МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ім. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

ПИВОВАРОВА Людмила Павлівна

УДК 611.127:599.323.4:57.086.3:632.95

СТРУКТУРА МІОКАРДА ЩУРІВ

ПРИ ХРОНІЧНІЙ ІНТОКСИКАЦІЇ СИМАЗИНОМ

І КОРЕКЦІЇ ТИМОГЕМІНОМ

14.03.09 - гістологія, цитологія, ембріологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Вінницькому національному медичному університеті ім. М.І. Пирогова МОЗ України

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, професор Стеченко Людмила Олександрівна, Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця МОЗ України, професор кафедри гістології та ембріології

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Гордієнко Вадим Максимович, Київський національний університет ім. Т.Г. Шевченка, професор кафедри цитології, гістології і біології розвитку

доктор медичних наук, професор Шутка Богдан Васильович, Івано-Франківська медична академія МОЗ України, завідувач кафедри анатомії

Провідна установа:

Тернопільська державна медична академія ім. І.Я. Горбачевського МОЗ України

Захист відбудеться “ 6 ” березня 2003 р. о 1330 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.003.06 при Національному медичному університеті ім. О.О. Богомольця МОЗ України (03057, м. Київ, просп. Перемоги, 34).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця (03057, м. Київ, вул. Зоологічна, 1).

Автореферат розісланий “ 3 ” лютого 2003 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

доктор медичних наук Грабовий О.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вивчення серцево-судинних захворювань продовжує залишатись однією з найактуальніших проблем медицини. Останнім часом першочергову роль в розвитку таких захворювань віддають дії різних чинників, в тому числі, фізичних та хімічних. Зміни в структурній організації серця, і зокрема міокарда, суттєво відбиваються на організмі в цілому. У зв’язку з різким погіршенням екологічного стану землі у біосфері виявляється чимало високоактивних хімічних сполук, котрими забруднена вода й харчові продукти, та найбільшими забруднювачами визнані пестициди. Постійна тенденція зростання локальних концентрацій залишкової кількості їх у об’єктах зовнішнього середовища і харчових продуктах підвищує вірогідність реального надходження їх до організму тварин і людей. Дія пестицидів на організм в цілому політропна. Зокрема такий токсичний ефект має і пестицид симазин – представник великої групи гербіцидів, похідних сим-триазинів, котрі з економічної точки зору складають сімейство найбільш ефективних гербіцидів у світі (Сафуан Д., 1983). Доведена нейротоксичність, імунотоксичність з індукцією вторинного Т-імунодефіциту, токсична дія на органи ендокринної системи, на внутрішні органи (Пушкарь М.С., 1991, 1998). Як антагоніст фолієвої кислоти, симазин та інші пестициди цього ряду сприяють розвитку анемії, появі антиеритроцитарних аутоантитіл (Буркацкая Е.Н., 1983), суттєвим змінам ЕКГ у робітників симазинового виробництва (Благодатин В.И., 1965). На підставі інтоксикації, а також гіпоксії на тлі анемії під дією симазину має розвинутися міокардіодистрофія зі своїми характеристиками.

В літературі відсутні дані про характер дистрофії міокарда під дією хронічної інтоксикації малими дозами сим-триазинових пестицидів, механізми розвитку такої міокардіодистрофії, та вірогідність кореляції її на різних етапах з динамікою змін показників крові. Крім того, прогресування патологічних станів хімічної етіології або так званої “хімічної епідемії”, спонукає не лише вивчати їх розвиток, а й вести пошук засобів протидії у вигляді суттєвої корекції або запобігання у певній мірі.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тема дисертаційного дослідження органічно пов’язана з державною науково-медичною проблемою “Здоров’я сільського населення”, виходить з планових науково-дослідних робіт кафедри гістології, цитології та ембріології Вінницького державного медичного університету: “Характер морфофункціональних змін в деяких системах організму під впливом малих доз хімічних чинників та розробка шляхів корекції”, № державної реєстрації теми: 0195V015825 та “Морфофункціональні зміни в деяких системах новонароджених щурів під впливом антенатальної інтоксикації малими дозами пестицидів і пошуки шляхів корекції”, № державної реєстрації теми: 0198V002713. Дисертант є виконавцем фрагменту.

Мета дослідження: Вивчити характер і динаміку морфофункціональних змін у міокарді та кількісно-функціональних показників елементів периферичної крові щурів при хронічній інтоксикації пестицидом симазином в малих дозах та її корекції тимогеміном в режимах профілактики і лікування.

Завдання дослідження:

1. На рівні світлової та електронної мікроскопії визначити структурно-функціональні зміни в міокарді щурів у динаміці піврічної пероральної інтоксикації малими дозами симазину.

2. Дослідити особливості морфофункціональних змін в міокарді щурів в динаміці піврічної пероральної інтоксикації малими дозами симазину на фоні профілактичної підтримки організму тимогеміном.

3. Виявити в усіх умовах і періодах токсикологічного експерименту зміни чисельності лейкоцитів, в тому числі фагоцитарної активності сегментоядерних нейтрофілів, співвідношення популяцій лімфоцитів у периферійній крові. З’ясувати відповідність цих змін структурним пошкодженням у міокарді.

4. З’ясувати на світлооптичному й електронномікроскопічному рівнях якісні й кількісні показники відновних процесів у структурах міокарда через місяць після припинення інтоксикації симазином в усіх серіях експериментів, у тому числі після лікування щурів тимогеміном на початку 7-го місяця спостережень.

Об’єкт дослідження – міокард стінки лівого шлуночка серця і лейкоцити крові білих лабораторних щурів.

Предмет дослідження – морфофункціональні зміни в міокарді, зміни у лейкоцитарній формулі і фагоцитарній активності нейтрофілів та у співвідношеннях Т- і В-лімфоцитів крові щурів упродовж хронічної інтоксикації малими дозами пестициду симазину та її корекції тимогеміном.

Методи дослідження – морфологічні: світлова мікроскопія, електронна мікроскопія, які дали можливість встановити зміни на різних рівнях структурної організації міокарда. Морфометричні методи забезпечили отримання кількісних параметрів структур, що вивчалися та їх вірогідно-статистичний аналіз. Гематологічний, імунологічний методи для вивчення показників периферичної крові.

Наукова новизна одержаних результатів. В тривалому експерименті з повсякденною дією на організм малих доз пестициду симазину отримані нові відомості про характер і динаміку змін у міокарді та клітинах крові, що розвиваються впродовж пестицидної інтоксикації. Вперше отримані електронномікроскопічні маркери міокардіодистрофії, ініційованої малими дозами пестициду симазину.

Визначено, що пестицид симазин як представник сим-триазинових гербіцидів, котрі мають всесвітнє визнання й застосування, - взятий у принципово малій дозі, яка дорівнює величині вірогідного і реального забруднення пестицидами продуктів і води, за умов тривалої дії проявляє патогенний вплив на клітини крові і реалізує свій значний кардіотоксичний потенціал.

Визначена відповідність динаміки морфофункціональних змін у міокарді динаміці змін у крові.

Вперше показано, що прогресування міокардіодистрофічного процесу відбувається паралельно із появою та поглибленням Т-імунодефіциту, фагоцитарної недостатності нейтрофілів, з падінням кількості моноцитів і зростанням еозинофілів та супроводжується заміною сильних позитивних кореляційних зв’язків ефекторних клітин в стромі міокарда на сильні негативні.

Доведена можливість корекції токсикогенних пестицидних пошкоджень міокарда і активації відновних процесів у кардіоміоцитах, а також позитивних змін показників крові і значного збереження позитивності кореляції серед ефекторних клітин при використанні імуномодулятора тимогеміна.

Практичне значення одержаних результатів. Практичне значення результатів проведеного дисертаційного дослідження полягає в тому, що з них випливає змістовна експериментальна екологічна модель механізму міокардіодистрофії та вагомих змін у крові в життєвих умовах тривалого впливу на організм людей хімічних факторів зовнішнього середовища малої інтенсивності. Модель може використовуватись для поглиблення уяв про механізми хімічного пошкодження серця за таких екологічних обставин, подальших пошуків засобів надійного упередження розвитку дегенеративних процесів у міокарді або хоча б ефективної корекції міокардіодистрофії, що вже розвинулася.

Вагоме значення мають також отримані дані, які свідчать про можливий зв’язок механізму міокардіодистрофії хімічної етіології та індукованого, вторинного Т-імунодефіциту. Підтверджена закономірність виникнення останнього в ході інтоксикації малими дозами пестициду. Цей факт набутої недостатності клітинного імунітету, який разом з іншими регуляторними системами контролює структурний гомеостаз організму, має пояснювати виявлену послабленість регенераторних процесів у кардіоміоцитах.

Практичне значення мають і позитивні результати застосування тимогеміну, які стверджувалися відносним збереженням популяції Т-лімфоцитів у разі профілактичного введення його і покращанням фагоцитарної активності нейтрофілів у профілактичному й при лікувальному використанні, а також відновленням втрачених і появою нових сильних позитивних кореляцій серед ефекторних клітин сполучної тканини міокарда.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом проаналізовані джерела наукової літератури з досліджуваної проблеми. Проведено експеримент, набрані об’єкти дослідження, здійснено їх аналіз, що базується на результатах мікроскопічного й електронномікроскопічного вивчення міокарда щурів, його морфометрії, підрахунках лейкоцитарної формули крові, визначення фагоцитарної активності нейтрофільних сегментоядерних лейкоцитів, співвідношень Т- і В-лімфоцитів. Автором особисто виконано статистичну обробку отриманих результатів, написано всі глави власних досліджень та їх обговорення, підготовлено ілюстративні докази основних положень роботи, спільно з науковим керівником сформульовано висновки.

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи дисертації доповідалися на VI з’їзді паталогоанатомів України 30 вересня 1998 року; на конференції у м. Івано-Франківськ 20-22 квітня 2000 року, на конференції в м. Санкт-Петербург жовтня-листопада 2000 року, на конференції молодих науковців Вінницького державного медичного університету в квітні 2000 року, на розширеному засіданні кафедр анатомії людини, гістології, цитології та ембріології, оперативної хірургії та топографічної анатомії 20 березня 2002 року.

Публікації. Основний зміст праці і результати досліджень повністю відображені у 7 публікаціях (4 статті опубліковано у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, з них 2 без співавторів).

Обсяг і структура дисертації. Повний обсяг дисертації – 162 сторінки, з яких основний текст займає 132 сторінки машинопису. Дисертація включає вступ, аналітичний огляд літератури, опис об’єктів та методів досліджень, 4 розділи власних досліджень, в останньому з яких обговорюються одержані результати, висновки та список використаних джерел. Дисертація ілюстрована 53 рисунками, 27 таблицями і 2 графіками. Список літератури містить 196 джерел (164 вітчизняних та 32 іноземних). Додатки представлені на 4 сторінках і містять акти впровадження результатів дисертаційної роботи.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали і методи дослідження. В роботі використовували білих лабораторних щурів, пестицид симазин у вигляді олійної суспензії, комплексний імуномодулятор тимогемін на фізіологічному розчині. Для морфологічних досліджень брали передню стінку лівого шлуночка серця, досліджували кров щурів.

Експериментально моделювалася наближена до дійсності ситуація, у якій неминуче споживання людьми харчових продуктів, що забруднені пестицидами. Мінімальний рівень такої забрудненості, за даними літератури (Каган Ю.С., 1981), становить 1/1000 – 1/2000 ЛД50. Щодо симазину, то це 1/1000 ЛД50 (середньосмертельна доза) або 10 МДР. Один МДР – максимально допустимий рівень шкідливої хімічної речовини в 1 кг харчового продукту. ЛД50 симазину для щурів (пероральне введення) становить 1390 мг/кг (Медведь Л.И., 1974).

Експерименти виконано на 147 білих статевозрілих лабораторних щурах-самцях. Пестицид вводили щоденно перорально за допомогою атравматичної голки на інсуліновому шприці. Оскільки симазин низько розчинний у воді, використовували масляну суспензію пестициду на рафінованій соняшниковій олії. Для зручності введення користувалися об’ємом 0,1 мл суспензії, в якому містилася 1/1000 ЛД50 симазину, тобто 10 МДР. У розрахунках дози покладалися на відомості про допустимі залишкові кількості симазину в 1 кг зернобобових, фруктів, овочів (Медведь Л.И., 1974). Спиралися на методичні вказівки про гігієнічну оцінку нових пестицидів.

Тривалість хронічного експерименту сім місяців. З них шість місяців певним групам тварин вводили симазин. Сьомий місяць брався як період реабілітації або можливого відновлення структур, що пошкоджувалися протягом шестимісячної інтоксикації симазином.

Зважаючи на дані наукової літератури і власні спостереження щодо несприятливої дії екзогенних хімічних речовин на імунну систему, від нормального стану якої залежить чимало важливих функцій, зокрема фізіологічна та репаративна регенерація (Анисимов В.Н., 1980), ми використовували імуномодулятор тимогемін профілактично, а також як лікувальний засіб. Він поєднує в собі тималін та гемалін. Обидва вони представники класу цитомединів (Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., 1983), котрі складають систему біологічних регуляторів, що здійснюють перенесення специфічної інформації як інструменту для фізіологічного функціонування, розвитку і взаємодії клітинних популяцій, а пестициди в організмі порушують медіаторну регуляцію.

В загальному плані проведені експерименти мають 5 серій:

1)

2)

3)

4)

5) загальний контроль – інтактна група щурів (35 щурів), котрим щоденно перорально вводили 0,1 мл олії, як емульгатор симазину.

Тимогемін (сухий препарат) у флаконі (10 мг) розводили фізрозчином (5,0 мл), отже в 1 мл кількість препарату дорівнювала 2 мг. За відомими рекомендаціями (Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., 1983), підшкірно щурам одноразово вводили 0,2 мг тимогеміну в об’ємі 0,1 мл розчину. В дослідах з профілактичним застосуванням тимогеміну (друга серія) його вводили кожні 5 перших днів на початку наступного місяця піврічного перорального введення симазину. Як додатковий контроль у такому ж режимі профілактики на фоні тривалої інтоксикації щурам п/шк вводили фізрозчин у такому самому об’ємі 0,1 мл. В дослідах з лікувальним використанням препарату його вводили після припинення шестимісячної інтоксикації симазином, тобто з початку сьомого місяця – 14 ін’єкцій протягом двох тижнів.

Тимогемін - комплексний пептидний біоактиватор з класу клітинних медіаторів – цитомединів. Він утворений з цитомедина тимуса - тималіна і цитомедина кісткового мозку - гемаліна. В досліди тимогемін взяли, керуючись існуючою науковою інформацією про мієлотропність (Кулаков А.Е., 1970) сим-триазинових пестицидів і виникнення анемічних станів, а також Т-імунодефіцита. До того ж відомо, що фактори тимуса підвищують резистентність організму, виконують роль імуномодулятора, перешкоджають розвитку пухлинного процесу, первинного лейкозу, розвитку туберкульозної інфекції, здійснюють протекторну дію при опроміненні, стимулюють процеси регенерації у випадках їх пригнічення (Гриневич Ю.А, Чеботарёв В.Ф., 1989, Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., 1984, Яковлев Г.М. и др., 1986).

Методи досліджень. Для комплексної оцінки дії на організм шкідливих речовин рекомендується проводити обов’язково морфологічні (Руднев М.И., Обузан Е.И., 1986) та гематологічні (Буркацкая Е.Н. и др., 1978) дослідження. Дослідження реакцій клітин крові допоможе зрозуміти механізми дії як інтегральний показник токсичного ефекту. Кров брали з кінчика хвоста до декапітації.

Визначали:

- абсолютну кількість лейкоцитів (у камері Горяєва);

- лейкоцитарну формулу крові по мазках, забарвлених азурII-еозином;

- фагоцитарну активність нейтрофілів (фагоцитарний індекс) (Чернушенко Е.Ф., Когосова Л.С., 1981);

- процентні співвідношення популяцій лімфоцитів – Т-, В- і “нульових”.

Відсоткові співвідношення популяцій лімфоцитів визначали в мазках крові за допомогою гістохімічного метода виявлення кислої фосфатази як маркера Т-лімфоцитів. Для цього використовували нафтол-As-Bi-фосфат і диазотований парарозанілін. Для кращого диференціювання лімфоцитів та інших ядерних клітин крові після маркірування фосфатази мазок додатково забарвлювали метиленовим блакитним індикатором (Иванова Л.А. и др., 1979).

Морфологічні методи. Перед початком морфологічних досліджень визначали вагу серця. Для світлооптичних досліджень шматочки передньої стінки лівого шлуночка фіксували у 10водному розчині нейтрального формаліну. Здійснювали парафінову заливку. Зрізи забарвлювали гематоксилін-еозином, по Ван Гізон, проводили імпрегнацію азотнокислим сріблом за методом Гоморі, забарвлювали толуїдиновим синім, азурII-еозином, залізним гематоксиліном по Гейденгайну. Вимірювали об’єм ядер кардіоміоцитів. Підраховували кількість різних ефекторних клітин у сполучнотканинних проміжках периваскулярної локалізації: сегментоядерні нейтрофіли, еозинофіли, моноцити, макрофаги, лімфоцити, плазматичні клітини, тканинні базофіли, - для вивчення кореляційної ситуації між цими ефекторними клітинами.

Для електронномікроскопічного дослідження матеріал стінки лівого шлуночка після подрібнення фіксували в 1розчині чотирьохокису осмію за Колфілдом на протязі двох годин на холоді. Об’єкти зневоднювали в етанолі зростаючої концентрації, в ацетоні і заливали в суміш епону з аралдітом (Карупу В.Я., 1984). Ультратонкі зрізи одержували на ультратомах LKB; Reichert. Контрастували 2розчином уранілацетату на 700 етанолі на протязі 15 хвилин та цитратом свинцю стільки ж часу. Вивчали в електронному мікроскопі ЕМ-125К і ЕМВ-100БР. Для порівняльної оцінки кількісних перебудов внутрішньоклітинних органел в кардіоміоцитах контрольних і піддослідних тварин застосовували метод морфометричного аналізу на основі принципів стереології (Лакин Г.Б., 1973). Стереологічні виміри здійснювались за допомогою напівавтоматичного пристрою для обробки графічних зображень за допомогою програми “Органелла”, розробленої в лабораторії електронної мікроскопії НДЛЦ Київського національного медичного університету ім. О.О. Богомольця. В кардіоміоцитах визначали кількісні показники міофібрил, мітохондрій та саркоплазматичної сітки. Зокрема підраховували об’ємну щільність міофібрил, об’ємну щільність мітохондрій, кількісну щільність мітохондрій, середню площу зрізу мітохондрій та фактор форми їх. Щодо саркоплазматичної сітки, то, вимірюючи її, визначали об’ємну щільність, кількісну щільність, середню площу зрізу та фактор форми.

Числові результати досліджень лейкоцитів та їх фагоцитарної активності, а також об’єму ядер у кардіоміоцитах та стереологічних вимірів обробляли методом варіаційної статистики. Кореляційний аналіз взаємовідносин клітин-ефекторів у міокарді проводили за рівнянням Пірсона на персональному комп’ютері.

Результати дослідження та їх обговорення. Досліджуючи морфологічні зміни в міокарді щурів, ми вивчали також коливання показників білої крові. З огляду на мієлотропність пестициду симазину, вважали такий підхід єдино вірним у своєму прагненні до максимально досяжного визначення об’єктивних причин міокардіальних пошкоджень хімічної етіології.

В результаті проведеного дослідження в динаміці експерименту було встановлено, що дія симазину протягом шести місяців проявляється лейкоцитозом. При чому, спостерігається переважно нейтрофільний лейкоцитоз, розвивається відносна еозинофілія, а з іншого боку моноцитопенія і лімфоцитопенія.

Щодо фагоцитарної активності сегментоядерних нейтрофілів, то порівняно з контрольними показниками фагоцитарний індекс до шести місяців прогресивно зменшується під дією симазину, відповідно: 60,8 та 35,8

Популяція Т-лімфоцитів зменшується від кінця другого тижня (35,4проти 57,2у контролі) до завершення експериментів (27,6проти 58,0в контролі). Стрімкий розвиток дефіциту Т-клітин супроводжується зростанням популяції В-лімфоцитів. Явище індукованого симазином Т-імунодефіциту спостерігається нами не вперше. У відповідь на хронічну інтоксикацію малими дозами пестицидів Т-імунодефіцит констатовано у попередніх експериментальних дослідженнях (Пушкарь М.С., 1991, Пушкарь М.С. и др., 1998), а також у клінічних обстеженнях людей, що довгий час мали професійний контакт з різноманітними пестицидами.

Паралельно таким гематологічним зсувам відчутно змінюються й морфологічні характеристики міокарду.

Так, на ранніх термінах спостережень (2 тижні, 1 місяць) серцеві м’язові волокна суттєво не відрізняються від таких у контрольних тварин, хоча зустрічаються сегменти волокон без поперечної посмугованості з ділянками еозинофільної або базофільної зернистості. В кардіоміоцитах таких волокон спостерігається субсарколемальний набряк і загальне просвітлення саркоплазми. Міофібрили часто дезорієнтовані, з ділянками лізису. Визначається набухання мітохондрій кардіоміоцитів, локальний лізис зовнішніх мембран і крист, просвітлення матриксу. Стереологічні дослідження показали, що статистично ймовірно знижуються показники об’ємних щільностей міофібрил, мітохондрій і саркоплазматичної сітки та кількісних щільностей двох останніх у порівнянні з контролем (табл.1).

Крім змін в кардіоміоцитах, спостерігаються також зміни в структурній організації сполучнотканинних елементів та гемомікроциркуляторному руслі. Ретикулярні волокна спочатку набухають і фрагментуються, а при збільшені строку інтоксикації грубішають, колагенізуються. Ефекторні клітини крові, в тому числі лімфоцити, потроху інфільтрують сполучнотканинні проміжки і, крім того, розміщені в зонах дистрофічно змінених м’язових волокон. Для гемокапілярів характерне різке стоншення цитоплазми ендотеліальних клітин, що є проявом процесу рекапітуляції ендотелію (Стеченко Л.А., 1989). Подекуди спостерігається розходження ендотеліоцитів і вихід у інтерстицій формених елементів крові. В ендотеліоцитах, просвіті судин та в кардіоміоцитах виявляються мієліноподібні фігури, які вважаються субстратом порушення перекисного окислення ліпідів, і утворюються в результаті руйнування мембранних структур клітин (Маркова О.О., 1998).

Таблиця 1

Стереологічні показники змін міофібрил, мітохондрій та саркоплазматичної

сітки (СС) в кардіоміоцитах лівого шлуночка серця щурів

після дії симазину

Терміни спосте-режень | Об’ємна щіль-ність міофібрил, % | Об’ємна щіль-ність мітохондрій, % | Кількісна щільність мітохондрій,

10-2/мкм3 | Середня площа зрізу мітохондрій

10-2мкм2 | Об’ємна щільність СС, % | Кількісна щільність СС,

10-2/мкм3 | Середня площа зрізу СС, 10-2мкм2

Контроль | 65,2±2,8 | 27,5±1,8 | 34,0±3,0 | 49,8±2,4 | 1,95±0,42 | 76,7±12,9 | 7,6±0,9

1 місяць | 40,6±5,6* | 15,3±2,7* | 20,8±4,2* | 49,4±2,4 | 0,28±0,03* | 21,0±5,6*,** | 5,0±0,4*

3 місяці | 44,3±3,8* | 21,1±3,8 | 14,6±2,9* | 77,6±4,5* | 0,16±0,06* | 9,1±2,7*,** | 6,1±1,3

6 місяців | 32,9±2,5* | 13,2±1,9*,** | 18,5±3,4* | 47,9±2,6** | 0,31±0,10* | 37,3±5,3*,** | 3,4±0,4*,**

* - вірогідно відносно контролю (р<0,05);

** - вірогідно відносно попереднього терміну спостереження (р<0,05).

На більш пізніх строках (3-6 місяців) в сегментах м’язових волокон серця симазинова інтоксикація обумовлює поступове посилення ознак зернистої міокардіодистрофії з проявами гетерогенності, розрідження, близького до стану лізису, а через три місяці й зони чистого сарколізису. Виявляються кардіоміоцити, в яких повністю чи частково відсутня поперечна посмугованість. Міофібрили часто дезорієнтовані, з ділянками лізису, спостерігається субсарколемальний набряк. Продовжують знижуватися і значно відстають від контрольних показники об’ємної та кількісної щільності міофібрил, мітохондрій та саркоплазматичної сітки (табл 1). Що стосується розмірів цих органел, то через 3 місяці відбувається статистично достовірне збільшення середньої площі зрізів мітохондрій на фоні зменшення їх кількості, що, можливо, пов’язано з процесом їх злиття. За даними А.С. Гавриш і співавт. (1996) це явище слід вважати мітохондріальною асоціацією. Вона лабільна і є адаптаційною реакцією, яка спрямована на оптимізацію функції системи енергетичного забезпечення кардіоміоцитів як в ситуації підвищення загального навантаження на серце, так і його перерозподілу поміж робочими клітинами скорочувального міокарда. Лабільність мітохондріальної асоціації зберігається в кардіоміоцитах і через шість місяців пестицидної інтоксикації, але компенсаторна гіпертрофія їх зменшується і розвиваються деструктивно-дистрофічні зміни (табл.1). Статистично ймовірно знижуються і всі досліджені стереологічні показники канальців саркоплазматичної сітки, що призводить до порушень кальцієвої регуляції функції саркомерних компонентів. Подекуди спостерігаються цілком зруйновані кардіоміоцити.

В гемомікроциркуляторному руслі через 6 місяців хронічної інтоксикації симазином, як і через 3, ендотеліальна вистелка значно стоншена і майже позбавлена органел білоксинтетичного призначення. Разом із тим виявляється послаблення електронної щільності просвіту мікросудин при більш значному периваскулярному набряку і накопиченні тут білкових конгломератів, як результату порушення проникності стінок судин.

Таким чином, встановлено, що малі дози симазину при систематичному надходженні до організму суттєво деформують співвідношення клітин білої крові, що проявляється компенсаторною нейтрофілією, ознаками алергізації у вигляді еозинофілії, а з іншого боку – моноцитопенією, невпинним зростанням Т-імунодефіциту на фоні В-лімфоцитозу. До того ж виявляється поступове падіння фагоцитарної активності нейтрофільних лейкоцитів. Ці зміни супроводжуються прогресивним поглибленням міокардіодистрофії. Слід відзначити, що розвиток міокардіодистрофії корелює зі змінами функціонального напруження ядер кардіоміоцитів, показники яких на початкових стадіях експерименту, коли ще прогресують реактивні зміни, свідчать про їх гіпертрофію, а наприкінці при перевазі дистрофічних процесів в міокарді відмічається різке зменшення їх розмірів (табл.2).

Таблиця 2

Об’єми ядер (мкм3) кардіоміоцитів при хронічному введенні симазину

Серії

експериментів | Терміни досліджень

2 тижні | 1 місяць | 3 місяці | 6 місяців

Контроль | 96,6±1,81 | 96,5±1,82 | 96,6±1,82 | 96,2±1,76

Симазин | 157,6±5,26* | 173,2±4,76* | 162,7±5,21* | 64,5±1,72*,**

* - вірогідно відносно контролю (р<0,05);

** - вірогідно відносно попереднього терміну спостереження (р<0,05).

Ці дані корелюють зі зменшенням відносної ваги серця щурів тільки через шість місяців експерименту (2,9±0,11 проти 3,4±0,22 у контрольних тварин).

Дискретне, протягом шестимісячної інтоксикації симазином, застосування тимогеміна з метою корекції значно покращує як показники з боку периферичної крові, так і гістологічні характеристики міокарду. Так, через 6 місяців в 1,5 рази збільшується абсолютна кількість лейкоцитів (19,7 проти 12,7 у контролі та 15,2 в групі з використанням симазину). Що стосується окремих форм лейкоцитів, то відносно контролю еозинофілів у крові щурів серій симазин – тимогемін в кінці шостого місяця в 1,75 разів більше, а у серії симазин-фізрозчин – їх більше в 2,25 рази. Ці результати свідчать, що алергізація організму щурів на симазин неминуча.

Що стосується фагоцитарної активності нейтрофілів, то у щурів серії симазин-фізрозчин вона знижується до 38,0проти 53,7в серії симазин-тимогемін і проти 60,8в контролі, тобто досить збережена в усіх термінах експерименту.

Підрахунки серед популяції Т- і В- лімфоцитів крові тварин усіх серій показують прогресуючий до кінця шостого місяця Т-імунодефіцит (26,2Т-лімфоцитів у групі симазин-фізрозчин проти 43,6в серії симазин-тимогемін і 58,0у контрольних тварин). Паралельно в протилежному відношенні зростає чисельність В-лімфоцитів (52,8у серії симазин-фізрозчин проти 34,2у контролі, в кінці експерименту 59,0проти 33,8у контролі).

Згідно морфологічних даних на ранніх строках щоденної інтоксикації симазином на фоні короткочасного профілактичного введення тимогеміну характер змін в міокарді лівого шлуночка серця щурів близький до тих, які розвиваються під дією самого симазину, але ступінь вираженості їх дещо інший. В першу чергу це стосується стану скорочувального та енергетичного апаратів кардіоміоцитів. Аналіз кількісних даних в групах тварин, що отримували протягом місяця симазин, і таких самих тварин, але з профілактичним введенням тимогеміну показує те, що ознаки, які характеризують стан міофібрил і мітохондрій в кардіоміоцитах порівнювальних груп суттєво відрізняються. Іншими словами, дія лише самого симазину протягом одного місяця обумовлює достовірне зменшення стереологічних показників міофібрил і мітохондрій (див. табл. 1), тоді як профілактичне введення тимогеміну попереджує суттєві зміни об’ємної щільності міофібрил, об’ємної, кількісної щільності та середньої площі зрізу профілей мітохондрій (табл.3) в кардіоміоцитах.

Таблиця 3

Стереологічні показники змін міофібрил, мітохондрій та саркоплазматичної сітки (СС) в кардіоміоцитах лівого шлуночка серця щурів

після дії симазину на фоні профілактичного введення тимогеміну

Терміни спосте-режень | Об’ємна щіль-ність міофібрил, % | Об’ємна щіль-ність мітохондрій, % | Кількісна щільність мітохондрій,

10-2/мкм3 | Середня площа зрізу мітохондрій

10-2мкм2 | Об’ємна щільність СС, % | Кількісна щільність СС,

10-2/мкм3 | Середня площа зрізу СС, 10-2мкм2

Контроль | 65,2±2,8 | 27,5±1,8 | 34,0±3,0 | 49,8±2,4 | 1,95±0,42 | 76,7±12,9 | 7,6±0,9

1 місяць | 59,8±3,6 | 25,1±2,9 | 35,8±3,5 | 43,4±1,9* | 0,31±0,03* | 19,0±4,9* | 5,8±0,3*

3 місяці | 37,0±3,3* | 22,6±2,1 | 26,3±2,3*,** | 52,8±2,2 | 0,26±0,03* | 20,6±3,9* | 4,8±0,6

6 місяців | 39,6±3,9* | 15,0±1,7*,** | 15,2±2,5*,** | 59,2±2,9* | 0,81±0,25*,** | 14,0±4,3* | 13,2±2,9*,**

* - вірогідно відносно контролю (р<0,05);

** - вірогідно відносно попереднього терміну спостереження (р<0,05).

Щодо саркоплазматичної сітки, то введення тимогеміну на фоні одномісячної інтоксикації симазином не забезпечує захисну дію. Кількісні показники тут однотипно змінюються в обох групах, що статистично вірогідно відрізняє їх від контролю (табл.3).

Введення тимогеміну на фоні постійного протягом місяця впливу симазину не відбивається суттєво на ультраструктурній організації гемомікроциркуляторного русла міокарда, яка в цілому не відрізняється від того, що описано для цього строку спостережень у міокарді щурів, які переносили інтоксикацію без підтримки тимогеміном.

До особливостей міокарда щурів цієї серії спостережень слід віднести ознаки активації імунокомпетентних клітин. Посилюється макрофагальна реакція, про що свідчить виявлення у значній кількості макрофагів і лімфоцитів, що можливо пов’язати з утилізацією некротичних залишків клітинного детриту, який визначається в інтерстиціумі і стимулюють, очевидно, аутоімунний процес.

Другий шлях утилізації пошкоджених кардіоміоцитів, запрограмованих на загибель, - це апоптоз - фізіологічний процес, який рідко вдається спостерігати в нормі з причини його короткочасності. Інтоксикація симазином, що супроводжувалась введенням тимогеміну, обумовлює появу кардіоміоцитів, у яких порушуються міжклітинні контакти, вони округлюються, в їх саркоплазмі зростає кількість лізосомальних утворень, ущільнюється каріоплазма й хроматин, міняється конденсація останнього. Такі клітини перетворюються в апоптозні тіла, котрі надалі мають бути утилізованими макрофагами або іншими сполучнотканинними клітинами.

Через 3 місяці після початку експерименту гістологічна картина міокарда суттєво не відрізняється від того, що спостерігалося в групі без підтримки тимогеміном. В кардіоміоцитах відбуваються подальші деструктивні зміни в міофібрилах, про що свідчать дані стереологічного аналізу (табл.3). Для мітохондріального апарату характерною є гетерогенність пошкодження їх структурної організації. Разом з тим визначаються мітохондрії, що мають ознаки активації процесів внутрішньоклітинної регенерації. Про це свідчить наявність злитих разом цих органел, утворюючих структури довжиною до 5-6 саркомерів. Крім того, в деяких мітохондріях зустрічаються кільцеподібні розташування крист, що має збільшувати площу поверхні крист як морфологічного субстрату синтезу АТФ.

Результати стереологічного аналізу показали, що більшість показників, які характеризують стан міофібрил і мітохондрій, в групах без використання тимогеміну та з його підтримкою статистично однотипні (див. табл. 1 і 3). Це є свідченням того, що профілактичне введення тимогеміну на фоні постійної трьохмісячної інтоксикації симазином недостатньо попереджує розвиток деструктивних змін у міофібрилах та мітохондріях кардіоміоцитів. Спостерігається також гіпертрофія мітохондрій, як і у попередньому терміні спостережень, і яка має безперечно компенсаторно-пристосувальний характер. Але в той самий час не відбувається подальшого посилення змін саркоплазматичної сітки, показники якої залишаються статистично однотипними у порівнянні з попереднім терміном цієї лінії експерименту, тоді як в групі без профілактики виявляється подальше зростання деструктивних процесів (див. табл. 1 і 3).

Через 6 місяців інтоксикації симазином з одночасною періодичною підтримкою тимогеміном зміни у міокарді щурів мають той же напрямок, що й у тварин, які тимогеміну не отримували, проте ступінь їх вираженості менший. На фоні деструктивних процесів у міофібрилярному апараті кардіоміоцитів спостерігається активація білоксинтезуючих процесів. Про це свідчить збільшена чисельність рибосом, канальців зернистої ендоплазматичної сітки й комплексу Гольджі. Серед мітохондрій переважають структури зі збереженими зовнішніми та внутрішніми мембранами. Зустрічаються досить часто мітохондрії неправильної форми, з виростами на їх поверхні, що відбиває процес їх брунькування, тобто новоутворення.

Якщо порівнювати дані з аналогічними показниками в кардіоміоцитах щурів аналогічного терміну спостережень, які однак не отримували тимогеміну, то можна помітити, що кількісні показники у характеристиці міофібрил та мітохондрій у порівнюваних групах мають досить однотипний вигляд, за виключенням несуттєвої, але статистично значущої різниці в розмірах мітохондрій (табл. 1 і 3), що в цілому має означати подібність змін міофібрил та мітохондрій в умовах інтоксикації симазином без підтримки і з підтримкою тимогеміном. Дещо інакше поводять себе елементи саркоплазматичної сітки, кількісні характеристики яких в кінці шостого місяця мають свою спрямованість порівняно з тією, що виявлялася в кардіоміоцитах щурів, які зазнали хронічної інтоксикації симазином без профілактичної підтримки тимогеміном (табл. 1 і 3). В останній відбувалося дроблення канальців, про що свідчить зменшення їх розмірів при зростанні чисельності (табл. 3), тоді як корекція тимогеміном має інші наслідки щодо цих органел: зменшення їх кількості супроводжується різким збільшенням їх розмірів.

Періартеріально спостерігається набряк в сполучнотканинних прошарках міокарда і, одночасно помітно збільшення кількості макрофагів і лімфоцитів, порівняно з групою з використанням симазину. В гемомікроциркуляторному руслі визначаються зміни, які були характерні для цих же судин в групі з дією симазину. Разом з тим, слід відмітити, що в ендотелії деяких кровоносних капілярів спостерігається збільшення елементів білоксинтезуючого апарату та зменшення електронної щільності просвітів.

Таким чином, при підтримці тимогеміном у міокарді поряд із дистрофічними змінами виявляються прояви стимуляції внутрішньоклітинної регенерації та активації макрофагальної системи. Посилення пристосувальних процесів у міокарді корелює з покращенням кількісних показників крові.

Дані морфометричного аналізу ядер кардіоміоцитів цієї групи досліджень свідчать, що профілактичне застосування тимогеміну на ранніх строках експерименту дещо сповільнює гіпертрофію ядер, а на пізніх, навпаки підсилює (табл.4). При цьому відносна вага серця практично не відрізняється від контрольних показників.

Що стосується досліджень через 7 місяців, то спостерігається незначний позитивний вплив тимогеміна, застосованого лише в якості лікувального засобу. Це стосується фагоцитарної активності сегментоядерних нейтрофілів. Щодо індукованого симазином Т-імунодефіциту і деструктивних змін у міокарді, то вони не мають до кінця 7-го місяця позитивної динаміки, як і у тварин нелікованих після припинення введення симазину.

Таблиця 4

Об’єми ядер (мкм3) кардіоміоцитів при профілактиці тимогеміном на фоні введення симазину

Серії

експериментів | Терміни досліджень

2 тижні | 1 місяць | 3 місяці | 6 місяців

Контроль | 96,6±1,81 | 96,5±1,82 | 96,6±1,82 | 96,2±1,76

Симазин | 157,6±5,26* | 173,2±4,76* | 162,7±5,21* | 64,5±1,72*,**

Симазин+тимогемін | 142,8±3,87* | 107,9±2,14* | 168,7±3,48* | 221,4±5,41*

* - вірогідно відносно контролю (р<0,05);

** - вірогідно відносно попереднього терміну спостереження (р<0,05).

Отже, в результаті проведених досліджень доведено, що симазин в динаміці експерименту в міокарді щурів викликає міокардіодистрофію та деструктивні зміни у всіх структурних компонентах міокарда. Особливо виражені зміни спостерігаються на 6 місяці дії симазину. Результати наших спостережень з використанням тимогеміну як імуномодулятора, свідчать, що протидія його направлена на зменшення гіпоксії міокарда, деструкції кардіоміоцитів та їх органел, активізацію білок-синтезуючого та енергетичного апаратів кардіоміоцитів. Властивості тимогеміну ефективно реалізуються лише в режимі профілактичного застосування впродовж інтоксикації симазином. З цього факту виходить практична рекомендація у випадках неминучості контакту з пестицидами застосовувати тимогемін профілактично.

ВИСНОВКИ

В дисертації вирішена актуальна медична задача – вивчені характер і динаміка структури міокарда та показників периферичної крові при хронічній інтоксикації пестицидом симазином в малих дозах, а також при профілактичному та лікувальному застосуванні імуномодулятора тимогеміна. Встановлено, що симазин в малих дозах призводить до розвитку вираженої міокардіодистрофії, яка корегується лише при профілактичному застосуванні імуномодулятора тимогеміна.

1. Вперше встановлена взаємозалежність змін показників крові та структурної організації міокарда від часу дії пероральної інтоксикації малими дозами симазину. Під впливом симазину відбувається нейтрофільний лейкоцитоз, еозинофілія, моноцитопенія, лімфоцитопенія, яка супроводжується зменшенням вмісту Т-лімфоцитів, та відчутне падіння фагоцитарної активності нейтрофілів. В міокарді компенсаторно-пристосувальні процеси, які характерні для ранніх строків експерименту, починаючи з 3 місяця інтоксикації змінюються на дистрофічно-деструктивні, проявом яких є розвиток міокардіодистрофії.

2. Періодична протидія тимогеміна на фоні пестицидної інтоксикації за всіма показниками зменшує гіпоксію міокарда, обмежує процеси деструкції міофібрил і мітохондрій в кардіоміоцитах, сприяє збагаченню їх елементами апарату білкового синтезу і джерелами енергетичного забезпечення. Протидія тимогеміну найбільш виразна на ранніх етапах експерименту, що підтверджується показниками об’ємної щільності міофібрил (40,6±5,6 при дії симазину; 59,8±3,6 при паралельному введенні тимогеміну; 65,2±2,8 у інтактних тварин), об’ємної щільності мітохондрій (відповідно, 15,3±2,7; 25,1±2,9; 27,5±1,8) та їх кількісної щільності (відповідно, 20,8±4,2; 35,8±3,5; 34,0±3,0). Позитивна динаміка у структурі кардіоміоцитів корелює з покращанням фагоцитарної активності сегментоядерних нейтрофілів, зростанням Т-клітинної ланки імунітету, збільшенням кількості моноцитів крові як попередників макрофагів.

3. Протективний вплив тимогеміну проявляється в міокарді збереженням важливих позитивних кореляційних зв’язків між ефекторними клітинами в сполучнотканинних прошарках. Процеси регенерації відбуваються на фоні інтенсивного звільнення міокарда від детритних залишків некротизованих клітин шляхом активної діяльності макрофагів. Збільшується частота виявлення апоптозних клітин, які є формою природного закінчення їх життєвого циклу.

4. В кінці реабілітаційоного періоду в міокарді щурів, які зазнали тільки інтоксикації, структурні зміни відповідають таким, які характерні для кінця шостого місяця, відсутня позитивна динаміка показників лейкоцитарної ланки захисту та імунологічної реактивності. У тварин, що були протягом інтоксикації під захистом тимогеміну, показники всіх досліджуваних об’єктів та їх функцій істотно покращуються кількісно та якісно.

5. Після лікування щурів тимогеміном від вже сформованих наслідків довготривалої симазинової інтоксикації не спостерігається відновлення структури міокарда, не зростає кількість Т-лімфоцитів, дещо активізується фагоцитарна активність сегментоядерних нейтрофілів. Найефективнішим імуномодулятор тимогемін виявляється в режимі протекторного його застосування.

6. Наявність ознак підсилення регенераторних процесів у кардіоміоцитах щурів при застосуванні впродовж інтоксикації симазином імуномодулятора тимогеміна, дозволяє рекомендувати його як запобіжний засіб для підтримання резистентності організму, що слід вважати перспективним напрямком профілактичної й лікувальної медицини.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Пивоварова Л.П. Структура міокарда і фактори реактивності організму в умовах пестицидної інтоксикації // Вісник морфології. - 2000. – Т.6, №1. - С.39-41.

2. Пивоварова Л.П. Імуномодуляторна корекція реактивності організму та структури міокарда в умовах тривалої пестицидної інтоксикації // Вісник Вінницького державного медичного університету. - 2000. – Т.4, №2. - С.417-419.

3. Стеченко Л.О., Пивоварова Л.П. Ультрамікроскопія міокарда щурів у різних періодах піврічної інтоксикації пестицидом симазином // Український медичний альманах. - 2000. - Том3, №3. - С.145-147. (Ідея та основний зміст належить дисертанту).

4. Пивоварова Л.П., Куфтирева Т.П., Скибинська Т.P. Аналіз ультрамікроскопічних змін у міокарді щурів при пестицидній інтоксикації та корекції тимогеміном // Вісник Вінницького державного медичного університету. - 2001. – Т.5, №1. - С.38-40. (Здобувачем особисто виконані обгрунтування ідеї та змісту експерименту, проведені дослідження, обробка отриманих результатів).

5. Пушкарь М.С., Пивоварова Л.П., Пушкарь П.М. Морфофункциональные аспекты кардиомиопатии химической этиологии и возможности коррекции // Судинні і онкологічні захворювання: морфогенез та екологічний патоморфоз: Матеріали 6-го конгресу патологів України. - Вінниця, 1998. - С.302-304. (Дисертантом проаналізовано стан проблеми, яка вивчалась).

6. Пушкарь М.С., Пивоварова Л.П., Тереховсквая Е.И. К механизму действия цитомединов на иммунную систему крыс в условиях интоксикации малыми дозами пестицидов // Актуальные вопросы клинической патоморфологии. Сб. трудов науч. конф., посвящённой 80-летию со дня рождения и 50-летию работы в С.-Петербургской медицинской академии последипломного образования з.д.м.н. РФ, члена-корр. РАМН, профессора О.К. Хмельницкого. - С.-Петербург. – 2000. – С.153. (Здобувачем виконані гістологічні дослідження, оброблені їх результати, підготовлені матеріали до друку).

7. Влияние пренатальной пестицидной интоксикации на тимус потомства и её коррекция / Тереховская Е.И, Кравчук В.В., Пивоварова Л.П.. и др. // Морфология. - 2000. – Т.117, №3. - С.120. (Здобувачем проведені гістологічні дослідження, оброблені результати, написаний морфологічний фрагмент статті).

АНОТАЦІЯ

Пивоварова Л.П. Структура міокарда щурів при хронічній інтоксикації симазином і корекції тимогеміном. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.09 – гістологія, цитологія, ембріологія. – Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця. – Київ, 2002.

Дисертація присвячена вивченню характеру і динаміки морфофункціональних змін у міокарді