МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ім. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

ПРИТУЛО ОЛЬГА ОЛЕКСАНДРІВНА

УДК 616.527:612.017.71:612.015.1:616-005.1-08+616.94-08:615

АКАНТОЛІТИЧНА ПУЗИРЧАТКА: ІМУНО-

ГЕМОКОАГУЛЯЦІЙНИЙ, ПРОТЕОЛІТИЧНИЙ ДИСБАЛАНС ТА ЕНДОТОКСИКАЦІЙНИЙ СИНДРОМ В ПАТОГЕНЕЗІ ПРОГРАДІЄНТНОГО ПЕРЕБІГУ

14.01.20 - шкірні та венеричні хвороби

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

д о к т о р а медичних наук

Київ - 2003 Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Кримському державному медичному університеті

імені С.І.Георгієвського МОЗ України.

Науковий консультант: доктор медичних наук, професор Коляденко

Володимир Григорович,

Національний медичний університет

імені О.О. Богомольця МОЗ України, завідувач

кафедри шкірних та венеричних хвороб.

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Глухенький

Борис Тихонович,

Київська медична академія післядипломної

освіти ім. П.Л.Шупика МОЗ України, професор

кафедри шкірних та венеричних хвороб.

доктор медичних наук, професор Романенко

Всеволод Миколайович,

завідувач кафедри шкірних та венеричних

хвороб Донецького медичного університету

ім.М.Горького

доктор медичних наук, професор Андрашко Юрій

Володимирович, Ужгородський державний

університет МОЗ України, завідувач кафедри

шкірних та венеричних хвороб.

Провідна установа: Харківський інститут дерматології та венерології АМН України, м. Харьків.

Захист дисертації відбудеться “4” uhelyz 2003 року о 13.30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.003.02 при Національному медичному університеті імені О.О.Богомольця Міністерства охорони здоров’я України (адреса: 01023, м.Київ - 23, вул. Шовковична, 39/1; Центральна Міська клінічна лікарня, корпус 2).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Національного медичного університету імені О.О.Богомольця МОЗ України (адреса: 03057, м.Київ - 57, вул. Зоологічна, 3).

Автореферат розісланий “31” жовтня 2003 року.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради, доктор медичних наук

професор Свирид С.Г.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Рівень захворюваності на акантолітичну пузирчатку (АП) становить близько 1% в структурі дерматологічної патології. Актуальність і важливість подальшого вивчення проблеми АП обумовлена тяжким перебігом захворювання, високою інвалідизацією, смертністю, несподіваністю загострень, недосконалістю діагностики та лікування, а також наявністю серйозних ускладнень та побічних ефектів від традиційної імуносупресивної терапії (Торсуєв С.А., Романенко В.Н. 1979; Глухенький Б.Т., Грандо С.А., 1990; Корольова Ж.В., 1990; Коляденко В.Г. і співавт., 1997).

Крім цього, деякі атипові клінічні форми проявів даного захворювання, паранеопластична пузирчатка, герпетиформні синдроми, потребують від клініцистів використання найбільш точних лабораторних методів діагностики для верифікації діагнозу. Існуючі на сьогодні імунофлюоресцентні, гістологічні, цитологічні методи лабораторного обстеження в більшості випадків дозволяють уточнити діагноз. Однак вони не завжди забезпечують можливість розмежувати подібні за клінічними проявами захворювання (Матушевская Е.В., 1996; Todd J.A., Acha-Orbea H.L., 1987; Kozlowska A, Hashimoto T. et al 2003), особливо на ранніх стадіях патологічного процесу, коли акантолітичні клітини Тцанка, головну цитологічну ознаку захворювання, ще не вдається виявити.

Проблема терапії АП, як і, до речі, інших аутоімунних захворювань, полягає у використанні імунодепресантів – цитостатиків, глюкортикостероїдів (ГКС). Відомо, що ці лікарські засоби в деякій мірі супресують розвиток патологічних процесів при АП, але, на жаль, позитивний результат від їх використання обмежений в часі побічними ефектами та ускладненнями.

Особливо складним є вибір тактики лікування хворих з тяжким проградієнтним перебігом захворювання та гормонорезистентністю. За результатами спостережень, клінічною особливістю перебігу захворювання у даної категорії хворих є формування у них гемокоагуляційних розладів – синдрому дисемінованого внутрішньосудинного згортання крові, тромбозу глибоких вен нижніх кінцівок, тромбоемболії гілок легеневої артерії, шлунково-кишкових кровотеч (Коляденко В.Г. та співавт., 1981; Глухенький Б.Т. Грандо С.А., 1991).

Необхідність призначення високих доз імунодепресантів незмінно веде до прогресування вторинного імунодефіциту, що пов’язано з розвитком у хворих на АП інтеркурентної інфекції, і веде до пониження антиендотоксинового імунітету, підвищення рівня білкового катаболізму,

виразності синдрому ендогенної інтоксикації (Федорич П.В., 1997; Пантелєєва Г.А. та співавт., 2001).Тому вивчення та поглиблений аналіз імунних та біохімічних параметрів процесу, будуть сприяти визначенню патогенетичних механізмів, що обумовлюють тяжкий перебіг дерматозу, та дозволять запропонувати методи диференційованого підходу до лікування АП у кожному конкретному випадку.

В зв’язку з цим актуалізується один із вагомих аспектів пошуку методів ад’ювантної терапії, спрямованих на підвищення ефективності лікування і сприяючих скороченню кількості ускладнень та побічних ефектів від імуносупресивної перманентної терапії.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках наукової тематики кафедри шкірних та венеричних хвороб КДМУ імені С.І. Георгієвського “Розробка та втілення нових методів діагностики, лікування та профілактики деяких шкірних та венеричних захворювань”(№ державної реєстрації 0100U003141.Шифр.2.111).

Здобувачем самостійно виконано фрагмент “Нові патогенетично обґрунтовані підходи до діагностики та лікування хворих на акантолітичну пузирчатку”.

Мета дослідження.

Удосконалення методів ранньої диференційної діагностики, підвищення ефективності лікування та запобігання розвитку ускладнень у хворих на акантолітичну пузирчатку, з урахуванням дисбалансу еферентних ланок систем імунітету, протеолізу та гемостазу в процесі проградієнтного перебігу захворювання.

Задачі дослідження.

1.Провести клінічне обстеження 125 хворих на акантолітичну пузирчатку.

2.Вивчити методом імуноблотингу спектр ауто антитіл до антигенів епідермісу при різних клінічних варіантах акантолітичної пузирчатки та деяких бульозних дерматозах. На основі отриманих результатів розробити метод диференційної діагностики бульозних дерматозів.

3.Вивчити перерозподіл рецепторів лектинів нормальної шкіри при істинній пузирчатці та дерматозі Дюрінгу, і на цій основі запропонувати метод диференційної діагностики цих дерматозів.

4.Визначити експресію Fas рецептору (антиген CD95) на кератиноцитах та описати формування акантолітичних клітин Тцанку шляхом апоптозу.

5.Вивчити рівні антитіл до ліпополісахариду кишкової палички, аутоантитіл до одно- та дво ниткової ДНК та визначити їх участь в імун-ній відповіді у хворих на АП в процесі проградієнтного перебігу захворювання.

6.Установити роль Fas-залежного апоптозу Т-лімфоцитів периферійної крові в залежності від проградієнтності перебігу захворювання, та терапії глюкокортикостероїдами.

7.Вивчити залежність між рівнем ендогенної інтоксикації у хворих, ступінню важкості перебігу АП, та вмістом молекул середньої маси в крові та сечі.

8.Вивчити значення змін системних та регіонарних гемокоагуляційних механізмів, протеолітичних реакцій у формуванні проградієнтності АП.

9.Розробити комплексні, патогенетично обґрунтовані методи лікування акантолітичної пузирчатки, які передбачають диференційне використання пара (амінометил) бензойної кислоти (ПАМБА), свіжозамороженої плазми (СЗП), гемоімуносорбції на ДНК-сорбентах, курантілу (дипиридамолу).

10.Порівняти клінічну та лабораторну ефективність загальноприйнятої терапії та запропонованих методів лікування. Провести аналіз диспансерного спостереження хворих на АП.

11.Впровадити в практичну діяльність ШВД розроблені методи діагностики і лікування АП.

Об’єкт дослідження: хворі на АП та інші бульозні дерматози.

Предмет дослідження: клінічні особливості, та патогенез АП в проградієнтному перебігу захворювання; методи диференційної діагностики АП; розробка нових способів комплексної індивідуалізованої терапії АП.

Методи дослідження: клінічні, імунологічні, цитологічні, імуногістохімічні, біохімічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. У дисертаційній роботі наведено нові теоретичні,клінічні, імунологічні, біохімічні дані щодо шляхів інтегральних механізмів формування хибного кола, проградієнтного перебігу АП. Викладено патогенетичне обгрунтування лікування тяжкого аутоімуного бульозного дерматозу на основі комплексної корекції виявлених порушень, яка дозволяє підвищити ефективність традиційної терапії АП.

Вперше запропоновано метод імуноблотингу для виявлення аутоантитіл до антигенів епідермісу при різних клінічних формах АП та деяких бульозних дерматозах.

Вперше установлено специфічний перерозподіл рецепторів лектинів характерний для АП та дерматозу Дюрінгу, та описано формування акантолітичних клітин Тцанка шляхом апоптозу кератиноцитів, також вивчено особливості антиендотоксинового імунітету у хворих на АП.

Вперше доведено підвищення рівня аутоантитіл до одно- та дво ниткової ДНК у хворих на АП, яке асоційовано із порушенням антиендотоксинового імунітету, та важкістю перебігу дерматозу, проведено комплексну оцінку коагуляційного гемостазу та фібринолізу у хворих на АП,досліджено особливості імунної регуляції фібринолізу у хворих на АП.

Вперше, на основі імунофенотипічних досліджень встановлено, що дія преднізолону проявляється у дозозалежному зниженні кількості активованих Т-хелперів з фенотипом CD4+CD25+, CD4+CD71+ та CD4+HLA-DR+, CD4+CD95+, з одночасним збільшенням кількості апоптотичних Т-лімфоцитів. Збільшення порогової дози ГКС не супроводжувалось пропорційним зменшенням кількості активованих Т-хелперів, але значно збільшувало кількість апоптотичних Т-лімфоцитів.

Вперше вияснено, що лікування ГКС не понижує виразність протеолітичної активності нейтрофільних гранулоцитів. Виявлено дискретність в системі фібринолізу у хворих на АП, що заключається в пониженні системної активаторної активності крові, урокіназної активності сечі, з одночасним високим фібринолітичним потенціалом бульозної рідини.

Вперше показано, що високий фібринолітичний потенціал бульозної рідини асоційовано з накопиченням у вогнищі ураження нейтрофілів та CD8+ лімфоцитів. Доведено, що використання свіжозамороженої плазми у комплексному лікуванні важких форм пузирчатки сприяє підвищенню клінічної ефективності терапії, корекції виражених порушень системи протеолізу та рівня плазмового фібронектину.

Вперше дано клініко-імунологічне обґрунтування доцільності проведення гемоімуносорбції на ДНК-сорбентах в комплексному лікуванні хворих на АП.

Вперше доведено, що застосування ПАМБА у комплексному лікуванні хворих на АП сприяє корекції показників системи протеолізу, та дозволяє зменшити інтенсивність аутоімунного запалення, знизити морбідостатичну дозу ГКС та тривалість їх прийому, та обґрунтовано доцільність застосування курантілу (дипиридамолу) у комплексному лікуванні хворих на АП.

Практичне значення одержаних результатів. Результати роботи розширюють і поглиблюють розуміння патогенезу інтегральних механізмів формування хибного кола, проградієнтного перебігу АП, роль порушення стану чинників неспецифічного захисту та імунного гомеостазу, обгрунтовують лікування тяжкого аутоімуного бульозного дерматозу та оптимізації комплексної корекції виявлених порушень, які дозволяють підвищити ефективність традиційної терапії АП. Отримані результати роботи полягають в удосконаленні методів диференційної діагностики та терапії хворих на АП, а саме: запропоновано метод лектиногістохімічних маркерів в диференційній діагностиці дерматозу Дюрінга та АП, та метод імуноблотингу для диференційної діагностики АП та інших клінічно схожих бульозних дерматозів.

Установлено, що у хворих з тяжким проградієнтним перебігом АП необхідно проводити моніторинг визначення рівню антитіл до ДНК, як критерію важкості захворювання. Обґрунтовано та втілено в клінічну практику метод гемоімуносорбції на ДНК-сорбентах в комплексному лікуванні тяжких форм АП. Розроблено лабораторні індивідуальні критерії підбору дози ГКС у хворих на АП на основі вивчення фенотипу Т-лімфоцитів з використанням проточної лазерної цитофлюориметрії.

Втілено в практику патогенетично обґрунтований метод комплексного лікування хворих на АП з призначенням ПАМБА для корекції протеолізу у хворих в прогресуючій стадії перебігу АП (Патент України № 52189А), та метод поєднаної корекції порушень імунітету та протеолізу при тяжкому перебігу захворювання, що включає використання свіжозамороженої плазми (Патент України № 49653А).

Впровадження результатів дослідження в практику. Результати дисертації впроваджені в практичну діяльність КРШВД (м. Сімферополь), дерматологічних відділень Севастополя, Ялти, Донецька, Луганська.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно проведено аналіз даних наукової літератури, обґрунтовано мету і задачі дослідження, визначено і виконано програму наукових досліджень, написано розділи і оформлена дисертаційна робота, зроблені необхідні висновки і практичні рекомендації. Проведено клініко-лабораторне обстеження, лікування і динамічне спостереження за 125 хворими на АП, значна кількість досліджень автором здійснена самостійно. Дисертант самостійно здійснила інтерпретацію всіх зібраних даних, статистичну обробку результатів дослідження.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи було представлено и обговорено на VII Українському з’їзді дерматовенерологів (Київ 1999р.), на Підсумковій науковій конференції Центральної науково-дослідницької лабораторії Кримського державного медичного університету ім. С.І. Георгієвського (Сімферополь 2000 р.), на 29 Північному Конгресі Дерматологів та Венерологів (Стокгольм 2001р.), на Науково-практичній конференції, присвяченій 100-річчю Наукового товариства лікарів дерматовенерологів м.Києва (Київ 2001 р.), на Підсумковій науковій конференції присвяченій 70-річчю Кримського державного медичного університету ім. С.І. Георгієвського (Сімферополь 2001 р.), на Всеукраїнській науково-практичній конференції присвяченій 175-річчю з дня народження Л.К. Горецького (Київ 2001 рік), на 11 й конференції Європейської Асоціації дерматологів та венерологів EADV (Прага 2002 р.), на Всеукраїнській науково-практичній конференції “Гіперкератози в дерматології, венерології, косметології” (Київ 2002 р.), на Щорічній конференції Американської Асоціації алергологів та імунологів (Сан- Антоніо 2002р.), на III Національному Конгресі анатомів, гістологів, ембріологів і топографоанатомів (Київ 2002 р.), на Відкритій науково-практичній конференції “Актуальні проблеми сучасної медицини” (Сімферополь 2002р.), на Науково-практичній конференції присвяченій 80-річчю дерматовенерологічної служби на Донеччині (Донецьк 2002 р.), на Науково-практичній конференції імунологів м. Київа (Київ 2003 р.), на Науково-практичній конференції, присвяченій 102-річниці Наукового товариства лікарів-дерматовенерологів м. Києва (Київ 2003 р.), I-ій Науково-практичній конференції “Аутоімунні захворювання: імунопатогенез, імунодіагностика, імунотерапія” (Київ 2003р.) на Засіданнях республіканського товариства дерматовенерологів Криму (Сімферополь 1996, 1998, 1999, 2001, 2002 рр.).

Апробація захисту дисертаційної роботи здійснена 2.07.2003 р на засіданні Апробаційної Ради “Спеціальні питання клінічної медицини” при Національному медичному університеті імені О.О. Богомольця МОЗ України.

Публікації. За темою дисертації опубліковано наукових робіт 36, в тому числі статей у спеціалізованих виданнях ВАК України 22, (із них в моноавторстві 17), 2 патенти на винахід, та 12 тез доповідей у збірниках матеріалів науково-практичних конференцій та з’їздів.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на 328 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 51 таблицею, 28 рисунками, 3 історіями хвороби і складається зі вступу, огляду літератури, розділу, в якому викладена характеристика матеріалів і методів дослідження, п’яти розділів власних досліджень, аналізу та обговорення результатів, висновків і практичних рекомендацій. Список використаної літератури містить 459 джерел літератури вітчизняних(192) і зарубіжних авторів(267).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Об’єктом клініко-лабораторних досліджень було 125 хворих на АП, 12 хворих на інші бульозні дерматози у віці від 18 до 79 років. Серед хворих на АП з вперше установленим діагнозом – 48 хворих, які раніше не отримували імуносупресивної терапії. Інші 77 хворих поступили на фоні підтримуючої глюкокортикостерїдної терапії у період загострення шкірного процесу. Тривалість захворювання була в межах від 1 місяця до 16 років. Контрольну групу складали 32 умовно здорові людини.

Для вирішення поставленої мети та задач використовувались клінічні та лабораторні методи: імунологічні, цитологічні, імуногістохімічні, біохімічні.

Імунологічні методи:

Метод імуноблотингу по Towbin H. (1988); метод лектиногістохімії по Луцик А.Д. і співавт. (1989); дослідження мазків-відбитків із дна ерозій за допомогою моноклональних антитіл CD95, а також внутрішньо ядерним барвником Hoechst 33342; визначення субпопуляцій лімфоцитів з використанням панелі моноклональних антитіл до лейкоцитарних диференційовочних антигенів серії LT підприємства “Сорбент” (Інститут імунології РАМН, Москва); визначення показників клітинного імунітету та експресії Fas-рецептору (антиген CD95) на лімфоцитах периферійної крові хворих на пузирчатку методом проточної лазерної цитофлюориметрії в прямому двоколірному імунофлюоресцентному тесті моноклональними антитілами (МКА) фірми Becton Dickinson, поміченими флюоресцеінізотіоцианітом (FITC) и фікоерітріном ( FE); визначення Fc-рецепторів до Fc- фрагментів Ig M, IgG, C3-b компонента комплементу на нейтрофілах периферійної крові та бульозної рідини (Romans D. et al, 1976); НСТ-тест нейтрофілів та моноцитів (Park B.H. et al, 1968); визначення IgA IgM IgG мікротурбодіметричним методом (Гордієнко А.І і співавт. 2002); визначення концентрації фібронектину (Фн) в плазмі та бульозній рідині проводили імуноферментною тест-системою для визначення фібронектину підприємства біологічних медичних препаратів ‘‘БІОМЕД’’ ім. І.І. Мечникова (м. Москва).

Оцінку результату ферментативної реакції проводили на мікроспектрофотометрі ІФКО-2 при довжині хвилі 492 нм. Концентрація фібронектину в бульозній рідині у хворих на АП визначалась в перерахунку на одиницю білку; визначення антитіл до ліпополісахариду методом твердофазного імуноферментного аналізу з використанням тест-систем виробництва ВНДІ “Медполімер”, С.- Петербург; визначення аутоантитіл до ДНК у сироватках крові методом твердофазного імуноферментного аналізу за допомогою тест-систем виробництва ВНДІ “Медполімер”, С.- Петербург. Оптичну щільність кінцевого продукту ферментативної реакції визначали за допомогою імуноферментного аналізатору АКІЦ-01 при довжині хвилі 492 нм.

Біохімічні методи:

Визначення рівня середніх молекул (МСМ) у сироватці крові проводили по методиці Габріелян Н.Е. і співавт. (1984); визначення рівня МСМ в сечі проводили по методиці Малахової М.Я. і співавт. (1995); визначення активованого часткового тромбопластинового часу (АЧТЧ) проводили уніфікованим методом за допомогою наборів реактивів ‘‘Гемостаз‘‘ фірми “Реакомплекс” (м. Чіта); визначення активаторної активності плазми крові (АКАП) (Januszko T., Dubinska L., 1965); визначення урокіназної активності сечі (УАС).(Jamamoto S. 1971); визначення концентрації фібриногену, продуктів деградації фібрин(огену) (ПДФ) з використанням імуноферментної системи визначення фібриногену і ПДФ підприємства біологічних медичних препаратів ‘‘БІОМЕД’’ ім. І.І. Мечникова (м. Москва).

Оцінку результату ферментативної реакції проводили на мікроспектрофотометрі ІФКО-2 при довжині хвилі 492 нм; визначення активності антитромбіну III (АТ III) (Беліцер В.А. і співавт. 1988); визначення еластазоподібної активності (ЕПА) сироватки крові та пузирної рідини за допомогою гідролізу синтетичного субстрату N-т-бок-аланіл-п-нітрофенілового ефіру (БАНФЕ) (Reanal) (Оглобліна О.Г. і співавт.,1980); визначення загальної протеолітичної активності (ЗПА) сироватки крові та пузирної рідини по Веремеєнко К.Н. (1988); визначення вмісту б 2-макроглобуліну (б 2-МГ) та б1-інгібітору протеїназ (б1-ІП) в крові на основі модифікованого мікрометоду (Русаков С.В., Кубишкін А.В., 1995.); визначення желатиназної активності (ЖАК) нейтрофілів пузирної рідини проводили по експрес методу Веремеєнко К.Н. (1988).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Усі хворі на АП поступили в стаціонар КРШВД (м. Сімферополь) в стадії загострення шкірного процесу. Діагноз базувався на клінічних ознаках: наявності пузирних елементів або ерозій на слизових та шкірі, наявності епідермолізу (крайового симптому Нікольського) та загальному стані хворих, а також за знаходженням акантолітичних клітин Тцанка в мазках відбитках; в важко діагностичних випадках – методом імуноблотингу та лектиногістохімічно. З урахуванням часу виникнення захворювання, розповсюдження процесу, реагування на ГКС та їх дози, важкості загального стану, частоти та тривалості рецидивів, ми розподі лили усіх хворих в залежності від ступеню важкості перебігу дерматозу таким чином:

- легка ступінь важкості перебігу дерматозу: клінічно - ураження на слизовій або шкірі поодинокі пузирі, ерозії, що піддаються ГКС- терапії в дозі 30-60 мг із розрахунку на преднізолон, рідко рецидивуючі форми;

- середня ступінь важкості перебігу дерматозу: клінічно – численні висипання, важке загальне самопочуття, купірування шкірного процесу повільне в дозі 60- 90 мг, рецидиви 1-2 рази на рік;

- важка ступінь перебігу дерматозу: клінічно – розповсюджений шкірний процес, злоякісний перебіг захворювання, часті рецидиви, короткі ремісії, високі початкові - більш 90 мг на добу - дози преднізолону або гормонорезистентні форми.

Також ми виділяли стадії перебігу дерматозу:

- початкова стадія (поодинокі елементи);

- стадія загострення, генералізації або виражених клінічних проявів (численні ерозії, більшого розміру, часто зливні);

- стадія переважної епітелізації або стадія ремісії (поодинокі ерозії не схильні до зливання, їх епітелізація в процесі ГКС терапії) що в середньому відповідало 18-21 дню перебування у стаціонарі;

Таким чином всі обстежені нами хворі на АП були розподілені на групи в залежності від ступеню важкості перебігу дерматозу, та методу терапії (табл.1).

Таблиця 1.

Розподіл хворих на групи в залежності від ступеню важкості перебігу

АП та методу терапії

№

групи |

Назва групи | Ступінь важкості

захворювання | Загальна кількість хворих (n=125)

Легка (n=38) | Середня (n=59) | Важка (n=28)

1 | Тр.Т. + ПАМБА | 19 | 31 | 50

2 | Тр.Т. + ПАМБА+ СЗП | 3 | 9 | 12

3 | Тр.Т. + ПАМБА+ ДНК-сорбція | 11 | 11

4 | Тр.Т. | 19 | 25 | 8 | 52

Примітки: Тр.Т. – Традиційна терапія; ПАМБА – пара(амінометил) бензойна кислота; СЗП – свіжозаморожена плазма; ДНК-сорбція – ДНК гемоімуносорбція.

Із 48 хворих на АП з вперше установленим діагнозом з легкою ступінню важкості – 16, з середньою – 22, з важкою – 10. Із 77 хворих, що поступили на фоні підтримуючої ГКС- терапії в період загострення шкірного процесу з легкою ступінню важкості – 22, з середньою – 38, важкою – 18. Окремо була виділена група, яка нараховувала 25 хворих, що отримували курантіл (дипиридамол) на етапах диспансерного спостереження.

Із 48 хворих на АП з вперше поставленим діагнозом вульгарна пузирчатка зустрічалась в 40 випадках (81,4%), вегетуюча – в 2 випадках (4%), листоподібна- у 3 випадках (6%), себорейна – 3 випадках (6%). У всіх 77 хворих с проградієнтним перебігом була вульгарна пузирчатка.

Перші висипання частіше локалізувались на слизових оболонках ротової порожнини у 91 (72,8%) із 125 хворих. При себорейній та листоподібній пузирчатці слизові не були уражені. Аналіз розподілу хворих за статтю показав, що АП зустрічається частіше у жінок (38 мужчин и 87 жінок, відповідно 30,4% и 69,6%).

Аналіз розподілу хворих за віком показав що жінки захворюють частіше у віковому діапазоні 40-59 років. У мужчин АП зустрічається частіше в 30-39 років. Хоча мужчини хворіють рідше, але дерматоз у них протікає в більш тяжкій формі. Тільки 17 із 48 хворих при першому зверненні був встановлений вірний діагноз (35,4%), при чому хворі вже мали розповсюджений шкірний процес.

На основі взаємодії антитіл з антигенами епідермісу в важкодіагностичних випадках у 12 хворих було використано метод імуноблотингу, який дозволив розмежувати не тільки важкі в діагностиці бульозні дерматози, але й різні клінічні форми АП. Крім цього при ранній диференційній діагностиці бульозних дерматозів у 12 хворих на АП і 6 хворих на дерматоз Дюрінгу нами було використано лектиногістохімічний метод досліджень за допомогою вивчення специфічного перерозподілу тканинних та клітинних кон’югатів шкіри. Дослідження показали, що при вульгарній пузирчатці не тільки в області пузирів, але й у зовні не ураженній шкірі, на відміну від дерматозу Дюрінга, має місце значний перерозподіл глікокон’югатів.

Найбільшу діагностичну цінність в розмежуванні вульгарної пузирчатки та дерматозу Дюрінга мають лектини сої (специфічні до N-ацетил-D-глюкозаміну) та чечевиці (специфічні до a-D-манози), рецептори до яких відсутні в здоровій шкірі. При пузирчатці рецептори лектина сої є на цитолемі клітин базального шару епідермісу, а при дерматозі Дюрінга – в епітеліоцитах базального та рогового шарів. Допоміжну цінність мають лектини золотого дощу (специфічні до б -L- фукози) та зародків пшениці (специфічні до N-ацетил-D-глюкозаміну), диференційно забарвлюючі здорову шкіру та шкіру при вульгарній пузирчатці та дерматозі Дюрінга, що може служити додатковим діагностичним критерієм для підтвердження діагнозу та контролю ефективності лікування вульгарної пузирчатки або дерматозу Дюрінга, оскільки в стадії ремісії специфічного перерозподілу рецепторів лектинів при АП не виявлено.

За допомогою визначення експресії Fas-рецептору (антиген CD95) на акантолітичних клітинах Тцанку, та з використанням специфічного до апоптозу внутрішньоядерного барвника Hoechst 33342, було встановлено, що формування клітин Тцанку відбувається шляхом апоптозу.

Дисбаланс гомеостазу у хворих на АП може викликати виснаження адаптаційних можливостей організму, а також зміни вмісту ендогенних біологічно активних речовин. Наявність ауто антитіл до ДНК є одним із важливих показників, які характеризують особливості аутоімунного процесу в організмі хворого, і мають важливе діагностичне та прогностичне значення. Враховуючи це, на першому етапі роботи нами було проведено комплексне дослідження вмісту анти-ендотоксинових антитіл різних класів, вміст загальних імуноглобулінів, та рівень ауто антитіл до ДНК у сироватках крові хворих на АП.

В результаті досліджень вмісту анти-ендотоксинових антитіл різних класів у сироватках крові хворих на АП було установлено, що в середньому рівень анти-ЛПС-IgM у хворих на АП з важким перебігом захворювання був майже в 2,4 рази нижчим, ніж у осіб контрольної групи (р<0,05), тоді як за рівнем анти-ЛПС-IgA та анти-ЛПС-IgG ці показники практично не відрізнялись від контрольної групи (р>0,05). При дослідженні рівня аутоантитіл до одно-(анти-ss-ДНК-IgG) та дво ниткової (анти-ds-ДНК-IgG) ДНК, нами було установлено, що в середньому рівні анти-ss-ДНК-IgG та анти-ds-ДНК-IgG у хворих на АП були відповідно в 1,5 та 1,2 рази (р<0,05 и p<0,1) вищими за аналогічні показники для контрольної групи. Між вмістом анти-ss-ДНК-IgG та анти-ds-ДНК-IgG виявлена достатньо висока кореляція (r=0,86). Рівні анти-ss-ДНК – IgG та анти-ds-ДНК – IgG, які перевищували значення медіан показників контрольної групи (відповідно 0,060 та 0,065) більш ніж в 2 рази, було виявлено відповідно у 21,4% та 14,3% хворих на АП.

На основі графічного аналізу розподілу рівнів анти-ssДНК-IgG та анти-dsДНК-IgG виявилось можливим, усіх обстежених нами хворих доволі чітко розподілити на дві групи – з низьким та високим рівнем аутоантитіл до одно- та двониткової ДНК (рис.1).

Рис. 1 Гістограма розподілу рівнів антитіл до одно- та двониткової ДНК в сироватці крові хворих на АП

При аналізі гуморальної ланки імунітету у хворих на АП було встановлено, що середній вміст загального IgA хворих на АП в 1,6 разів перевищував показники контрольної групи (1,37±0,2 мг/мл), а у 78,6% хворих з на АП вміст загального IgA перевищував показники контрольної групи в середньому в 2,1 рази (р<0,001).

Методом кореляційного аналізу виявлено взаємозв’язок між рівнями анти-ендотоксинових антитіл та аутоантитіл до ДНК класу G для тих хворихна АП, у яких було зареєстровано підвищення вмісту анти-ДНК-антитіл. Найбільш виразною була зворотна залежність між рівнями аутоантитіл до одно ниткової ДНК та анти-ЛПС-IgM (r=-0,93)- тобто, чим нижчим у даного хворого був вміст анти-ЛПС-IgM, тем більший у нього був рівень аутоантитіл до ДНК.

Дана кореляція показала, що саме у хворих з важкою ступінню перебігу АП виявляється підвищення титру аутоантитіл до ДНК, та зниження рівню анти-ЛПС-IgM, що необхідно враховувати при прогнозі особливостей перебігу та наслідків захворювання. В даний час головним засобом лікування пузирчатки є кортикостероїди, які, крім іншого, мають суттєвий вплив на функціональний стан Т-клітин імунної системи. В зв’язку з цим за допомогою цитофлюориметричного методу було проведено вивчення впливу терапії преднізолоном на особливості мембранного фенотипу Т-хелперів хворих на АП до і після терапії преднізолоном в дозах, що складали до 60 мг, до 90 мг, 120мг і більше.

З цією метою на CD4+ лімфоцитах хворих на АП до проведення терапії преднізолоном було вивчено особливості експресії активаційних маркерів – антигенів CD25, CD71, HLA-DR. Виявлено що кількість CD4+CD25-лімфоцитів дорівнювало 21,3±4,8 %. У тих самих хворих кількість CD4+CD71-лімфоцитів була 24,2±5,0%; CD4+HLA-DR+- лімфоцитів – 30,1±4,8 %.

Рис. 2. Дозозалежний ефект впливу терапії преднізолоном на експресію активаційних антигенів Т-хелперами хворих на АП.

Установлено, що імунофенотип Т-хелперів в залежності від кількості преднізолону, що отримують хворі на АП характерно змінювався. В середньому кількість CD4+ лімфоцитів, що експресували антигени CD25+, CD71+ та HLA-DR+ у таких хворих було відповідно в 2,0, 2,2 та 1,7 разів меншими, ніж до лікування (p<0,05).

Найбільш значне зменшення експресії активаційних маркерів спостерігалось в групі хворих на АП, які отримували преднізолон в дозі 120 мг. У хворих цієї групи після лікування середній вміст CD4+CD25+ - CD4+CD71+- та CD4+HLA-DR+ - лімфоцитів був відповідно в 2,2, 2,6 та 1,9 рази нижчим ніж до проведення терапії (p<0,05).

Таким чином проведені дослідження показали, що терапія преднізолоном в дозах 60, 90 та 120 мг практично не впливає на загальну кількість Т-хелперів в периферійній крові хворих на АП, але дозозалежно понижує вміст CD4+ лімфоцитів, що коекспресують активаційні антигени CD25, CD71 та HLA-DR (рис.2). У обстежених нами хворих на АП до початку терапії преднізолоном кількість CD4+CD95+ лімфоцитів в середньому складала 9,2±2,6 %, а кількість лімфоцитів в піку sub-G1 (тобто лімфоцитів, що вийшли в апоптоз) не перевищувала 6,1±3,0 %.

Пропорційно збільшенню дози преднізолону, призначеної хворим на АП (60, 90 та 120 мг) спостерігався ріст кількості лімфоцитів в піку sub-G1 (відповідно 15,8±3,1, 22,7±4,1 и 37,1±5,6 %), при чому залежність між дозою преднізолону, що отримували хворі на АП та збільшенням відсотку апоптотичних лімфоцитів була практично лінійною. Паралельно пропорційному дозі преднізолону збільшенню кількості лімфоцитів, що вийшли в апоптоз, у хворих на АП спостерігалось зменшення кількості Т-хелперів, що експресують антиген CD95, хоча в цьому випадку терапія преднізолоном мала менш виражену дію.

Так, якщо після терапії хворих на АП преднізолоном в максимальній дозі 120 мг відсоток лімфоцитів в піку sub-G1 в середньому зростав майже в 6,1 рази у порівнянні з аналогічним показником до початку лікування (p<0,001), то рівень CD4+CD95+- лімфоцитів при цьому зменшувався всього в 2,0 рази (p<0,05).

Таким чином, на основі проведених імунофенотипічних досліджень можна зробити висновок, що у хворих на АП дія преднізолону проявляється в дозозалежному зниженні кількості активованих Т-хелперів з фенотипом CD4+CD25+, CD4+CD71+, CD4+HLA-DR+, CD4+CD95+ та одночасному збільшенні кількості апоптотичних Т-лімфоцитів.

Було виявлено ефект “плато” (рис.3)– тобто існувала деяка порогова доза преднізолону, перевищення якої вже не супроводжувалось пропорційним зменшенням кількості активованих Т-хелперів, але призводило до суттєвого зростання кількості апоптотичних Т-лімфоцитів.

Рис. 3 Вплив терапії преднізолоном на експресію Т-хелперами антигену CD95 та кількість апоптотичних клітин у хворих на АП.

Вивчення стану Т-клітинної ланки імунітету та неспецифічної резистентності в процесі проградієнтного перебігу показало, що у хворих на АП виявлено дисфункцію клітинної ланки імунітету, яка характеризується невірогідним підвищенням рівню CD3+, CD4+, CD8+ лімфоцитів периферійної крові у вперше захворівших, та зниженням даних клітин по мірі прогресування захворювання у хворих, які знаходились на імунодепресивній терапії. Зокрема якщо у вперше захворівши вміст CD4+ лімфоцитів був 48,3±3,5, то у хворих з важким перебігом 26,4±2,5% (p<0,001). Вміст CD8+ відповідно дорівнював 24,3±4,5% и 12,1±3,2% (p<0,001).

В процесі лікування на 18-21 день перебування у стаціонарі не спостерігається нормалізації показників Т- клітинного імунітету, найбільш вираженою депресія залишалась у хворих з важким перебігом захворювання. (CD4+-36,4±1,8%; p<0,01 та CD8+-15,4±1,5%; p<0,01).

Показники неспецифічної резистентності характеризувались зниженням здатності нейтрофілів та моноцитів експресувати рецептори до Fc- фрагментів IgG, IgM C3b- компонента комплементу.

В бульозній рідині виявлено Т-лімфоцити, серед субпопуляцій яких переважають CD8+ лімфоцити. Так, якщо вміст CD4+- лімфоцитів в бульозній рідині у хворих з легким перебігом був 11,6±0,8%, то вміст CD8+- лімфоцитів – 20,2±1,8%. Нейтрофіли бульозної рідини представляють собою клітини з активними процесами киснево-залежних механізмів бактерицидності, та несуть на своїй поверхні значну кількість рецепторів до Fc- фрагментів IgM, IgG, та C3b- компонента комплементу. Проведено вивчення стану системи протеолізу та гемостазу у хворих на АП різної ступені важкості з урахуванням стадії захворювання.

Серед пацієнтів, що захворіли вперше було зареєстровано підвищення загальної протеолітичної активності крові у 1,78 рази відносно показників контрольної групи (р<0,001). Аналогічне підвищення протеолітичної активності спостерігається також у пацієнтів, що хворіють тривалий час в період загострення (у 1,78 рази у хворих з легкою ступінню важкості (р<0,001), у 1,83 рази у хворих із середньою ступінню важкості(р<0,001), у 1,85 рази у хворих з важкою ступінню(р<0,001)). На 18-21 день лікування традиційними методами зареєстровано нормалізацію загальної протеолітичної активності у пацієнтів, що захворіли вперше та у тих, що хворіють тривалий час з легким перебігом захворювання, однак у хворих із середньою ступінню важкості та важким перебігом на останньому етапі обстеження спостерігається статистично вірогідна висока загальна протеолітична активність (у 1,41 (р<0,001) та 1,84 (р<0,001) рази вище норми, відповідно). Загальну протеолітичну активність в бульозній рідині зареєстровано у всіх хворих, при цьому максимальну протеолітичну активність виявлено у хворих із середньою ступінню важкості (46,2±7,1 од/мл).

У пацієнтів що вперше захворіли на АП в сироватці крові зареєстровано статистично вірогідне підвищення еластазоподібної активності (у 1,72 рази р<0,001), на 18-21 дні лікування цей показник нормалізується. У пацієнтів що хворіють довго з легким перебігом захворювання спостерігається аналогічна тенденція (еластазоподібна активність у 1,68 (р<0,001) рази вище норми при поступленні та її нормалізації на 18-21 день), тоді як у хворих із середньою ступінню важкості та тяжким перебігом не спостерігається нормалізації даного показника (у 2,29 (р<0,001) при поступленні та у 1,64 (р<0,001) рази вище норми на 18-21 день в групі із середньою ступінню важкості захворювання; у 2,51 (р<0,001) та у 2,39 (р<0,001) рази вище норми в групі з важким перебігом захворюваннявідповідно). Зареєстровано також еластазоподібну активність в бульозній рідині, при цьому максимальну еластазоподібну активність бульозної рідини виявлено у хворих з важким перебігом захворювання (5,1±0,2 мкМ/мл хв.).

У хворих на АП спостерігається зниження активаторної активності крові, при цьому найбільше зниження виявлено у хворих з важким перебігом захворювання (66,2±2,5 %; р<0,001). При цьому на 18-21 день лікування не спостерігається нормалізації показників в усіх групах, а найбільше зниження залишається у хворих з важким перебігом захворювання (69,3±2,6%; р<0,001) відносно показників контрольної групи (100,0±2,6%).

В бульозній рідині присутній активатор плазміногену, мінімальна його активність виявлена у пацієнтів що захворіли вперше та з легким перебігом захворювання, максимальна – з важким (13,4±1,1 мм2 та 22,3±2,8 мм2 відповідно). Це значить, що в бульозній рідині відповідно до важкості перебігу захворювання спостерігається підвищення активності активатора плазміногену.

У хворих реєструється зниження урокіназної активності сечі відносно показників контрольної групи (100,1±2,1%); при цьому мінімальні значення урокіназної активності сечі відмічаються при середньої важкості та важкому перебігу захворювання (63,2±2,7%; р<0,001 та 54,2±2,3%; р<0,001 відповідно). На 18-21 дні не спостерігається нормалізації урокіназної активності сечі (69,4±3,2% - з середньою ступінню важкості р<0,001, 57,3±2,5%– важкою ступінню р<0,001).

У хворих при поступленні спостерігається статистично вірогідне підвищення концентрації фібриногену, при цьому підвищення концентрації відбувається по мірі зростання важкості перебігу захворювання (у 1,50 у вперше захворівших (р<0,001), у 1,56 у хворих з легкою ступінню важкості (р<0,001), у 1,72 у хворих із середньою ступінню важкості (р<0,001), у 2,06 рази у хворих з важким перебігом захворювання (р<0,001) вище за норму). На 18-21 дні лікування підвищений вміст фібриногену зареєстровано у хворих із тяжким перебігом захворювання (у 1,78 рази вище норми (р<0,001)).

При вивченні концентрації фібриногену в бульозній рідині встановлено, що максимальний його вміст спостерігається у хворих, що захворіли вперше та у хворих з легким перебігом захворювання, тоді як при важкому перебігу вміст фібриногену практично на 50% менш, ніж у тих, що захворіли вперше (9,5±0,8 мг/мл на од. білку у тих що захворіли вперше, 8,1±0,4 мг/мл на од. білку – у хворих з легкою ступінню важкості, 5,2±0,3 мг/мл на од. білку- середньої ступені важкості 4,2±0,5 мг/мл на од. білку – важкого перебігу захворювання).

У хворих на АП, як у тих що захворіли вперше, так і в тих що поступили під час загострення шкірного процесу, реєструється зниження активованого тромбопластинового часу АЧТЧ (у 1,64 у вперше захворівши (р<0,001), у 1,34 у хворих з легкою ступінню важкості (р<0,05), у 1,34 у хворих із середньою ступінню важкості (р<0,05), та у 1,83 рази у хворих з важким перебігом захворювання (р<0,001) нижче за норму). Дослідження проведені на 18-21 день, дали змогу встановити той факт, що нормалізації показників АЧТЧ не відбувається, що в свою чергу вказує на гіперкоагуляцію крові, яка збільшується відповідно до ступеню важкості захворювання.

У хворих на АП при поступленні реєструється істотне зниження активності антитромбіну III AT-III (77,2±2,5% у хворих що захворіли вперше (р<0,001), 81,4±2,7%- хворих з легкою ступінню важкості (р<0,001), 76,4±2,5%- середньої ступені важкості (р<0,001), 68,4±2,3%– важкого перебігу (р<0,001)). В процесі лікування спостерігається підвищення активності АТ- III, однак в усіх групах вона продовжувала залишатися статистично вірогідно нижчою за норму, при цьому найбільш виражена депресія спостерігалась при важкому перебігу захворювання (76,2±2,4%; р<0,001) при нормі 100,0±2,6%.

У хворих на АП в гостру фазу запалювального процесу спостерігається статистично вірогідне зниження концентрації фібронектину в плазмі крові. При цьому по мірі зростання важкості захворювання відмічається прогресуюче зниження концентрації фібронектину. Так, якщо у хворих з легким перебігом, концентрація фібронектину була знижена у 1,25 рази (р<0,01), то у хворих із перебігом середньої важкості – у 1,62 (р<0,001) та з важким – у 2,07 рази (р<0,001) відносно концентрації, що зареєстрована в контрольній групі. За час лікування спостерігалось підвищення концентрації фібронектину, однак повної нормалізації вмісту фібронектину в плазмі крові не відбулося. Виражені зміни залишались у хворих із середньою ступінню важкості, та у хворих з важким перебігом захворювання (у 1,34 нижче норми р<0,01, та 1,43 рази р<0,001 відповідно). При вивченні вмісту фібронектину в пузирній рідині його найбільша концентрація виявлена у хворих із легким перебігом – 66,3±11,2-3 мкг/мл на од. білку.

У хворих на АП при поступленні реєструється статистично вірогідне підвищення вмісту в плазмі крові продуктів деградації фібриногену ПДФ (у 2,38 у вперше захворівших (р<0,001), у 2,17 у хворих з легкою ступінню важкості (р<0,001), у 2,65 у хворих із середньою ступінню важкості (р<0,001), у 2,98 рази у хворих з важким перебігом захворювання (р<0,001) вище норми, що зареєстрована в контрольній групі). На 18-21 день спостережень відмічається зменшення вмісту ПДФ в крові, але при цьому концентрація ПДФ перевищувала норму, у 1,47 раза у вперше захворівших (р<0,001), у 1,76 разу у хворих з легкою ступінню важкості (р<0,001), у 2,10 разу у хворих із середньою ступінню важкості (р<0,001), у 2,48 рази у хворих з важким перебігом захворювання (р<0,001).

При вивченні вмісту ПДФ в бульозній рідині нами