НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

ОНИЩЕНКО ОЛЬГА МИХАЙЛІВНА

УДК 579.68+579.264

ТАКСОНОМІЯ І АНТИБІОТИЧНА АКТИВНІСТЬ ALTEROMONAS-ПОДІБНИХ БАКТЕРІЙ ЧОРНОГО МОРЯ

03.00.07 – мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ – 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі антибіотиків Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України.

Науковий керівник: академік НАН України, професор Смірнов Валерій Веніамінович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу антибіотиків, директор Інституту

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Романовська Вікторія Олександрівна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, провідний науковий співробітник відділу біології газоокислюючих мікроорганізмів кандидат біологічних наук, доцент Сергійчук Михайло Гордійович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, кафедра мікробіології та загальної імунології

Провідна установа: Одеський національний університет ім. І.І. Мечникова

Захист відбудеться “22” січня 2003 р. о 10.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 по захисту докторських дисертацій при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: 03143, Київ, вул. Заболотного, 154.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: 03143, Київ, вул. Заболотного, 154.

Автореферат дисертації розіслано “____” грудня 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник Пуріш Л.М.

Актуальність проблеми. Мікроорганізми є важливою складовою частиною морських екосистем. Серед метаболітів морських бактерій знайдено унікальні ферменти, цитотоксини, антибіотики. За останнє десятиліття досягнуті значні успіхи у вивченні мікроорганізмів світового океану, але систематичне положення та біологічні властивості мікрофлори Чорного моря досліджені недостатньо. Мікробіологічні дослідження Чорного моря мають більше як сторічну історію, але накопичений в цій галузі матеріал потребує ревізії з позицій сучасної систематики.

Останнім часом процес антропогенного впливу на екосистеми Чорного моря досягнув критичного рівня і став реальною загрозою для біорізноманіття цього басейну. Як один з екологічно “гарячих пунктів” на карті світового океану, Чорне море звернуло на себе увагу ООН. Зусиллями 42 учених з причорноморських країн створена Червона книга Чорного моря. Однак це лише початковий етап дослідження та захисту його біорізноманіття. Особливої уваги заслуговують практично не вивчені галофільні мікроорганізми цього регіону, серед яких особливе місце займають Alteromonas-подібні бактерії. До їх складу входять фенотипово і філогенетично близькі мікроорганізми родів Alteromonas, Pseudoalteromonas, Marinomonas та Shewanella. Alteromonas-подібні бактерії – грамнегативні аеробні галофільні неферментуючі, рухливі за допомогою одного полярного джгутика паличковидні форми – відзначаються високою ферментативною активністю (Alteromonas), продукцією різних антибіотичних речовин (Pseudoalteromonas), а також участю в кругообігу речовин та самоочищенні моря (Shewanella). Крім того, ці мікроорганізми є індикаторами чистоти акваторії, важливими компонентами біорізноманіття та перспективними продуцентами біологічно активних сполук.

Зв'язок роботи з науковими програмами, темами, планами. Робота виконана згідно планів науково-дослідних робіт Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України та була включена в програму “Підтримка та розвиток Української Колекції Мікроорганізмів”. Частина роботи виконувалась за підтримки INTAS в рамках міжнародного проекту № YSF 01/1-0001.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи – ізоляція та дослідження Alteromonas-подібних бактерій Чорного моря, вивчення їх таксономічної структури і антибіотичної активності.

Згідно наявної мети необхідним було вирішення наступних завдань:

- виділити грамнегативні еубактерії з води, безхребетних і водоростей Чорного моря;

- розробити схему селективного відбору для створення колекції Alteromonas-подібних бактерій;

- вивчити широкий спектр фенотипових властивостей ізолятів і створити базу для нумеричного аналізу;

- здійснити їх попередню ідентифікацію на основі нумеричноі класифікації;

- провести молекулярно-генетичний аналіз штамів морських бактерій (ПЛР-ампліфікація та сіквенс 16S рРНК);

- встановити їх родову (а при можливості видову) належність;

- вивчити антагоністичні властивості Alteromonas-подібних бактерій, дослідити антибіотичну активність культуральних рідин та клітинних екстрактів щодо спектру грамнегативних і грампозитивних патогенних та умовно патогенних бактерій, дріжджів, фітопатогенних грибів, а також ціанобактерій.

Обўєктом дослідження були бактерії, виділені з води, безхребетних та водоростей Чорного моря.

Предметом дослідження був видовий склад Alteromonas-подібних бактерій та їх антибіотична активність по відношенню до тест-культур бактерій, дріжджів, фітопатогенних грибів та ціанобактерій.

Матеріали та методи дослідження. Для виконання поставлених завдань використовували методи поліфазного таксономічного аналізу, які включали мікробіологічні, біохімічні, нумеричні, молекулярно-генетичні методи, а також методи вивчення антибіотичної активності бактерій.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше досліджено біорізноманіття Alteromonas-подібних бактерій Чорного моря. На основі сіквенсу 16S рРНК та характеристики за 112 фенотиповими ознаками, які включали вивчення чутливості до 14 антибіотиків різної хімічної будови, здійснено їх поліфазний таксономічний аналіз. Вперше встановлено присутність морських бактерій родів Pseudoalteromonas, Alteromonas, Marinomonas, Shewanella, Halomonas, Psychrobacter серед мікробного населення Чорного моря. Поряд з видами Alteromonas macleodii, Pseudoalteromonas citrea, P. haloplanktis, Marinomonas protea, Shewanella colwelliana, S. baltica, Halomonas variabilis, Psychrobacter glacincola серед чорноморських ізолятів виявлено штами бактерій, які за результатами сіквенсу 16S рРНК є представниками нового виду Pseudoalteromonas. З Чорного моря виділено і охарактеризовано мікроорганізм, який за результатами молекулярно-генетичних досліджень є представником нового роду. Встановлено високу антибіотичну активність Alteromonas-подібних бактерій Чорного моря, зокрема штамів родів Pseudoalteromonas і Shewanella, більшість з яких - асоціанти морських безхребетних. Серед п'яти штамів Alteromonas macleodii виявлено активний штам-продуцент антибактеріальних та фунгіцидних речовин.

Практичне значення отриманих результатів. На основі отриманих результатів розроблено схему селективного відбору морських Alteromonas-подібних бактерій, а саме представників родів Pseudoalteromonas, Alteromonas, Marinomonas і Shewanella, які є важливою складовою морського біорізноманіття та індикаторами чистоти акваторії моря, а також перспективними продуцентами антибіотичних речовин. Розроблена схема дає можливість попередньої ідентифікації Alteromonas-подібних бактерій і може бути використана в галузі морської мікробіології та біотехнології. Створено колекцію галофільних бактерій Чорного моря, серед яких знайдені продуценти антибактеріальних, антифунгальних та альгоцидних речовин. Ідентифіковані сучасними методами штами багатьох таксонів морських бактерій поповнили фонд Української Колекції Мікроорганізмів.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертації самостійно виконані представлені в дисертації експериментальні дослідження, проаналізовані їх результати і обґрунтовані висновки. Молекулярно-генетичні дослідження морських бактерій проведено автором самостійно під керівництвом проф. Ф. Родрігес-Валера (Університет Мігеля Ернандеса, Іспанія), вивчення впливу Alteromonas-подібних бактерій на ціанобактерії виконано спільно з к.б.н. Т.Г. Лисенко (Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ), за що автор роботи висловлює свою глибоку вдячність. Особлива подяка науковому керівнику д.м.н., проф., акад. НАНУ В.В. Смірнову та д.б.н. О.А. Кіпріановій (Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ) за всебічну допомогу при обговоренні одержаних результатів.

Апробація результатів досліджень. Результати роботи доповідались на Європейському симпозіумі з морської мікробіології “7th European Marine Microbiology Symposium” (Голландія, 2000), на конкурсі експериментальних робіт молодих дослідників ІМВ НАНУ (Київ, 2000), міжнародній науковій конференції “Екологія і біогеохімічна діяльність мікроорганізмів” (Одеса, 2001), конференції молодих учених з проблем екології Азово-Чорноморського басейну (Севастополь, 2001), на науково-практичній школі для молодих спеціалістів “Екологія Карпат” (Ужгород, 2001), на Міжнародному симпозіумі з водної мікробної екології “8th Symposium on Aquatic Microbial Ecology” (Італія, 2002).

Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 8 робіт (з них 5 статей в профільних журналах і 3 – в тезах доповідей).

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 146 сторінках машинописного тексту і складається з розділів “Вступ”, “Огляд літератури”, “Матеріали та методи досліджень”, “Результати досліджень”, “Обговорення”, “Висновки”, “Список використаних джерел”, який містить 171 посилання (з яких 136 - іноземних авторів). Робота містить 17 таблиць та 26 рисунків.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Об'єктом дослідження були 384 штами бактерій, виділених з морської води, водоростей (Cladophora albida, Ectocarpus confervoides, Cystoceira crinita, Ulva rigida, Codium vermilara, Dasia baillonviana, Enteromorpha intestinalis, Polysiphonia cepaca, Dilophus fasciola, Scytosiphon lomentaria) та безхребетних (Aurelia aurita, Actinia equina, Mytilus galloprovincialis, Mytilus acrocyrta, Rapana thomasiana, Mytilaster lineatus), відібраних з Чорного моря в акваторії Карадазького природного заповіднику. Для порівняльних досліджень були використані типові штами морських бактерій, підтримувані в Українській Колекції Мікроорганізмів: Pseudoalteromonas nigrifaciens УКМ В-11035т (АТСС 19375), P. haloplanktis УКМ В-11034т (АТСС 14393), P. elyakovii УКМ В-11039т (КММ 162), P. tetraodonis УКМ В-11039т (ІАМ 14160), P. carrageenovora УКМ В-11039т (АТСС 43555), P. atlantica УКМ В-11037т (АТСС 19262), P. undina УКМ В-11070т (АТСС 29660) , P. citrea УКМ В-11071 (АТСС 15251), Alteromonas maсleodii УКМ В-11033т (АТСС 27126), Marinomonas communis УКМ В-11074т, Shewanella putrеfaciens УКМ В-4173т (АТСС 8071).

Для виділення штамів використовували метод прямого висіву із зразків морської води, гомогенатів водоростей та безхребетних на агаризоване середовище “В” для морських мікроорганізмів (Baumann, 1986). Фенотипову характеристику досліджуваних штамів проводили загальноприйнятими методами (Bergey?s Manual of Systematic Bacteriology, 1984; 1997). Були досліджені морфологія клітин, культуральні властивості, рухливість, забарвлення за Грамом, потреба в іонах натрію для росту, тип метаболізму, здатність продукувати оксидазу, ферментативну активність, здатність до денітрифікації та відновлення нітратів до нітритів. Для вивчення здатності бактерій до анаеробної утилізації аргініну, лізину та орнітину використовували метод Меллера (Moeller, 1955). Для вивчення засвоєння бактеріями органічних сполук як єдиного джерела вуглецю було використано 79 сполук, в тому числі вуглеводні, жирні кислоти, дикарбонові кислоти, поліспирти та гліколі, ароматичні та інші циклічні сполуки, аліфатичні та кільцеві амінокислоти. Чутливість до антибіотиків визначали методом дисків, що містили антибіотики: бензилпеніцилін, лінкоміцин, олеандоміцин, поліміксин, стрептоміцин, еритроміцин, тетрациклін, цефалотин, фурадонін, азтреонам, рифампіцин, левоміцетин, налідиксова кислота та ципрофлоксацин. Електронно-мікроскопічне дослідження проводили на електронному мікроскопі ЕМВ – 100 БР при інструментальному збільшенні х12000-15000. Нумеричний аналіз проводили за результатами вивчення 97 фенотипових ознак, групування штамів за ступенем подібності проводили методом однозв'язкового аналізу за Сокалом та Снітом (Sneath, 1980).

Дослідження бактеріальних геномів виконувалось із застосуванням техніки ампліфікування ДНК – полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Для виділення ДНК клітини ресуспендували в 200 мкл лізис-буферу (10 мM тріс (рН 8,0), 1 мM EDTA, 1% трітон Х-100) та кип'ятили протягом 5 хв. Після екстракції хлороформом використовували 5 мкл супернатанту для приготування ПЛР-розчину, що містив (мкл): буфер – 5, MgCl2 - 3, dNTPs - 1, Taq - 0,2, ДНК (супернатант) – 3, праймери по 0,5, вода – 36,8. Для ПЛР були використані універсальні бактеріальні праймери: Ant 1 та 16S5R. Реакцію ампліфікації проводили із застосуванням PTC-100 Programmable Thermal Controller (MJ Research INC) за таких умов: 1-й початковий цикл при 95 є? протягом 4 хв., 35 циклів для денатурації ДНК при 95 ?С – 1 хв., віджиг при 55 є? – 1 хв., стaдія при 72 ?С – 2 хв., останній цикл при 72?С – 10 хв. Продукти ампліфікації були розділені горизонтальним електрофорезом в гелі з 1% агарози, забарвлені розчином бромистого етідію та візуалізовані скануванням при 500 нм в Fluorimager scanner (Molecular Dynamics, USA). Сіквенування здійснювали на АВІ PRISM 377 (Perkin-Elmer). Філогенетичне дерево побудовано з використанням алгоритму однозвўязкового аналізу за ступенем подібності (450 нуклеотидних позицій) за допомогою програм Clustal W (Genetics Computer Group package) та MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) версія 1.01.

Антагонізм бактерій вивчали методом перехресних штрихів на агаризованому середовищі “В” та “ВМ” з додаванням 0,1% фумарату, б-аланіну, ацетату, L-глютамату, гліколату, гіпурату та L-аргініну. Для дослідження антибіотичних речовин ізоляти вирощували на рідкому середовищі “В” в умовах глибинного культивування на качалці протягом 72 год. при 25 oC. Ціанобактерії вирощували у стерильних умовах з аерацією повітрям при 25 oC та освітленні 1500 лк на середовищі BG11. Активність культуральних рідин досліджували методом лунок, активність ацетонових екстрактів мікробної біомаси – методом паперових дисків (Егоров, 1994). Як тест-мікроорганізми були використані референтні штами: Staphylococcus aureus УКМ В-4001 (АТСС 6538Р), Bacillus subtilis УКМ В-902 (ГІСК 010010), Pseudomonas aeruginosa УКМ В-907 (АТСС 27853), Escherichia coli УКМ В-906 (АТСС 25922), Proteus vulgaris УКМ В-905 (АТСС 6896), Micrococcus luteus УКМ Ас-469, Mycobacterium phlei УКМ Ас-402т (АТСС 11758), Candida albicans УКМ Y-1918 (АТСС 885-653), Pseudoalteromonas undina УКМ В-11070т (АТСС 29660), штами фітопатогенних грибів Penicillium chrysogenum 001125.Z, Fusarium oxysporum 50575, Cochliobolus sativus 000748.Z та Mucor circinelloides 001959.Z, а також ціанобактерій Synechococcus cedrorum CALU 705 та Synechocystis minuscula CALU 701.

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Виділення мікроорганізмів з води, молюсків та водоростей Чорного моря

З води, молюсків та безхребетних Чорного моря було виділено 384 штами бактерій та дріжджів. Серед ізолятів домінували грамнегативні палички (67%), їм поступалися коки (17%), дріжджі (9%) та грампозитивні палички (7%). Максимальна кількість і різноманітність колоній різних мікроорганізмів (незабарвлених та пігментованих в червоний, білий, жовтий, жовтогарячий кольори, слизуватих чи пастоподібних) спостерігалась у висівах з тканин молюсків, їм поступалися водорості. Мінімальною кількістю та різноманітністю мікрофлори характеризувались висіви з морської води. Так, середня кількість мікроорганізмів в 1 мл води становила 1,13 *103, в 1 мг гомогенатів водоростей – 1,03*104 і безхребетних – 1,38*104.

Відбір Alteromonas-подібних бактерій серед ізольованих штамів

та їх фенотипове дослідження

Мікроорганізми На основі розробленої нами схеми поетапного селективного відбору Alteromonas-подібних бактерій (рис. 1) серед загальної кількості ізолятів було відібрано 51 штам грамнегативних, оксидазопозитивних, галофільних, неферментуючих, позбавлених аргініндигідролази паличок, рухливих за допомогою одного полярного джгутика. Всі вони були охарактеризовані за 97 фенотиповими ознаками (морфологічні та культуральні властивості, чутливість до антибіотиків, характер спектрів вуглецевого живлення). Нумеричний аналіз Alteromonas-подібних бактерій За результатами фенотипових досліджень проведено нумеричну класифікацію ізолятів, попередньо віднесених до Alteromonas-подібних бактерій.

Грамнегативні оксидазопозитивні

Галофільні

Не ферментують вуглеводи

Негативна аргініндигідролаза

Один полярний джгутик Alteromonas-подібні бактерії Рис. 1. Схема фенотипового дослідження мікроорганізмів, виділених з Чорного моря.

Таблиця 1 Результати сіквенування фрагментів 16S рРНК чорноморських бактерій Крім того, до нумеричного аналізу були включені типові штами родів Pseudoalteromonas, Alteromonas, Shewanella та Marinomonas з Української Колекції Мікроорганізмів. Згідно отриманої дендрограми досліджувані бактерії було розподілено на 8 кластерів, до складу яких увійшли також типові штами. Це дало нам підставу попередньо віднести штами того чи іншого кластеру до видів, до яких належали типові культури. На основі кластерного аналізу досліджені штами було орієнтовно віднесено до видів Pseudoalteromonas nigrifaciens, P. citrea, P. haloplanktis та Alteromonas macleodii. Молекулярно-генетичні дослідження Після вивчення комплексу фенотипових характеристик та здійснення нумеричного аналізу досліджуваних штамів для подальшої ідентифікації були відібрані 34 репрезентативні штами Alteromonas-подібних бактерій, які входили до основних кластерів дендрограми. Крім того, до генетичних досліджень були залучені 2 штами, здатних до анаеробної ферментації глюкози, та 4 штами, що відрізнялись відсутністю джгутиків. Нуклеотидні послідовності більшості фрагментів мали досить високий рівень подібності з 16S рРНК генами описаних в літературі видів (табл. 1). Значна кількість штамів виявилась генетично близькою до представників роду Pseudoalteromonas. Чорноморські псевдоальтеромонади були представлені видами P. haloplanktis (4 штами) і P. citrea (7 штамів). Штами 12 і 42 показали лише 96 % генетичної подібності до фрагменту 16S рРНК референтного штаму P. aurantia.

Назва виду та номер в GenBank Номер штаму Подібність 16S р РНК референт- них штамів, % Кількість нуклеотидів ідентичного фрагменту 16S рРНК

Alteromonas macleodii AF 052600 10 9 8 100 - // - - // - 453 450 458

Pseudoalteromonas haloplanktis AF 261041 23 38 6 37 100 - // - - // - - // - 484 475 482 470

P. citrea X 82137 20 16 17 13 14 34 39 100 98 97 97 97 97 97 452 452 445 440 443 456 442

P. aurantia X 82135 12 42 96 96 418 432

Shewanella baltica AJ 000215 1 5 4 26 99 - // - - // - 97 412 426 430 437

S. colwelliana AF 170794 18 19 22 24 32 36 47 49 51 97 - // - - // - - // - - // - - // - - // - - // - - // - 465 408 448 454 456 458 412 459 476

Marinomonas protea AJ 238597 46 31 99 - // - 450 448

Halomonas variabilis AJ 306893 28 99 450

Oceanospirillum linum AF 260752 25 93 442

Brevundimonas vesicularis AJ 007801 35 100 415

Psychrobacter glacincola U 85876 44 45 29 27 98 - // - - // - 97 452 456 448 450

Aeromonas popoffii AJ 223180 33 41 98 - // - 441 448

Рис. 2. Дендрограма, отримана за результатами філогенетичного аналізу чорноморських Alteromonas-подібних бактерій. Масштаб: 0,01 замін нуклеотидів на одну позицію.

Такий рівень подібності може свідчити як про генетичну мінливість даних штамів, так і про належність названих ізолятів до нових, ще не описаних видів. Численною була також група шеванел.Чотири з них віднесені до Shewanella baltica, дев'ять – до S. colwelliana. Причому лише деякі з них показали високий рівень подібності структури геному до названих видів – 99%, більшість же виявила лише 97% подібності, що лише з певною мірою вірогідності може свідчити про їх належність саме до цих видів шеванел. Два штами виявились подібними до виду “Marinomonas protea”. В генетичній базі даних є відомості про послідовності 16S рРНК цього виду, але до цього часу опис виду не опублікований. Ген 16S рРНК штаму 25 відзначився досить низьким ступенем подібності до відомих видів і родів морських бактерій. За даними сіквенсу цей штам ближче всього був до виду Oceanospirillum linum (93%), що може свідчити про належність штаму до нового роду. Чотири безджгутикових штами, які також були відібрані для ідентифікації, віднесені нами до антарктичного морського виду Psychrobacter glacincola. Два штами, що поряд з іншими ферментуючими штамами, були виключені з числа Alteromonas-подібних бактерій, виявили свою генетичну близькість до виду Aeromonas popoffii. Заключним етапом генетичних досліджень було проведення філогенетичного аналізу відібраних штамів і одержання “філогенетичного дерева” - дендрограми, на якій представлені рівні еволюційної спорідненості досліджених груп мікроорганізмів та їх місце серед інших протеобактерій (рис. 2).

Рід Alteromonas

За результатами досліджень п'ять штамів морських бактерій віднесено нами до виду Alteromonas macleodii (Рис. 3А). Три з них показали 100% ідентичності фрагменту 16S рРНК з геном типового штаму A. macleodii. Ще два були фенотипово близькими трьом вищеназваним штамам (99% подібності). Всі п'ять штамів були виділені з води Чорного моря. За своїми властивостями досліджені штами вкладалися в характеристики роду Alteromonas (табл. 2). Чорноморські альтеромонади виявили високу ферментативну активність. Спектр вуглецевого живлення чорноморських ізолятів, а також типового штаму A. macleodii істотно відрізнялись, що свідчить про значну варіабельність даного показника у чорноморських альтеромонад. В цілому, досліджені штами засвоювали 46 із 79 органічних сполук, 20 з яких були універсальними субстратами, в тому числі вуглеводні та похідні сахарів, органічні кислоти, аліфатичні та кільцеві амінокислоти, а також пропіонат, манніт, саркозин та гліцерин. Серед сполук, що не засвоювались альтеромонадами були головним чином поліспирти, ароматичні сполуки та жирні кислоти. Ізоляти були чутливі до олеандоміцину, поліміксину, стрептоміцину, еритроміцину, тетрацикліну, рифампіцину, левоміцетину, налідиксової кислоти та ципрофлоксацину.

В дослідах по вивченню антагонізму на середовищі “В” штам 10 спричинював затримку росту Proteus vulgaris і повністю гальмував ріст Candida albicans; штам 9 був активним по відношенню до фітопатогенних мікроміцетів Cochliobolus sativus, Mucor circinelloides та Fusarium oxysporum. При додаванні КBr, який, за літературними даними бере участь у синтезі бром-вмісних антибіотиків, в синтетичне середовище “ВМ” з проліном штам 8 виявив антагонізм щодо Mycobacterium phlei.

Таблиця 2

Фенотипові характеристики Alteromonas-подібних бактерій Чорного моря

Характеристики Кількість позитивних за ознакою (%) штамів видів ( в дужках число досліджених штамів):

Alteromonas macleodii (5) Pseudoaltero monas citrea (8) Pseudoaltero monas haloplanktis (4) Pseudoaltero monas sp. (2) Shewanella baltica (6) Shewanella colwelliana (10)

Наявність полярного джгутика 100 100 100 100 100 100

Потреба в іонах Na+ 100 100 100 100 100 100

Здатність до денітрифікації 0 0 0 0 0 0

- // - до відновлення NO3 в NO2 0 0 0 0 100 100

Наявність желатинази 100 87 100 100 83 80

- // - амілази 100 75 25 50 16 0

- // - ліпази 100 12 25 100 83 0

- // - агарази 0 50 25 0 0 0

Засвоєння D-глюкози 100 62 50 50 0 10

D-галактози 0 0 0 0 0 0

сахарози 100 75 0 50 0 0

трегалози 100 75 25 50 0 0

лактози 0 25 0 100 0 0

мальтози 60 12 50 100 0 0

фруктози 100 50 50 50 0 0

саліцину 80 0 0 0 0 0

глікогену 100 87 100 100 0 0

ацетату 80 75 100 50 83 40

малонату 80 62 50 50 83 0

лактату 100 75 100 50 100 50

цитрату 100 100 75 100 83 30

пірувату 100 100 100 100 83 90

сукцинату 0 75 75 100 83 50

фумарату 100 75 100 100 83 60

манніту 100 50 0 100 0 0

гліцеролу 100 0 0 0 0 0

етонолу 40 100 100 100 0 0

P-гідроксибензоату 60 25 75 50 83 30

M-гідроксибензоату 0 50 50 0 50 60

в-?ланіну 0 75 100 100 83 40

L-глютамату 100 87 100 100 100 80

L-аргініну 80 100 100 100 `83 60

L-лізину 40 25 75 100 0 0

L-орнітину 0 0 25 50 83 10

креатиніну 0 0 0 0 0 0

цитруліну 80 0 50 50 83 10

гіпурату 80 37 100 0 83 10

А Б В

Г Д Е

Рис. 3. Електоронні фотографії Alteromonas macleodii 10 (А), Pseudoalteromonas citrea 17 (Б), P. haloplanktis 37 (В), Pseudoalteromonas sp. 42 (Г), Shewanella baltica 50 (Д), S. collwelliana 47 (Е). Збільшення х12000.

При дослідженні синтезу антибіотичних речовин в умовах глибинного культивування високу і різнобічну активність виявив штам 9, культуральна рідина якого спричинювала значні зони затримки росту Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis (рис. 4), а також фітопатогенних грибів.

1 2

Рис. 4. Вивчення антибіотичної дії культуральної рідини Alteromonas macleodii (штамів 5, 6, 9, 10) по відношенню до: 1 - Staphylococcus aureus УКМ В-4001 (АТСС 6538Р); 2 - Bacillus subtilis УКМ В-902 (ГІСК 010010).

Рід Pseudoalteromonas

В результаті досліджень було виявлено 14 штамів псевдоальтеромонад. Вісім з них було віднесено до P. сitreа (рис. 3Б), сім з яких - на основі подібності фрагменту 16S рРНК з геном відповідного типового штаму, ще один штам - на основі фенотипової близькості до інших семи вищеназваних штамів (99% подібності). Чотири штами показали 100 % ідентичності фрагменту 16S рРНК з геном типового штаму Р. haloplanktis і були віднесені до цього виду (рис. 3В). Ще два штами псевдоальтеромонад виявили недостатній для видової ідентифікації рівень подібності фрагменту 16S рРНК (96 %), і тому були визначені як Pseudoalteromonas sp. (рис. 3Г). Названі штами псевдоальтеромонад були виділені як з води, так і безхребетних Чорного моря. За своїми властивостями вони вкладалися в характеристики роду Pseudoalteromonas. Майже всі вони виявили желатиназну активність, деякі мали амілазу та ліпазу. Більшість штамів засвоювала d-глюкозу, жоден не утилізував саліцин, сорбіт, інозит, адоніт, о-оксибензоат.

Pseudoalteromonas citrea. Бактерії цього виду відзначалися вражаючою фенотиповою мінливістю. Досліджений нами типовий штам виявив агаролітичні властивості, але, на відміну від описаного в літературі фенотипу, він був непігментований. Серед чорноморських ізолятів були як забарвлені форми, так і безпігментні, деякі також мали агаролітичні властивості. Крім здатності до гідролізу агар-агару, гідролітична активність ферментів чорноморських бактерій цього виду характеризувалась також наявністю желатинази та амілази. Досліджені штами цього виду засвоювали 50 з 79-ти сполук. Універсальними субстратами були етанол, L-аргінін, цитрат та L-пролін. Більшість штамів добре засвоювала також піруват, ?-аланін, гліцин, L-глютамат, інулін та саркозин (табл. 2). Досліджені штами P. citrea не виявили чутливості до цефалотину, пеніциліну та лінкоміцину і відрізнялися від A. macleodii чутливістю до фурадоніну та азтреонаму.

Pseudoalteromonas haloplanktis. Згідно характеристик, представлених в літературі, до представників цього виду належать непігментовані форми. Ферментативна активність чорноморських представників Р. haloplanktis характеризувалась наявністю желатинази, один штам продукував ліпазу та амілазу. Досліджені ізоляти засвоювали 49 з 79-ти сполук, в тому числі гексози, дисахариди, жирні кислоти, трикарбонові кислоти, амінокислоти (табл. 2). Серед універсальних субстратів були глікоген, пропіонат, фумарат, малат, етанол, глютамат, L-гістидин, L-пролін. Характеристики чорноморських представників Р. haloplanktis і P. citrea в цілому дуже схожі. Відмінності стосуються лише здатності деяких штамів P. citrea до утилізації сахарози, манніту та гліцерину, відсутньої у досліджених Р. haloplanktis. Чутливість до антибіотиків також була подібною, окрім чутливості штамів Р. haloplanktis до цефалотину, яка була відсутня у штамів P. citrea.

Pseudoalteromonas sp. Генетичні дослідження штамів 12 і 42 показали можливу їх належність до одного виду, але фенотипові характеристики цих штамів мали значні відмінності. Це може свідчити як про мінливість штамів у межах виду, так і про їх належність до різних видів. Так, штам 42 мав рожево-біле забарвлення, а штам 12 відзначався наявністю яскраво-жовтого некаротиноїдного пігменту. Останній відрізнявся також високою ферментативною активністю та здатністю до утилізації більшої кількості сполук, в тому числі лактози і манніту, які не засвоювались іншими псевдоальтеромонадами (табл. 2). Антибіотикограми цього штаму відрізнялися від P. citrea стійкістю до фурадоніну, від P. haloplanktis - до цефалотину та фурадоніну. Штам 42 навпаки не засвоював більшості з досліджених субстратів, в тому числі універсальних для псевдоальтеромонад С-джерел: ацетату, глюконату, фруктози, целобіози, бутирату, лактату, малату. Чутливість до антибіотиків була подібною до такої інших псевдоальтеромонад.

Антибіотичні властивості штамів роду Pseudoalteromonas. Бактерії роду Pseudoalteromonas виявилися досить активними антагоністами бактерій, дріжджів і мікроскопічних грибів. В дослідах по вивченню антагонізму на середовищі “В” штам Pseudoalteromonas sp. 12 спричинював затримку росту, а штам P. citrea 39 повністю гальмував ріст тест-культури Bacillus subtilis. Штам Pseudoalteromonas sp. 12 виявився також активним антагоністом Candida albicans та Pseudomonas aeruginosa (рис. 5).

Рис. 5. Антагоністична дія штаму Pseudoalteromonas sp. 12 на середовищі “В” у відношенні до: 1 – Staphylococcus aureus, 2 – Bacillus subtilis, 3 – Mycobacterium phlei, 4 – Pseudomonas aeruginosa, 5 – Candida albicans 6 - Pseudoalteromonas undina.

Деякі штами P. citrea виявили антагонізм у відношенні до Pseudoalteromonas undina, що може бути зумовлено дією бактеріоцинів. На середовищі “В” з додаванням KBr штам P. citrea 13 виявив протикандидозну активність. На синтетичному середовищі “ВМ” штам Pseudoalteromonas sp. 12 затримував ріст Pseudomonas aeruginosa; штами P. citrea та Pseudoalteromonas sp. 12 виявили антифунгальну активність. Антибіотична активність спостерігалась при дослідженні їх культуральних рідин та клітинних екстрактів бактерій методом лунок та дисків (табл. 3). Переважна більшість продуцентів антибіотиків була представлена штамами P. citrea, більшість з яких були активними у відношенні до фітопатогенних грибів і один штам (P. citrea 39) – до бацил.

Рід Shewanella

В результаті проведених досліджень було виявлено 13 штамів шеванел, чотири з яких було віднесено до виду S. baltica і дев'ять – до S. colwelliana на основі результатів сіквенування 16 S рРНК (табл. 1). Штами S. baltica (рис. 3Д) були виділені з води, представники S. colwelliana (рис. 3Е) - з води та безхребетних Чорного моря. Досліджені штами вкладалися за своїми властивостями в характеристики роду Shewanella. Відомо, що шеванели відрізняються від інших Alteromonas-подібних бактерій здатністю до факультативно-анаеробного метаболізму за рахунок відновлення окислів заліза, марганцю, сірки, а також нітратів до нітритів. Досліджені нами шеванели також відновлювали нітрати до нітритів.

Таблиця 3

Антибіотична активність культуральних рідин та клітинних екстрактів штамів бактерій роду Pseudoalteromonas

Bид Діаметр зони затримки росту тест-мікроорганізмі (мм)

Bacillus subtilis Penicillium chrysogenum Cochliobolus sativus Synechocystis minuscula

Pseudoalteromonas citrea 13 0 20* 13*, 10** 0

P. citrea 17 0 25* 0 0

P. citrea 20 0 11** 9* 0

P. citrea 34 30* 0 0 0

P. citrea 39 0 30** 45* 13*

P. haloplanktis 38 0 0 0 14**

Pseudoalteromonas sp. 12 0 0 20** 0

Примітка: * активність культуральних рідин, ** активність клітинних екстрактів.

S. baltica. Чорноморські штами цього виду продукували оранжево-бежевий пігмент і гідролітичні ферменти (амілазу та ліпазу), засвоювали 37 з 79-ти досліджених сполук, в тому числі жирні кислоти, різні органічні кислоти та амінокислоти (табл. 2). Серед них універсальними субстратами були пропіонат, глютарат, лактат, L-глютамат і L-гістидин. Чорноморські штами S. baltica майже не засвоювали вуглеводні та полісахариди, а також поліспирти та деякі амінокислоти. Вони виявили чутливість до більшості з досліджених антибіотиків, але були стійкі до бензилпеніциліну, лінкоміцину та цефалотину.

S. colwelliana. Ці штами здебільшого виділялись з молюсків та актиній, на відміну від штамів S. baltica, які були виділені лише з води. Більшість штамів продукувала желатиназу. На відміну від чорноморських культур, віднесених до S. baltica, представники S. colwelliana не виявили ліпазної активності. Чорноморські ізоляти цього виду засвоювали 32 з 79-ти сполук, серед яких переважали органічні кислоти та амінокислоти (табл. 2). Універсальними субстратами були декстрин, піруват, L-гістидин та аспарагін. В цілому, штами S. colwelliana мали вужчий спектр вуглецевого живлення і виявили більшу чутливість до антибіотиків, ніж штами S. baltica.

Антибіотичні властивості штамів роду Shewanella. Дослідження антибіотичної активності шеванел вперше показали їх здатність до продукції антибіотичних речовин. Антагоністична активність спостерігалась у відношенні до грамнегативних бактерій та фітопатогенних грибів. На середовищі “В” штами S. baltica 18, 19, 22 затримували ріст культури Pseudoalteromonas undina. На синтетичному середовищі “ВМ” з проліном та KBr штам S. baltica 5 пригнічував ріст Mycobacterium phlei, а на “ВМ” з ацетатом - Pseudomonas aeruginosa. При дослідженні антибіотичних властивостей шеванел методом їх глибинного культивування клітинний екстракт штаму S. baltica 1 виявив активність щодо Candida albicans. Культуральна рідина S. colwelliana 24 була активною у відношенні до Bacillus subtilis, а S. colwelliana 51 – щодо гриба Cochliobolus sativus.

Рід Marinomonas

Два чорноморські штами, виділені з морської води, було ідентифіковано як “M. protea”. Фрагмент 16S рРНК бактерій цього виду, представники якого були раніше виділені в Антарктиці, знаходився в генетичній базі даних, але новий вид не був легітимно описаний в літературі. За своїми характеристиками чорноморські мариномонади повністю вкладалися в діагноз роду. Спектри вуглецевого живлення “M. protea” та типового виду M. communis були дуже подібні і мали лише незначні розбіжності. Чорноморські мариномонади і типовий штам були чутливі у відношенні майже до всіх досліджених антибіотиків, крім бензилпеніциліну. Дослідження антибіотичних властивостей методом глибинного культивування показало здатність штаму “M. protea” 46 до продукції антифунгальних та альгоцидних речовин. Культуральна рідина цього ізоляту затримувала ріст фітопатогенного гриба Cochliobolus sativus, а клітинний екстракт пригнічував ріст ціанобактерії Synechocystis minuscula.

Інші таксони

Рід Psychrobacter. Серед чорноморських ізолятів було виявлено чотири штами психробактерів, які на основі молекулярно-генетичного аналізу було віднесено до виду P. glacincola. За своїми характеристиками чорноморські психробактери відповідали діагнозу роду. Виняток становила їх нездатність до редукції нітратів та стійкість до бензилпеніциліну. В цілому досліджені штами були фенотипово близькі до P. glacincola, за виключенням деяких відмінностей у спектрі вуглецевого живлення, а саме: вони засвоювали більшу кількість вуглеводів як єдине джерело вуглецю (в тому числі сахарозу, трегалозу, целобіозу, фруктозу та ін.). В дослідах по вивченню антагонізму чорноморські психробактери не виявили активності. При дослідженні антибіотичних властивостей методом глибинного культивування штам P. glacincola 44 виявив антифунгальну активність культуральної рідини у відношенні до фітопатогенного гриба Cochliobolus sativus.

Рід Halomonas. Фрагмент 16S рРНК штаму 28, виділеного з води Чорного моря, виявив 99 % подібності з відповідним фрагментом штаму H. variabilis. Чорноморський штам не мав аргініндигідролази, лізин- і орнітиндекарбоксилази, не виявив амілазної, желатиназної та ліпазної активності, відновлював нітрати до нітритів, виявив здатність до засвоєння широкого спектру різних органічних сполук та не мав антибіотичних властивостей.

Новий рід. Найвищий рівень подібності фрагменту 16S рРНК штаму 25 до відповідного фрагменту Oceanospirillum linum становив лише 93 %, що вказує на імовірну належність цього штаму до нового роду. Результати філогенетичного аналізу показали його приналежність до гама підкласу протеобактерій (рис. 2). За фенотиповими характеристиками ці мікроорганізми були близьким до Alteromonas-подібних бактерій – грамнегативні оксидазопозитивні галофільні неферментуючі рухливі палички, нездатні до люмінесценції, ферментації глюкози, денітрифікації та відновлення нітратів до нітритів. Вони не мали аргініндигідролази, лізин- і орнітиндекарбоксилази, а також амілази, ліпази та желатинази. На відміну від Alteromonas-подібних бактерій штам 25 був чутливий до бензилпеніциліну, виявив стійкість до поліміксину і засвоював обмежену кількість сполук як єдине джерело вуглецю. При дослідженні антибіотичних властивостей штам 25 не виявив активності.

Узагальнення отриманих результатів підтвердило ефективність запропонованої схеми селективного відбору Alteromonas-подібних бактерій. Вперше проведене нами вивчення широкого спектру вуглецевого живлення цієї групи бактерій підтвердило значну варіабельність фенотипових ознак Alteromonas-подібних бактерій. Разом з тим, було встановлено кілька відносно стабільних ознак, характерних для представників окремих родів Alteromonas-подібних бактерій, що дало змогу запропонувати нові характеристики для їх диференціації (рис. 6). Відмінності, виявлені при співставленні результатів вивчення чутливості до антибіотиків (табл. 4) підкреслюють перспективність дослідження цієї ознаки для розширення діагностичних ключів.

Таблиця 4

Чутливість Alteromonas-подібних бактерій до антибіотиків

Штами виду: Середній діаметр зон затримки росту (мм) до антибіотиків:

азтреонам фурадонін цефалотин лінкоміцин

Pseudoalteromonas haloplanktis 15 14 15 0

P. citrea 20 12 0 0

Pseudoalteromonas sp. 12 12 0 0 0

Pseudoalteromonas sp. 42 12 0 15 0

Shewanella baltica 35 20 0 0

S. colwelliana 35 32 0 18 “

Marinomonas protea” в 20 26 в

Примітка. “В” – варіабельна реакція.

+ Засвоєння d-глюкози, сахарози, трегалози, d-рибози, фруктози, манніту -

- Відновлення NO3- до NO2- +

Alteromonas Pseudoalteromonas Marinomonas Shewanella

+ Засвоєння l-рамнози, лактози, сорбіту, сукцинату, реатиніну -

Marinomonas Alteromonas Pseudoalteromonas

+ чутливість до фурадоніну -

Pseudoalteromonas Alteromonas

Рис. 6. Схема диференціації родів Alteromonas-подібних бактерій.

В И С Н О В К И

1. З води, водоростей та безхребетних Чорного моря ізольовано 384 штами грамнегативних оксидазопозитивних паличок, 81 з яких – галофільні. Серед останніх виділено групу неферментуючих позбавлених аргініндигідролази рухливих форм, які за розробленою нами схемою ідентифікації віднесено до Alteromonas-подібних бактерій.

2. Серед бактерій Чорного моря вперше ізольовані і досліджені молекулярно-генетичними методами представники морських родів Alteromonas, Pseudoalteromonas, Marinomonas і Shewanella.

3. Alteromonas-подібні бактерії Чорного моря були ідентифіковані як: Alteromonas macleodii – 5 штамів, Pseudoalteromonas haloplanktis – 4, P. citrea – 7, Pseudoalteromonas sp. – 2, Shewanella baltica - 4, S. colwelliana - 9, Marinomonas protea – 2.

4. Вперше досліджена чутливість Alteromonas-подібних бактерій до широкого набору антибіотиків, встановлені певні таксономічні закономірності їх чутливості до антимікробних препаратів різної хімічної будови.

5. Два штами Pseudoalteromonas за біологічними властивостями та даними сіквенсу 16S рРНК не співпадали з характеристиками відомих видів псевдоальтеромонад і очевидно належать до нового виду.

6. Поряд з Alteromonas-подібними бактеріями ізольовані з Чорного моря та ідентифіковані поодинокі штами Halomonas variabilis, Psychrobacter glacincola і близький до Oceanospirillum ізолят, що за даними сіквенсу може бути віднесений до нового роду.

7. Штами родів Pseudoalteromonas (43 %) та Shewanella (38 %) були асоціантами морських безхребетних, а представники родів Marinomonas i Alteromonas виділялись тільки з морської води.

8. Alteromonas-подібні бактерії синтезували як екстрацелюлярні, так і внутрішньоклітинні антибіотичні речовини, які затримували ріст Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, а також фітопатогенних грибів та ціанобактерій. Найбільш антибіотично активними були представники роду Pseudoalteromonas (зокрема штами P. citrea).

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Смірнов В.В., Онищенко О.М., Кіпріанова О.А. Морські грамнегативні еубактерії, ізольовані з води, молюсків та водоростей Чорного моря // Мікробіол. журн. – 2001. – 63 (4). –