, здатні нести позитивний заряд – особливо ефективним є аргінін R. Третє положення чутливе до полярності й просторової структури, найвищу активність виявили АК з наявністю або довгого CH2-ланцюга (мінімум 3 CH2) з кінцевою полярною групою, або з -розгалуженням (наприклад, i-Pr), а також S-вмісні АК). Заміщення по другому положенню не грає великої ролі, однак N й T позбавляють активності, напевно, за причиною надлишкової електронної густини ОН групи короткого бокового ланцюга треоніна Т. Кінцеві АК, напевно, відіграють роль гідрофобних якорів. Схоже, що структурні вимоги виявились придатними й у випадку активації каналу FaNaC RFa-пептидами.

4) N-кінцеве подовження ланцюгу не знімає активності, як у випадку, наприклад KNFLRFa, FNFLRFa, PQYPFLRFa, YPFLRIa.

5) FMRFa в D-конфігурації проявляє якісно таку ж, але кількісно в більшій мірі, активність на уповільнення кінетики десенситизації протон-активованого струму, як й L-аналог (t0.5cont/t0.5pep = 576% в концентрації 50 мкМ, N=3). Однак, D-FMRFa виявився не здатний індукувати струм через канал FaNaC.

6) RRFa виявив найбільш сильну дію як на амплітуду, так й на кінетику струму. Така подвійна дія характерна й для інших трипептидів з центральним R (CRFa, MRHa, KRFa, QRFa, MRRa).

7) Аргінін R ефективний в будь-якому положенні, а пептиди, які мають 2 аргінінових залишки, відрізняються підвищеною активністю, наприклад FRRFa (t0.5cont/t0.5pep = 624% в концентрації 50 мкМ, N=4). FMRHa й FHRFa з гістідіном H у 2-ому й 4-ому положеннях теж виявили високу активність. Ми передбачаємо, що дія вищевказаних пептидів на уповільнення кінетики протон-активованого струму опосередковано гуанідіновим залишком аргініну й ізостеричним йому амідіновим фрагментом гістідіну. Відсутність або слабко виражений ефект на уповільнення кінетики протон-активованого струму у випадку пептидів HMRFa й FMHFa може пояснюватися тим, що в цих пептидах структурне розташування амідінового фрагменту гістідіна, певно, не дозволяє йому прийняти потрібну конформацію при взаємодії з локусом каналу, або ж перешкоджати нормальній взаємодії аргінінового бокового ланцюга із цим же локусом.

Обговорення результатів

Давно відомо, що нейрони периферичної нервової системи виконують сенсорно-моторну функцію, але механізми цих функцій і по цей день ретельно не прояснені. За останні роки почали стрімко накопичуватися відомості, що не останню роль в цих функціях грає родина протон-чутливих іонних каналів – ASICs.

Варіабельність характеристик протон-активованого струму в сенсорних нейронах

Ми зареєстрували цілу родину різних по основним характеристикам протон-активованих струмів та прийшли до двох основних висновків: 1) характеристики протон-індукованої провідності не залежать від анатомічної локалізації нейронів; 2) характеристики протон-індукованої провідності залежать від діаметра соми нейронів. Одержана різноманітність характеристик із розподілення за кінетикою десенситизації струму можна привести у відповідність з експресією різних типів ASICs. Можна припустити, що ASIC3, ASIC1 й ASIC2 гетеромери мають вклад у перший пік розподілення на рис. 3.1 та в обидва піки розподілення на рис. 3.2А. Струм в нейронах маленького діаметра, що має повільну кінетику десенситизації (рис. 3.2Б), напевно, опосередкований каналами із суттєвим вкладом субодиниці ASIC1.

Характеристика стаціонарної інактивації протон-активованих каналів залежить від діаметра сенсорних нейронів.

Ми виявили 3 яскраво виражених типи кривих стаціонарної інактивації в сенсорних нейронах щура, які мають кореляцію з діаметром нейронів та тільки 1 характерний тип кривої стаціонарної активації. Знайдені нами вперше 2 типи кривих (1 й 2-ой типи) мають близькі коефіцієнти Хіла 8±2 при рН половинної десенситизації 7.11, характерний для великих клітин й 7.21 – для маленьких. Наскільки значна різниця у 0.1 одиницю рН для сигнальної функції сенсорних нейронів? Точність контролю рН в крупних судинах складає ±0.01 одиницю рН: зсув рН крові з 7.4 до 7.2 є вже небезпечним для життя; а флуктуації цього параметру для плазми при нормальному функціонуванні не перевищує ±0.03 одиниці рН. Локальні зміни рН можуть бути значно великими, звичайно вони викликані змінами в переносі та забезпеченні киснем й, таким чином, ведуть до ацидозу. Стаціонарна десенситизація протон-активованої провідності з рН50 в межах 7.0 – 7.25 й драматично крутим нахилом кривої, напевно, є ідеальним кандидатом в ультрачутливі сенсори змін рН. Проблема, що залишається – джерело швидкого вивільнення кислоти. Однак, практично всі продукти екзоцитозу мають кислий рН, включаючи продукти секреторної активності тучних клітин.

Різні підкласи протон-активованих струмів в сенсорних нейронах, напевно, виконують різні функції.

Механізм дії RFa–подібних пептидів на протон-активовані канали.

Передбачається, що модулююча дія FMRFa–подібних пептидів є селективною по відношенню до мономерних та гетеромерних каналів, які утворені DRG-специфічною субодиницею ASIC3. Як часткове підтвердження цьому передбаченню, ми не виявили модулюючої дії ендогенних FMRFa–подібних пептидів на протон-активовані канали в мембрані клітин HEK-293T, трансфекованих субодиницею ASIC, більш того, сила дії одного й того ж пептиду в однаковій концентрації могла суттєво відрізнятися в різних клітинах. Таким чином, із всього вищесказаного випливає висновок, що переважна більшість, якщо не усі, протон-активовані канали, які експресуються в сенсорних нейронах щурів, є гетеромерами ASIC3 та інших субодиниць й мономерами ASIC3.

Ми виключили можливість прояву ефекту пептидів шляхом взаємодії на внутріклітинні посередники: результати дослідів з використанням внутріклітинних розчинів TrisPO4 й KF статистично не відрізнялись.

Для побудови моделі взаємодії RFa-подібних пептидів з протон-активованими каналами сенсорних нейронів щурів ми також врахували дані, одержані Асквітом та іншими. Було висунуто припущення, що пептид зв’язується з локусом каналу в закритому стані при нейтральних рН та виявляється “спійманий у пастку” при наступному відкритті каналу при прикладенні активуючого рН.

Вимальовується наступна загальна модель механізму дії RFa-подібних пептидів: пептид приєднується до свого зв’язуючого сайту рецептора в закритому стані й виявляється щільно закріпленим в цьому сайті при наступному відкритті каналу. Це стає можливим завдяки конформаційним змінам, що відбуваються при активації каналу. Змінюється конформація каналу у відкритому стані та, як наслідок, модулюється струм. Напевно, спійманий у пастку пептид перешкоджає нормальній десенситизації каналу. Модуляція струму виражається як дозозалежний перехід Afast Aslow. Цей перехід відповідає, таким чином, перетворенню каналу, що характеризується виразом fast *fast, де *fast це константа десенситизації повільної компоненти струму, тобто slow.

Зв’язування пептидів з каналом відбувається при нейтральних рН, при цих умовах пептиди знаходяться переважно в незарядженій формі. Це можливо, оскільки кінцеві амінокислоти, які входять у склад пептидів, такі як F, L, M є гідрофобними та можуть проникати в мембранний бішар неподалік від зовнішнього отвору каналу.

Ми також виявили залежність дії ендогенних RFa-пептидів та їх похідних від активуючого рН, цей феномен, схоже, обумовлений наявністю аргінінового амінокислотного залишку R. Всі відомі ендогенні FMRFa-подібні пептиди мають RFa залишок. Відомо, що єдиний на даний момент відомий синтетичний блокатор каналів родини ENaC/DEG – амілорид та деякі його похідні – також мають в своєму складі гуанідінову групу (яка присутня також в R). Позитивний заряд гуанідінової групи є необхідною умовою для прояву блокуючої дії амілориду на протон-активовані канали. Порівнюючи залежність структура-ефект для взаємодії FMRFa-подібних пептидів з протон-активованими каналами ASICs та пептид-активованими каналами FaNaCs, можна передбачити, що, не зважаючи на різницю в будові каналів цих підродин, вимоги до будови пептидів у них схожі. Пептиди, які проявляють активність стосовно каналів ASICs й FaNaCs, мають аргінін із зарядженою гуанідіновою групою в оточенні ліпофільних амінокислот.

Все вищесказане може мати відношення до незвичайного явища рН-залежності модулюючої дії FMRFa-подібних пептидів на протон-активовані канали. Напевно, за цей ефект відповідає електростатична взаємодія між зарядженим боковим ланцюгом аргініну в пептиді й рецептором каналу. Дослід з синтетичним пептидом FMVFa підтвердив цю ідею. Слід відмітити, що даний експеримент також підкреслює різницю в механізмі взаємодії протон-активованих каналів із RFa-пептидами, зарядженими позитивно, й нейтральними пептидами. Потенціальним кандидатом на роль “рН-сенсора” каналу в районі рН 5-7 є гістідіновий залишок (His) з рКа бокового ланцюга 6.04.

RFa–подібні пептиди розрізняють протон-активовані канали ноціцептивних й механочутливих сенсорних нейронів.

Ми відкрили, що пептиди здатні посилювати функцію протон-активованих каналів при ацидозі шляхом зсуву кривої стаціонарної десенситизації в маленьких клітинах, але вельми слабко або зовсім ніяк – у великих клітинах. Це спостереження привертає увагу у зв’язку із асоціацією сенсорних нейронів з їх функціями в залежності від діаметра: маленькі клітини є ноціцепторами, а великі – механорецепторами. Таким чином, можна припустити, що криві стаціонарної десенситизації протон-активованих каналів також можна співвіднести із ноціцептивною або механочутливою функцією. Достатньо логічно припустити, що крива з pH50 7.21 відповідає протон-активованим каналам ноціцепторів, а з pH50 6.78 – механорецепторів або клітин с якимись специфічними сигнальними функціями. Клітини з каналами, які характеризуються кривою з pH50 7.11, крім механорецепторної, можуть мати змішану функцію, із врахуванням того, що такий тип кривої може зустрічатися й в маленьких клітинах. Наші результати показують, що FMRFa-подібні пептиди здатні змінювати чутливість ноціцепторів до протонів, так само, як і часовий характер їх активності. Найшвидше, пептиди посилюють ноціцептивну функцію шляхом збільшення вкладу протон-активованого струму, що забезпечується клітинами-ноціцепторами. Це сміливе передбачення цілком узгоджується з одержаними із дослідів in vivo даних, що FMRFa-подібні пептиди посилюють відчуття болю у ссавців. Оскільки RFa-пептиди були знайдені у ссавців, вони можуть грати певну роль в модуляції сенсорних