НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

Оченашко Ольга Вадимівна

УДК: 615:361.36.013.014.413:612.015.3:

616-003.9.36:57.085.2

ВПЛИВ ТРАНСПЛАНТАЦІЇ КРІОКОНСЕРВОВАНИХ КЛІТИН ЕМБРІОНАЛЬНОЇ ПЕЧІНКИ НА ПЕРЕКИСНЕ ОКИСЛЕННЯ ЛІПІДІВ ТА ВІДНОВНІ ПРОЦЕСИ У ЩУРІВ З ПЕЧІНКОВОЮ НЕДОСТАТНІСТЮ

03.00.19 – кріобіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків – 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини Національної Академії наук України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Петренко Олександр Юрійович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини Національної Академії наук України, завідувач відділу кріобіохімії.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Бондаренко Тетяна Петрівна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини Національної Академії наук України, завідувач відділу кріобіохімії та фармакології нейрогуморальних систем;

доктор біологічних наук, професор

Каліман Павло Авксентійович, Харківський Національний університет ім. В.Н. Каразіна, завідувач кафедрою біохімії.

Провідна установа: Харківський Державний медичний університет МОЗ України, кафедра біохімії, м. Харків.

Захист відбудеться “28” січня 2003 р. о 1330 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 при Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України , 61015, м. Харків 15, вул. Переяслівська, 23.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці ІПКІК НАН України за адресою: 61015, м. Харків 15, вул. Переяслівська, 23.

Автореферат розісланий 26 грудня 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої Вченої Ради ,

доктор медичних наук, професор Гольцев А.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Останнім часом особливу увагу дослідників привертає ембріональна та фетальна печінка як потенційне джерело стовбурових клітин [Lilja H. еt al., 1998], які мають високу проліферативну активність, низьку імуногенність і високу пластичність [Crombleholme T., 1993; Fine A., 1994; Sell S., 2001], містять і продукують біологічно активні речовини, здатні забезпечувати їх власне виживання та стимулювати регенерацію ушкоджених тканин реципієнта [Репин В., 1998; Рябчиков O., 1998; Kale V., 1999; Sennikov S.et al., 2001, 2002]. Окрім того, для клітинних суспензій такого походження, на відміну від цілого органа, існує можливість тривалого низькотемпературного зберігання до трансплантації [Грищенко В. И. и др., 1999], що дає можливість щодо накопичення і повноцінного тестування матеріалу для безпечного використання у клініці.

Актуальність теми. На сьогодні клінічне застосування суспензії кріоконсервованих клітин ембріональної печінки (ККЕП) людини переважно обумовлюється присутністю в ній стовбурових кровотворних клітин [Грищенко В.И., 1988; Люлько О. В. і др., 2000; Смикодуб О. І., 2002]. Відомо, що до складу ембріональної печінки, крім кровотворних попередників, входять гепатобласти загальні попередникі гепатоцитів та біліарних клітин [Alison M., 2000; Shafritz D., 2000], а також різні типи клітин строми, що створюють специфічне мікрооточення для розвитку не тільки гемопоетичних, але й гепатичних елементів [Deans R., 2000]. Ці обставини дозволяють припустити можливість використання суспензії ККЕП в гепатології для корекції печінкової недостатності, яка є значною біомедичною проблемою та потребує пошуку нових шляхів її вирішення [Логинов А. С., 1987; Me Laughlin B. et al., 1999]. Поодинокі експериментальні роботи в цьому напрямку не розкривають існуючої проблеми [Лепехова С. А. и др., 1998; Батанов А. Н. и др., 2000], а клінічні мають випадковий характер [Люлбко О. В. і др., 2000].

Успіхи трансплантології багато в чому визначаються досягненнями сучасної кріобіології, яка розробляє методи низькотемпературного консервування і збереження тканин і клітинних суспензій у життєздатному стані. При цьому істотним є питання про вплив терміну низькотемпературного зберігання на цілість і функціональну повноцінність кріоконсервованого матеріалу, що вимагає експериментального вивчення для конкретного об'єкта.

Актуальність обраного напрямку роботи визначається необхідністю дослідження механізмів дії in vivo кріоконсервованих клітинних суспензій, збагачених стовбуровими клітинами, з метою обґрунтування їхнього клінічного застосування. Практично це може бути реалізовано на адекватних моделях експериментальної патології у тварин, оскільки трансплантація є достовірним методом визначення функціонального потенціалу кріоконсервованого матеріалу при його повертанні до умов нормотермії [Рудых О. Д., Кейсевич Л. В., 1970]. Серед експериментальних систем, за допомогою яких вивчають стимулюючу або інгібуючу дію факторів на печінку, традиційними є моделі печінкової недостатності (ПН) [Hagihara M. et al., 1994; Kaido T., 1996].

Важливими показниками, що характеризують перебіг ПН, можна вважати активність процесів регенерації в ушкодженому органі [Абакумова О. Ю. и др., 1996], а також стан про-антиоксидантної рівноваги [Логинов А. С., 1991; Дудник Л.Б. и др., 2000]. Однак дотепер відсутні дослідження, які б вивчали направленість змін показників регенераторно-відновних процесів і стану перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) при використанні ККЕП у тварин з ПН різного генезу та ступеня вираженості.

Для розуміння механізмів дії клітинних препаратів важливим є питання специфічності їхнього ефекту при трансплантації. Для з'ясування цього як один із видів контролю використали безклітинний цитозоль м'яких тканин ембріона (ЦТЕ) людини.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відділі кріобіохімії в рамках планових тем НДР ІПКіК НАН України: №87 “Вивчення механізму біологічної дії кріоконсервованих препаратів ембріональної печінки на метаболізм гепатоцитів в умовах функціональної недостатності печінки”, № ГР 0202U000833; №7 “Вивчення морфофункціональних особливостей регіональних стовбурових клітин ембріонів, їхньої кріочутливості й механізмів реалізації біологічної активності в умовах культивування і на моделях деяких патологічних станів”, № ГР 0102U002026.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи – встановити особливості дії кріоконсервованих клітин ембріональної печінки (ККЕП) людини різних термінів низькотемпературного зберігання на ПОЛ і відновний потенціал печінки при трансплантації щурам з експериментальною печінковою недостатністю різного походження.

Для досягнення мети були поставлені наступні задачі:

1. Вивчити вплив тривалості низькотемпературного зберігання на життєздатність ККЕП.

2. Дослідити вплив трансплантації ККЕП і ЦТЕ на проліферацію гепатоцитів і відновлення маси печінки щурів після часткової гепатектомії (ЧГЕ).

3. Вивчити стан антиоксидантно-прооксидантного гомеостазу в печінці і крові щурів після часткової гепатектомії і введення ККЕП і ЦТЕ.

4. Оцінити дію ККЕП і ЦТЕ на перекисне окислення ліпідів (ПОЛ) і ступінь пошкодження паренхими печінки щурів після гострого токсичного ураження тетрахлорметаном.

5. Вивчити вплив трансплантації ККЕП і введення ЦТЕ на перекисне окислення ліпідів, морфофункціональний та біоенергетичний стан печінки щурів після хронічної інтоксикації тетрахлорметаном.

Об'єкт дослідження. Перекисне окислення ліпідів та проліферативно-відновні процеси в печінці щурів з експериментальною печінковою недостатністю при трансплантації ККЕП.

Предмет дослідження. Кріоконсервовані клітини ембріональної печінки людини різних термінів низькотемпературного зберігання при трансплантації тваринам з експериментальною печінковою недостатністю.

Методи дослідження. У роботі використано методи: програмного кріоконсервування в присутності ДМСО (диметилсульфоксид); спектрофотометрії для визначення активності ферментів і рівня біохімічних показників у крові й гомогенатах печінки; спектрометрії для визначення радіоактивності фракцій яРНК і ДНК; полярографії для визначення дихальної активності гомогенату печінки; світлової мікроскопії для виявлення життєздатності ККЕП і морфологічних особливостей печінки після тривалого введення тетрахлорметану.

Наукова новизна отриманих результатів. Уперше встановлено, що зберігання ККЕП протягом 120 тижнів в умовах низькотемпературного банку не знижує життєздатності клітин in vitro та їхньої біологічної активності при трансплантації тваринам з експериментальною печінковою недостатністю. Вперше показано, що введення ККЕП тваринам з печінковою недостатністю призводить до зниження інтенсивності ПОЛ незалежно від використаної моделі експериментальної патології. На моделі ЧГЕ вперше встановлено, що пригнічення ПОЛ після введення ККЕП обумовлено їх впливом на ферментативну та неферментативну ланки антиоксидантної системи. Встановлена здатність ККЕП позитивно впливати на відновні процеси у печінці щурів, а саме: викликати посилення синтезу ДНК і прискорення темпу регенерації органа після ЧГЕ. Застосування ККЕП у тварин з експериментальним цирозом призводить до активації репаративного процесу в патологічно зміненому органі та нормалізації біохімічних показників, що характерізують функціональний стан печінки.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані результати можуть бути експериментальним обґрунтуванням клінічного застосування ККЕП людини при лікуванні печінкової недостатності різної етіології. Інгібуюча дія ембріональних препаратів на перекисне окислення ліпідів може стати підставою для застосування їх при лікуванні захворювань, до патогенезу яких залучаються перекисні процеси.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертаційної роботи самостійно проведено аналіз даних літератури, отримано результати експериментальних досліджень, проведено їхній первинний аналіз і статистична обробка. Автором разом з науковим керівником інтерпретовані результати і зроблені остаточні висновки. Роботи, опубліковані у співавторстві з д.б.н., проф. Божковим А. І. та к.б.н. Никитченком Ю. В., відбивають результати спільного планування, проведення експериментів і обговорення результатів.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідалися й обговорювалися на: конференціях молодих учених ІПКіК (м. Харків, 2000, 2001); 2-ому з'їзді трансплантологів України (м. Київ, 2000); Всеукраїнській науковій конференції "Успіхи й перспективи розвитку кріобіології і кріомедицини" (м. Харків, 2001), 38-ому з`їзді Товариства кріобіологів (м. Единбург, 2001), 8-ому Українському біохімічному з`їзді (м. Чернівці, 2002).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 5 статей, 4 тези доповідей.

Структура дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, результатів власних досліджень та їхнього обговорення, заключення, висновків і списку використаної літератури. Матеріали дисертації викладені на 135 сторінках. Роботу проілюстровано 28 рисунками, 6 таблицями. Список літератури містить 218 джерел і розміщений на 22 сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження

Клітини печінки виділяли з ембріонів людини 8–10 тижнів гестації та кріоконсервували за трьохетапною програмою заморожування у кріозахисному середовищі, що містить 5% ДМСО, з початковою швидкістю 1 ?С/хв до – 40 ?С, 10 ?С/хв від – 40 ?С до –80 ?С з наступним занурюванням у рідкий азот. ККЕП зберігали в низькотемпературному банку при –196 ?С до 120 тижнів. ЦТЕ одержували з гомогенатів м'яких тканин ембріонів людини [Грищенко В. И. і др., 2000] і зберігали при –35 С. Перед початком експерименту ККЕП і ЦТЕ відігрівали при 37 С на водяній бані. Життєздатність клітин ембріональної печінки до та після кріоконсервування визначали по забарвленню трипановим синім [Seglen Р. О., 1976]. Концентрацію клітин визначали в камері Горяєва [Неменова Ю. М., 1972].

В експериментах використали 230 лабораторних білих щурів-самців масою 150–180 г. Досліди на тваринах проводили відповідно до правил “Європейської конвенції захисту хребетних тварин, використовуваних з експериментальною і іншою науковою метою”. Оперативні втручання на тваринах, включаючи декапітацію, проводили під інгаляційним ефірним наркозом.

Уведення ККЕП (107 млн клітин/0,3 мл) і ЦТЕ (0,7–0,8 мг білка/0,3мл) здійснювали в пульпу селезінки щурів з різними формами печінкової недостатності. Щурам контрольної групи незалежно від типу сформованої експериментальної моделі в пульпу селезінки вводили 0,3 мл середовища кріоконсервування.

Дію ККЕП і ЦТЕ досліджували на моделях печінкової недостатності.

1. Часткову гепатектомію (ЧГЕ) проводили за класичною методикою [Higgins G., Anderson R., 1931]. Уведення ККЕП і ЦТЕ здійснювали відразу після видалення частини печінки. Щурів декапітували через 24, 48 і 72 год після ЧГЕ.

2. Гостре токсичне ушкодження печінки викликали одноразовою внутрішньочеревинною ін'єкцією 40 % - го масляного розчину СCl4 (0,4 мл/100 г маси тіла). Уведення ККЕП і ЦТЕ проводили за три доби до ін'єкції ССl4. Тварин декапітували через 24, 48 і 72 год після введення тетрахлорметану.

3. Хронічне токсичне ушкодження печінки (експериментальний цироз) формували шляхом внутрішньочеревинних ін'єкцій 50 % - го масляного розчину ССl4 (0,2 мл/100 г маси тіла) протягом 3-х місяців 2 рази на тиждень [Рубецкой А.С., 1960]. Уведення ККЕП і ЦТЕ проводили через 10 діб після завершення ін'єкцій ССl4. Тварин декапітували через 14 діб після введення досліджуваного матеріалу.

Біохімічному аналізу піддавали гомогенати печінки, плазму крові і гемолізати еритроцитів, що були отримані згідно із загальноприйнятими методами.

Синтез ДНК і яРНК у ядрах клітин печінки після ЧГЕ визначали за швидкістю включення 3Н-тимідіну (0,5 Мбк/100г маси тіла тварини) і 14С-оротової кислоти (0,4 Мбк/100г) відповідно, які уводили внутрішньочеревно за 1 год до декапітації. Вміст нуклеотидів ДНК і яРНК визначали спектрофотометрично [Спирин А. C., 1958], радіоактивність фракцій ДНК і яРНК на сцинтиляторному -спектрометрі S-7800 Beckman (США).

Ступінь регенерації печінки після ЧГЕ визначали за зміною маси органа, використовуючи формулу Child С. G. et al. (1953).

Дихальну активність гомогенату печінки вимірювали полярографічно за допомогою закритого платинового електрода Кларка [Chance B., 1955].

Рівень ПОЛ оцінювали, визначаючи вміст ТБК (2-тіобарбітурова кислота)-активних продуктів в плазмі крові [Андрєєва Л. Н., 1988] та в гомогенатах печінки [Орехович В. Н., 1977]. Інтенсивність спонтанного ПОЛ вимірювали за швидкістю накопичення малонового діальдегіду (МДА) у гомогенаті печінки [Владимиров А. Ю., 1972] через 30 хв нормотермічної інкубації.

Антиокисну активність (АОА) плазми визначали за ії здатністю гальмувати накопичення ТБК-активних продуктів ПОЛ у суспензії жовточних ліпопротеїдів [Клебанов Г. И., 1988]. АОА екстрагованих ліпідів печінки визначали в модельній системі з термічним окисленням лінетолу [Паранич А. и др. 1995].

Se-залежну глутатіонпероксидазну (КФ 1.11.1.9) й глутатіонредуктазну (КФ 1.6.4.2) активності визначали спектрофотометрично за спадом NADPH [Ланкин В.З., 1976], каталазну (КФ 1.11.1.6) активність – за спадом H2O2 [Marklund S., 1981].

Активність аланінамінотрансферази (АлАт) та аспартатамінотрансферази (АсАт), вміст загального білірубіну й альбуміну в плазмі крові визначали за уніфікованими методами.

Матеріал для гістологічних досліджень фіксували в 10 % - му формаліні, заливали до парафіну, зрізи фарбували гематоксиліном й еозином [Волкова О. В., 1971], дослідження проводили під світловим мікроскопом зі збільшенням 10х25.

Визначення вмісту білка в гомогенаті печінки й гемолізаті еритроцитів проводили за методом Лоурі в модифікації Міллера [Miller G.L., 1959].

Одержані результати обробляли статистично на персональному комп`ютері за допомогою пакету програм Exсel і Statistica. Для визначення достовірності даних використовували параметричний метод статистичного аналізу (t – критерій Стьюдента) або непараметричний – Манна-Уітні.

Результати досліджень та їхнє обговорення

Вплив тривалості низькотемпературного зберігання на життєздатність кріоконсервованих клітин ембріональної печінки. Важливою умовою успішної трансплантації є висока збереженість і функціональна повноцінність біоматеріалу після кріоконсервування і низькотемпературного зберігання. Вплив терміну перебування в низькотемпературному банку на збереженість клітин ембріональної печінки залишається не достатньо вивченим і вимагає окремого розгляду.

Життєздатність суспензії свіжоізольованих клітин ембріональної печінки після 20 хв еквілібрації з 5 % – ним ДМСО складала 73–79 %. Після програмного кріоконсервування і наступного відігрівання спостерігалося зниження досліджуваного показника на 16 % (р < 0,01), при цьому загальна кількість клітин у суспензії не змінювалася. В подальшому, при зберіганні експериментального матеріалу в умовах низькотемпературного банку ІПКіК НАНУ від 1 до 120 тижнів, не виявлено достовірних змін досліджуваного параметра. Це дозволило нам надалі використовувати ККЕП різних термінів зберігання в межах установленого часу для трансплантації тваринам з окремими формами печінкової недостатності. Показники, що характеризують стан проліферативно-відновних та перекисних процесів, як було встановлено при виконанні відповідних частин дослідження, суттєво при цьому не змінювалися.

Проліферативна активність гепатоцитів та відновлення маси печінки після часткової гепатектомії і трансплантації ККЕП. Можливість використання ККЕП для регенераційної терапії в гепатології потребує з’ясування особливостей їх дії, зокрема на проліферацію клітин печінки. Найбільш простою й відтворюваною моделлю для вирішення цього питання можна вважати часткову гепатектомію, що є оборотною моделлю печінкової недостатності [Chamuleau R. A., 1997]. Після видалення двох третин частини органа в залишку печінки активуються проліферативні процеси, які найінтенсивніше протікають у перші 24–72 год [Сидорова В., 1966; Поліщук А., 1983; Kay А., 1997]. Поряд з цим у печінці, що регенерує, значно змінюється стан антиоксидантно-прооксидантної рівноваги [Бурлакова Е., 1975; Slater Т. et al., 1990]. Це дозволило нам використати часткову гепатектомію як модель для з'ясування особливостей дії ККЕП і ЦТЕ на процеси проліферації і стан систем, що контролюють перекисні процеси в організмі.

ККЕП і ЦТЕ чинили односпрямовану дію на динаміку синтезу швидко мічених яРНК у клітинах регенеруючої печінки щурів, що виражалося у зменшенні інтенсивності транскрипції через 24 год і збільшенні цього показника на 47 % (р < 0,05) через 72 год після ЧГЕ. В той же час уведення ККЕП і ЦТЕ супроводжувалося збільшенням швидкості синтезу ДНК через 24 год після операції в 2,5 і 3,2 рази (р < 0,05), відповідно (рис. 1). З огляду на те, що дослідний варіант перевершував контроль не тільки через 24, але й через 72 год, можна припустити, що введення ККЕП і ЦТЕ сприяє посиленню регенераційної здатності печінки щурів.

Рис. 1. Зміна питомої радіоактивності ДНК ядер у процесі регенерації печінки після часткової гепатектомії в контролі (1), після введення ЦТЕ (2) і ККЕП (3).

* – р < 0,05 порівнянно з контролем.

Інтегральним показником стану регенераційних процесів у печінці тварин після ЧГЕ та введення ККЕП і ЦТЕ є ступінь регенерації органа, визначений за зміною його маси [Child С.G. et al., 1953]. Після часткової гепатектомії спостерігали швидке збільшення цього показника в контролі: через 72 год ступінь відновлення маси органа досягав 56±3,9 % (рис. 2), що збігається з даними літератури [Yoshikawa А. et al., 1998]. Трансплантація ККЕП призводила до додаткового збільшення ступеня регенерації печінки порівнянно з контрольною групою протягом усього досліджуваного періоду. Через 72 год цей показник становив 70,6±4,5 %. Уведення ЦТЕ виявляло подібний ефект на динаміку досліджуваного параметра.

Рис. 2. Вплив ККЕП і ЦТЕ на ступінь регенерації печінки щурів після часткової гепатектомії: 1 – контроль, 2 – уведення ККЕП, 3 – уведення ЦТЕ.

* – р < 0.05 порівнянно з контролем.

Таким чином, введення ККЕП і ЦТЕ щурам з частковою гепатектомією збільшувало не тільки швидкість синтезу ДНК, але й прискорювало відновлення маси печінки, що свідчить на користь нашого припущення про їх здатність підсилювати темпи регенерації у досліджуваному органі. Оскільки безклітинна ЦТЕ спричиняла таку ж дію, як і суспензія клітин, можна вважати, що виявлений ефект обумовлений дією біологічно активних речовин, які містяться в ембріональних тканинах.

Перекисне окислення ліпідів і його регуляція в печінці і крові щурів після часткової гепатектомії і трансплантації ККЕП. Відповідно до сучасних уявленнь, існує зворотна кореляція між рівнем вільнорадикального окислення ліпідів у клітині та ступенем проліферації [Player T., 1981; Burdon R., 1995]. З огляду на той факт, що ККЕП і ЦТЕ підсилювали синтез ДНК і прискорювали відновлення маси печінки, уявлялося за необхідне оцінити їхній вплив на стан прооксидантно-антиоксидантної рівноваги в організмі експериментальних тварин після часткової гепатектомії.

Результати досліджень рівня ПОЛ у печінці щурів контрольної групи свідчать, що після ЧГЕ спостерігалося його зниження. Так, через 48 год після ЧГЕ вміст ТБК-активних продуктів ПОЛ знижувався в 4,2 рази (р 0,05), а до 72 год незначно збільшувався. Подібним чином змінювалася й інтенсивність спонтанного ПОЛ (табл. 1). Дослідження стану неферментативної системи антиоксидантного захисту показало збільшення АОА ліпідів печінки, яка досягала максимуму через 48 год після ЧГЕ. Зміни АОА і рівня продуктів ПОЛ у плазмі крові мали подібну спрямованість, але спостерігалися на більш ранній стадії після ЧГЕ, ніж у печінці (рис. 3). Установлена нами динаміка змін вивчених показників узгоджується з відомостями літератури [Бурлакова Е. Б. и др., 1975; Player T., 1981; Slater T. et al., 1990].

Таблиця 1

Інтенсивність спонтанного ПОЛ (нмоль МДА/мг білка; інкубація 30 хв) у печінці щурів після часткової гепатектомії і введення ККЕП і ЦТЕ (М±m, n=5–7)

Групи тварин | Час після часткової гепатектомії, год

24 | 48 | 72

Контроль | 1,310,14 | 0,970,23* | 1,300,11*

+ ККЕП | 1,440,26 | 1,100,18* | 0,820,17*,+

+ ЦТЕ | 1,590,15 | 1,080,16* | 1,120,11*

Примітки: * – р < 0,05 порівнянно з нормою (1,750,15 нмоль МДА/мг білка);

+ – р < 0,05 порівнянно з відповідним контролем.

Після введення ККЕП і ЦТЕ визначалося зниження рівня ПОЛ у печінці в порівнянні з контролем. Уведення ЦТЕ достовірно знижувало вміст ТБК-активних продуктів ПОЛ у печінці через 24 год після ЧГЕ на 41 % (р 0,05), а трансплантація ККЕП призводила до зниження інтенсивності спонтанного ПОЛ через 72 год на 36% (р 0,05) (табл. 1). Вміст ТБК-активних продуктів у плазмі крові після трансплантації ККЕП достовірно знижувався порівнянно з контролем до 72 год на 35 % (р 0,05), а введення ЦТЕ не впливало на динаміку цього показника (рис. 3).

Зниження рівня ПОЛ після введння ККЕП і ЦТЕ може бути наслідком зміни активності як ферментативної, так і неферментативної систем антиоксидантного захисту, що беруть участь у його регуляції.

Дослідження стану неферментативної системи показало, що при введенні ККЕП і ЦТЕ спостерігалося більш виражене в порівнянні з контролем збільшення АОА ліпідів печінки через 24 і 72 год після ЧГЕ. АОА плазми крові через 24 год після ЧГЕ у відповідь на введення ККЕП і ЦТЕ збільшувалася більш виражено, ніж у контролі (рис. 3). Високий рівень цього показника в крові щурів цих 2-х груп зберігався до 72 год. Слід зазначити, що дія ЦТЕ на досліджуваний параметр була більш вираженою порівнянно з ККЕП на ранніх термінах спостереження, а дія ККЕП найбільш повно реалізовувалася до 48–72 год. Посилення АОА плазми крові та ліпідів печінки у відповідь на введення ККЕП і ЦТЕ може свідчити про додаткове зростання рівня ліпідрозчинних антиоксидантів у тканинах [Бурлакова Е. Б. и др., 1975].

Рис. 3. Вплив ККЕП і ЦТЕ на антиокисну активність (А) і вміст ТБК-активних продуктів ПОЛ (Б) у плазмі крові щурів після часткової гепатектомії: 1 – контроль; 2 – уведення ККЕП; 3 – уведення ЦТЕ.

* – р < 0,05 порівнянно з відповідним контролем.

Для повної оцінки стану антиоксидантної системи захисту клітин після ЧГЕ і введення ККЕП і ЦТЕ необхідно було вивчити зміну її ферментативної складової. Ми визначали Se-залежну глутатіонпероксидазну, глутатіонредуктазну та каталазну активності у печінці і крові щурів після часткової гепатектомії і введення ККЕП і ЦТЕ. Як показали дослідження, активності всіх вивчених антиоксидантних ферментів печінки і крові на ранніх термінах після ЧГЕ знижувалися, а на 72 год поверталися до рівня норми за винятком глутатіонпероксидазної активності печінки, що збільшувалася після ЧГЕ.

При введенні ККЕП спостерігалася нормалізація глутатіонпероксидазної активності печінки щурів через 72 год після ЧГЕ. Ще більш виражений нормалізуючий ефект на глутатіонпероксидазну активність виявлено у плазмі й еритроцитах крові. У цьому випадку активність ферменту у дослідних тварин достовірно не відрізнялася від активності в нормі протягом всього експерименту (24–72 год після ЧГЕ). Глутатіонредуктазна активність печінки щурів у відповідь на введення ККЕП через 24 год після ЧГЕ знижувалася так само, як і в контролі, а до 48 год підвищувалася до рівня норми. Дослідження глутатіонредуктазної активності еритроцитів крові показало, що застосування ККЕП призводило до підтримування її на рівні норми протягом всього експерименту. Динаміка каталазної активності еритроцитів за цих умов практично не відрізнялася від такої в контролі. На відміну від цього у печінці протягом всього експерименту спостерігалося збереження активності каталази на рівні норми. Характер впливу ЦТЕ на активності вивчених ферментів відрізнявся від дії ККЕП і був менш вираженим: уведення ЦТЕ виявляло нормалізуючий ефект на глутатіонредуктазну та глутатіонпероксидазну активності еритроцитів.

Виявлена більш виражена нормалізуюча дія ККЕП на стан ферментативної антиоксидантної системи може пояснити отримані нами раніше дані про те, що вплив ККЕП на інтенсивність спонтанного ПОЛ в гомогенатах печінки і вміст продуктів вільнорадикального окислення ліпідів у плазмі крові був ефективнішим порівнянно з ЦТЕ.

Узагальнюючи результати щодо цього розділу роботи, можна відзначити ряд особливостей, пов'язаних з дією ККЕП на організм тварин із ЧГЕ. По-перше, уведення ККЕП позитивно впливає на проліферативно-відновні процеси у печінці щурів, що характеризується підсиленням синтезу ДНК та додатковим збільшенням маси органу. По-друге, активація відновних процесів супроводжується зниженням інтенсивності ПОЛ у печінці і крові щурів, що обумовлено додатковим збільшенням АОА ліпідів цих тканин та нормалізацією активності антиоксидантних ферментів.

Сукупність отриманих даних дозволила припустити можливість використання ККЕП для корекції ПН іншого генезу, а саме після уведення тетрахлорметану.

Вплив трансплантації кріоконсервованих клітин ембріональної печінки на ПОЛ і відновні процеси в печінці щурів після гострої та хронічної інтоксикації ССl4. Як моделі, що дозволяють в експерименті відтворювати стани печінковій недостатності у людини, найчастіше використовують ураження печінки, викликані тетрахлорметаном [Абдуллаев Н., 1989; Nordlinger, 1997], тому що його введення може викликати гостру або хронічну патологію органа в залежності від дози і тривалості впливу [Скакун Н. П. и др., 1989]. Тому видалося за доцільне вивчити біологічну дію ККЕП і ЦТЕ на моделях гострої та хронічної печінкової недостатності у щурів, сформованих за допомогою тетрахлорметану.

Одноразове введення ССl4 в обраній дозі призводило до розвитку гострої ПН у щурів, що супроводжувалася загибеллю 40 % тварин. Відомо, що активність гепатоспецифічних ферментів у крові пропорційна і ступеню ушкодження гепатоцитів, і глибині патологічного процесу [Хендерсон Д., 1997]. У плазмі крові щурів через 24 год після введення ССl4 відзначалося багаторазове збільшення активності трансаміназ (АлАТ, АсАТ), рівень яких поступово знижувався до 72 год, але не досягав показників норми. Уведення ККЕП і ЦТЕ істотно не впливало на рівень активності досліджуваних ферментів у плазмі крові тварин з ураженою печінкою.

Обрана модель ПН характеризується активацією вільнорадикальних процесів, що є наслідком метаболізму ССl4 у печінці [Slater T., 1985; Костюк В., 1992]. Відповідно до наших даних вміст ТБК-активних продуктів у плазмі крові контрольних тварин збільшувався в 1,7 рази (р < 0,05) через 24 год після введення ССl4, і це співвідношення зберігалося до 72 год (рис. 4), що узгоджується з даними Berlanga J. et al. (1998). Уведення ККЕП і ЦТЕ змінювало картину, яка спостерігалася: при використанні ККЕП виявлялася тенденція до інгібування ПОЛ вже в першу добу і достовірне зниження концентрації ТБК-активних продуктів на третю добу (р < 0,01). При введенні ЦТЕ відзначалася тенденція до зниження вмісту продуктів ПОЛ через 24 год після ін'єкції ССl4 (р=0,08), але ця дія не виявлялася вже через 48 год (рис. 4).

Слід зазначити, що введення ККЕП і ЦТЕ, пригнічуючи ПОЛ, не запобігало загибелі клітин печінки. Можна вважати, що індукція ПОЛ у такій постановці експерименту не є визначальним механізмом у розвитку гострої печінкової недостатності. Це узгоджується з точкою зору інших авторів [Stasey N., 1980; Holme J., 1982], які показали, що ушкоджуюча дія на клітину при отруєнні ССl4 може бути опосередкована іншими факторами, зокрема його ковалентним зв'язуванням з білками [Костюк В., 1991].

У наступній серії експериментів вивчався вплив ККЕП і ЦТЕ на ПОЛ, морфофункціональний і біоенергетичний стан печінки щурів після тривалого введення ССl4.

Рис. 4. Вплив ККЕП і ЦТЕ на вміст ТБК-активних продуктів у плазмі крові щурів після одноразової дії ССl4: 1 – контроль, 2 – уведення ККЕП, 3 – уведення ЦТЕ.

* – р < 0,05 порівнянно з нормою;

+ – р < 0,01 порівнянно з відповідним контролем.

Тривале введення малих доз ССl4 призводило до розвитку хронічної ПН у щурів, яка супроводжувалася загибеллю 40 % тварин протягом усього періоду формування моделі. Гістологічний аналіз печінки тварин після 3-х місяців уведення тетрахлорметану показав розвиток патології органа, що по сукупності морфологічних ознак відповідала експериментальному цирозу. Морфологічні зміни в печінці супроводжувалися збільшенням вмісту загального білірубіну в 2,2 рази (р < 0,05) та активацією вільнорадикальних процесів: вміст ТБК-активних продуктів у плазмі був у 2 рази вищий за норму (р < 0,05).

Оцінку впливу ККЕП і ЦТЕ на ПОЛ і відновні процеси в патологічно зміненій печінці проводили через 14 діб після їх уведення.

Аналіз гістологічних зрізів печінки щурів, яким уводили ККЕП, показав, що поряд з деструктивно-дистрофічними змінами, котрі характеризують циротично змінену печінку, з'являлися ділянки, сформовані з великих гепатоцитів зі світлою цитоплазмою і збільшеними ядрами з 1–3 ядерцями. При введенні ЦТЕ також відзначені молоді гепатоцити, але вони були дифузно розсіяні по всьому обсягу паренхіми. Таким чином, відмічалися ознаки, що вказують на активацію репаративного процесу в циротично зміненому органі. Подібні зміни не виявлені в печінці тварин контрольної групи.

Істотним показником компенсаторних і відновних процесів у печінці є рівень її тканиноспецифічних функцій. У плазмі крові щурів контрольної групи вміст загального білірубіну збільшився на 62 % (р < 0,01), а вміст альбуміну зменшився на 39 % (р < 0,02), що свідчить про порушення білоксинтетичної й екскреторної функції печінки (табл. 2). Уведення ККЕП і ЦТЕ сприяло відновленню екскреторної функції і не впливало на білоксинтетичну. Можливо, це пов'язано з малим терміном спостереження, тому що відновлення функцій у патологічно зміненому органі може відбуватися поетапно. Одночасно введення ККЕП і ЦТЕ сприяло нормалізації вмісту ТБК-активних продуктів (табл. 2).

Таблиця 2

Біохімічні показники плазми крові щурів з експериментальним цирозом печінки після введення ККЕП і ЦТЕ (М±m, n=5–9)

Показник | Групи тварин

Норма | Цироз печінки

контроль | +ККЕП | +ЦТЕ

Білірубін, мкмоль/л | 7,9±0,3 | 12,83±0,7* | 8,5±0,7+ | 8,3±0,6+

Альбумін, г/л | 39,0±2,1 | 23,8±2,9* | 27,0±2,7* | 29,3±2,5*

ТБК-активні продукти, нмоль/мл | 4,5±0,4 | 6,7±0,2* | 5,1±0,3+ | 5,2±0,5+

Примітки: * – р<0,01 порівнянно з нормою;

+ – р<0,03 порівнянно з контролем.

Відомо, що енергетичний стан печінки відповідає за її повноцінне функціонування. У зв'язку з цим відновні процеси в циротично зміненій печінці оцінювалися за станом біоенергетичних показників. Як видно з рис. 5, швидкість окислення сукцинату у стані V4 не змінювалася при всіх варіантах впливу, що свідчить про збереження бар'єрних властивостей внутрішньої мембрани мітохондрій печінки. В нормі додання роз’єднувача 2,4-динітрофенолу (ДНФ) призводило до різкого збільшення швидкості окислення субстрату (V3p), пов’язаного зі зниженням мембранного потенціалу. При цьому швидкість дихання у присутності роз’єднувача відбиває максимальну активність ферментів дихального ланцюга мітохондрій [Groen A.K et al., 1982]. Дихальний контроль (ДК), що вимірювався як співвідношення V3р/V4, складав у нормі 4,5±0,5 від.од., що свідчить при високий рівень енергетичного стану мітохондрій у складі гомогенатів печінки інтактних щурів.

Рис. 5. Швидкість поглинення кисню в присутності сукцинату (V4) і ДНФ (V3р) [А] та дихальний контроль (ДК) [Б] мітохондрій у гомогенаті печінки щурів з експериментальним цирозом після введення ККЕП і ЦТЕ: 1 – норма, 2 – контроль, 3 – введення ККЕП, 4 – введення ЦТЕ.

* – р < 0,05 порівнянно з нормою;

+ – р < 0,02 порівнянно з відповідним контролем.

У щурів з експериментальним цирозом спостерігали зниження швидкості дихання у стані V3р, що супроводжувалося значним зменшенням ДК до 2,8±0,2 від. од. У тварин, яким уводили ККЕП, ДНФ відновлював швидкість дихання мітохондрій до рівня норми. Односпрямований, але менш виражений ефект ДНФ виявлявся на мітохондріях печінки щурів, яким уводили ЦТЕ.

Приведені результати свідчать, що після введення ККЕП у печінці активуються проліферативні процеси, що супроводжується біогенезом мітохондрій у новоутворених гепатоцитах, оскільки швидкість дихання у присутності ДНФ прямо пропорційна кількості ферментів дихального ланцюга мітохондрій [Westerhoff H.V. et al., 1987].

Результати, отримані на моделі експерментального цирозу, свідчать, що ККЕП і ЦТЕ призводять до зниження інтенсивності ПОЛ та сприяють активації репаративного процесу в ураженому органі, що супроводжується поліпшенням біоенергетичних параметрів гепатоцитів і нормалізацією біохімічних показників крові.

Отже, дослідження, проведені з використанням експериментальних моделей печінкової недостатності різного генезу та ступеня вираженості (часткова гепатектомія, гостра та хронічна інтоксикація тетрахлорметаном), дозволили встановити стимулювання відновних процесів у пошкодженому органі та пригнічення ПОЛ під впливом ККЕП. При цьому не відзначалася залежність між терміном зберігання клітин у низькотемпературному банку та ефективностю їх дії при трансплантації. Встановлений однонаправлений характер дії ККЕП та ЦТЕ на відновні процеси при експериментальній печінковій недостатності вказує на те, що виявлені ефекти обумовлені стадіоспецифічними біологічно активними речовинами та сполуками, які містяться в ембріональних тканинах. Більш вираженість та тривалість біологічних ефектів, які спостерігались після уведення ККЕП, можуть свідчити на користь підключення додаткових механізмів при реалізації дії життєздатних клітин.

ВИСНОВКИ

1. У дисертації наведено теоретичне узагальнення та нове вирішення наукової задачі, яка спрямована на висвітлення шляхів реалізації біологічної дії кріоконсервованих клітин ембріональної печінки різних термінів низькотемпературного зберігання при введенні щурам з окремими формами експериментальної печінкової недостатності. Одержані у роботі дані свідчать про те, що уведення ККЕП тваринам з експериментальною патологією сприяє підсиленню відновних процесів у пошкодженій печінці щурів та зниженню інтенсивності ПОЛ.

2. Зберігання ККЕП людини в умовах низькотемпературного банку протягом 120 тижнів не впливає на життєздатність клітин в умовах in vitro та їх біологічну активність при трансплантації тваринам з експериментальною печінковою недостатністю.

3. ККЕП впливають на проліферативно-відновні процеси в печінці тварин з частковою гепатектомією: трансплантація ККЕП у селезінку щурів стимулює відновлення маси печінки і синтез ДНК через 24–72 год, а синтез яРНК – через 72 год після 70 %-ної гепатектомії,.

4. ККЕП спричиняють виражену дію на стан антиоксидантно-прооксидантної рівноваги в печінці і крові щурів з частковою гепатектомією. Трансплантація ККЕП призводить до додаткового зменшення рівня ТБК-активних продуктів у плазмі й інтенсивності спонтанного ПОЛ у печінці до 72 год після часткової гепатектомії. Уведення ККЕП додатково збільшує антиокисну активність ліпідів печінки через 24 і 72 год, а плазми крові – через 48–72 год після часткової гепатектомії.

5. Часткова гепатектомія призводить до зміни активності ферментів, які регулюють рівень перекисних процесів, а трансплантація ККЕП сприяє відновленню їх активності: глутатіонпероксидази плазми й еритроцитів крові, глутатіонредуктази еритроцитів і каталази печінки – через 24 год, глутатіонредуктази печінки – через 48 год, а глутатіонпероксидази печінки – через 72 год після часткової гепатектомії.

6. Превентивне уведення ККЕП тваринам з гострим токсичним ушкодженням печінки викликає зниження вмісту продуктів ПОЛ у плазмі крові через 72 год після ін’єкції тетрахлорметану.

7. Трансплантація ККЕП тваринам з експериментальним цирозом призводить до посилення відновних процесів у печінці і зменшення рівня ПОЛ: через 14 днів після їх введення у печінці спостерігаються морфологічні ознаки активації репаративного процесу, що супроводжується нормалізацією біоенергетичних параметрів клітин печінки та вмісту білірубіну і ТБК-активних продуктів у плазмі крові.

8. Уведення ЦТЕ впливало подібно до ККЕП на відновні процеси в печінці щурів при частковій гепатектомії й експериментальному цирозі. Вплив ЦТЕ на перекисні процеси був однонаправленим з дією ККЕП, але менш вираженим і короткочасним.

ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ

1. Петренко А. Ю., Оченашко О. В. Влияние препаратов эмбриональных тканей человека на интенсивность перекисного окисления липидов при остром токсическом гепатите у крыс // Проблемы криобиологии. – 2001. – №2. – С. 66–71. (Дисертантом проведено експерименти щодо визначення умов формування гострої печінкової недостатності та вимірювання вмісту продуктів ПОЛ і активності ферментів у крові щурів).

2. Оченашко О. В., Божков А. И., Петренко А. Ю. Влияние эмбриональных клеток человека на синтез ДНК и яРНК в регенерирующей печени крыс // Укр. біохім. журн. – 2002. – Т. 74, №3. – С. 25–30. (Дисертантом проведено експерименти щодо визначення швидкості синтезу ДНК та яРНК у печінці щурів).

3. Оченашко О. В., Волкова Н. А., Петренко А. Ю. Влияние криоконсервированных клеток эмбриональной печени на восстановительные процессы при экспериментальном циррозе печени // Проблемы криобиологии. – 2002. – №3. – С. 87–89. (Дисертантом сформовано модель экспериментального цироза у щурів та проведено експерименти щодо визначення біохімічних показників крові, біоенергетичного та морфологічного стану печінки тварин).

4. Грищенко В. И., Никитченко Ю. В., Оченашко О. В., Петренко А. Ю., Бондарь В. В., Дзюба В. Н. Влияние трансплантации препаратов эмбриональных тканей на прооксидантно-антиоксидантное равновесие в печени и крови крыс после частичной гепатэктомии // Бюл. экспер. биол. и мед. – 2001. – Т. 132, №10. – С. 394–397. (Дисертантом виконано експериментальне моделювання печінкової патології на щурах, визначено рівень продуктів ПОЛ та антиокисної активності).

5. Моисеева Н. Н., Мазур С. П., Оченашко О. В., Петренко А. Ю. Влияние трансплантации криоконсервированных клеток фетальной печени человека на регенерацию и функцию печени крыс после частичной гепатэктомии // Проблемы криобиологии. – 2001. – №1. – С. 42–47. (Дисертантом досліджено зміну маси та ступінь регенерації печінки щурів).

6. Петренко О.Ю., Мазур С.П., Моісеєва Н.М., Оченашко О.В. Вивчення можливостей використання трансплантації клітин фетальної печінки при лікуванні гострої печінкової недостатності // Трансплантологія. – 2000. – Т. 1, №1. – С. 276–277.

7. Петренко А.Ю., Оченашко О.В., Моисеева